第10卷 第13期 Vol.10 No.13 2017 年 7 月 July 2017

壳聚糖包裹 EGCG 载药微球及其生物应用研究 刘颖异，刘丽炜，胡思怡，王 玥，岳 婕，秦 沛，黄昱霖，梁耀天*

（长春理工大学理学院，长春 130022）

摘要：对壳聚糖（chitosan，CS）和表没食子儿茶素没食子酸酯（(-)-epigallocatechin gallate，EGCG）构成的

载药纳米微球的生物应用进行实验研究。首先制备了壳聚糖与 EGCG 偶联的载药纳米微球，通过琼脂糖凝胶

电泳实验证明了两者的成功偶联。然后在磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer saline，PBS）环境下对其胶体稳

定性进行了 101 h 监测，结果显示在 101 h 内该载药纳米微球无明显聚集、沉淀、降解；动态光散射粒径监测

结果显示粒径大小保持稳定，证明其具有良好的生物稳定性。最后进行体内和体外生物应用研究，将制备的

载药纳米微球用于小鼠乳腺癌肿瘤模型，在实验中壳聚糖包载表没食子儿茶素没食子酸酯（CS-EGCG）载药

纳米微球注射组的小鼠肿瘤尺寸减小，表现出对体内 MCF-7 乳腺癌肿瘤的良好抑制效果，且抑制效果明显优

于壳聚糖注射组与 EGCG 注射组。并在此基础上对其进行功能化修饰，实现了载药微球对 MCF-7 乳腺癌细胞

的靶向荧光标记作用。载药纳米微球在生物医药领域显示出广泛的应用前景。

关键词：光学；载药纳米微球；抑制；肿瘤 中图分类号：O439 文献标识码：A 文章编号：1674-2850(2017)13-1493-06

Chitosan encapsulated EGCG loaded microspheres and its biological application study

LIU Yingyi, LIU Liwei, HU Siyi, WANG Yue, YUE Jie, QIN Pei, HUANG Yulin, LIANG Yaotian

(School of Science, Changchun University of Science and Technology, Changchun 130022, China)

Abstract: In this paper, the biological applications of drug loaded nanospheres composed of chitosan (CS) and (-)-epigallocatechin gallate (EGCG) were studied. Firstly, the drug loaded nanospheres were prepared by coupling chitosan with EGCG, and the successful coupling was proved by agar gel electrophoresis. The colloidal stability were monitored in the phosphate buffer saline (PBS) environment in 101 h, the results showed that the microspheres had no obvious aggregation, precipitation and degradation in 101 h, and the dynamic light scattering particle size monitoring results showed that the particle sizes remained stable, which indicated CS-EGCG nanospheres have good biological stability. Finally, we conducted a research in the biological application of in vivo and in vitro, in which the preparated nanospheres were used in mouse breast cancer model. The tumor size of CS-EGCG nanospheres injection group was decreased and showed good inhibitory effect on MCF-7 breast cancer, and the inhibition effect was better than chitosan injection group and EGCG injection group. On this basis, the functional modification was carried out to achieve the targeted fluorescent labeling effect of drug loaded microspheres on MCF-7 breast cancer cells. Drug loaded nanospheres show wide application prospects in the biomedical field. Key words: optics; drug loaded nanospheres; inhibition; tumor

0 引言 纳米载药系统是由天然或合成的高分子材料制备的药物传递系统，其主要优点是药物递送具有针对

作者简介：刘颖异（1991—），女，硕士，主要研究方向：纳米光子学与生物光子学 通信联系人：刘丽炜，副教授，主要研究方向：纳米光子学与生物光子学. E-mail: liulw@szu.edu.cn

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性与缓释性，且载体材料可生物降解，可作为载体的材料有高分子纳米粒、纳米脂质体、纳米磁球、无

机纳米载体、固体脂质纳米粒、聚合物胶束、树枝状大分子等[1]。药物在经过纳米技术处理后，随着粒

径的减小，药物的溶解速率得到提高，从而提升了药物的生物利用度。与此同时，药物由载体递送到靶

位器官或组织，使其靶向作用于病灶部位，减小对机体正常组织的不良作用。近年来，将纳米载药系统

用于癌症治疗更是成为了一个热点研究课题。 JANES 等[2]研究发现，肿瘤细胞具有选择性吞噬纳米颗粒的特性，从而提高壳聚糖纳米粒的治疗效

果并减小外周副作用。MITRA 等[3]制备了壳聚糖包裹葡聚糖阿霉素的纳米粒子，并研究其毒性及生物活

性，结果显示，所制备的纳米粒子不仅可减轻外周的毒副作用，而且在很大程度上提高了对实体瘤的抑

制作用，可见壳聚糖是良好的药物载体。而绿茶中茶多酚的主要成分——EGCG，已被证实具有抗人类

免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）、神经保护、DNA 保护及抗肿瘤的作用[4]。特别是

在抗肿瘤方面，近年来已有研究报道，EGCG 对 HT-29 结肠癌细胞、MCF-7 乳腺癌细胞、BGC823 胃癌

细胞和 HepG2 肝癌细胞均具有生长抑制作用[5~8]。其中，EGCG 对乳腺癌的作用机制为其能够减弱参与

mRNA 转录和表达的金属蛋白酶 MMP-2 的活性，从而抑制 MCF-7 乳腺癌的生长[9]。但 EGCG 多羟基的

分子结构，导致其脂溶性差、生物利用度低以及在生物体内不稳定[10]。本文将采用壳聚糖包裹 EGCG 提

高其生物利用度及稳定性，实现对小鼠移植瘤的抑制作用，并在此基础上对其进行功能性优化。

1 实验 1.1 试剂与仪器

实验试剂：壳聚糖（低分子量）、EGCG（≥95%）、三聚磷酸钠（TPP，85%）购自 Sigma 公司；乙

酸（CH3COOH，>99%）、二甲基亚砜（DMSO）购自 Alfa Aesar 公司；高糖培养基（DMEM）、PBS 为

Hyclone 公司产品；新生牛血清（NBCS）购自四季青公司；青霉素−链霉素混合溶液购自 Gibco 公司； 胰酶细胞消化液购自 Biosharp 公司；TAE 凝胶电泳缓冲液为 Noah 公司产品；琼脂糖购自 Biowest 公司；

FAM-siRNA 购自上海吉玛制药技术有限公司；Opti-MEM I Reduced Serum Medium 为 Gibco 公司产品；

焦碳酸二乙酯（DEPC）水从北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司购买；去离子水（deionized water）由

Milli-Q 水纯化系统纯化所得。 实验仪器：离心机（Eppendorf Centrifuge 5430R，德国）；纳米粒度电位分析仪（Malvern Instruments

Nano ZS90，英国）；二氧化碳细胞培养箱[SANYO MCO-18AIC（UV），日本]；荧光倒置显微镜（Leica DMI3000 B，德国）等。

1.2 制备 CS-EGCG 载药纳米微球

首先将乙酸（CH3COOH，>99%）稀释至 0.175%（体积分数）的乙酸溶液，取壳聚糖 10 mg 溶解于

10 mL 乙酸溶液中，使用磁力搅拌器搅拌壳聚糖直至其完全溶解，此时溶液澄清。将壳聚糖溶液经 5 μm一次性针式过滤器过滤后，分别与 5.0，7.5，10.0，12.5，15.0 mg EGCG 混合，继续磁力搅拌约 30 min. 将提前配置好的 TPP 溶液（0.1%，质量体积分数）逐滴加入持续搅拌的上述溶液中，此时溶液由透明变化

为半透明状态，继续搅拌 4 h. 所得样品即不同质量比的 CS-EGCG 纳米粒子悬液（除凝胶电泳实验外，

其他实验均采用壳聚糖与 EGCG 质量比为 4:5 的样品）。

1.3 凝胶电泳实验

取适量 50×的 TAE 电泳缓冲液稀释至 1×，称量 500 mg 的琼脂糖溶于 50 mL 1×的 TAE 中加热搅拌至

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琼脂糖溶解沸腾。在琼脂糖溶液冷却前将其倒入配胶板中，水平放置冷却至琼脂糖凝固成胶，竖直向上

将梳子拔除。将配胶板搁置在电泳槽中，向其内倒入 1×的 TAE 电泳缓冲液至高于凝胶面 1～2 mm. 接下

来将各样品用罗丹明 6G染色后取 20 μL加入到孔内，给电泳槽加盖，在室温 110 V下开始跑胶计时 15 min.

1.4 稳定性测试

取 400 μL CS-EGCG 纳米粒子悬液与 600 μL PBS 混合置于比色皿中，在 101 h 内对混合后样品间隔

不同时间，经纳米粒度电位分析仪测试样品粒径变化。

1.5 活体小鼠移植瘤实验

小鼠选用 4 周龄的雌性 BALB/c-nu 小鼠，将传代培养的 MCF-7 乳腺癌细胞消化离心，用少量培养

基悬浮，在小鼠右前肢外侧进行皮下接种，继续饲养 14 d 后得到小鼠移植瘤模型。将实验小鼠分为 4 组，

分别注射 PBS、壳聚糖溶液、EGCG 溶液和 CS-EGCG 纳米粒子悬液。6 h 后开始拍照记录肿瘤尺寸，并

在接下来的每天持续拍照观察肿瘤尺寸及小鼠活跃情况。

1.6 FAM-siRNA 修饰 CS-EGCG 载药纳米微球细胞成像实验

用离心机将 FAM-siRNA（0.5 OD260/管）离心并小心打开，加入 DEPC 水 62.5 μL 溶为 20 μmol/L 溶

液。抽取 4 μL 20 μmol/L 的 FAM-siRNA 溶液，与 100 μL Opti-MEM I Reduced Serum Medium 混合摇匀，

再将其在室温下与 CS-EGCG 纳米粒子悬液混合静置 20 min. 将制备的 FAM-siRNA_CS-EGCG 混合物滴

加到提前 1 d 无抗生素培养基培养 MCF-7 细胞的培养皿中，24 h 后将培养皿置于荧光倒置显微镜下进行

细胞成像实验。

2 结果与讨论 2.1 CS-EGCG 载药纳米微球的制备与表征

研究制备了以壳聚糖为载体包裹 EGCG 的纳米载药微

球，结构如图 1 所示。利用琼脂糖凝胶电泳实验分析不同质

量比的 CS-EGCG 载药纳米微球的偶联状态，如图 2 所示。

EGCG 呈负电，向正电极移动，而壳聚糖与 CS-EGCG 载药

纳米微球表面带正电荷，在琼脂糖凝胶电泳实验中壳聚糖与

CS-EGCG 载药纳米微球均向负电极运动，并且随着 EGCG含量的增加，制备的载药纳米微球的分子量变大，在凝胶中

注：图中比例为壳聚糖与 EGCG 的质量比

图 2 凝胶电泳实验实物图（a）与电泳图（b） Fig. 2 Physical photo (a) and electrophoretogram (b) of gel electrophoresis experiment

图 1 CS-EGCG 载药纳米微球合成结构图

Fig. 1 Synthesis structure diagram of CS-EGCG drug loaded nanospheres

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所受到的阻力增加，电泳距离缩短。如图2所示，CS-EGCG载药纳米微球中 EGCG 含量越高，电泳距离越短，由

此证明 EGCG 与壳聚糖的成功偶联。

为检测制备的 CS-EGCG 载药纳米微球的稳定性，

本研究选用与人体血液 pH 值相近的 PBS，在 PBS 环境

下测试该载药纳米微球的胶体稳定性。如图 3 所示，经

纳米粒度电位分析仪在 101 h 内对样品的粒径测试发现，

CS-EGCG 载药纳米微球的平均粒径为(182±5) nm，基本

保持稳定，由此可见 CS-EGCG 载药纳米微球的生物稳

定性良好。

2.2 CS-EGCG 载药纳米微球对体内 MCF-7 乳腺癌细

胞的生长抑制研究

在小鼠肿瘤部位给药后 4 d 的时间内，对小鼠的肿瘤尺寸以及小鼠活跃状态进行拍照观察。图 4 为

样品注射后前 3 d 观察小鼠状态的照片。图 5 为 CS 注射组、EGCG 注射组及 CS-EGCG 载药纳米微球注

射组对小鼠体内 MCF-7 肿瘤的生长抑制率。如图 5 所示，EGCG 注射组小鼠的肿瘤尺寸在第 1 天的时间

内呈现增长趋势，而后减小又增长，这是由于 EGCG 体内吸收缓慢且在生理环境下不稳定导致的。CS注射组小鼠的肿瘤尺寸保持不变，说明壳聚糖本身对 MCF-7 乳腺癌肿瘤模型具有一定的抑制作用。而在

实验时间内，CS-EGCG 载药纳米微球对小鼠体内 MCF-7 乳腺癌肿瘤模型抑制效果明显优于对照组、CS注射组及 EGCG 注射组。由此可见，壳聚糖与 EGCG 偶联后对 MCF-7 乳腺癌肿瘤模型抑制作用明显优

于单体。

图 4 小鼠移植瘤模型实验实物图

Fig. 4 Nude mice transplanted tumor model experiment photos

2.3 FAM-siRNA 靶向标记 CS-EGCG 载药纳米微球的研究

采用纳米粒度电位分析仪对制备的 CS-EGCG 载药纳米微球与 FAM-siRNA 进行电位测试分析，如图 6

图 3 CS-EGCG 纳米粒子在 PBS 中的稳定性

Fig. 3 Stability of CS-EGCG nanoparticles in PBS

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所示。CS-EGCG 载药纳米微球电位为+46.3 mV，表面带正电，FAM-siRNA 表面带负电，因而两者可通

过静电吸附连接在一起。对制备的 FAM-siRNA_CS-EGCG 混合物进行细胞成像实验后，经荧光倒置显微

镜观察拍照（如图 7 所示）。FAM 是与 siRNA 相连接的一种绿色荧光基团，其激发波长为 480 nm，只

有转染成功的细胞才能看到 FAM 绿色荧光。在荧光倒置显微镜下选用蓝光激发，实验组细胞内明显可

见绿色荧光。由此可见，FAM-siRNA 修饰 CS-EGCG 载药纳米微球后能够成功地进入到细胞中，

FAM-siRNA 既起到了荧光标记的作用，又为日后开展与目的基因相匹配的 siRNA 介导载药微球研究提

供了实验基础。

图 7 FAM-siRNA 修饰的载药纳米微球细胞成像

Fig. 7 Cell imaging of FAM-siRNA modified drug loaded nanospheres

3 结论 本文制备了不同配比的 CS-EGCG 载药纳米微球，通过琼脂糖凝胶电泳实验及稳定性测试，证实壳

聚糖与 EGCG 成功偶联，以及该载药纳米微球在 PBS 环境下的良好稳定性。通过小鼠移植瘤模型实验得

图 5 CS-EGCG载药纳米微球对小鼠体内MCF-7 的肿瘤抑制率 Fig. 5 Inhibitory rate of CS-EGCG drug loaded nanospheres on

MCF-7 in nude mice

图 6 CS-EGCG 载药纳米微球与 FAM-siRNA 测试电位

Fig. 6 Zeta potential of CS-EGCG drug loaded nanospheres and FAM-siRNA

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出结论，制备的 CS-EGCG 载药纳米微球对 MCF-7 乳腺癌肿瘤模型具有明显抑制作用，且抑制效果优于

壳聚糖与 EGCG 单体。经 FAM-siRNA 对 CS-EGCG 载药纳米微球优化后，实现了对载药微球在细胞中

的荧光标记，并为其匹配目的基因做了铺垫。 [参考文献] (References)

[1] 张燕. 多功能性纳米载药系统的研究[D]. 天津：南开大学，2014.

ZHANG Y. Research on multifunctional drug delivery system[D]. Tianjin: Nankai University, 2014. (in Chinese)

[2] JANES K A, FRESNEAU M P, MARAZUELA A, et al. Chitosan nanoparticles as delivery systems for doxorubicin[J]. J.

Controlled Release, 2001, 73(2-3): 255-267.

[3] MITRA S, GAUR U, GHOSH P C. Tumour targeted delivery of encapsulated dextran-doxorubicin conjugate using chitosan

nanoparticles as carrier[J]. J. Controlled Release, 2001, 74(1-3): 317-323.

[4] CHUNG J E, TAN S S, GAO S J, et al. Self-assembled micellar nanocomplexes comprising green tea catechin derivatives and

protein drugs for cancer therapy[J]. Nature Nanotechnology, 2014, 9(11): 907-912.

[5] CHEN C, SHEN G X, HEBBAR V. Epigallocatechin-3-gallate-induced stress signals in HT-29 human colon adenocarcinoma

cells[J]. Carcinogensis, 2003, 24(8): 1369-1378.

[6] MITTAL A, PATE M S, WYLIE R C, et al. EGCG down-regulates telomerase in human breast carcinoma MCF-7 cells,

leading to suppression of cell viability and induction of apoptosis[J]. International Journal of Ooncology, 2004, 24(3):

703-710.

[7] LIU X P, WEN X L, ZOU S N, et al. Induction of apoptosis by epigallocatechin-3-gallate via activating mitochondrial

signaling in human gastric cancer cells[J]. Journal of Nanhua University (Medical Edition), 2007(4): 499-502.

[8] FANG Z X, CHENG D, LUO Z Y. EGCG inhibited the proliferation of liver canner HepG2 cells through NF-кB pathway[J].

Chinese Journal of Gastroenterology Hepatology, 2012, 21(3): 229-231.

[9] SEN T, MOULIK S, DUTTA A, et al. Multifunctional effect of epigallocatechin-3-gallate (EGCG) in downregulation of

gelatinase-A (MMP-2) in human breast cancer cell line MCF-7[J]. Life Sciences, 2009, 84(7-8): 194-204.

[10] SANG S, LAMBERT J D, YANG C S. Bioavailability and stability issues in understanding the cancer preventive effects of tea

polyphenols[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2006, 86(14): 2256-2265.