Vergelijking Hendrickx zonale centrifuge met de Oostenbrink spoelmethode aangevuld met wattenfilter incubatie.

T.G. van Beers, G.W. Korthals, C.H. Schomaker, T.H. Been

Praktijkonderzoek Plant & Omgeving B.V. Sector Akkerbouw, Groene ruimte en Vollegrondsgroente januari 2004 PPO AGV

2

© 2004 Wageningen, Praktijkonderzoek Plant & Omgeving B.V. Alle rechten voorbehouden. Niets uit deze uitgave mag worden verveelvoudigd, opgeslagen in een geautomatiseerd gegevensbestand, of openbaar gemaakt, in enige vorm of op enige wijze, hetzij elektronisch, mechanisch, door fotokopieën, opnamen of enige andere manier zonder voorafgaande schriftelijke toestemming van Praktijkonderzoek Plant & Omgeving. Praktijkonderzoek Plant & Omgeving B.V. is niet aansprakelijk voor eventuele schadelijke gevolgen die kunnen ontstaan bij gebruik van gegevens uit deze uitgave.

Dit is een vertrouwelijk document, uitsluitend bedoeld voor intern gebruik binnen PPO dan wel met toestemming door derden. Niets uit dit document mag worden gebruikt, vermenigvuldigd of verspreid voor extern gebruik. Dit onderzoek is onderdeel van project 520103 van DWK 397 I; project 15 Nieuwe kwantitatieve opsporings7 en monitoringstrategieën voor de plantparasitaire quarantaine organismen Meloidogyne chitwoodi en/of M. fallax.

Praktijkonderzoek Plant & Omgeving B.V. Sector Akkerbouw, Groene ruimte en Vollegrondsgroente Adres : Edelhertweg 1 Lelystad : Postbus 430, 8200 AK Lelystad Tel. : 0320 7 291111 Fax : 0320 7 230479 E7mail : info.ppo@wur.nl Internet : www.ppo.dlo.nl

3

Inhoudsopgave pagina

1 INLEIDING: ................................................................................................................................... 4

2 OPZET ......................................................................................................................................... 5

3 RESULTATEN METHODISCH .......................................................................................................... 6 3.1 Resultaten Meloidogyne.......................................................................................................... 6 3.1.1 Spoelen............................................................................................................................. 6 3.1.2 Incubatie............................................................................................................................ 7 3.1.3 Totaal................................................................................................................................ 7

3.2 Resultaten Pratylenchus penetrans.......................................................................................... 8 3.2.1 Spoelen............................................................................................................................. 8 3.2.2 Incuberen .......................................................................................................................... 8 3.2.3 Totaal................................................................................................................................ 9

4 VARIANTIE7ANALYSE LABORATORIUM PROCEDURES ..................................................................... 10 4.1 Zonale centrifuge................................................................................................................. 11 4.1.1 Tellingen minerale fraktie. ................................................................................................. 11 4.1.2 Tellingen organische fraktie............................................................................................... 12

4.2 Oostenbrink methode........................................................................................................... 13 4.2.1 Tellingen minerale fractie. ................................................................................................. 13 4.2.2 Tellingen organische fraktie............................................................................................... 14

5 CONCLUSIE/ DISCUSSIE ............................................................................................................. 14

6 LITERATUUR............................................................................................................................... 15

4

1 Inleiding:

De huidige standaard methode voor de extractie van Meloidogyne spp uit grondmonsters bestaat uit het opspoelen van de aaltjes uit de minerale fractie (de gezeefde grond) met behulp van de Oostenbrink spoelkan, eventueel aangevuld met een 2 7 4 weken durende incubatie van de uitgezeefde, organische fractie, die op de topzeef (180µm) van de spoelkan achterblijft. De aaltjes (in het geval van Meloidogyne zijn dit eipakketten) die zich in het organische materiaal (wortelresten e.d.) bevinden zullen zich tijdens het incuberen op een wattenfilter (of in de mistkast) verder ontwikkelen. Uiteindelijk zullen deze aaltjes zich uit het wortelmateriaal bewegen en in de watersuspensie onder het filter terechtkomen. Deze suspensie wordt regelmatig afgetapt en de aaltjes erin worden dan geteld. Deze traditionele extractie7 en aanvullende incubatie7 technieken hebben als nadeel dat het totale tijdsbestek van monstername tot uitslag vrij lang is. Het incuberen duurt minimaal twee weken en ook het spoelmonster moet 48 uur worden geincubeerd voordat er geteld kan worden. Dit is vooral voor commerciële bemonsteringsinstanties een nadeel omdat de teler vaak snel een uitslag nodig heeft. De zonale centrifuge techniek zou hierin een aanzienlijke versnelling kunnen opleveren. Voorwaarde hierbij is dat de absolute opbrengst van de zonale centrifuge methode en de spreiding van de resultaten op een vergelijkbaar niveau liggen als van de traditionele methoden. Bijvoorbeeld het blenderen van de organische fractie vóórdat deze wordt gecentrifugeerd zou een potentiële bron van aaltjesverliezen kunnen zijn. In eerste instantie is deze methodiek vergelijking opgezet voor grond met daarin Meloidogyne chitwoodi aaltjes. De zonale centrifuge methode is de standaard in het laboratorium van het CLO te Merelbeke en heeft zijn nut reeds bewezen. De beide methoden, zonaal en Oostenbrink, zijn afzonderlijk wel getoetst (Verschoor & de Goede, 2000) en Chen et al (2000). Het is echter de vraag of de gevonden aaltjesniveaus vergelijkbaar zijn met de methoden zoals die in Nederland gebruikt worden; met andere woorden is een uitslag onafhankelijk van de gebruikte methode. Vergelijking van de prestaties van beide apparaten met dezelfde bodemmonsters moet daarom uitsluitsel bieden.

Onze bijzondere dank gaat uit naar Gerard Hendrickx voor het beschikbaar stellen van de protocollen van het door hem gebouwde prototype, en het beantwoorden van onze praktische vragen gedurende het uitvoeren van de proef. Onze bijzondere dank gaat ook uit naar Anton van der Sommen en Loes de Nijs van de Plantenziektenkundige Dienst in Wageningen voor het tellen van aaltjessuspensies.

5

2 Opzet

Gebruikte grondsoorten: Omdat het geen meerwerk oplevert en het voor de vraagstelling wel belangrijk is, is gekozen voor gronden waarin behalve Meloidogyne chitwoodi ook Pratylenchus spp voorkomt.

• Zandgrond (herkomst ”Melo Dream” proefveld Smakt, voorvrucht: aardappelen) • Dalgrond (herkomst proefveld populatieonderzoek Kooyenburg voorvrucht: waspeen)

Er is gemonsterd in oktober. Per veld is een bulkmonster van ongeveer 10 kg verzameld. Dit monster is goed gemengd waarna 20 deelmonsters zijn genomen: 10 van 100cc voor de Oostenbrink trechter en 10 deelmonsters van 200cc voor de zonale centrifuge. Deze deelmonsters zijn door het PPO7AGV verwerkt tot de suspensies voor telling. De suspensies werden verdeeld over PD en PPO7AGV. Van de 10 herhalingen werden per grondsoort, methode en fractie 5 door de PD en 5 door PPO7AGV geteld. Methoden: Traditioneel en met zonale centrifuge Zonale centrifuge: Deelmonsters van 200ml worden over een zeef van 180µm gespoeld. De minerale

fractie gaat rechtstreeks de zonale centrifuge in. Instellingen: alvorens 50 %

opzuigen; roeren 1,5 minuut op 900rpm, MgSO4=1,20sg, kalolin=20 gram/liter. De organische fractie wordt eerst 30 sec geblenderd (op stand lo 19000rpm) en gaat vervolgens ook de zonale centrifuge in. Dit zijn dus per deelmonster twee centrifuge monsters. Deze monsters worden ook apart geteld. Volume van de monsters noteren en hieruit 2 * 10ml tellen.

Traditioneel: 100ml grond volgens de Oostenbrink spoelmethode aangevuld met 4 weken wattenfilter incubatie. De uitvoering van alle methoden wordt op het PAV gedaan. De spoel en incubatiefractie wordt ook bij de traditionele methode apart geteld.

Tabel 1: Overzicht telmonsters test zonale centrifuge

Methode Dalgrond Zandgrond

Oostenbrink spoelen 10 10

Wattenfilter incubatie 10 10

Spoelfractie centrifugeren 10 10

Incubatiefractie blenderen en centrifugeren 10 10

6

3 Resultaten methodisch

Er zijn een aantal praktische punten waar tijdens het werken met de Hendrickx zonale centrifuge tegen

aangelopen is. Het is niet eenvoudig om een deelmonster van 200ml met een beperkte (het uiteindelijke

monster dat de centrifuge ingaat mag niet meer dan 1 liter zijn) hoeveelheid water volledig over een topzeef

van 180 µm te spoelen. Bij de traditionele Oostenbrink methode wordt wel 2 á 3 liter gebruikt om een

monster van 100ml door te spoelen.

De uiteindelijke suspensie die verkregen wordt met de Hendrickx zonale centrifuge bleek troebel te zijn wat het tellen bemoeilijkte. Mondeling overleg met G. Hendrickx heeft genoeg aanknopingspunten opgeleverd (hogere concentratie kaolin) om hier een en ander aan te kunnen verbeteren.

3.1 Resultaten Meloidogyne

In onderstaande tabellen staan de resultaten van de proeven. De analyses zijn met behulp van Genstat

uitgevoerd. Naar aanleiding van het draaien van de procedure 'BOXCOX’ is besloten de data

getransformeerd (10LOG) te analyseren. In de tabellen is de mediaan weergegeven en zowel de

variatiecoëfficiënt van de afzonderlijke waarneming als die van de mediaan.

3.1.1 Spoelen

Tabel 2: Mediaan van het aantal Meloidogyne aaltjes in de spoelfractie per 100ml grond. Fprob <0,001

Methode Dalgrond (VarCoef. waarn / gem) Zandgrond (VarCoef. Waarn / gem)

Oostenbrink spoelen 139 44.50 / 14.07 293 23.07 / 7.29

Spoelfractie centrifugeren 504 44.58 / 14.10 440 26.07 / 8.25

Voor beide grondsoorten worden er bij het spoelen significant meer aaltjes gevonden met de zonale

centrifuge. Over beide grondsoorten heen is er een significant verschil tussen de Oostenbrink methode en

de zonale centrifuge gevonden (Fprob van <0.001) ten voordele van de zonale centrifuge. Gemiddeld

Oostenbrink 202 per 100ml grond en voor zonaal gemiddeld 471.

7

3.1.2 Incubatie

Tabel 3: Mediaan van het aantal Meloidogyne aaltjes in de incubatiefractie per 100ml grond. Fprob 0.023

Methode Dalgrond (VarCoef. waarn / gem) Zandgrond (VarCoef. Waarn / gem)

Wattenfilter incubatie 364 47.62 / 15.06 593 85.36 / 26.99

Incubatiefractie blenderen en centrifugeren

332 24.59 / 7.78 220 42.57 / 13.46

Voor dalgrond zijn er voor de incubatie geen significante verschillen tussen de Oostenbrink methode en de zonale centrifuge. Voor zandgrond worden er significant meer aaltjes gevonden met de Oostenbrink methode. Bij de analyse over beide grondsoorten heen is er voor de incubatie ook een significant effect voor de behandeling (Oostenbrink of zonaal) met een Fprob van 0,007 ten gunste van de Oostenbrink methode. Gemiddeld Oostenbrink 465 per 100ml grond en voor zonaal gemiddeld 270 per 100ml grond.

3.1.3 Totaal

Tabel 4: Mediaan van het aantal Meloidogyne aaltjes totaal per 100ml grond. Fprob 0,003

Methode Dalgrond (VarCoef. waarn / gem) Zandgrond (VarCoef. Waarn / gem)

Totaal Oostenbrink 518 37.65 / 11.91 955 64.23 / 20.31

Totaal zonale centrifuge 855 29.42 / 9.30 677 25.19 / 7.97

Voor de analyse over het totale aantal aaltjes in de monsters bestaat er voor dalgrond een significant verschil tussen de Oostenbrink methode en de zonaal ten voordele van de laatste methode. Voor zandgrond zijn er geen significante verschillen tussen de Oostenbrink methode en de zonale centrifuge ondanks het grote numerieke verschil tussen de twee medianen. Dit is het gevolg van de grote variatie tussen de afzonderlijke waarnemingen die bij beide methoden opgetreden is. Bij de analyse over de gepoolde dataset van beide grondsoorten is geen significant effect voor de behandeling gevonden (Fprob van 0,566). Gemiddeld werden er met de Oostenbrink methode 704 per 100ml grond en voor zonaal gemiddeld 761 per 100ml grond gevonden. Er is dus geen aantoonbaar verschil tussen de Oostenbrink methode of zonale centrifuge in het aantal aaltjes dat wordt geextraheerd.

8

3.2 Resultaten Pratylenchus penetrans

In onderstaande tabellen staan de resultaten van de gegevensverwerking over de gevonden aantallen Pratylenchus penetrans. De analyses zijn met behulp van Genstat uitgevoerd. Naar aanleiding van het draaien van de procedure ‘BOXCOX’ is besloten de data ongetransformeerd te analyseren. In de tabellen is het gemiddelde weergegeven en zowel de variatiecoëfficiënt van de afzonderlijke waarneming als die van het gemiddelde.

3.2.1 Spoelen

Tabel 5: Aantal P. penetrans gemiddeld in het spoelmonster per 100ml grond

Methode Dalgrond (VarCoef. waarn / gem) Zandgrond (VarCoef. Waarn / gem)

Oostenbrink spoelen + 58 42.46 / 13.48 82 42.26 / 13.37

Spoelfractie centrifugeren 139 40.78 / 12.90 69 74.63 / 23.60

lsd 40 40 Uit tabel 5 blijkt dat voor dalgrond middels de zonale centrifuge significant meer P. penetrans gevonden worden (fprob 0,002). Voor zandgrond is dit verschil er niet. Bij de analyse over beide grondsoorten heen is er een klein significant verschil (fprob 0,020) tussen zonaal en de Oostenbrink methode ten voordele van de zonale centrifuge. Gemiddeld worden er met zonaal 104 aaltjes per 100ml gevonden en met de Oostenbrink methode 70 aaltjes per 100ml grond. Lsd 28.

3.2.2 Incuberen

Tabel 6: Aantal P. penetrans gemiddeld in de incubatiefractie per 100ml grond.

Methode Dalgrond (VarCoef. waarn / gem) Zandgrond (VarCoef. waarn / gem)

Wattenfilter incubatie 135 47.68 / 15.08 246 25.04 / 7.92

Incubatiefractie blenderen en centrifugeren

101 25.25 / 7.99 210 39.01 / 12.34

Lsd 56 56 Uit tabel 6 blijkt dat er in de incubatiefractie geen significante verschillen bestaan tussen zonaal en de

wattenfilterincubatie (Fprob 0,958). Bij de analyse over beide grondsoorten heen blijkt ook dat er geen

significant (fprob 0,082) verschil zit tussen zonaal en de wattenfilterincubatie. Gemiddeld worden er met

zonaal 155 aaltjes per 100ml grond gevonden en met de wattenfiltermethode 190. Lsd 40.

9

3.2.3 Totaal

Tabel 7: Aantal P. penetrans totaal per 100ml grond.

Methode Dalgrond (VarCoef. Waarn / gem) Zandgrond (VarCoef. waarn / gem)

Totaal Oostenbrink 193 38.30 / 12.11 328 25.99 / 8.22

Totaal zonale centrifuge 240 18.40 / 5.82 278 22.31 / 7.06

Lsd 62 62

In tabel 7 is af te lezen dat er voor het totale aantal P. penetrans per 100ml geen significante verschillen zijn voor beide grondsoorten tussen zonaal en de Oostenbrink methode. Ook de analyse over beide grondsoorten heen laat geen significant verschil zien (fpob 0,966). Gemiddeld worden er door de zonale centrifuge 259 P. penetrans per 100ml grond gevonden en middels de Oostenbrinkmethode aangevuld met wattenfilterincubatie 260 P. penetrans per 100ml grond. (lsd 44)

10

4 Variantie7analyse laboratorium procedures

Om laboratoriumprocedures die gepaard gaan met de grootste variantie te identificeren – en in een later stadium te verbeteren – moeten alle bronnen van variatie nader worden onderzocht. De belangrijkste bronnen zijn: 1. De monsterfout bij het nemen van de deelmonsters uit een goed gemengd bulkmonster. Bij een ideale

menging van de nematoden in het bulkmonster is dit een multinomiale fout. Te kort mengen geeft een grotere variatie door onvolledige menging terwijl lang mengen extra variatie tot gevolg heeft door sterfte van de nematoden. Bij deelmonstername van de organische fractie is het moeilijk de ideale menging te bereiken, vooral bij de traditionele opspoelmethoden.

2. Voor de zonale centrifuge: De variatie t.g.v. het nemen van een deelmonster van 500 cc. uit de suspensie van 1000cc.

3. De variantie in extractie7efficiency voor de minerale en de organische fractie. Voor de zonale centrifuge komt hierbij de variatie (b.v. door sterfte van nematoden) t.g.v. het blenderen. In het ideale geval zijn deze variatiebronnen voor beide apparaten verwaarloosbaar.

4. De variatie t.g.v. het nemen twee 10 ml. monsters uit de suspensie waaruit de nematoden worden geteld. Bij een ideale verdeling van de nematoden in de suspensie waarbij het volume van de nematoden verwaarloosbaar is t.o.v. het totale volume van de vloeistof is dit een Poisson7fout. Deze poissonfout is verwaarloosbaar wanneer er voldoende nematoden worden geteld.

5. De variatie t.g.v. vergissingen tijdens het tellen. Idealiter is deze verwaarloosbaar. 6. De variatie tussen de tellingen door verschillende laboranten en/of laboratoria. Deze is idealiter

verwaarloosbaar. Deze variantie7analyse is verricht per laboratorium, per machine en per fractie (mineraal en organisch). Niet alle bronen van variantie kunnen in deze variantieanalyse rechtstreeks worden geschat. Variantiebron (2) is onbekend en zou idealiter moeten overeenkomen met een binomiale fout. Dit moet empirisch worden bevestigd. Ook (3) de variantie in extractie7efficiency van de organische en minerale fractie is voor beide machines en laboratoria onbekend. Idealiter zou foutenbron (4) routinematig moeten worden gecheckt in ieder laboratorium. Er moet daarbij na worden gegaan of de verdeling van de nematoden in de suspensie inderdaad overeenkomst met een poissonfout. Foutenbronnen (4) + (5) kunnen gecombineerd rechtstreeks worden geschat uit de getelde paren en trio’s. Als ervan wordt uitgegaan dat het bulkmonster ideaal was gemengd, dan kan uit de variantie tussen de deelmonsters minus de multinomiale fout t.g.v. deelmonstername en de variantiebronnen (4) + (5) een ruwe schatting worden gemaakt van de variantie in extractie7effeciency voor de minerale en de organische fractie. Om werkelijk inzicht te krijgen in de prestaties van beide machines en om gerichte verbeteringen te kunnen doorvoeren moeten alle afzonderlijke foutenbronnen empirisch worden vastgesteld.

11

4.1 Zonale centrifuge

4.1.1 Tellingen minerale fraktie.

Fig. 1Minerale fraktie, zonale centrifuge

Fig. 1Minerale fraktie zonale centrifuge

PAV, tellingen mineraal zonaal

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

0 20 40 60 80 100 120

Gemiddelde

Var

ian

tie

M SmaktP SmaktP KooijM Kooijtheor var

CV subsamples mineraal

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0 200 400 600 800 1000 1200

Nem in bulksample

CV

PDPAVtheoretisch

PD, tellingen mineraal zonaal

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

0 20 40 60 80 100 120

Gemiddelde

Var

ian

tie

M SmaktP SmaktP KooijM Kooijtheor var

De variatie tussen tellingen door de PD vertoont een ideaal beeld: die volgens een poissonfout. De tellingen door het laboratorium van het PAV vertonen over het algemeen een wat grotere variatie dan die volgens een poissonfout. Uitzonderlijk hoog is de variatie tussen drie Meloidogyne deelmonsters op het Kooijenburg perceel. De variantiecoefficient tussen de deelmonsters volgt min of meer het patroon van een multinomiale verdeling, zij het met een extra variatiecomponent. Deze extra component kan onder meer bestaan uit variatie t.g.v. het trekken van een extra deelmonster van 500cc uit de 1000cc suspensie en variatie in de extractie7efficiency van de zonale centrifuge. Ook de telfout zou een rol kunnen spelen. Dat is zeker het geval bij de ene uitschieter, afkomstig van het PAV.

12

4.1.2 Tellingen organische fraktie.

Fig. 2Organische fraktie zonale centrifuge

PD, tellingen, incubatie zonaal

0

100

200

300

400

500

600

700

0 10 20 30 40 50 60

Gemiddelde

Var

ian

tie

M Smakt

P Smakt

P Kooij

M Kooij

theor var

PAV, tellingen, incubatie zonaal

0

100

200

300

400

500

600

700

0 10 20 30 40 50 60

GemiddeldeV

aria

nti

e

M Smakt

P Smakt

P Kooij

M Kooij

theor var

CV subsamples incubatie

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0 200 400 600 800 1000 1200

Nem in bulksample

CV

PDPAVtheoretisch

De variatie tussen tellingen vertoont hier een minder ideaal beeld. Op 1 uitschieter na (Meloidogyne Kooijenburg) benadert het PPO7PAV laboratorium de poissonfout het dichtst. Het PD7lab kan een aanzienlijke verbetering in resultaten bereiken door meer aandacht te geven aan de mate waarin variatie tussen tellingen overeenstemmen met de theoretische fout. De grotere variatie tussen de tellingen werkt ook door in de variatie tussen de deelmonsters. Daarnaast kan ook hier een extra variatiecomponent zitten in de deelmonstername uit de geblenderde organische fractie en variatie in sterfte van nematoden t.g.v. het blenderen.

13

4.2 Oostenbrink methode

4.2.1 Tellingen minerale fractie.

Fig. 3Minerale fraktie Oostenbrink

Cv subsamples mineraal

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 200 400 600 800 1000 1200

P, M in bulksample

CV

PDPAVtheoretisch

PD, tellingen mineraal standaard

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 10 20 30 40 50

Gemiddelde

Var

ian

tie

M Smakt

P Smakt

P Kooij

M Kooij

theor var

PAV, tellingen mineraal standaard

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 10 20 30 40 50

Gemiddelde

Var

ian

tie

M SmaktP SmaktP Kooij

M Kooijtheor var

De variatie tussen de tellingen vertoont hier voor beide laboratoria een merkwaardig patroon. Anders dan bij de zonale centrifuge is er slechts een geringe correlatie tussen variantie en het gemiddelde. Het merendeel van de tellingen heeft een lagere variantie dan die volgens de poissonverdeling. Dit zou kunnen betekenen dat het deelmonster uit de aaltjessuspensie (bij het tellen) niet oneindig klein is geweest en de poissonverdeling hier niet geldt. Zonder nader onderzoek is hiervoor echter geen duidelijke oorzaak aan te wijzen. Ondanks de geringere telfouten is de variatie tussen de deelmonsters (uit het bulkmonster) over het algemeen groter dan bij de zonale centrifuge. Dit zou kunnen wijzen op een grotere variatie is extractie7efficiency van de Oostenbrink kan.

14

4.2.2 Tellingen organische fraktie.

Fig. 4Organische fraktie Oostenbrink

Variantie tussen deelmonstersIncubatie standaard

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

0 200 400 600 800 1000 1200

P, M in bulksample

CV

PDPAVtheoretisch

PD, tellingen, incubatie standaard

0

50

100

150

200

250

300

0 50 100 150 200 250

Gemiddelde

Var

ian

tie

M SmaktP SmaktP KooijM Kooijtheor var

PAV, tellingen, incubatie standaard

0

50

100

150

200

250

300

0 50 100 150 200 250

GemiddeldeV

aria

nti

e

M SmaktP SmaktP KooijM Kooijtheor var

Op 1 uitschieter na, komt de variatie tussen de tellingen door het PD lab goed overeen met die volgens de – ideale – Poissonverdeling. Het aantal uitschieters van het PAV lab is iets groter (3). Desondanks is de variatie tussen de deelmonsters (van het bulkmonster) ongunstig. In ieder geval ongunstiger dan het geval is bij de zonale centrifuge. Het blijft problematisch om nematoden in wortelresten of eiproppen ideaal te verdelen door een bodemmonster zodat bij het nemen van deelmonsters een grote variatie van de organische fractie optreedt.

5 Conclusie/ Discussie

Ten aanzien van de verschillen in aantallen aaltjes tussen de ‘traditionele’ extractiemethode en de zonale centrifuge bestaat alleen voor de Meloidogyne aaltjes in dalgrond een significant verschil tussen beide methoden voor het totale aantal aaltjes. De zonale centrifuge presteert hier beter. De zonale centrifuge is ook stabieler wat extractie7efficiency aangaat. De spreiding in resultaten is erg groot bij de traditionele methode en minder bij de zonale centrifuge – vooral door een beduidend geringere spreiding bij zowel de organische als de minerale fractie. Op basis van deze gegevens kan worden geconcludeerd dat er op dit moment de voorkeur moet uitgaan voor het gebruik van de zonale centrifuge. Hoewel het goed mogelijk is dat beide technieken na verdere optimalisatie gelijkwaardig presteren, ligt deze optie niet voor de hand. Eerder zal er sprake zijn van een verbetering van de resultaten afkomstig van de zonale centrifuge. De eerdere problemen met een troebele suspensie zijn ondertussen verholpen. In Merelbeke is door de heer Hendrickx ondertussen de besturingssoftware van de zonale centrifuge aangepast, alsook een aangepaste

15

scheidingsmethode van de minerale en organische fractie in gebruik genomen, die, zoals hij beweert “specifiek voor sommige grondmonsters die in Lelystad geanalyseerd worden” bruikbaar zou zijn. Hij claimt nu nog schonere nematodensuspensies te verkrijgen. Enkele belangrijke vragen die in deze proef niet beantwoord zijn; • Onderschat de zonale centrifuge de organische fractie vanwege de techniek of omdat tijdens een

incubatie van 4 weken, eieren rijp en larven telbaar worden, die in de zonale centrifuge worden gemist? • Wat is het effect van het nemen van een deelmonster van 500 cc uit de 1 liter suspensie waarin 200cc

grond is gesuspendeerd bij de zonale centrifuge? Hierdoor wordt een extra fout toegevoegd hoewel deze (50% wordt verzameld) vrij klein hoort te zijn. Voorstelbaar is dat door de aanwezigheid van 200 cc grond deze deelmonstername (opzuigen van de suspensie op een bepaalde hoogte) verre van ideaal is. Of er is een constante fout tussen de 500 cc opgezogen en de 500 cc die achterblijft (vaste verhouding tussen de dichtheden in beide fracties) of de menging is verre van goed waardoor de variantie stijgt.

• Kunnen monster betrouwbaarder worden door van een groter monster de organische fractie te gebruiken om de dichtheid te bepalen (organische fractie in zijn geheel opspoelen)?

• Kunnen telfouten worden gereduceerd door regelmatig te checken of de suspensie wel ideaal is geroerd en de variatie tussen tellingen overeenkomt met een poissonfout?

• Wat zijn de afzonderlijke fouten van alle afzonderlijke laboratoriumhandelingen? Vanwege de potentiële mogelijkheden van de Hendrickx zonale centrifuge is voortzetting van het onderzoek naar toepassing van dit apparaat gewenst. Idealiter, zou in een vervolgproef de variantie van alle procedurele stappen in de laboratoria moeten worden geschat. Uit de huidige gegevens kan alvast worden afgeleid waar de zwakke plekken zitten en op basis hiervan kunnen aanpassingen worden gedaan en gericht naar variatiebronnen worden gekeken. Daarna is het zinnig de werking cq betrouwbaarheid van het apparaat te testen met meerdere grondsoorten en aaltjessoorten (met name Trichodoriden). Als de apparaten routinematig worden ingezet moeten de zwakste schakels van tijd tot tijd worden gecontroleerd en de behaalde varianties worden vergeleken met de theoretisch ideale. Met de Belgische collega’s wordt onderzocht in hoeverre deze, in het kader van de certificering van hun diagnostische laboratorium, enkele van de vragen kunnen oplossen.

6 Literatuur

Verschoor, B.C. & Goede, R.G.M. de (2000) The nematode extraction efficiency of the Oostenbrink elutriator7cottonwool filter method with special reference to nematode body size and life strategy. Nematology, vol. 2(3): pp. 3257342 Chen7SL; Hendrickx7G; Moens7M (2000) The importance of organic matter when assaying Meloidogyne chitwoodi soil populations. Russian Journal of Nematology 2000; 8 (2): 1477152