β-glükozidáz aktivitás mérése talajban

Enzimek

•globuláris fehérjék•jellegzetes térszerkezet specifikusság•biológiai katalizátorok: vagy egy

reakciótípust vagy egy bizonyos anyag átalakulását katalizálják

•a reakciók lebonyolításában az aminosav-oldalláncok által kialakított aktív centrum vesz részt

Az enzimek működése

•egy enzimkatalizált reakcióban az enzim aktív centrumában ideiglenesen megköti a szubsztrátot és létrejön egy enzim-szubsztrát komplex

•a reakció lejátszódásával termék keletkezik, amely leválik az enzimről, majd az enzim visszakerül eredeti állapotába

•függ: kémhatás, hőmérséklet

Az enzimek működése

1. ábra: http://hu.wikipedia.org/wiki/Enzim

Enzimaktivitás

•az enzim mennyiségét az enzimaktivitással szokták jellemezni

•tulajdonképpen reakciósebességet jelent, vagyis azt jelenti, hogy a jelen levő enzimmennyiség szigorúan meghatározott szubsztrát koncentráció mellett, időegység alatt, mennyi szubsztrát átalakulását katalizálja

•egysége: 1 µmol/perc, catal

Enzimaktivitást befolyásoló tényezők

•enzimkoncentráció•szubsztrátkoncentráció•kémhatás•hőmérséklet• inhibitorok, aktivátorok

β-glükozidáz •mikroorganizmusokban, növényekben és

állatokban is egyaránt megtalálható•hidroláz enzim•a cellulózt hidrolitikusan hasítja glükóz

molekulákká•a diszacharidokat hidrolizáló glükozidázok

csoportjába tartozik•a talajban sokkal nagyobb jelentőségű,

mint az ugyanebbe a csoportba tartozó α- glükozidáz és α- és β-galaktozidáz

Hidrolízis

• a hidrolizáló enzimek víz belépésével két részre hasítják a szubsztrátmolekulákat• a szubsztrátmolekulák egy részét az

OH- csoportra viszik át, míg a víz protonja a szubsztrátmolekula másik

részére kerül

2. ábra: Alef K. and Nannipieri P. : Methods in Applied Soil Microbiology and Biochemistry

β-glükozidáz aktivitás mérése

• leggyakrabban p-Nitrofenil-β-D-glükozidot használnak szubsztrátként

• ennél a szubsztrátnál Km értéke általában 1,3-2,4 mM (Michaelis-állandó (Km): az a szubsztrátkoncentráció, amelynél a maximális ( vmax) felét éri el a reakciósebesség)

• 70°C-on inaktiválódik és jelentős összefüggést mutat a talaj szeversanyagával

β-glükozidáz aktivitás vizsgálata(Tabatabai 1982; Eivazi és Tabatabai 1988)

• alapja a p-nitrofenol csökkenésének meghatározása, a talaj p-nitrofenil glükozid oldat inkubációja után

• az inkubáció időtartama 1 óra; hőmérséklet: 37 °C

3. ábra: Alef K. and Nannipieri P.: Methods in Applied Soil Microbiology and Biochemistry

Szükséges eszközök és anyagok

Eszközök Anyagok

• Spektrofotométer• Erlenmeyer lombik (50 ml)• 37°C –os vízfürdő, rázató• Szűrőpapír

• Toluol• MUB (modified universal

buffer) puffer (pH=6)• 0,5 M CaCl2 • 0,1 M TRIS puffer (pH=12

és 10)• Standard p-Nitrofenol oldat• 25 mM p-Nitrofenil-β-D-

glükozid (PNG) oldat (0,377 g PNG-t 40 ml MUB pufferben oldva, 50 ml-re hígitva)

A mérés metodikája

• 1g nedves talajt Erlenmeyer lombikba helyezünk, majd hozzáadunk 0,25 ml toluolt, 4 ml MUB oldatot és 1ml PNG oldatot

• lezárva 1 órán keresztül 37°C-os rázatóban inkubáljuk• az inkubáció után hozzáadunk 1 ml CaCl2 oldatot , 4 ml

TRIS puffert (pH=12), összekeverjük a lombikban és szűrőpapírral azonnal leszűrjük a szuszpenziót

• spektrofotométerrel 400 nm-en megmérjük az intenzitást (ha túl magas, azaz nem fér bele a mérhető tartományba, akkor pH=10-es TRIS pufferrel hígítani kell a szűrletet)

• vakoldat készítése• mérés megismétlése 3x (ugyanahhoz a vakoldathoz)

β-glükozidáz aktivitás vizsgálata(Hoffmann és Dedeken 1965)

• alapja a salignin (2-oxymetil-fenol) csökkenésének meghatározása salicin 2-( hidroximetil)fenil –β-D-glükopiranozid (β-glükozid salignin) talajban történő inkubálása után

• az inkubálás időtartama 3 óra;hőmérséklet: 37 °C

Szükséges anyagok és eszközökAnyagok Eszközök

• 2 M acetát puffer (pH=6,2)

• Borát puffer (pH=9,6)• Dibróm-kinon -klórimid

oldat (200 mg 100 1/ml etanol)

• 2,306 g β-glükozid salignin oldat

• Standard salignin oldat (0,1 mg/ml)

• toluol

• Spektrofotométer• Mérőlombik (50 ml)• 37 °C-os vízfürdő, rázató• Szűrőpapír

A mérés metodikája

• mérőlombikba 5 g nedves talajt helyezünk, majd hozzáadunk 1 ml toluolt és 15 percig állni hagyjuk, szobahőmérsékleten

• ezután hozzáadunk 10 ml-t a szubsztrát oldatból és 20 ml acetát puffert, majd 3 órán keresztül 37°C-on inkubáljuk

• az inkubálás után desztillált vízzel 50 ml-re hígitjuk, összekeverjük és leszűrjük

• a szűrletből 1-3 ml-t mérőlombikba pipettázunk és hozzáadunk 20 ml acetát puffert, 2 ml borát puffert és 0,5 ml dibróm-kinon-klórimid oldatot

• desztillált vízzel 50 ml-re töltjük és 90 perc után, 578 nm-en mérjük az abszorbanciát

• a vakoldat elkészítéséhez 10 ml desztillált vizet adunk a szubsztrát helyett

• a mérést háromszor megismételjük (ugyanazzal a vakoldattal)

Felhasznált irodalom:

• Alef K. and Nannipieri P. (Editors): Methods in Applied Soil Microbiology and Biochemistry. Academic Press Limited. London. 1995

• Boross László, Sajgó Mihály: A biokémia alapja. Mezőgazda Kiadó Kft. 2003

• Ádám Veronika: Orvosi biokémia. Medicina. 2004• Sarkadi Lívia: Biokémia mérnök szemmel. Typotex. 2007• http://hu.wikipedia.org/wiki/Enzim