实验 0Y 果蝇遗传标记分析 -PAPD

一、实验目的：1. 掌握 RAPD 分析基本方法技术 ;2. 了解分子标记的重要应用价值 .

二、主要内容：基因 DNA 提取 PCR 反应 电泳 电泳图谱的观察、分析

助教： 助教： 郑莹郑莹

三、实验原理 :RAPD: 建立在 PCR 基础上的一种分子标记。模板高温变性→足够低的温度下（通常为 36℃ ）与随机引物（一般 10 个 bp ）退火→ PCR → 电泳如果两个退火位点足够近（ 200-2000bp 左右）、分别位于互补的 DNA 链上，可以通过 PCR 扩增出 DNA 片段。

引物结合位点 DNA 序列的改变以及两扩增位点之间 DNA 碱基的缺失、插入或置换均可导致扩增片段数目和长度的差异，经电泳分离后通过 EB 染色以检测DNA 片段的多态性。

若位点 2 处碱基发生改变，则

四、实验材料 - 步骤 :

（ 1 ） D.Virilis ------------10 只 （ 2 ）黑腹果蝇 --P♀ 、 P♂ 、 F1♀ 、 F1♂ 、 F2♀ 、 F2♂ 各 40 只 （ 3 ）其他材料 -- 0.2g

1 份（ 7 种果蝇样品 +1 种其他） / 小组

（ 1 ）、（ 2 ）的 P 、（ 3 ）由教师提供，（ 2 ） F1 、 F2 用自己存的材料。

已经制备匀浆液 ,一半已经用于同工酶实验

制备 DNA 粗提液：每份材料（普通果蝇 40 只、大果蝇 10 只、或其他材料 0.2g ）

+400μL 匀浆缓冲液匀浆

匀浆液 200μL 匀浆液 200μL 用于 RAPD 实验提取 DNA

（冰浴操作）

液体倒入 1.5ml 离心管

+22μL SDS 、 2μL的蛋白酶 K

翻转混匀（动作要轻）→ 55℃ 水浴 >2h → 存 -20℃

用于同工酶实验已完成

第一周做到此步

一周后的实验课及课余时间 :

-20℃ 中取出的样品+RNA 酶至 200μg/mL ， 37 0.5~1h℃

等 V 酚 / 氯仿 / 异戊醇（ 25 24 1﹕ ﹕ ）抽提 ( 慢慢旋转混匀，倾斜使两相接触面增大 )

冰浴 10min 4 12000rpm ℃ 离心 5min 1.5ml 新 EP

上清（水相）至

等 V 氯仿 / 异戊醇（ 24 1﹕ ），轻混匀 冰浴 10min 4 12000rpm ℃ ， 5min

1.5ml 新 EP 上清（水相）至

等 V 异丙醇，轻轻混匀 白色线团状物 4 12000rpm ℃ ， 5min

弃上清

为省时老师代做此步

70% 酒精洗涤 4 12000rpm ℃ ， 5min弃上清

+100μl TE 溶解

室温干燥（不要太干，否则 DNA 不易溶解）0.6%Agarose 电泳检测 DNA质量 (免 )

2. RAPD 反应1‘．在 0.2ml PCR 管中配制 25μl 反应体系

（ 2次）

随机引物 1μl dNTP Mixture 2μl Taq 酶 0.2μl 10×PCR buffer 2.5μl

ddH2O up to 24μl

全班一人负责配齐（此配方 ×64 ，见下页）

每桌一人领取 16 份样品所需量平均配给两组 各组等分 8 份

分别加 8 种样品的模板 DNA 各 1μl

随机引物 64μl dNTP Mixture 128μl Taq 酶 12.8μl 10×PCR buffer 160μl

ddH2O up to 1536μl （即 1.536 mL ）

反应体系 64倍量（除模板外）：

2’．在 PCR热循环仪中进行如下反应： 94 200s→ 94 60s→36 60s→72 120s ℃ ℃ ℃ ℃

40 个循环→72 (300s--600s)℃

尽量成批与老师约时间

3．电泳 2%琼脂糖凝胶电泳，观察比较不同品系或同一品系亲子代间的条带的不同，并照相记录。

操作分工技术问题注意事项

助教指导：

实验作业（写在实验记录本上）： 1. 简述 RAPD 的实验原理、解决的问题； 2.将你的实验结果画（剪贴）在记录本上，标出

样品名称、差异条带等；你的实验结论是什么？

补充知识（课后阅读）：RAPDRFLPAFLPSTRSNP

利用利用 1010 个碱基的一个或几个随机引个碱基的一个或几个随机引物非定点地扩增物非定点地扩增 DNADNA 片段，一般一片段，一般一个引物可扩增个引物可扩增 6-126-12 条条 DNADNA 片段，利片段，利用凝胶电泳分开扩增的片段，从而进用凝胶电泳分开扩增的片段，从而进行基因多态性研究。行基因多态性研究。RAPDRAPD 是一种能快速进行基因多态性是一种能快速进行基因多态性研究的技术，并且由于不涉及印迹杂研究的技术，并且由于不涉及印迹杂交、放射性自显影等技术，因此简便交、放射性自显影等技术，因此简便易行。易行。

RAPDRAPD

RAPD

RAPD

是英文是英文 Restriction Fregrmeat Length Po1ymor— PhismRestriction Fregrmeat Length Po1ymor— Phism的缩写，意思是“限制性片段长度多态性”。的缩写，意思是“限制性片段长度多态性”。RFLPRFLP 是根据不同品种（个体）基因组的限制性内切酶的酶是根据不同品种（个体）基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变，或酶切位点之间发生了碱基的插入、切位点碱基发生突变，或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失，导致酶切片段大小发生了变化，这种变化可以通过缺失，导致酶切片段大小发生了变化，这种变化可以通过特定探针杂交进行检测，从而可比较不同品种（个体）的特定探针杂交进行检测，从而可比较不同品种（个体）的 DDNANA 水平的差异（即多态性），多个探针的比较可以确立生水平的差异（即多态性），多个探针的比较可以确立生物的进化和分类关系。物的进化和分类关系。所用的探针为来源于同种或不同种基因组所用的探针为来源于同种或不同种基因组 DNADNA 的克隆，位的克隆，位于染色体的不同位点，从而可以作为一种分子标记于染色体的不同位点，从而可以作为一种分子标记 (Mark)(Mark) ，，构建分子图谱。构建分子图谱。

RFLPRFLP

9

限制性片段长度多态性RFLPs ( restriction fragment length polymorphisms)

1987年，第一张较完整的人基因连锁图，500多个RELP 位点，定位了Huntington病，CF（囊性纤维化）和癌相关基因（APC，DCC 等）

RFLP

RFLP

AFLP:

Amplified Fragment Length Polymorphism. AFLP technology combines the power of Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) with the flexibility and power of PCR.

AFLPAFLP

扩增片段多态性

“AFLP”续：由于变异、进化，一种引物可以使某一品系的 DNA 片段复制（扩增），而不能使另一品系的 DNA 片段复制（扩增）。电泳分离：同一引物扩增

品系 1 品系 2

引物如：EcoRI和MseI相关引物

荧光标记全自动AFLP原理与方法

For ABI 377 DNA Sequencer and AFLP Kits

AFLPAFLP

短串联重复序列STRs (short tendem repeats, mini-satellites )

STR广泛存在于人基因组，占约 5% ，基本单位是 1bp-8bp 的串联重复，重复次数 n=15-60 ，已知 8000 多个，主要形式为： (CA)n ， (GA)n ， (AA)n ， (GG)n ， (CAA)n ， (CGG)n ，其中以 (CA)n ， (GT)n 为多见。1992年， Welssenbanch 等以 STR 为标记的第二代连锁图取代了 RFLP连锁图。

可变数目串联重复序列VNTRs (variable number tandem repeats)

每个 VNTR 都含有 10-15 bp核心序列，VNTR 与 STR比较类似，但是重复顺序更长；多态性及分布方面不如 STR ，因而 VNTR 作为遗传标记只是一种过渡，目前已较少使用，但是， VNTR曾经对 STR 的基因定位运用起到推动作用。

定义：不同个体间，基因组 DNA某部位的 单核苷酸的变异。 1996年， Lander报道了用单核苷酸多态性标记（ single nucleotid polymorphism SNP ）制备第三代遗传连锁图的遗传标记。

可通过杂交、序列分析、电泳等检测。

单核苷酸多态性（ single nucleotid polymorphism ， SNP ）

1 ， The most abundant DNA marker present in the human genome ， about 90% of sequences variants in human are SNP. There is one SNP in every 1000 bases leads to an estimate that any two individuals differ by up to three million SNPs. 2 ， A few hundred thousand are currently identified, but 17 million of SNPs out of 3 billion are estimated.3, SNPs in coding regions of genes have been termed cSNPs, about 500,000 of cSNPs and an average of about 6 per gene.

Frequency of SNP in Human Genome

1, Neutral alteration: a base substitution with no effect on the amino acid residue encoded.2, Conservative change: a base substitution that results in an altered amino acid, but has minimal effect on protein structure or function.3, Non-conservative alteration: leading to a change in the encoded amino acid residue that has dramatic effects on protein structure or function.

The Functional Effects of cSNPs

Major changes in protein structure can result from subtle variation in the genetic sequence encoding it. These changes can completely block the function of the protein in vivo and can also affect the development of high-throughput( 高通亮 ) assays for screening therapeutic compounds.