项目：生物工程下游技术综合性实验——柠檬酸的生产

子项目 1 产柠檬酸黑曲酶的菌种活化及种子培养

子项目 2 产柠檬酸黑曲酶发酵

子项目 3 柠檬酸的分离提取

子项目 4 柠檬酸的纯化（设计性实验）

1.教学目标

• 1.1 知识目标：• 1 ） 掌握柠檬酸发酵生产的原理• 2 ）掌握真菌深层液体发酵生产工艺• 3 ）掌握钙盐沉淀法提取柠檬酸的原理及方法• 4 ）熟悉柠檬酸的纯化方法

• 1.2 能力目标：• 1 ）综合运用所学专业知识完成一种生物技术产品

的生产。• 2 ）通过查询、收集、整理信息，制定出实验方

案，锻炼主动分析问题、解决问题的能力。• 3 ）提高团队协作能力。

• 2- 羟基丙烷 -1,2,3- 三羧酸• C6H8O7 192.14• 理化性质：白色结晶粉末，无臭，酸性强。熔点 153℃ ，沸点

175℃ 。溶于水、乙醇、丙酮，不溶于乙醚、苯，微溶于氯仿。

• 用途： 1 、食品行业（ 70% ）：酸性调味剂、防腐剂。• 2 、医药、化妆品（ 10% ）：药品合成的原料• 3 、化工（ 15% ）：原料，如其酯类做无毒增塑剂• 4 、其他（ 5% ）

2. 柠檬酸（ Citric acid)简介

• 生产情况：• 目前柠檬酸世界消耗量 120 万吨，年产能 160 万

吨。中国的年产能 80 万吨，是最大的柠檬酸生产国和出口国。

• 生产方法：• 水果提取法• 化学合成法• 发酵法（固态发酵法、液体浅盘发酵、深层通风

发酵）

3 柠檬酸生产的原理• 3.1 原料：理论上凡是能被微生物代谢并分泌积累大量柠

檬酸的物质都可作为柠檬酸的发酵原料，分糖质原料和石油烷烃原料。

糖蜜

葡萄糖

EMP3.2 柠檬酸发酵的原理

3.3 生产菌 黑曲霉 Aspergillus niger

真菌中的一个常见种，半知菌亚门，半知菌纲，壳霉目，杯霉科。是重要的发酵工业菌种，可生产淀粉酶、酸性蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、柠檬酸、葡糖酸和没食子酸等。 好氧菌，生长适温 37 ℃，无性繁殖，孢子在培养基中 6-8h 出芽，一个生活周期约 50h 。

乌头酸合成酶和异柠檬酸脱氢酶活性低，而柠檬酸合成酶的活性高，利于大量积累柠檬酸。

黑曲霉发酵的特点：

4.1 柠檬酸生产的工艺流程：

斜面 种子

原料 液化 发酵 压滤 柠檬酸钙 柠檬酸 纯化

空压机 空气净化系统

碳酸钙 硫酸

4 柠檬酸生产的过程

4.2 生产步骤• 4.2.1预备实验• 1 ）斜面培养基制备• 2 ）菌种活化：将长期保存的菌种接入斜面培养基活化培

养一次， 35℃ 培养 3~4天至长出大量黑色孢子。

• 4.2.2 种子制备• 1 ）种子培养基制备： 1-2%小麦粉糖化液， 0.2%硝酸铵， pH自然，三角瓶分装后于 121℃灭菌 30min 。

• 2 ）制备孢子悬液：向每支菌种斜面中加入 5 mL 无菌水，用接种环刮下孢子制成孢子悬液。

• 3 ）接种与发酵：将孢子悬液接入到已灭菌的种子培养基中，于 35℃ 、 250r.p.m ，发酵 3~5d 。

• 观察菌体生长情况，待溶度达 60-150 万 /mL ，菌丝球为致密形，直径 <0.1mm ，菌丝短粗，分支少，瘤状突出为优。

菌种活化

种子制备

发酵培养

柠檬酸提取

纯化

4.2 生产步骤

• 4.2.3 发酵培养• 1 ）空罐灭菌• 2 ）发酵培养基制备：小麦粉液化，营养盐添加，灭菌• 3 ）接种• 4 ）发酵参数设置• 5 ）发酵条件控制：温度 28-30 ℃ ，生物量 12-20% ，严防缺氧

菌种活化

种子制备

发酵培养

柠檬酸提取

纯化

• 思考题：

• 1 、为什么要在培养基中加铵盐？

• 2 、影响柠檬酸发酵的因素有哪些？

• 4.3影响柠檬酸发酵的因素• 1）通氧量与产酸量• 2）菌球形态 :小而致密、空心状• 3）无机盐：缺 Fe是柠檬酸生成的必要条件，且是在磷、锌、锰充裕下表现出。