Vom Molekül zur Zelle Block 3 Seminar / Praktikum 1 Georg Weitzer, Ernst Müllner Max F. Perutz...

Vom Molekül zur ZelleVom Molekül zur Zelle

Block 3Block 3

Seminar / Praktikum 1Seminar / Praktikum 1

Georg Weitzer, Ernst MüllnerMax F. Perutz Laboratories (MFPL)Department für Medizinische BiochemieMedizinische Universität Wien, Jan 2007

Diese Präsentation befindet sich auf der Lehr-Inhalts Seite desDepartments für Medizinische Biochemie unter der Adresse:

www.meduniwien.ac.at/Medbch/Teaching

LiteraturLiteratur

Ergänzung der theoretischen Grundlagen und biochemisches Praktikum im Block 3 - vom Molekül zur ZelleFacultas VerlagHans Goldenberg (Hg.)

Zellbiologie, Wiley - Verlag ChemieBruce Alberts ergänzend z.B.

Chemie erleben (Abschnitt „Analytische Chemie“),Facultas - Universitäts Taschenbuch VerlagEdgar Wawra, Helmut Dolznig, Ernst Müllner

Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007

Der praktische Teil der1. Übung findet statt am:

Institut fürInstitut fürMedizinische ChemieMedizinische ChemieWähringerstraße 10Übungssaal III (Tiefparterre)

• DünnschichtchromatographieDünnschichtchromatographie• IonenaustauschchromatographieIonenaustauschchromatographie• Reversed Phase ChomatographyReversed Phase Chomatography

(apolare stationäre Phase, polares Elutionsmittel = mobile Phase)(apolare stationäre Phase, polares Elutionsmittel = mobile Phase)

• GaschromatographieGaschromatographie

• GelfiltrationGelfiltration (Größenausschluss Chromatographie)(Größenausschluss Chromatographie)

• ElektrophoreseElektrophorese• AffinitätschromatographieAffinitätschromatographie

TrennmethodenTrennmethoden

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Affinitätschromatographie::

z.B. Reinigung eines Enzyms aus einer komplexen Mischung von Proteinen

Praktikumsbeispiel 1Praktikumsbeispiel 1

Trennung von Aminosäuren mittels Dünnschichtchromatographie(nach ihrer Polarität)

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Glasröhrchen

Zellulose auf Alufolie,polare, stationäre Phase

Standard = Referenzwert

Auftragen der ProbenAuftragen der Proben

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Auftragen der ProbenAuftragen der Proben

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Laufmittel,apolar,mobile Phase

35% Azeton / 35%n-Butanol in Acetatpuffer

Dünschicht-Chromatographie-folie in Glastrogmit Laufmittelstellen

Wanderungs-richtungder Proben

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Dünnschichtchromatographie TrogDünnschichtchromatographie Trog

gelber Farbstoff = Isatin

Chemie erleben Wawra et al.

nach circa 2 Stunden:

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Front

Start

Markieren der

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DünschichtchromatogrammDünschichtchromatogrammnach der Färbung / Trocknungnach der Färbung / Trocknung

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Front

Start

Wanderungs-strecke dermobilenPhase

Wanderungsstreckeder Aminosäure

W(as)W(m)

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Nernstscher Verteilungssatz

Verteilungskoeffizient c =

W(as) = Rf(as)W(m)

Rf = Retentionsfaktor

[Aminosäure] stationäre Phase

[Aminosäure] mobile Phase

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AuswertungAuswertung

Nernstscher VerteilungssatzNernstscher VerteilungssatzBeschreibt die Verteilung eines Stoffes zwischen zwei miteinander nicht mischbaren Phasen (z.B. gasförmig / flüssig oder flüssig / fest oder flüssig / flüssig).

Verteilungskoeffizient c =[Br2] Chloroform

[Br2] Wasser

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Praktikumsbeispiel 2Praktikumsbeispiel 2

GelfiltrationGelfiltration

Trennung der Moleküle nach ihrer Größe

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GelfiltrationGelfiltration

Probe, z.B. Protein / Salz Gemisch

Poren und Kapillarenkleine Moleküle könnenhinein, haben dadurch einen längeren Weg zurückzulegen als die großen, (die außen herum schwimmen)und kommen daher späteraus der Säule heraus.

Glasfritte

kleine Moleküle

große

Fraktionen

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Trennung eines Trennung eines Dextranblau / MethylrotDextranblau / Methylrot Gemisches mittels GelfiltrationGemisches mittels Gelfiltration

• Sephadex G25 Säulenmaterial in Elutionspuffer äquilibriert.

• 0.5 ml der Probe (Dextranblau und Methylrot) direkt auf die gerade trockengelaufene Glasfritte auftragen.

• Wenn vollkommen ins Säulenmaterial eingedrungen, mit ca. 5 ml Elutionspuffer nachspülen, 3 mal wiederholen.

• Austretender Elutionspuffer wird in Fraktionen zu je 20 Tropfen (= ca. 1 ml) gesammelt.

• Um Methylrot sichtbar zu machen, Fraktionen mit je 1 Tropfen HCl ansäuern. Dextranblau ist blau gefärbt.

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Gelfiltrations - Chromatographie SäuleGelfiltrations - Chromatographie Säule

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Elutionspuffer in Dispenserflasche

Dextransblau / Methylrot Farbstoffmischung

Salzsäure (HCl) zum Ansäuern und Entwickeln der Rotfärbung von Methylrot

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Reagenzien für Reagenzien für die Gelfiltrationdie Gelfiltration

GelfiltrationGelfiltrationSammeln der Fraktionen

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Fraktionen nach der GelfiltrationFraktionen nach der Gelfiltration

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Schema der Trennung eines Schema der Trennung eines Dextranblau / Dextranblau / MethylrotMethylrot Gemisches mittels Gelfiltration Gemisches mittels Gelfiltration

Fraktionen

Fa

rbin

ten

sit

ät

Dextranblau: großes Molekül, eluiert zuerstMethylrot: kleines Molekül, kommt später aus der Säule heraus

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Praktikumsbeispiel 3Praktikumsbeispiel 3

ElektrophoreseElektrophorese

Trennung von geladenenMolekülen imelektrischen Feld

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Trennung und quantitative Analyse der Serumproteine

Voraussetzungen:

• Serumproteine müssen positiv oder negativ geladen sein.

• richtige Wahl des Puffers !• Trägermaterial (analog zur stationären Phase)

• Gleichstromquelle

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Arbeitsplatz ElektrophoreseArbeitsplatz Elektrophorese

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Elektrophorese ApparaturElektrophorese Apparatur

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pipettieren kleiner Voluminapipettieren kleiner Volumina

mit automatische Pipetten

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Elektrophorese - ProbenvorbereitungElektrophorese - Probenvorbereitung

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Proben aufgetragenProben aufgetragen

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Cellogel, Trägermaterial

Tröge mit Pufferlösung

PlatinElektroden

Gleichstromquelle

+

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Anode

Kathode

Welchen pH-Wert muss die Pufferlösung haben, Welchen pH-Wert muss die Pufferlösung haben, wenn alle Proteine zur Anode wandern sollen?wenn alle Proteine zur Anode wandern sollen?

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Welchen pH-Wert muss die Pufferlösung haben, Welchen pH-Wert muss die Pufferlösung haben, wenn alle Proteine zur Anode wandern sollen?wenn alle Proteine zur Anode wandern sollen?

Der isoelektrische Punkt pI der

Serumproteine ist ~ 5.

Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007

Welchen pH-Wert muss die Pufferlösung haben, Welchen pH-Wert muss die Pufferlösung haben, wenn alle Proteine zur Anode wandern sollen?wenn alle Proteine zur Anode wandern sollen?

Der isoelektrische Punkt

pI der Serumproteine

ist ~ 5.

Daher muss der pH des Puffer > 5 sein (in der Praxis bei etwa pH = 9), damit ALLE Proteine negativ geladen werden ...

Chemie erleben, Wawra et al.

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... ansonsten würden der Anteil an positiv geladenen Proteinen zur Kathode wandern

Gleichstromquelle

+Proben

StandardSerum

250V30 min

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Anode

Kathode

negativ geladene Proteine(Anionen) wandern zur positivgeladenen Anode

Wanderungsrichtung

Zwischenfrage:Zwischenfrage:

• Warum gibt es im Blut mehr Kationen, wie Na+, K+, Ca++, Mg++ als Anionen, wie Cl-, HCO3

- ?

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Zwischenfrage:Zwischenfrage:

• Warum gibt es im Blut mehr Kationen, wie Na+, K+, Ca++, Mg++ als Anionen, wie Cl-, HCO3

- ?

• Weil die Anionenlücke durch dienegative Ladung der Proteine bei pH 7.4 ausgeglichen wird.

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Gleichstromquelle: 250 VGleichstromquelle: 250 V

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Nach der ElektrophoreseNach der Elektrophorese

• Färben der Proteine

• Trägermaterial durchsichtig machen

• Photometrische (densitometrische) Auswertung

• Messen der Farbstoffdichte entlang des Trägermaterials

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aufgetrennte Serumproteine

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Fläche ist proportionalder Farbmenge, also auch der Proteinmenge

Detektor

Lichtquelle

Probe wird am Detektor vorbeigezogen

Das Prinzip derDas Prinzip derAuswertung ...Auswertung ...

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E = x c x d

Küvetted = 1 cm

PrismaLichtquelle

E = log (1/T) = log (I0/I)

Detektor

II0

... beruht auf dem Lambert-Beerschen Gesetz... beruht auf dem Lambert-Beerschen Gesetz

E = Extinktion = spez. Molarer Extinktionskeoff.c = Konzentration d = Schichtdicke

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Photozelle

verwendetes Densitometer verwendetes Densitometer (ein Typ von Photometer)(ein Typ von Photometer)

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Ausdruck der ErgebnisseAusdruck der Ergebnisse

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Elektrophorese von SerumproteinenElektrophorese von Serumproteinen

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diagnostischediagnostischeAussage-Aussage-möglichkeitenmöglichkeiten

(Beispiele)

für eine ausführlichere Darstellung siehe z.B. www.med4you.at/laborbefunde/lbef_ephorese_eiweiss.htm

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aus: “Ergänzungder theoretischen Grundlagen”,H. Goldenberg, (Hg.)

Protokoll zur Bewertung der ErgebnisseProtokoll zur Bewertung der Ergebnisse

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Fotos: Gelfiltration-Auswertung neufertige Aminosäure-Dünnschichtneue Ausdrucke DensitometerFoto LageplanFoto Med. Chem. Gebäude (von Homepage)

Informationen zur Protein-Elpho:www.med4you.at/laborbefunde/lbef_ephorese_eiweiss.htm

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