1

Лекция 3:

•Репарация мтДНК

http://goo.gl/9acqtM

2

•За день в каждой клетке человека происходит 103-106 повреждений ДНК.

•В человеческом организме около ~1013 клеток.

•За сутки каждый из нас получает ~1017

повреждений ДНК.

3

С возрастом частота мутаций в мтДНК увеличивается примерно в 5 раз к 80ти годам.

PMID: 24086148

4

МтДНК мутирует быстрее ядерной

Почему?

•в митохондриях повышенное содержание ROS

• в митохондриях более слабый аппарат репарации

•в митохондриях менее точный аппарат репликации

5

В нормальной человеческой клетке:

0.3-4.2 8oxoG/106 G,

что соответствует

7.7х104 – 1х105 8oxoG

в одной клетке

Наиболее распространенные продукты окислительного стресса: 8охоG и 8охоА

6

Частота трансверсии G ->T практически не увеличивается с возрастом также как и все остальные трансверсий, в отличии от транзиций.

•Транзиция — одно пуриновое основание замещается на другое пуриновое (аденин на гуанин или наоборот), либо происходит аналогичная перестановка пиримидиновых оснований (тимин с цитозином). •Трансверсия — пуриновое основание замещается на пиримидиновое основание или наоборот.

Частота разных типов мутаций в мтДНК

PMID: 24086148

7

Количество мутаций в мтДНК увеличивается с возрастом не за счет образования 8охоG под

действием окислительного стресса.

8

В области D-loop мутаций больше, чем в остальном геноме.

Но относительное количество каждого типа мутаций одинаково по всему мт геному и не меняется с возрастом.

Видимо, уже при рождении мутаций в D-loop больше.

Как распределены мутации по мт

геному?

9

Замены

G ->A и Т ->С

чаще

происходят в

L-цепи, чем в

Н-цепи

по всему

мт-геному,

но не D-loop.

Как распределяются мутации по цепям мт ДНК?

10

Это можно объяснить асинхронной репликацией мтДНК: материнская Н-цепь остается в оц состоянии, когда с oriH идет синтез Н-цепи на матрице L-цепи.

В одноцепочечном состоянии в Н-цепи происходит спонтанное дезаминирование цитозина с образованием тимина и аденина с образованием гуанина.

11

За счет чего растет частота мутаций в митохондриях?

•Возникает спонатнное дезаминирование С и А особенно в одноцепочеченых участках ДНК в ходе репликации

•ДНК полимераза γ ошибается в репликации

•Возможно, 8охоG удаляется до репликации или его репарация усиливается с возрастом

12

Виды репарацииИзменение в одной цепи ДНК:

1. BER – base excision repair: замена измененного в результате окисления, алкилирования, гидролиза или дезаминирования азотистого основания

2. MMR – mismatch repair: удаление неспаренных нуклеотидов

3. NER – nucleotide excision repair: исправление нарушений правильной двуцепочечной структуры ДНК (например, пиримидиновых димеров)

13

1. NHEJ – non-homologous end joining: DNA ligase IV использует ближайшие выступающие концы ДНК для присоединения к месту разрыва и его сшивания. Этот процесс приводит к серьезным нарушениям в геноме

2. HR – homologous recombination: для восстановления структуры ДНК в качестве матрицы используются гомологичные хромосомы

Изменения в обеих цепях ДНК (Double-strand break repair):

14

PMID:20950654

15

Репарация митохондриальной ДНК.•BER – base excision repair

•MMR – mismatch repair

•NER – nucleotide excision repair

• NHEJ – non-homologous end joining

•HR – homologous recombination

PMID: 22138376

16

Base excision repair (BER) в митохондриях:

• SN (single nucleotide) or SP (short patch) BER

– заменяется 1 нуклеотид

• LP (long patch) BER

– заменяется 2-6 нуклеотидов

17

1. Специфичная ДНК-гликозилаза перемещает поврежденное основание ДНК

2. АP-эндонуклеаза (от apurinic or apyrimidinic site) расщепляет цепь ДНК, оставляя единичный разрыв, содержащий 5’-dRP-группу.

3. Вместо удаленного нуклеотида ДНК-полимераза вставляет новый (ые).

4. Лигаза зашивает цепь ДНК.

Base excision repair (BER) в митохондриях:PMID:20950654

18

•SN BER: 5’-dRP- группа удаляется, а gap заполняет DNA pol γ, затем сшивает DNA ligase IIIСкорость dRP-лиазной реакции у DNA pol γ ниже, чем у DNA pol β, осуществляющей BER в ядре.

•LP BER проходит в экстрактах митохондрий в присутствии белков:•Хеликаза DNA2 процессирует расширяющуюся flap-структуру•Flap endonuclease FEN1 удаляет flap-структуру, замененную DNA pol γ •Ligase III сшивает разрыв

19

Основные виды повреждений азотистых оснований:

•Окисление

•Алкилирование

•Дезаминирование

20

Base excision repair (BER) в митохондриях:

Поврежденные азотистые основания удаляются

специфичными гликозилазами

21

Основные продукты окисления азотистых оснований

22

В нормальной человеческой клетке:

0.3-4.2 8oxoG/106 G,

что соответствует

7.7х104 – 1х105 8oxoG

в одной клетке

Наиболее распространенные продукты окислительного стресса: 8охоG и 8охоА

23

Репарацию 8oxoG осуществляет гликозилаза OGG1 (MutM у бактерий).

Альтернативный сплайсинг мРНК hOGG1 дает несколько изоформ фермента, в том числе и митохондриальную.

В ядре есть другие ферменты для репарации 8oxoG, в митохондрии их нет:•В экстрактах митохондрий из ogg1-/- мышей in vitro не вырезается 8oxoG.• У ogg1-/- мышей в ядре содержание 8oxoG увеличивается не сильно, в митохондриях гораздо сильнее.

MYH (MutY у бактерий) перемещает аденин или гуанин, ошибочно вставленные при репликации во вторую цепь ДНК напротив 8oxoG.

Альтернативный сплайсинг дает ядерную и митохондриальную изоформы MYH.

24

Образование тимингликоля из тимина под действием окислительного стресса

блокирует работу РНК- и ДНК-полимеразы

25

Тимингликоль удаляется тимингликоль-гликозилазой.

У дрожжей её кодируют два гена: NTG1 и NTG2. У NTG1 двойная локализация – в ядре и в митохондриях, а NTG2 образует ядерную изоформу.

PMID:10207101

26

Совместно с NTG1 в дрожжевых митохондриях при BER-репарации работает хеликаза PIF1.

Совместное потеря генов NTG1, PIF1 и SOD (супероксиддисмутаза) приводит к потере мтДНК.

Это доказывает, что повреждения от окислительный стресса вносят основной вклад в геномную нестабильность митохондриального генома дрожжей.

PMID:15923634

27

Для тимингликоль-гликозилазы Млекопитающих hNTHL1 данные противоречивы:

•по одним данным она локализована в ядре и митохондриях, по другим – только в ядре.

•удаление тимингликоля не происходит в митохондриях из клеток мышей nth-/-, но в то же время другой группой показано удаление тимингликоля в экстрактах митохондрий мышей nth-/-.

28

Продукты дезаминирования

29

Сущестуют ядерная и митохондриальная формы урацил-ДНК-гликозилазы. Они образуются с двух разных промоторов одного

гена и в результате альтернативного сплайсинга.

У дрожжей одна изоформа этого фермента, в нем есть сигналы как ядерной, так и митохондриальной локализации.

Удаление урацила, образованного при дезаминировании цитозина,

осуществляет урацил-ДНК-гликозилаза

UNG2 UNG1 PMID:9016624

30

Наиболее распространенные продукты алкилирования: О-4-alkylT О-6-alkylG

31

Алкилированные основания удаляет

N-methylpurine-DNA-glycosylase (MPG или AAG – от alkyladenine-DNA-glycosylase или 3-

methyladenine-DNA-glycosylase).

Этот фермент не обнаружен в митохондриях, но в митохондриях репарируются повреждения, обычно служащие

субстратами этого фермента.

32

Base excision repair (BER) в митохондриях:АР эндонуклеазы

Основная АР эндонуклеаза Млекопитающих АРЕХ1 локализована как в ядре, так и в митохондриях. Митохондриальная форма короче ядерной. Есть и другая АР эндонуклеаза АРЕ2, частично транспортируемая в митохондрии, но её каталитическая активность низка, функции требуют дальнейшего изучения.

У дрожжей основная эндонуклеаза Apn1 на N-конце имеет митохондриальную адресную последовательность и сигнал ядерной локализации на C-конце. Apn1 транспортируется в митохондрии, взаимодействуя с Pir1 – белком клеточной стенки дрожжей. Pir1 конкурирует с ядерными белками за связывание с сигналом ядерной организации, что позволяет части Apn1 импортироваться в митохондрии.

33

Base excision repair (BER) в митохондриях:застраивание бреши и лигирование

АР эндонуклеаза освобождает OH-группу на 3’-конце бреши, но механизм дальнейшей репарации зависит того, какая группа расположена на 5’-конце.

В митохондриях застраивание бреши осуществляет ДНКполимераза γ, у неё есть и полимеразная и лиазная активность, но последняя слабее, чем у DNA pol β, осуществляющей BER в ядре.

34

В случае, если АР эндонуклеаза и ДНК-полимераза может оставить на 5’-конце фосфат, репарация идет по механизму short patch BER – вставляется только один нуклеотид.

В случае, если продукт вырезания устойчив к лиазной активности ДНК-полимеразы (например, при образовании 2-deoxyribonolactone) - репарация идет по механизму long patch BER – вставляется 2-6 нуклеотидов.

35

Base excision repair (BER) в митохондриях:PMID:20950654

Считается, что в long patch BER в митохондриях участвуют FEN1 и хеликаза DNA2.

Последняя стадия BER-репарации – лигирование. В митохондриях человека лигирование проводит DNA ligase 3 (LIG3). У дрожжей в митохондриях работает LIG1.

36

•ROS, образованные вне митохондрии или в результате утечки электронов из ЭТЦ повреждают свободные dNTP и мтДНК. •Сигнал о повреждении поступает в цитозоль, белки системы репарации транспортируются в митохондрию (возможно, за счет посттрансляционных модификаций). •Передача сигнала о повреждении мтДНК может дополняться передачей сигнала о повреждении ядерной ДНК для перераспределения факторов репарации. Происходит изменение локализации OGG1, UNG1 и NTH1 и дрожжевого NTG1.

Регуляция BER

Зеленым выделены главные факторы репарации; дополнительные факторы – желтым и фиолетовым; ДНК связывающие белки выделены серым.

PMID:20950654PMID:20950654

37

•Уничтожение окисленных dNTPs (I)

•Short-patch BER (II)

•Long patch BER (III)

•Регуляция репарационных процессов (IV-V)

Зеленым выделены главные факторы репарации; дополнительные факторы – желтым и фиолетовым; ДНК связывающие белки выделены серым.

Основные пути репарации в митохондриях:

38

ROS

Factors from cytoplasmTFAM участвует в

репарации мтДНК. TFAM связывается с поврежденной ДНК прочнее, чем с интактной. У TFAM аффинность к ДНК, содержащей 8-охоG, выше, чем у гликозилаз OGG1 и MYH.

Клетки, устойчивые к циспластину (алкилирующий агент), гиперэксперессируют TFAM и TRX2 (тиоредоксин 2).

TFAM связывается с р53, который тоже может регулировать его связывание с ДНК в зависимости от вида повреждения.3’-5’ экзонуклеазная активность р53 может удалять 8-охоG на 3’-конце, эта реакция усиливается SSB.

39

1. В митохондриях происходит репарация BER двух типов:

• SP (short patch) BER • LP (long patch) BER

2. Основные стадии BER:• Гликозилаза удаляет поврежденное азотистое основание• АР-эндонуклеаза освобождает 3’-конец бреши• В зависимости от группы на 5’-конце бреши ДНК полимераза

ɣ застраивает брешь одним (SP BER) или несколькими (LP BER) нуклеотидами.

• FEN1 и DNA2 участвуют в LP BER• LIG 3 зашивает разрыв

3. Существует регуляция BER в митохондриях:• Многие ферменты переходят в митохондрии в ответ на

сигналы о повреждениях• В репарации BER участвуют TFAM и p53

40

MMR – mismatch repair

Удаление несоответствий и небольших петель. Эффективность невысокая, т.к. не всегда происходит верный выбор материнской цепи, что приводит к мутациям. Удаление несоответствий - некомплементарных пар G:T и G:G показано в лизатах митохондрий млекопитающих.

Одним из основных факторов MMR в ядре служит YB-1, предполагается, что он является ключевым компонентом MMR и в митохондриях.

41

YB-1 в отличие от остальных участников ядерной MMR (MSH1, MSH3, MSH6) частично локализован в митохондриях.

В митохондриальных экстрактах из клеток с отсутствием MSH2 наблюдается MMR => механизм MMR в митохондриях отличается от ядерного.

MMR в экстрактах митохондрий снижается при уменьшении уровня YB-1 (нокдаун siRNA).

PMID:19272840

42

•Вопрос о наличии MMR в митохондриях остается открытым.

•BER тоже может репарировать несоответствия.

• Существует предположение, что MMR необходима для удаления маленьких петель в большей степени, чем несоответствий в парах нуклеотидах.

43

Double-strand break repair

Есть доказательства наличия в митохондриях обоих механизмов: NHEJ (non-homologous end joining) и HR (homologous recombination).

RAD51 – основной фермент HR в ядре – локализован также в человеческих митохондриях

:

44

Rad 51 переходит в митохондрии в ответ на окислительный стресс.

Для перехода Rad 51 необходима репликация.

PMID:23591384

45

Direct repair (без разрезания фосфодиэфирной связи)

Повреждения ДНК УФ излучением в ядре репарирует фотолиаза, её активность не показана в митохондриях Млекопитающих. У дрожжей фотолиаза работает в митохондриях.

O6-methylguanine-DNA methyltransferase (MGMT) – основной фермент прямого репарирования алкилированных оснований в ядерной ДНК. Есть данные, что MGM присутствует в митохондриях, но может репарировать только метилированные и этилированные основания.

46

NER – nucleotide excision repair

Считается, что этот механизм отсутствует в митохондриях.

•В митохондриях дрожжей индуцированные УФ пиримидиновые димеры репарируются эндонуклеазой Rad2. Этот механизм UVER (UV excision repair) одновременно похож и на BER, и на NER.

•Белки, участвующие в ядерной NER CSA (от Cockayne Syndrome) и CSB обнаруживаются в митохондриях Млекопитающих в условиях окислительного стресса. Они связываются с мтДНК и компонентами BER.

Возможно, в митохондриях есть отличный от ядра механизм NER, который еще будет исследован.

47

•В митохондриях происходит репарация двух типов: •BER – base excision repair•MMR – mismatch repair

2. В митохондриях отсутствует NER – nucleotide excision repair

3. Наличие репарации при двуцепочеченых повреждениях мтДНК не изучено, но Rad 51 поступает в митохондрии в условиях окислительного стресса и участвует в репликации.

48

•CSB (от Cockayne Syndrome) рекрутирует факторы BER к мембране;

•CSA and CSB взаимодействуют с SSB и гликозилазой;

•p53 стимулирует гликозилазу и POLγ;

•PARP-1 модулирует BER.

Регуляция и топология репарации в митохондриях

PARP1 – Poly (ADP-ribose) polymerase – ключевой ядерный фермент репарации однонитевых разрывов. Такие разрывы образуются при BER, поэтому PARP1 влияет и на BER.PARP1 локализована в митохондрии и участвует в поддержании целостности мтДНК. PARP1 входит в комплекс, включающий мтДНК и лигазу 3.

49

Мт ДНК связана с внутренней мембраной. Один из белков, связывающих ДНК с мембраной – М19, вероятно, участвуют также РНВ1 (prohibitin1) и ATAD3 (белок внутренней мембраны, ответственный за перемещения D-loop).

Большинство компонентов BER связаны с внутренней мембраной (кроме АР-эндонуклеазы). Но стабильного комплекса компоненты BER не образуют. Есть данные, что CSB вовлечен в сборку и сохранение комплекса мтДНК и компонентов BER: он связывает SSB и OGG1 в один комплекс с мтДНК.

50

Есть две модели:

•мтДНК мобильна и проходит через комплексы, расположенные на внутренней мембране, для репликации, репарации и. т. д.

•мтДНК заякорена на внутренней мембране.

51

Регуляция репарации мтДНКМт изоформы многих ферментов мт репарации образуются с помощью альтернативного сплайсинга, а, значит, возможна посттранскрипционная регуляция.

Есть данные по NTG1 и NTG2 дрожжей. NTG1 динамично перераспределяется между ядром и митохондриями при окислительном стрессе. Переход NTG1 в митохондрии зависит от окислительных повреждений, но не от уровня ROS. Значит, есть специфичные сигналы об этих повреждениях, исходящие из митохондрий.

Некоторые белки с двойной ядерной и митохондриальной локализацией обнаруживаются в митохондриях только в условиях окислительного стресса: Rad51, APEX1, CSA и CSB.

Многие белки имеют сигналы как ядерной, так и митохондриальной локализации: NTG1, UNG1, APE1 у дрожжей и hOGG1a, hNTHL1 у Млекопитающих. Возможно, механизм, показанный для NTG1, является общим.

Окислительный стресс вызывает переход р53 в митохондрии.