View
1
Download
0
Category
Preview:
Citation preview
1
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LẦM KHOA HỌC VÀ
CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
LƢU ANH TÚ
SÁN LÁ PHỔI PARAGONIMUS HETEROTREMUS VÀ
PARAGONIMUS WESTERMANI Ở VIỆT NAM: HÌNH THÁI,
PHÂN TỬ, SINH HỌC VÀ CHẨN ĐOÁN MIỄN DỊCH
Chuyên ngành: Ký sinh trùng học
Mã số: 62.42.01.05
TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
Hà Nội, 2018
2
Luận án được hoàn thành tại: Học viện Khoa học và Công nghệ -
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. TS. Phạm Ngọc Doanh
2. TS. Bùi Khánh Linh
Ngƣời phản biện 1:
Ngƣời phản biện 2:
Ngƣời phản biện 3:
Luận án đƣợc bảo vệ trƣớc Hội đồng chấm luận án cấp Học Viện
Họp tại: Học viện Khoa học và Công nghệ
Vào hồi ..... giờ, ngày ..... tháng ...... năm 2018
Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Thƣ viện Quốc gia
- Thƣ viện Học viện Khoa học và công nghệ
3
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Sán lá phổi (SLP) thuộc giống Paragonimus gây bệnh SLP có
ảnh hưởng lớn đến sức khỏe của người và động vật. Nguyên nhân
nhiễm bệnh do ăn phải metacercaria ở vật chủ trung gian thứ hai
(VCTG 2) hoặc sán non từ vật chủ chứa. Triệu chứng bệnh SLP dễ bị
chẩn đoán nhầm với lao phổi hoặc các bệnh phổi khác, gây khó khăn
cho chẩn đoán và trị bệnh (Blair et al., 1999).
Ở Việt Nam, SLP và bệnh SLP được quan tâm nghiên cứu trong
hơn 20 năm qua (Cao Văn Viên và cs., 1994; Nguyễn Văn Đề và cs.,
1998-2003; Doanh et al., 2005-2013). Đến nay, 7 loài SLP đã được
phát hiện (Doanh et al., 2013), trong số đó có loài P. heterotremus
phổ biến ở các tỉnh miền Bắc và loài P. westermani phổ biến ở các
tỉnh Bắc Trung Bộ, cả 2 loài gây bệnh cho người. Nhiều vấn đề về 2
loài SLP này chưa được nghiên cứu. Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề
tài nghiên cứu “Sán lá phổi Paragonimus heterotremus và
Paragonimus westermani ở Việt Nam: hình thái, phân tử, sinh học và
chẩn đoán miễn dịch”.
2. Mục tiêu của đề tài:
Mục tiêu chung của đề tài là hiểu biết về hai loài SLP
P. heterotremus và P. westermani, cung cấp cơ sở khoa học cho việc
chẩn đoán và phòng trị bệnh SLP, góp phần bảo vệ sức khỏe cộng
đồng.
Với các mục tiêu cụ thể như sau:
1. Xác định được phương pháp xét nghiệm cua suối tốt nhất để thu
metacercaria và xác định tình hình nhiễm metacercaria của SLP ở
cua suối tại tỉnh Lào Cai, Yên Bái, Quảng Trị.
4
2. Xác định được sự đa dạng hình hình thái metacercaria và đa dạng
di truyền phân tử của hai loài P. heterotremus và P. westermani.
3. Xác định được một số đặc điểm sinh học của hai loài
P. heterotremus và P. westermani.
4. Thiết lập được phản ứng dot-ELISA chẩn đoán nhanh bệnh SLP
tại thực địa, giúp điều trị bệnh kịp thời.
3. Nội dung nghiên cứu
3.1. Xác định phương pháp xét nghiệm cua tốt nhất để thu
metacercaria và điều tra tình hình nhiễm metacercaria ở cua
suối tại Lào Cai, Yên Bái và Quảng Trị.
3.2. Nghiên cứu đa dạng hình thái metacercaria và di truyền phân tử
của loài P. heterotremus và P. westermani.
3.3. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học hai loài sán lá phổi.
- Xác định vật chủ trung gian 1 và vật chủ chính ngoài tự nhiên.
- Sự phát triển của sán lá phổi ở vật chủ chính và vật chủ chứa.
- Nghiên cứu sức sống của metacercaria.
3.4. Thiết lập phản ứng dot-ELISA chẩn đoán bệnh sán lá phổi
- Xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng dot-ELISA.
- Xác định nồng độ kháng nguyên của phản ứng.
- Xác định thời gian phản ứng ở điều kiện nhiệt độ khác nhau.
4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài
4.1. Ý nghĩa khoa học: Đề tài cung cấp các thông tin khoa học về
hình thái metacercaria, di truyền phân tử và một số đặc điểm sinh
học của 2 loài P. heterotremus và P. westermani ở Việt Nam.
4.2. Ý nghĩa thực tiễn: Đề tài cung cấp cơ sở khoa học khuyến cáo
phòng tránh nhiễm bệnh SLP và thiết lập được phản ứng dot-ELISA
5
chẩn đoán nhanh bệnh SLP ở thực địa, góp phần bảo vệ sức khỏe
cộng đồng.
5. Những đóng góp mới của đề tài
5.1. Phát hiện metacercaria P. heterotremus ở miền Trung và
P. westermani ở miền Bắc. Mô tả sự đa dạng hình thái
metacercaria của 2 loài SLP này.
5.2. Phân tích đa dạng di truyền của P. heterotremus và
P. westermani. Xác định P. westermani ở Việt Nam là dạng 2n.
5.3. Xác định chính xác VCTG 1 và ấu trùng cercaria của 2 loài SLP
nghiên cứu. Ngoài ra, xác định VCTG 1 của loài P. proliferus.
5.4. Xác định vật chủ chính ngoài tự nhiên của SLP ở Da Krong là
mèo rừng (Prionailurus bengalensis).
5.5. Xác định chó nhà không bị nhiễm P. westermani. Mèo nhà bị
nhiễm P. westermani với mức độ mẫn cảm thấp hơn so với
P. heterotremus.
5.6. Xác định chuột đóng vai trò là vật chủ chứa trong vòng đời của
loài P. heterotremus và P. westermani ở Việt Nam.
5.7. Sức sống của metacercaria SLP không chỉ phụ thuộc vào dung
dịch nuôi, nhiệt độ, mà còn phụ thuộc vào mật độ metacercaria.
5.8. Thiết lập được kỹ thuật dot-ELISA, xác định được thời gian thực
hiện ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau có thể áp dụng để chẩn
đoán nhanh bệnh SLP ở thực địa.
6. Cấu trúc luận án
Luận án gồm 111 trang, mở đầu 3 trang, tổng quan tài liệu 21 trang,
đối tượng, vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu 15 trang, kết quả
nghiên cứu và thảo luận 54 trang, kết luận và kiến nghị 03 trang, đóng góp
mới và danh mục công trình công bố 2 trang, tài liệu tham khảo 13 trang.
Luận văn có 21 bảng, 56 hình ảnh và biểu đồ, 132 tài liệu tham khảo.
6
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về sán lá phổi
Đến nay, hơn 50 loài SLP thuộc giống Paragonimus đã được mô
tả. Vòng đời phát triển của SLP cần 3 đến 4 vật chủ. Vật chủ chính là
thú hoang và động vật nuôi, đặc biệt là họ mèo và chó. VCTG 1 là ốc
nước ngọt. VCTG 2 là cua và một số loài tôm nước ngọt (Blair et al.,
1999). Vật chủ chứa (Paratenic host) là động vật ăn cua.
Các phương pháp chẩn đoán bệnh SLP bao gồm bốn nhóm: ký
sinh trùng học, huyết thanh học/miễn dịch học, chẩn đoán hình ảnh
và các phương pháp phân tử.
1.2. Tình hình nghiên cứu về hai loài Paragonimus heterotremus
và Paragonimus westermani trên thế giới
1.2.1. Tình hình nghiên cứu loài Paragonimus heterotremus
Loài P. heterotremus phân bố ở các nước Nam Á, Đông Nam Á,
phía Nam Trung Quốc, và gây bệnh cho người ở các vùng phân bố
này. VCTG 1 là ốc thuộc họ Assimineidae và Pomatiopsidae. VCTG
2 là 6 loài cua thuộc họ Potamidae. Vật chủ chính là mèo và sóc ở
Thái Lan, động vật thí nghiệm là chó, mèo, chuột và thỏ. Chuột đóng
vai trò vật chủ chứa của loài P. heterotremus (Blair et al. 1999).
1.2.2. Tình hình nghiên cứu loài Paragonimus westermani
Paragonimus westermani phân bố rộng ở châu Á, rất đa dạng về
hình thái, di truyền phân tử, sinh học. P. westermani chủ yếu có 2
dạng triploid (3n) và diploid (2n). Vòng đời cần 3-4 loài vật chủ.
VCTG 1 là ốc thuộc giống Brotia và Semisulcospirus. VCTG 2 là 8
loài tôm và 40 loài cua. Vật chủ chính là nhiều loài động vật có vú.
Sự mẫn cảm của động vật với P. westermani khác nhau rõ rệt giữa
các quần thể địa lý. Đáng chú ý, người bị nhiễm loài P. westermani
7
chỉ giới hạn ở Đông Á và Philiipines. Vật chủ chứa ngoài tự nhiên là
lợn, lợn rừng, hươu (Blair et al. 1999; Yoshida et al. 2016).
1.3. Tình hình nghiên cứu sán lá phổi ở Việt Nam
Bệnh SLP được quan tâm nghiên cứu từ năm 1994, sau đó phát
hiện bệnh SLP ở 10 tỉnh phía Bắc. Đến nay, 7 loài SLP được phát
hiện ở các tỉnh miền Bắc và Trung. Trong số đó, 3 loài (P.
heterotemus, P. westermani và P. skrjabini) có khả năng gây bệnh
cho người. Loài P. skrjabini mới tìm thấy ở cua suối tại Thanh Hóa
với tỷ lệ nhiễm thấp; loài P. heterotremus phổ biến ở miền Bắc; loài
P. westermani phổ biến ở miền Trung (Doanh et al. 2013). Nhiều vấn
đề về 2 loài P. heterotremus và P. westermani chưa được làm sáng tỏ
(Doanh et al., 2013). Hơn nữa, các ca bệnh SLP mới vẫn được tiếp
tục phát hiện. Vì vậy, cần có những nghiên cứu chẩn đoán nhanh,
đơn giản có thể chẩn đoán ở thực địa để trị bệnh kịp thời, góp phần
bảo vệ sức khỏe cộng đồng. Đề tài sẽ giải quyết những vấn đề này.
CHƢƠNG 2
ĐỐI TƢỢNG, ĐỊA ĐIỂM VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng và địa điểm nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu:
SLP P. heterotremus và P. westermani.
2.1.2. Địa điểm nghiên cứu
- Xã Lương Sơn (huyện Bảo Yên, tỉnh Lào Cai) và An Lạc
(huyện Lục Yên, tỉnh Yên Bái) - nơi có tỷ lệ nhiễm metacercaria của
P. heterotremus cao và 4 xã thuộc huyện Quảng Trị là: Hướng Sơn
và Tân Thành (huyện Hướng Hóa), và xã Da Krong và Tà Long
(huyện Da Krong) - là nơi có tỷ lệ nhiễm P. westermani ở vật chủ
trung gian 2 rất cao.
2.1.3. Thời gian nghiên cứu: từ 10/2014 đến 10/2017
8
2.2. Phƣơng pháp tiếp cận và thiết kế thí nghiệm
Metacercaria ở VCTG2 là chỉ thị nhanh và chính xác nhất để
xác định vùng phân bố của SLP. Vì vậy, tại các điểm nghiên cứu, đề
tài xét nghiệm cua suối trước để xác định các địa điểm có tỷ lệ nhiễm
metacercaria của 2 loài P. heterotremus và P. westermani cao nhất
để tiếp tục điều tra xác định vật chủ chính, VCTG 1 ngoài tự nhiên.
Kết hợp cả phương pháp định loại hình thái và phân tử để định danh
cả loài SLP cũng như vật chủ chính và VCTG 1 của SLP. Đồng thời
thu metacercaria để sử dụng cho các nội dung nghiên cứu khác về
hình thái, di truyền và sinh học.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Xét nghiệm cua thu metacercaria của SLP
Xác định thời gian lắng cặn của phương pháp giã lọc cua:
Lấy một cá thể cua suối bắt ở vùng không nhiễm SLP. Loại bỏ mai
cua, dùng chày giã nhuyễn trong cối giã cua.
Đếm 50 metacercaria của loài P. westermani nhỏ vào cối cua
đã giã nhuyễn, cho thêm 250 ml nước, khuấy đều và lọc qua lưới lọc
kích thước 1 x 1 mm vào cốc nhựa thể tích 300 ml. Để lắng trong
thời gian thử nghiệm, sau đó gạn ½ phần dung dịch phía trên sang
một cốc khác. Tiếp tục cho thêm đầy nước vào phần cặn. Tiến hành
gạn-lọc đến khi phần cặn trong có thể xem dưới kính hiển vi soi nổi.
Thử nghiệm thời gian lắng cặn giữa các lần lọc là: 3 phút, 2 phút và
1 phút bằng cách dùng đồng hồ bấm giờ. Thí nghiệm với mỗi thời
gian lắng cặn lặp lại 3 lần. Đem phần cặn cuối cùng kiểm tra dưới
kính hiển vi soi nổi tìm metacercaria SLP.
9
Thời gian lắng cặn thích hợp nhất là thời gian ngắn nhất vẫn
thu lại đủ 50 metacercariae ở phần cặn của lần lọc cuối cùng. Làm
tương tự như vậy với metacercaria của loài P. heterotremus.
- So sánh 2 phương pháp giã-lọc cua và ép cua giữa 2 tấm kính về
thời gian xét nghiệm và số lượng metacercaria thu được.
2.3.2. Điều tra tỷ lệ và cường độ nhiễm metacercaria sán lá phổi
Bắt cua ở các khe suối, mỗi địa điểm xét nghiệm ít nhất 50
con cua suối. Định loại cua dựa vào hình thái theo khóa định loại cua
ở Việt Nam theo Đặng Ngọc Thanh và Hồ Thanh Hải, 2012.
Xét nghiệm cua theo phương pháp tốt nhất đã được xác định,
từ đó xác định tỷ lệ và cường độ nhiễm.
2.3.3. Nghiên cứu hình thái metacercaria: dựa vào hình dạng, kích
thước và độ dày vỏ. Định loại theo Doanh et al., 2013.
2.3.4. Nghiên cứu đa dạng di truyền phân tử SLP
Chọn gen nghiên cứu: đối với loài P. heterotremus chọn
đoạn chèn ITS2 và gen ty thể CO1, đối với loài P. westermani chọn
đoạn chèn ITS2 và gen 16S, vì gen này có thể phân biệt dạng 2n hay
3n của loài P. westermani.
Tách chiết DNA tổng số, thực hiện phản ứng PCR để nhân
bản trình tự đích với cặp mồi lựa chọn, tinh khiết sản phẩm PCR, đọc
trình tự trực tiếp. So sánh trình tự thu được và vẽ cây phát sinh chủng
loại bằng phần mềm MEGA6.
2.3.5. Gây nhiễm cho vật chủ chứa và vật chủ chính:
Gây nhiễm 2 loài SLP cho 10 cá thể chuột nhắt trắng với số
lượng 50 metacercaria/chuột. Sau 1-2 tháng, mổ khám chuột thí
nghiệm thu sán non, gây nhiễm chuyển tiếp cho mèo nhà.
10
Gây nhiễm loài P. westermani cho 4 chó và 8 mèo nhà với số
lượng 30-50 metacercaria/vật chủ. Theo dõi động vật thí nghiệm,
định kỳ xét nghiệm phân để tìm trứng sán bằng phương pháp gạn lọc,
xác định thời gian phát triển của sán ở động vật.
2.3.6. Nghiên cứu hình thái SLP trưởng thành: Làm tiêu bản cố
định bằng cách nhuộm carmine alumine. Đo vẽ kích thước sán và các
cơ quan (giác bụng, giác miệng, tinh hoàn, buồng trứng).
2.3.7. Xác định vật chủ tự nhiên của loài SLP
- Xác định VCTG 1: Thu các loài ốc ở nơi cua nhiễm
metaceracria cao, định tên loài ốc theo Đặng Ngọc Thanh và cs,
2006. Sheding và ép ốc giữa 2 tấm kính để thu cercaria của SLP,
định loài cercaria bằng phân tích trình tự ITS2. Vật chủ ốc bị nhiễm
ấu trùng SLP được thẩm định lại bằng phân tích trình tự gen CO1.
- Xác định vật chủ chính: Xét nghiệm phân chó nhà và phân động
vật hoang tìm trứng SLP. Mẫu trứng sẽ được định loài bằng phân
tích trình tự ITS2. Những mẫu phân vật chủ có trứng SLP được định
loài vật chủ qua phân tích trình tự vùng D-Loop của hệ gen ty thể.
2.3.8. Nghiên cứu sức sống của metacercaria:
- Metacercaria của mỗi loài được nuôi trong nước sinh lý, ở các
điều kiện nhiệt độ khác nhau: nhiệt độ phòng và 4oC ở các mật độ 5,
50, 100, 200 metacercaria/ 2ml. Định kỳ quan sát dưới kính hiển vi
soi nổi để xác định sự thoát nang và sự sống của metacercaria.
2.3.9. Thiết lập phản ứng dot-ELISA
- Kháng nguyên chất tiết của P. heterotremus và P. westermani.
- 30 mẫu huyết thanh bệnh nhân nhiễm SLP, 30 mẫu bệnh nhân
nhiễm sán lá gan lớn, sán lá gan nhỏ, lao phổi và huyết thanh người
bình thường được sử dụng để kiểm tra mức độ phản ứng chéo.
11
- Kỹ thuật dot-ELISA theo Ito and Sato 1990. Thử phản ứng ở
các nồng độ kháng nguyên, nhiệt độ, thời gian khác nhau để đưa ra
điều kiện tối ưu nhất.
2.4. Phương pháp xử lý số liệu: bằng phần mềm Excell, SPSS.
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả xác định phƣơng pháp xét nghiệm cua để thu
metacercaria và tình hình nhiễm metacercaria ở cua suối
3.1.1 Phương pháp xét nghiệm cua tìm ấu trùng SLP
3.1.1.1. Xác định thời gian lắng cặn củ p ư n p áp -lọc cua.
Với phương pháp giã-lọc cua, thời gian metacercaria lắng hết
xuống đáy của loài P. westermani là sau 2 phút, loài P. heterotremus
là 3 phút. Metacercaria của loài P. heterotremus nhỏ nhất so với các
loài SLP khác (Doanh et al., 2015), vì vậy với phương pháp giã-lọc
cua thời gian lắng giữa các lần lọc 3 phút là thích hợp.
3.1.1.2. o án p ư n p áp n ệm cua
Thời gian xét nghiệm một cá thể cua bằng phương pháp ép giữa
hai tấm kính hết 76-85 phút (TB 80,3 phút , nhanh hơn so với
phương pháp giã-lọc cua mất 33-38 phút (TB 35,3 phút (P<0,005).
Từ 10 cá thể cua thu ở Yên Bái, phương pháp giã-lọc cua thu
được 902 metacercaria, nhiều hơn so với phương pháp ép cua thu
được 252 metacercaria (P<0,001).
3.1.2. Tỷ lệ và cường độ nhiễm metacercaria SLP ở cua suối
Tại các điểm nghiên cứu đã thu được 3 loài cua suối: loài
Indochinamon tannanti ở tỉnh Yên Bái và Lào Cai, và 02 loài
Vietopotamon aluoiense và Donopotamon haii ở tỉnh Quảng Trị.
12
Cả 3 loài cua suối đều bị nhiễm ấu trùng SLP. Tỷ lệ và cường độ
nhiễm được trình bày ở bảng 3.4.
Bảng 3.4 . Tỷ lệ và cường độ nhiễm metacercaria của SLP ở cua suối Địa điểm nghiên cứu Loài
cua
Số xét
nghiệm
(con)
Số con
nhiễm
(%)
Cƣờng độ
nhiễm (nang
sán/cua) Tỉnh Huyện Xã
Lào Cai
Bảo Yên
Lương Sơn
I. tannanti 70 58 (82,8) 4-504 (63,8)
Yên
Bái
Lục
Yên
An Lạc I. tannanti 130 91 (70,0) 1-362 (19,7)
Quảng
Trị
Da
Krong
Da
Krong
V. aluoiense 50 39 (78,0) 1-78 (10,1)
Tà Long V. aluoiense 50 48 (96,0) 12-608 (80,0)
Hướng
Hóa
Hướng
Sơn
V. aluoiense 50 50 (100,0) 8-500 (140,8)
Tân Thanh
V. aluoiense
50
5 (10,0) 1-6 (3,4)
D. haii 50 6 (12,0) 1-3 (2,2)
Ở Quảng Trị tìm thấy metacercaria của 4 loài SLP
(P. westermani, P. bangkokensis, P. proliferus và P. heterotremus),
trong đó tỷ lệ nhiễm P. westermani cao nhất. Tại 2 xã (An Lạc và
Lương Sơn ở 2 tỉnh miền Bắc phát hiện metacercaria của 4 loài SLP
P. heterotremus, P. vietnamensis, P. westermani và P. bangkokensis,
trong đó tỷ lệ nhiễm P. heterotremus cao nhất (bảng 3.5).
Bảng 3.5. Tỷ lệ và cường độ nhiễm các loài sán lá phổi ở cua suối Địa
điểm
Loài cua Tỷ lệ (%) và cƣờng độ nhiễm (metacercaria/cua) của các loài
P.
vietnamensis
P.
heterotremus
P.
bangkokensis
P.
westermani
P.
proliferus
Lương
Sơn
I. tannanti 8,6
(1-4)
82,8
(4-504)
An Lạc I. tannanti 6,0
(1-2)
69,2
(1-360)
1,5
(2-2)
13,8
(1-33)
Da
Krong
V.
aluoiense
4,0
(1-2)
6,0
(1-2)
78,0
(1-78)
Tà
Long
V.
aluoiense
8,0
(1-4)
96,0
(12-608)
Hướng
Sơn
V.
aluoiense
4,0
(1-3)
100,0
7-500
4,0
(1)
Tân
Thanh
V.
aluoiense
2,0
(1)
10,0
(1-5)
D. haii 12,0
(1-3)
Ghi chú: số trong ngoặc đ n là d o độn cườn độ nhiễm
13
3.2. Đa dạng hình thái metacercaria và di truyền phân tử
3.2.1. Loài Paragonimus westermani
Metacercaria P. westermani thu từ Yên Bái tương đối đồng đều
về hình thái. Metacercaria từ tỉnh Quảng Trị khác nhau về hình dạng
và kích thước (P<0,001), được chia thành 5 dạng (hình 3.5 a-e).
Hình 3.5. P. westermani metacercaria thu từ cua suối tại Quảng Trị.
Trình tự ITS2 của P. westermani ở Việt Nam khác nhau 1-2
(0,2-0,4%) vị trí nucleotid, làm thành 1 nhóm (hình 3.6). Trình tự
16S của các mẫu thu tại Quảng Trị và Yên Bái khác nhau 1,1-1,4%,
làm thành 2 nhóm trong cùng 1 nhánh (hình 3.7). Các trình tự
P. westermani của Việt Nam đều thuộc dạng 2n.
3.2.2. Loài Paragonimus heterotremus
Metacercaria của P. heterotremus thu ở Yên Bái và Lào Cai có sự
đa dạng về kích thước (hình 3.8). Ở Quảng Trị mới thu được 2
metacercaria có hình oval, kích thước 226-252 x 218-236 µm.
Hình 3.8. Metacercaria P. heterotremus
thu từ Yên Bái và Lào Cai
Phân tích phân tử cho thấy 2 mẫu P. heterotremus từ Quảng Trị
hoàn toàn tương đồng (100%) nhau về trình tự ITS2 và CO1 và
tương đồng cao với các mẫu thu từ miền Bắc (hình 3.10; 3.11).
14
Hình 3.6. Mối quan hệ tiến hóa phân tử của các quần
thể P. westermani dựa trên trình tự ITS2 được xây
dựng bằng phương pháp Maximum Likelihood.
Hình 3.7. Mối quan hệ tiến hóa phân tử của các quần
thể P. westermani dựa trên trình tự gen 16S được xây
dựng bằng phương pháp Maximum Likelihood.
15
Hình 3.10. Mối quan hệ tiến hóa phân tử của các
quần thể P. heterotremus dựa trên trình tự ITS2.
Hình 3.11. Mối quan hệ tiến hóa phân tử của các
quần thể P. heterotremus dựa trên trình tự CO1.
16
3.3. Một số đặc điểm sinh học của Paragonimus heterotremus và
Paragonimus westermani
3.3.1. Vật chủ trung gian thứ nhất
Cercaria thuộc nhóm microcercaria đặc trưng của giống SLP
tìm thấy ở các loài ốc nhỏ (4 mm) thuộc phân họ Triculinae ở Lào
Cai, Yên Bái và ở Hướng Sơn (Quảng Trị), và loài ốc có kích thước
lớn (4 cm) thuộc giống Sulcospira ở Quảng Trị.
Phân tích trình tự CO1 xác định mẫu ốc lớn ở Quảng Trị xác
định là loài Sulcospira quangtriensis. Trình tự CO1 của các mẫu ốc
nhỏ có độ tương đồng cao nhất (90-91%) với loài Gammatricula
fujiansis (AF213342). Mẫu ốc nhỏ ở Yên Bái và Lào Cai hoàn toàn
tương đồng với nhau, khác với trình tự mẫu ốc ở Quảng Trị 12,6%.
Khoảng cách giữa các loài thuộc giống Gammatricula dao động từ
6,4%-12,5%. Vì vậy, có thể khẳng định mẫu ốc nhỏ ở Quảng Trị
khác loài với mẫu ốc thu từ Yên Bái và Lào Cai. Trên cây phát sinh
chủng loại, chúng làm thành các nhánh khác nhau gần với giống
Gammatricula và Tricula, nhưng với giá trị bootrap rất thấp. Vì vậy,
để xác định chính xác vị trí phân loại của các loài ốc này cần kết hợp
phân tích hinh thái và giải phẫu thực hiện bởi các nhà nhuyễn thể
học. Hiện tại chúng tôi tạm để loài ốc ở Lào Cai và Yên Bái là
Triculinae gen sp.1 và ở Quảng Trị là Triculinae gen sp.2.
Trình tự ITS2 của ấu trùng thu từ ốc Triculinae gen sp.1 tại
Lào Cai và Yên Bái hoàn toàn tương đồng (100%) với loài
P. heterotremus, từ ốc Triculinae gen sp.2 ở Hướng Sơn tương đồng
(100%) với loài P. proliferus và từ ốc S. quangtriensis tương đồng
(100%) với loài P. westermani.
17
Đặc đ ểm hình thái ấu trùng SLP trong ốc vật chủ trung gian
Cercaria của 3 loài SLP rất giống nhau về hình dạng và kích
thước (P>0,05). Redia con của 3 loài cũng có kích thước tương tự
nhau (P>0,05). Tuy nhiên, chúng có thể phân biệt với nhau bởi chiều
dài ruột và số lượng cercaria trong mỗi redia. Redia của
P. westermani có ruột dài bằng 70% cơ thể, 2 loài còn lại có ruột
ngắn bằng 20% chiều dài cơ thể (P<0,001). Loài P. heterotremus có
10-12 cercaria nhiều hơn so với loài P. proliferus chứa 4-5
cercaria/redia (hình 3.20).
Hình 3.20. Cercaria (trên) và
redia (dưới) của các loài SLP
a. P. heterotremus;
b. P. proliferus;
c. P. westermani
Tỷ lệ nhiễm ấu trùng SLP ở ốc
Ốc Triculinae gen sp.1 ở Lào Cai và Yên Bái bị nhiễm ấu
trùng SLP với tỷ lệ tương ứng là 1,0 và 0,3%.
Tại Hướng Sơn, Quảng Trị ốc Triculinae gen sp.2 có tỷ lệ rất
thấp 0,02%, ốc S. quangtriensis bắt ở suối lớn không bị nhiễm ấu
trùng SLP, ốc ở khe suối nhỏ bị nhiễm với tỷ lệ 1,0%.
18
Vật chủ trung gian thứ nhất của 3 loài sán lá phổi tóm tắt ở
hình 3.21.
Hình 3.21. Ốc vật chủ trung gian của các loài SLP
a. Triculinae gen sp.1 VCTG 1 của P. heterotremus;
b. Triculinae gen sp.2 VCTG 1 của P. proliferus;
c. Sulcospira quangtriensis VCTG 1 của P. westermani
3.3.2. Vật chủ chính ngoài tự nhiên của sán lá phổi
Xét nghiệm 30 mẫu phân chó nhà tại 2 xã Hướng Sơn và Da
Krong đều âm tính. Xét nghiệm 120 mẫu phân động vật hoang ở Khu
bảo tồn thiên nhiên Da Krong thấy trứng SLP ở 7 mẫu phân. Phân
tích trình tự ITS2 đã xác định chúng thuộc loài P. westermani (3
mẫu), P. heterotremus (2 mẫu) và P. skrjabini (2 mẫu). Các mẫu
phân dương tính với trứng SLP được phân tích trình tự D-Loop đã
xác định tất cả là của mèo rừng, Prionailurus bengalensis.
3.3.3. Sự phát triển của SLP ở vật chủ chứa và vật chủ chính
3.3.3.1. Sự phát triển của P. westermani ở VCC và vật chủ chứa
Gây nhiễm cho chuột nhắt trắng đã thu được sán non ở cơ và
gan của tất cả chuột thí nghiệm. Tỷ lệ phát triển từ 25-75%, trong đó
19
sán thu được ở cơ chiếm tỷ lệ 65,3% và ở gan là 34,7%. Sán non ở
cơ và gan chỉ hơi lớn hơn so với metacercaria khi mới thoát khỏi
nang (hình 3.28).
Gây nhiễm cho động vật nuôi cho thấy sán không phát triển ở
chó nhà. Ngược lại, tất cả m o đều bị nhiễm. Đa số sán chưa trưởng
thành, tỷ lệ sán trưởng thành thấp. Thời gian thải trứng từ 140-145
ngày sau gây nhiễm (bảng 3.14).
Bảng 3.14. Kết quả gây nhiễm P. westermani cho động vật nuôi
Động vật
thí
nghiệm
Mầm bệnh
gây nhiễm
Thải
trứng
sau N
(ngày
Mổ khám
sau N
(ngày
Số sán thu được ở Tỷ lệ
phát
triển
(%)
Phổi Xoang
màng
phổi
Chó 1 50 mc - 150 0 0 0
Chó 2 50 mc - 200 0 0 0
Chó 3 50 mc - 200 0 0 0
Chó 4 50 mc - 200 0 0 0
M o 1 50 mc - 40 17 0 34,0
M o 2 50 mc - 45 18 0 36,0
M o 3 50 mc - 90 8 0 16,0
M o 4 30 mc - 120 4 0 13,3
M o 5 50 mc - 150 2 20 44,0
M o 6 30 mc 145 170 12 (2*) 7 54,3
M o 7 47 sán non 140 180 18 (5*) 5 48,9
M o 8 30 sán non - 100 13 0 43,3
Số cá thể sán trưởng thành; mc: metacercaria; N: gây nhiễm
Nghiên cứu hình thái thấy túi nhận tinh chứa đầy tinh trùng,
khẳng định P. westermani ở Việt Nam thuộc dạng 2n, phù hợp với
kết quả phân tích phân tử. Kích thước của sán thu từ phổi và xoang
màng phổi của m o thí nghiệm dao động lớn (hình 3.28 .
20
Hình 3.28 . Sự phát triển
của SLP P. westermani ở
động vật thí nghiệm
a. Metacercaria mới thoát khỏi nang
sán; b. Sán non thu từ cơ chuột bạch
sau 30 ngày; c. Sán trưởng thành thu từ
phổi m o nhà sau 180 ngày; d. Sán
chưa trưởng thành thu từ phổi m o nhà
sau 180 ngày.
3.3.3.2. Gây nhiễm chuyển tiếp sán non P. heterotremus từ vật chủ
chứa cho vật chủ chính.
Mổ khám chuột nhắt trắng cho thấy sán ở cơ chưa phát triển gì
thêm so với metacercaria mới thoát khỏi nang, kích thước 650-940 x
300-480 µm. Sán non ở gan có kích thước (2,2-4,5 x 1,2-2,4 mm) lớn
hơn so với sán ở cơ (hình 3.31). Gây nhiễm chuyển tiếp cho 2 mèo
thí nghiệm cho thấy m o ăn sán non thu từ gan chuột không bị nhiễm
SLP, ngược lại m o ăn sán non thu từ cơ chuột bị nhiễm SLP, tỷ lệ
phát triển đến trưởng thành là 45%.
Hình 3.31. Khác nhau về kích thước sán non thu ở cơ (a và gan (b
21
3.3.4. Sức sống của metacercaria SLP
Ở nhiệt độ phòng thí nghiệm metacercaria sống được tối đa 15-
17 ngày, số lượng metacercaria thoát khỏi nang và chết nhiều nhất
vào ngày thứ 7-8, chiếm tỷ lệ 32-33,3% (hình 3.34).
Hình 3.34. Sức sống của metacercaria ở điều kiện nhiệt độ phòng
(25-30oC trong nước muối sinh lý
Ở tủ lạnh 4oC với mật độ metacercaria khác nhau (5, 50, 100
và 200 metacercaria/2 ml) cho thấy metacercaria có thể sống tới 12
tháng phụ thuộc vào mật độ metacercaria. Ở mật độ metacercaria
thấp (5 metacercaria/2 ml) thời gian sống kéo dài hơn so với các mật
độ cao hơn (P<0,005). Với mật độ 200 metacercaria/2 ml tỷ lệ
metacercaria thoát nang và chết nhiều sau 2 tháng và chỉ sống tới 7-8
tháng. Ở mật độ 50 và 100 metacercaria/2 ml thì metacercaria có thể
sống tới 10-11 tháng, tỷ lệ thoát nang và chết nhiều vào tháng thứ 6-
7 (hình 3.35 và 3.36). Không có sự khác biệt về sức sống của
metacercaria của 2 loài P. westermani và P. heterotremus (P>0,05).
22
Hình 3.35. Sức sống của P. westermani metacercaria theo thời gian
bảo quản ở 4oC ở các mật độ khác nhau
Hình 3.36. Sức sống của P. heterotremus metacercaria theo thời gian
bảo quản ở 4oC ở các mật độ khác nhau
3.4. Thiết lập phản ứng dot-ELISA chẩn đoán nhanh bệnh SLP
3.4.1. Độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng
Phản ứng hoạt động rất tốt. Các ô nhỏ huyết thanh đối chứng
đều hiện màu rất rõ. Ở các bệnh nhân nhiễm SLP P. heterotremus
hiện màu đậm ở ô nhỏ kháng nguyên P. heterotremus và hơi nhạt
hơn ở ô nhỏ kháng nguyên P. westermani. Trong khi huyết thanh
23
người bình thường, bệnh nhân nhiễm sán lá gan lớn, sán lá gan nhỏ,
lao phổi đều âm tính, trừ 01 mẫu huyết thanh bệnh nhân sán lá gan
lớn dương tính, tuy nhiên màu nhạt hơn so với huyết thanh bệnh
nhân nhiễm SLP P. heterotremus (hình 3.38).
Hình 3.38. Kết quả phản ứng dot-ELISA với huyết thanh
Kết quả tính toán cho thấy độ nhạy của phản ứng là 100%, độ
đặc hiệu của phản ứng là 95%, giá trị tiên đoán dương tính là 96,7%
và giá trị tiên đoán âm tính là 100% (bảng 3.18).
Bảng 3.18. Độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng dot-ELISA
Dot-ELISA
Huyết thanh
Số mẫu
kiểm tra
Kết quả xét nghiệm dot-ELISA
Số mẫu
dương tính
Số mẫu
âm tính
Tổng
số
Nhiễm SLP 30 30 0 30
Không nhiễm SLP 30 1 29 30
Tổng số 31 29
Độ nhạy (%) 30/(30 + 0) x 100 = 100
Độ đặc hiệu (%) 29/(29+ 1) x 100 = 96,7
Giá trị tiên đoán dương tính (% 30/ (30 + 1) = 96,7
Giá trị tiên đoán âm tính (% 29/(29 + 0) = 100
24
3.4.2. Xác định nồng độ kháng nguyên
Ở nồng độ KN 0.25 mg/ml, các mẫu đều có màu nhạt, khó phát
hiện. Ngược lại, ở nồng độ 1mg/ml và 0.5mg/ml các mẫu đều hiện
màu. Nồng độ 0.5 mg/ml có màu hơi nhạt hơn nồng độ 1 mg/ml,
nhưng có thể quan sát rõ. Như vậy, có thể sử dụng nồng độ kháng
nguyên 0.5 mg/ml, giảm ½ so với các công bố trước.
3.4.3. Thời gian phản ứng ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau
Thời gian phản ứng phụ thuộc vào nhiệt độ (bảng 1.19). Thời
gian thực hiện phản ứng dot-ELISA tại thực địa có thể từ 51 phút ở
điêu kiện 37oC, tương đương với nhiệt độ mùa h , đến 3 giờ 26 phút
ở nhiệt độ 10oC hoặc 4 giờ 21 phút ở 4
oC, tương đương với nhiệt độ
mùa đông.
Như vậy, kỹ thuật dot-ELISA có thể đọc kết quả bằng mắt
thường, không cần máy đọc quang phổ, có thể thực hiện ở ngay tại
thực địa, không cần tủ ấm, thậm chí vào những ngày mùa đông lạnh
khoảng 4oC, thời gian thực hiện trong 4 giờ 21 phút, bệnh nhân có
thể chờ kết quả và được cấp thuốc điều trị trong ngày.
Bảng 3.19. Thời gian phản ứng ELISA ở các nhiệt độ khác nhau
Nhiệt
độ
Thời gian (phút) ủ với
Huyết
thanh
Conjugate Rửa Hiện
màu
Tổng thời
gian
37oC 20 20 6 5 51 (0h51’
20oC 60 60 6 5 131 (2h11’
10oC 90 90 6 10 206 (3h26’
4oC 120 120 6 15 261 (4h21’
25
KẾT LUẬN
1. Phƣơng pháp xét nghiệm cua và tình hình nhiễm metacercaria
sán lá phổi ở cua suối
- Với phương pháp giã-lọc cua, thời gian để lắng giữa các lần lọc
3 phút là thích hợp để thu metacercaria của SLP. Phương pháp
giã lọc-cua dễ thu metacercaria và chính xác hơn so với phương
pháp ép cua.
- Tỷ lệ nhiễm và cường độ nhiễm ở cua suối tại xã Lương Sơn
(Lào Cai) là 82,8% và 4-504 metacercariae/cua, ở xã An Lạc
(Yên Bái) là 70,0% và 1-362 metacercariae/cua. Ở tỉnh Quảng
Trị, tỷ lệ và cường độ nhiễm ở xã Tà Long là 96,0% và 12-608
metacercaria/cua; ở xã Da Krong là 78,0% và 1-78
metacercaria/cua, ở xã Hướng Sơn là 100% và 7-500
metacercariae/cua, ở xã Tân Thanh là 10,0-12,0% và 1-6
metacercariae/cua.
- Cua suối ở Lào Cai và Yên Bái bị nhiễm 4 loài SLP, cua suối ở
Quảng Trị bị nhiễm 4 loài SLP. Trong số đó, tỷ lệ nhiễm
P. heterotremus cao nhất ở Lào Cai và Yên Bái, tỷ lệ nhiễm
P. westermani cao nhất ở Quảng Trị.
2. Đa dạng hình thái và di truyền của P. heterotremus và
P. westermani
- Metacercaria của 2 loài SLP đều đa dạng về hình thái và kích
thước, nhưng có sự tương đồng cao về di truyền phân tử.
- Phân tích phân tử và hình thái xác định P. westermani ở Việt
Nam thuộc nhóm 2n.
3. Một số đặc điểm sinh học của Paragonimus heterotremus và
Paragonimus westermani
26
- VCTG 1 của loài P. heterotremus là ốc Triculinae gen sp.1, của
loài P. westermani là ốc S. quangtriensis, và của loài
P. proliferus là Triculinae gen sp.2.
- Cercaria của 3 loài SLP giống nhau về hình thái, tuy nhiên có
thể phân biệt qua chiều dài ruột và số lượng cercaria của redia.
- Vật chủ chính tự nhiên của loài P. westermani là mèo rừng
(Prionailurus bengalensis). Mèo rừng ở Da Krong bị nhiễm 3
loài SLP P. westermani, P. heterotremus và P. skrjabini.
- Trong gây nhiễm thực nghiệm, chó nhà không bị nhiễm loài
P. westermani. Mèo nhà bị nhiễm loài SLP này với tỷ lệ trưởng
thành thấp và thời gian phát triển dài hơn 4 tháng.
- Chuột đóng vai trò vật chủ chứa trong vòng đời phát triển của 2
loài P. heterotremus và P. westermani. Sán non ở cơ có kích
thước tương tự như metacercaria và có thể phát triển đến trưởng
thành ở vật chủ chính, sán non ở gan có kích thước lớn hơn,
không phát triển đến trưởng thành ở vật chủ chính.
- Sức sống của metacercaria SLP phụ thuộc vào dung dịch nuôi,
nhiệt độ và mật độ metacercaria. Ở điều kiện nước muối sinh lý,
ở nhiệt độ 4oC có thể sống tới 12 tháng. Mật độ metacercaria
càng thấp thì metacercaria càng sống lâu hơn.
4. Kỹ thuật dot-ELISA chẩn đoán bệnh sán lá phổi
- Độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng dot-ELISA với kháng
nguyên chất tiết của SLP là 100% và 96,7%.
- Nồng độ kháng nguyên thấp nhất có thể sử dụng là 0,5mg/ml.
- Thời gian ủ với huyết thanh, kháng thể 2 và thời gian hiện màu
phụ thuộc vào nhiệt độ. Nhiệt độ càng thấp thì cần thời gian lâu
hơn. Tổng thời gian của phản ứng có thể từ 51 phút (37oC đến
4h21 phút (4oC).
0
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÓ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI
1. Lƣu Anh Tú, Hoàng Văn Hiền, Bùi Khánh Linh, Phạm Ngọc
Doanh, 2017. So sánh phương pháp ép và giã-lọc cua tìm ấu
trùng sán lá phổi. Hội nghị Sinh thái và tài nguyên sinh vật lần
thứ 7, tr.2000-2004.
2. Lƣu Anh Tú, Phạm Ngọc Doanh, Hoàng Văn Hiền, Đỗ Trung
Dũng, Nguyễn Thị Hợp, 2016. Sự phát triển và khả năng gây
bệnh của loài sán lá phổi Paragonimus westermani ở động vật thí
nghiệm. Tạp chí Sinh học, 38(2):133-139.
3. Doanh PN, Hien HV, Tu LA, Nonaka N, Horii Y, Nawa Y.,
2016. Molecular identification of the trematode Paragonimus in
faecal samples from the wild cat Prionailurus bengalensis in the
Da Krong Nature Reserve, Vietnam. Journal of Helminthology
90(6):658-662.
4. Doanh PN, Tu LA, Bui TD, Loan TH, Nonaka N, Horii Y, Blair
D, Nawa Y., 2016. Molecular and morphological variation
of Paragonimus westermani in Vietnam with records of new
second intermediate crab hosts and a new locality in a northern
province. Parasitology 143(12):1639-46.
Recommended