Podstawy genetyki II

Podstawy genetyki II

Metody badawcze genetyki i organizmy modelowe

Podstawowe techniki genetyki molekularnej

2

Czym jest inżynieria genetyczna? Ang. recombinant DNA – manipulacje DNA in vitro

}  izolacja i amplifikacja DNA i cDNA }  mapowanie i sekwencjonowanie DNA }  tworzenie nowych cząsteczek DNA

}  przez rekombinację cząsteczek naturalnych }  przez syntezę de novo

}  wprowadzanie konstruktów DNA do komórek i organizmów }  modyfikacje syntezy białek

}  ekspresja heterologiczna

}  bioinformatyka

3

A co nie jest inżynierią genetyczną? }  Inżynieria embrionalna (np. klonowanie)

}  Tworzenie nowych form organizmów przez selekcję

4

Zastosowania }  Badania podstawowe }  Biotechnologia

Granica między badaniami podstawowymi a stosowanymi jest płynna, stosowane techniki są podobne, różnice dotyczą głównie skali.

5

Podstawowe techniki }  Izolacja DNA ze źródeł naturalnych

}  komórki i tkanki }  mikroorganizmy hodowane w laboratorium i występujące

naturalnie }  antyczny DNA

}  cDNA – izolacja RNA i przepisanie na DNA }  Chemiczna synteza DNA de novo

6

PCR

© 2005 Prentice Hall Inc. / A Pearson Education Company / Upper Saddle River, New Jersey 07458

7

Elektroforeza DNA i RNA

© 2005 Prentice Hall Inc. / A Pearson Education Company / Upper Saddle River, New Jersey 07458

8

Hybrydyzacja }  Wykorzystanie komplementarności kwasów

nukleinowych do wykrywania określonej sekwencji DNA (Southern) lub RNA (Northern)

© 2005 Prentice Hall Inc. / A Pearson Education Company / Upper Saddle River, New Jersey 07458

9

Hybrydyzacja Northern

}  Podstawowa metoda badania poziomu ekspresji genu

10

Podstawowe techniki

}  Enzymy restrykcyjne }  analiza fragmentów DNA

(mapowanie) }  klonowanie

11

Wektory }  Umożliwiają utrzymanie DNA wprowadzonego do

komórek (transformacja, transfekcja) }  wektory autonomiczne – zdolne do replikacji (np.. plazmidy,

wirusy) }  wektory integracyjne }  wektory ekspresyjne – umożliwiają ekspresję wprowadzonego

genu (autonomiczne lub integracyjne) }  wektory kierujące rekombinacją (ang. targeting) – integracyjne }  wektory bifunkcjonalne

12

Typowy wektor }  Sekwencje zapewniające replikację (w. autonomiczne) }  Sekwencje umożliwiające odróżnienie komórek z wprowadzonym

wektorem – markery selekcyjne }  Miejsce do wstawienia klonowanego DNA – linker }  Opcjonalnie – sekwencje umożliwiające odróżnienie wektora ze

wstawką od wektora „pustego” – marker rekombinacji

13

Klonowanie molekularne }  Włączenie danego fragmentu DNA (wstawki) do wektora

autonomicznego

14

Przykłady zastosowań }  Poznawanie sekwencji DNA (genów, genomów,

mutantów) }  Diagnostyka molekularna }  Ekologia i filogenetyka molekularna }  Heterologiczna ekspresja białek (dla celów poznawczych i

biotechnologicznych) }  „Odwrotna genetyka” – inaktywacja wybranych genów u

organizmów modelowych }  Terapia genowa

15

Sekwencjonowanie – metody klasyczne

}  Dideoksynukleotydy zatrzymują syntezę na określonych nukleotydach

!3’ ATCGGTGCATAGCTTGT 5’! !5’ TAGCCACGTATCGAACA* 3’!5’ TAGCCACGTATCGAA* 3’!5’ TAGCCACGTATCGA* 3’!5’ TAGCCACGTA* 3’!5’ TAGCCA* 3’!5’ TA* 3’!

Produkty reakcji A

Matryca

16

Tradycyjny odczyt sekwencji }  Znakowanie radioaktywne,

osobne reakcje A T C G

+

–

17

CGTAA CGTAAC CGTAACC CGTAACCC CGTAACCCT CGTAACCCTT CGTAACCCTTG CGTAACCCTTGG

• Obecnie stosuje się dideoksynukleotydy wyznakowane fluorescencyjnie – każdy innym kolorem

Sekwencjonowanie automatyczne

18

Sekwencjonowanie automatyczne

19

Postęp techniczny }  Koszt sekwencjonowania między 1999 a 2009 obniżył sie 14 000

razy }  Prędkość odczytu sekwencji między 2000 a 2010 r. wzrosła 50 000

razy }  Cel: sekwencja genomu jednej osoby za 1000$ osiągalny w ciągu

kilku lat }  Im więcej znamy sekwencji, tym łatwiej poznajemy kolejne

20

Sekwencjonowanie wysokoprzepustowe }  Tzw. deep sequencing }  Generowanie w jednym przebiegu milionów niezależnych

odczytów }  Pojedyncze odczyty krótkie (25-400 bp) }  Zastosowania

}  sekwencjonowanie nowych genomów }  resekwencjonowanie

}  np. analiza zmienności

}  badanie ekspresji przez sekwencjonowanie cDNA

21

Solexa

= 350

Solexa® Ultra-high-throughput DNA Sequencing Platform

22

Pirosekwencjonowanie (454)

The development and impact of 454 sequencing Jonathan M Rothberg & John H Leamon Nature Biotechnology 26, 1117 - 1124 (2008)

•  Fragmenty DNA przyłączone do kulek (1 fragment na kulkę), następnie namnożone

•  Kulki z DNA umieszczone w studzienkach

•  Sekwencjonowanie przez syntezę: dodaje się kolejno 4 nukleotydy, gdy dodany nukleotyd komplementarny, to uwoniony pirofosforan daje reakcję z luminescencją

•  Wynik: ~800,000 odczytów po 250-500 bp (~400 megabases)

23

Slides from http://www.illumina.com

Solexa (Illumina)

24

Slides from http://www.illumina.com

Solexa (Illumina)

25

Slides from http://www.illumina.com

Solexa (Illumina)

26

Slides from http://www.illumina.com •  Wynik: 80-100 milionów odczytów po

~50 bp (~4Gb)!

Solexa (Illumina)

27

Sekwencjonowanie }  Głównym wyzwaniem w sekwencjonowaniu nie jest sam

odczyt sekwencji }  Odczytywane fragmenty są krótkie

}  do ~700-800 nt (sekw. tradycyjne Sangera) }  200-400 nt (454) }  50-150 nt (Solexa)

}  Wyzwaniem jest złożenie długiej sekwencji z tych krótkich fragmentów

28

Genomika

}  Genomika jest dziedziną zajmującą się badaniem całych genomów (kompletu informacji genetycznej) różnych organizmów

}  Techniki biologii molekularnej + robotyka + informatyka

}  Sekwencjonowanie i charakteryzowanie genomów }  Badanie funkcji zawartych w nich genów

29

Metagenomika }  Izolacja DNA ze środowiska i sekwencjonowanie }  Jedyny sposób badania mikroorganizmów, które nie dają

się hodować

30

Metagenomika

}  Analiza sekwencji całości DNA wyizolowanego ze zbiorowiska organizmów

31

Odkrycia dzięki sekwencjonowaniu

}  Tajemnicza UCYN-A }  Sinica (cyjanobakteria) }  Niewielki genom (1,4mln par zasad, 1200 genów) }  Brak zdolności fotosyntezy, cyklu Krebsa, syntezy niektórych aminokwasów }  Zdolność asymilacji azotu }  Symbioza? – tajemnicza ekologia

32

RNA-seq

33

Sekwencjonowanie nowej generacji – wyzwanie dla bioinformatyki

}  Krótkie odczyty (50-150 nt) }  pojedyncze }  “paired-end”

}  Problem identyfikacji i składania sekwencji }  Indeksowanie i multipleks

34

Genom człowieka

35

Craig Venter Francis Collins (NIH) 36

37

Czym jest znajomość genomu }  Nie jest “odczytaniem księgi życia” }  Sama sekwencja nie daje jeszcze zrozumienia, jak

funkcjonują komórki }  Ale jest niezwykle cennym narzędziem w badaniach

}  Sekwencja nie jest lekarstwem }  Ale bardzo pomaga w zrozumieniu mechanizmów chorób i

wynajdywaniu nowych terapii

38

Co genom już dał nauce }  Dużo ciekawych i zaskakujących odkryć

}  Dlaczego mamy tak mało genów }  Jak ewoluował człowiek

}  Narzędzie do badania funkcji genów

39

Czy warto badać genomy

40

}  Nowoczesne techniki generują bardzo dużo danych }  Dwa podejścia

}  “hypothesis driven” – dane zbierane dla zweryfikowania jakiejś hipotezy

}  “data driven” – dane zbierane bez wstępnych założeń, potem wyszukiwane w nich prawidłowości

Zbieranie danych

41

}  Podejście zakładające poszukiwanie prawidłowości w dużych zbiorach danych, zbieranych bez wstępnych założeń, może być produktywne

}  Ale niesie też (dobrze znane w literaturze) ryzyko }  Lem, S. Cyberiada, Wyprawa szósta: czyli jak Trurl i Klapaucjusz

demona drugiego rodzaju stworzyli, aby zbójcę Gębona pokonać., 1965.

}  http://www.portalwiedzy.pan.pl/images/stories/academia_2012/academia_2013/022013/004-008_golik.pdf

TCACAATTTAGACATCTAGTCTTCCACTTAAGCATATTTAGATTGTTTCCAGTTTTCAGCTTTTATGACTAAATCTTCTAAAATTGTTTTTCCCTAAATGTATATTTTAATTTGTCTCAGGAGTAGAATTTCTGAGTCATAAAGCGGTCATATGTATAAATTTTAGGTGCCTCATAGCTCTTCAAATAGTCATCCCATTTTATACATCCAGGCAATATATGAGAGTTCTTGGTGCTCCACATCTTAGCTAGGATTTGATGTCAACCAGTCTCTTTAATTTAGATATTCTAGTACATACAAAATAATACCTCAGTGTAACCTCTGTTTGTATTTCCCTTGATTAACTGATGCTGAGCACATCTTCATGTGCTTATTGACCATTAATTAGTCTTATTTGTTAAATGTCTCAAATATTTTATACAGTTTTACATTGTGTTATTCATTTTTTAAAAAATTCATTTTAGGTTATATGTATGTGTGTGTCAAAGTGTGTGTACATCTATTTGATATATGTATGTCTATATATTCTGGATACCATCTCTGTTTCATGCATTGCATATATATTTGCCTATTTAGTGGTTTATCTTTTCATTTTCTTTTGGTATCTTTTCATTAGAAATGTTATTTATTTTGAGTAAGTAACATTTAATATATTCTGTAACATTTAATGAATCATTTTATGTTATGTTTAGTATTAAATTTCTGAAAACATTCTATGTATTCTACTAGAATTGTCATAATTTTATCTTTTATATACATTGATATTTTTATGTCAAATATGTAGGTATGTGATATTATGCACATGGTTTTAATTCAGTTAATTGTTCTTCCAGATGTTTGTACCATTCCAACATCATTTAAATCATTAAATGAAAAGCCTTTCCTTACTAGCTAGCCAGCTTTGAAAATCCATTCATAGGGTTTGTGTTAATATATTTTTGTTCTTTTTTTTCCTTTCTACTGATCTCTTTATATTAATACCTACTGTGGCTTTATATGAAGTCATGGAATAATACGTAGTAAGCCCTCTAACACTGTTCTGTTACTGTTGTTATTGTTTTCTCAGGGTACTTTGAAATATTCGAGATTTTATTATTTTTTAGTAGCCTAGATTTCAAGATTGTTTTGACGATCAATTTTTGAATCAATTGTCAATATTTTTAGTAATAAAATGATGATTTTTGATTGGAAATACATTAAATCTATAAGCCAAATTGGAGATTATTGATATATTAACAAAAATGAGTTTTCCAGTCCATGAATGTATGCACATTATAAAATTCATTCTTAAGTATGTCATTTTTTAAGTTTTAGTTTCAGCAGTATATGTTTGTTACATAGGTAAACTCCTGTCATGGGGGTTAGTTGTACAGGTTATTTTATCATCCAGGCATAAAGCCCAGTACCCAGTAGTTATCTTTTCTGCTCCTCTCCCTCCTGTCACCCTCCACTCTCAAGTAGACCCCAGTTTCTGTTGTTCTCTTCTTTGCATTAATGACTTCTCATCATTTAGATTGCACTTGTAAGTGAGAACAGGACGTATGTGGTTTTCTACTCCTGTGTTAGTTTGCTAAGGATAACCACCTCCATCTCCATCCATGTTCCCACAAAAGACATGATCTCCTTTTTTATGGCTGCATATTATTCCATGGTATATATGTACCACATTTTCTTTATCCAATCTGTCATTGATGGACATTTAGGTTGTTTCCACATCATTGCCGTTGTAAATACTGCTGCAGTGAATATTCGTGTGTATGTCTTTATGGTAGAATGATTTATATTCCTCTGGGTATATTTCCAAGTAATGGGATGGTTGGGTCAAATGGTAATTCTGCTTTTAGCTTTTTGAGGAATTGCCATATTGCCTTTCACAACGGTTGAACTAATTTATACTCCCAAGAGTGTATAAGTTGTTCCTTTTTCTCTGCAACCTCGACATCACCTGTTATTTATGACTTTTATATAATAGCCATTCTGCTGGTCTGAGATGGTATCTCATTATGATTTTGATTTGCATTTCTCTAATGCTCAGTGATATTGAGCTTGGCTGCATATATGTCTTCTTTTAAAAATATCTGTTCATGTCCTTTGCCTAATTTATAACGGGGTTGTTTGTTTTTCTCTTGTAAATTTGTTTAAGTTCCTTATAGATTCTAGGTATTAAACCTTTTTTCAGAGGCGTGGCTTGCAAATATTTTCTCCCATTCTATAGGTTGTCTGTTTATTCTGTTGATAGTTTCCCTTGCTGTGCAGAAGCTCTTAACTTTAATTAGATCCGACTTGTCAATTTTTGCTTTGGTCGCAATTGCTTTTGATGTTATTGTCGTGAAATCTTTGCTAGTTCTTAGGTCCAGGATGATATTGCCCAAGTTGTCTTCCAGGGCTTTTATAATTTTGGATTTTACATTTAAGTCTTAATATATTTATTAAATTTGTTAGGGTTTCAGGATACAAGGACAATATAGCAGCAAACAATGTAAAAGTAAAATCTGAAAAATAATAGAAAACAGTTTAATTGAACACTTTACCATTATGTAATGCCCTTCTTTGTCTTTCCTGATCTTTGTTGGTTTGAAGTTCAAAAAAGACAAACTTAATGGTACAATAGGTATTGTAGATTTCAGGACTTTCTGTATAAAATATTTTGTATATATGAATAGATCATTTTTTATTTCCAGTCTTTAAACATTTTCTTAACATTTTCTTCTATTGCTTCACTTCACTCGCTAGGACCATCAGGACAGTGTTGAACAGAAATTGTCAGACTGATCATCACAACTTTTTCTAGATTTTAGAAGGAAATTTTTCTTTATTTCAACATAAAGCAGCATGTTAATGCCAAGTTTTAATATGTGTTATCAGATTGAAATTTTTTTGTATATTTCTACATTACCAAGAATTTTTAGCAAGAGTTTTTGTTGAGTTTTAATTTAAAAATCATTTGTTAATTTCATCTGATTTTTTTATTTCTCTTTTTACCTTAAGAGATTAAACTGACTACAGATTGAATATAAACAAACAAACAAACAAACAAAAACTCTAAAATGCTGTGGATCAACACCACTTAGTAATTTGTATACTTGGATTCAATTTGCTGAAATTTTGTTAGACATTTTTGCGTCGATATTTATGAGGGATGTTGATCTGTAAAAGTATTAAAATGCCTTTGACAGATAGTGTCACCATATAAAAAACTTTGAACAAAATCAGATTATATCACTGTGGATATTTCTATTTTGAACTAACTTAGATGATAATTTTAATCTATATCCTAGATGAACT

Co to znaczy?

Mały fragment chromosomu 21 42

Co to znaczy? }  Bez teorii ewolucji nie mielibyśmy możliwości poznania

odpowiedzi na to pytanie }  Odszukujemy geny podobne do genów już zbadanych }  Możemy badać geny przez “odwrotną genetykę” –

tworzenie mutantów u organizmów modelowych }  Porównując genomy możemy wnioskować o biologii

organizmu

43

Odwrotna genetyka – od genu do funkcji

Genetyka tradycyjna

Funkcja (mutacja, fenotyp)

Klonowanie genu

Analiza sklonowanego genu

Genetyka „odwrotna”

Gen (z sekwencji całego genomu)

Inaktywacja genu

Analiza uzyskanego fenotypu

44

Odwrotna genetyka – inaktywacja przez rekombinację

45

Inaktywacja warunkowa

46

Odwrotna genetyka – interferencja RNA

Odkrycie roku 2002 – regulacyjna rola małych RNA Nagroda Nobla w dziedzinie medycyny 2006, za odkrycie mechanizmu interferencji RNA A. Fire i C. Mello 47

siRNA - jak to działa?

Hannon G.J.: ‘RNA interference’, Nature 418, July 11, 2002

Efekt – degradacja mRNA 48

Zastosowania siRNA

}  Badanie funkcji genów (“odwrotna genetyka”) - szczególnie skuteczne u nicienia Caenorhabditis, ale działa też w komórkach owadów, ssaków i roślin

}  Hamowanie wybranych genów jako metoda leczenia (np. zwalczania wirusów czy

nowotworów) – przykład: obniżenie poziomu receptora LDL („zły cholesterol”) u myszy

49

Ekspresja heterologiczna

Wektor ekspresyjny Oczyszczanie białka

50

Fuzje białkowe

}  Do sekwencji kodującej białko dołącza się inną domenę, np. ułatwiającą wykrycie i/lub oczyszczanie }  znaczniki epitopowe }  GFP (zielone białko fluorescencyjne)

51

Green Fluorescent Protein- Aequorea victoria

52

GFP

53

wt hPNPaza

-52 hPNPaza

MitoTracker anti-c-myc Nałożenie

Lokalizacja mitochondrialna nadejsprymowanej hPNPazy-myc w komórkach HeLa.

54

Ekspresja heterologiczna w biotechnologii

55

Inżynieria przeciwciał – leki przyszłości }  W łańcuchach immunoglobulin obszary zmienne

odpowiadają za rozpoznawanie różnych antygenów, obszary stałe nadają specyficzność gatunkową

}  W klasycznych metodach wytwarzania przeciwciał monoklonalnych uzyskiwano przeciwciała zwierzęce

}  Klonowanie i ekspresja genów kodujących przeciwciała jest alternatywnym sposobem ich uzyskiwania

}  Możliwe jest uzyskiwanie przeciwciał humanizowanych – obszary zmienne z genu przeciwciała zwierzęcego wstawione między obszary stałe przeciwciała ludzkiego

}  Humanizowane i rekombinowane ludzkie przeciwciała są stosowane w terapii np. nowotworów

56

Terapia genowa }  Zastępująca – wprowadzenie genu, którego defekt powoduje

chorobę }  Trudności z opracowaniem wektorów i zapewnieniem ekspresji,

zwłaszcza dla komórek nie dzielących się }  Stosowana dla chorób związanych z ekspresją genów w komórkach krwi

(np. SCID – gen ADA) i innych, które łatwo wprowadzić do organizmu (np. makrofagi – choroba Gauchera)

}  Inaktywująca – zmniejszenie ekspresji genu, którego ekspresja powoduje chorobę (np. nowotworową) }  Technicznie łatwiejsze i bezpieczniejsze (siRNA, modyfikowane

oligonukleotydy) }  Ograniczone zastosowania, pacjent musi ciągle przyjmować kosztowne

leki

57

Organizmy modelowe

Ogólne zasady i przykłady

58

Co to jest model?

? ?

«konstrukcja, schemat lub opis ukazujący działanie, budowę, cechy, zależności jakiegoś zjawiska lub obiektu» Słownik Języka Polskiego PWN

59

Organizmy modelowe

“Les éléments vitaux étant de nature semblable dans tous les êtres vivants, ils sont soumis aux mêmes lois organiques...”

“Podstawowe jednostki życia, mając u wszystkich żyjących istot podobną naturę, rządzone są tymi samymi prawami organicznymi...”

Claude BERNARD (1813-1878)

60

Modele w naukach przyrodniczych }  Modele analogii przyczynowej CAM

}  Przyczyny i skutki w układzie modelowym i docelowym są takie same. }  Nie mogą zaistnieć „jakiekolwiek istotne przyczynowo braki analogii

między modelem a modelowanym zjawiskiem“.*

}  Modele analogii hipotetycznej (HAM) }  Doprowadzenie do sformułowania hipotez, które mogą mieć ogólne

znaczenie tak dla układu modelowego, jak i docelowego. }  Nie dostarczają danych mających bezpośrednie znaczenie dla medycyny

człowieka, jednak polepszając nasze rozumienie zjawisk biologicznych mogą one sugerować możliwe mechanizmy fizjologiczne u człowieka.

61

Mikroorganizmy }  Bakterie i bakteriofagi

}  Escherichia coli, fag T4, fag λ

}  Mikroorganizmy eukariotyczne }  drożdże Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe }  grzyby nitkowate (Neurospora, Aspergillus) }  Chlamydomonas

62

Fenotypy mutacji }  Mutanty pokarmowe (auksotrofie)

}  prototrof – zdolny do syntezy niezbędnych składników organicznych, wymaga źródła węgla i energii (np. glukoza) i soli nieorganicznych (źródło azotu i mikroelementów)

}  auksotrof – niezdolny do syntezy określonego związku, wymaga jego obecności w podłożu }  np. mutanty leu, trp, ura, thi,

}  Mutanty kataboliczne }  niezdolne do wykorzystywania źródła węgla, wykorzystywanego przez

typ dziki }  np. mutanty gal, xyl, lac }  glukoza zawsze będzie wykorzystywana

63

Fenotypy mutacji }  Oporność na antybiotyki i inhibitory

}  enzymy rozkładające antybiotyk (np. beta-laktamaza) }  pompy usuwające antybiotyk z komórki }  mutacje w białkach, na które działa antybiotyk

64

Podłoża hodowlane }  Pełne

}  zawierają wszystkie składniki nieorganiczne i organiczne }  często na bazie ekstraktów biologicznych (ekstrakt drożdżowy, pepton

itp.) }  mogą być uzupełniane źródłem węgla (np. glukoza)

}  Minimalne }  źródło węgla, źrodło azotu (nieorganiczne), sole i mikroelementy }  umożliwia wzrost prototrofa, auksotrofy nie rosną o ile nie doda się

odpowiedniego uzupełnienia }  np. mutant leu wyrośnie na podłożu minimalnym + leucyna

}  Syntetyczne pełne }  źródła węgla i azotu, sole + kontrolowany zestaw uzupełnień

(aminokwasy itp.) }  umożliwia wzrost wszystkim auksotrofom }  warianty typu “drop-out”, np. SC –leu (bez leucyny): wyrosną wszystkie

szczepy, z wyjątkiem auksotrofa leu

65

Selekcja mutantów - repliki

66

Nowoczesny wariant – roboty laboratoryjne

©Singer Instruments, UK

67

Selekcja }  Pozytywna (bezpośrednia)

}  Na podłożu selekcyjnym wyrastają wyłącznie pożądane mutanty }  Np. selekcja mutantów opornych na antybiotyk na podłożu z

antybiotykiem

}  Negatywna }  Mutanty nie rosną na podłożu selekcyjnym }  Np. selekcja mutantów leu na podłożu bez leucyny }  Konieczne zastosowanie metody replik

68

“Jeden gen – jeden enzym” }  Badania na Neurospora, Beadle & Tatum, 1942

69

Modyfikacje genetyczne }  Transformacja

}  wprowadzenie DNA do komórki }  niektóre bakterie pobierają DNA naturalnie }  większość bakterii, a także np. drożdże, a nawet komórki

ssaków w hodowli można “zmusić” do pobrania DNA }  metody chemiczne }  elektroporacja }  metody mechaniczne (“działo genowe”)

}  DNA integruje się w genom lub utrzymuje niezależnie (plazmidy)

}  Infekcja wirusowa (fagi, wirusy eukariotyczne)

70

Saccharomyces cerevisiae

71

Drożdże jako organizm modelowy }  Łatwa hodowla i testy fenotypowe }  Fizjologia typowa dla mikroorganizmów }  Bezpieczne i nieszkodliwe dla środowiska }  Dobrze poznana genetyka klasyczna (analiza tetrad, mapy) }  Łatwe manipulacje genetyczne (“odwrotna genetyka”,

plazmidy) }  Znana od 1996 sekwencja genomu (12,5 Mb)

72

Fenotypy }  pokarmowe }  oporności na inhibitory i antybiotyki }  defekty cyklu komórkowego }  biochemia komórki }  ekspresja genów i jej regulacja }  oddychanie komórkowe – genetyka mitochondrialna

73

Skąd wzięły się mitochondria? }  Teoria endosymbiozy

74

Jak mitochondria traciły swój genom

Wolno żyjące bakterie - 1800-4500 genów

Endosymbiontyczne bakterie (Rickettsia) - 850 genów

Pierwotne mitochondria (Reclinomonas) - 100 genów

Mitochondria „współczesne” - 30-40 genów

75

I jak się to odbywało }  Ucieczka DNA do jądra }  Przeniesienie genów do jądra za pośrednictwem RNA }  Zastąpienie funkcji przez gen pochodzący z genomu

gospodarza }  Zastąpienie funkcji przez gen pochodzący z innej linii

}  polimeraza RNA, polimeraza DNA – pochodzenie fagowe

76

Genom mitochondrialny S. cerevisiae

• kolisty (?-mapa), wysoce polimorficzny, ~80kb

• mała gęstość genów

• bardzo bogaty w AT (17% GC)

• 8-9 genów kodujących białka; ~10 ORF intronowych, 24 tRNA, 2 rRNA, 1 RNaseP RNA

• 7-8 elementów ori, złożone mechanizmy replikacji

77

Badanie ekspresji mtDNA u drożdży? }  Dziedziczenie mitochondrialne odkryto u drożdży (1966) }  Istnieje skuteczny system genetyczny pozwalający na

analizę mutantów o zaburzonej funkcji oddychania mitochondrialnego

}  Wciąż wiele niewiadomych

glukoza glicerol

Fot. Kamil Lipiński 78

Drożdże jako model dla badania chorób człowieka?

79

Genomy

S. cerevisiae H. sapiens

~1,2 x 107 bp ~3 x 109 bp

~6500 genów ~25 000 genów

~1800 genów wykazuje homologie z genami H. sapiens (30%)

~ 4000 genów wykazuje homologie z genami S. cerevisiae (13%)

Wiele podstawowych funkcji komórki jest zachowanych. Niekiedy możliwa wymienność białek drożdżowych i ludzkich (np. Ras, Oxa1)

80

Przykładowe drożdżowe modele chorób

}  Progerie Wernera i Blooma }  Choroby związane z defektami naprawy DNA

(HNPCC, ataksja-telangiektazja) }  Ataksja Friedreicha }  Zaburzenia komunikacji jądrowo - mitochondrialnej

(PEO) }  Choroby wywołane mutacjami w mtDNA (NARP) }  Poszukiwanie leków za pomocą drożdży

81

Zespół Wernera

}  Normalny rozwój w dzieciństwie.

}  Przedwczesne starzenie rozpoczyna się wraz z wiekiem dojrzewania.

}  Niski wzrost, owrzodzenia, zwapnienia.

}  Pacjenci dożywają średnio 47 lat. }  Przyczyną śmierci z reguły

choroba nowotworowa, albo schorzenia sercowo-naczyniowe.

Przyczyna: mutacje genu WRN kodującego

helikazę DNA z rodziny RecQ

82

Zespół Blooma

}  Opóźniony wzrost, karłowatość.

}  Zaburzenia pigmentacji skóry. }  Predyspozycje do wczesnego

(ok. 25 r. ż.) występowania wielu różnych nowotworów.

}  Z reguły nie dożywają 40-50 lat (1/3 nie dożywa 25 lat).

Przyczyna: mutacje genu BLM kodującego

kolejną helikazę DNA z rodziny RecQ

83

Zaburzenia w zespołach Wernera i Blooma }  Utrata stabilności genomu

}  Zaburzenia w okolicach telomerów (WRN) }  Zwiększona częstość wymiany chromatyd siostrzanych

(BLM) }  Zwiększona częstość zaburzeń kariotypowych }  Zwiększona częstość mutacji genów

84

SGS1 – model drożdżowy }  Gen SGS1 jest drożdżowym homologiem genów WRN i BLM. }  Fenotyp delecji SGS1:

}  zwiększona rekombinacja mitotyczna (zwłaszcza subtelomerowa) }  zaburzenia segregacji chromosomów }  zaburzenia mejozy

}  Białko Sgs1p jest zaangażowane w hamowanie nieuprawnionej rekombinacji i utrzymywanie stabilności genomu.

}  Ludzkie geny BLM i WRN częściowo komplementują fenotyp delecji SGS1

85

HNPCC (zespół Lyncha)

}  HNPCC - dziedziczny rak jelita grubego niezwiązany z polipowatością

}  Około 5% wszystkich raków jelita grubego }  Mutacje w genach kodujących białka zaangażowane w

naprawę niedopasowanych nukleotydów (mismatch repair)

}  Podwyższona częstość mutacji, zwłaszcza niestabilność traktów z powtórzeniami

}  Najczęściej mutacje genów hMSH2 i hMLH1

86

Drożdżowy model HNPCC

W mutantach drożdżowych wzrost spontanicznej mutagenezy

Alfred & Borts (2007) Biochem Soc Trans, 35:1525-28

Dla dokładniejszego zbadania efektu konkretnych mutacji ludzkich stworzono hybrydowe geny, w których fragmenty genu S. cerevisiae zastępuje się pochodzącymi z genów człowieka tak, by zachować funkcję w drożdżach (tzw. humanizowanie drożdży).

87

Ataksja Friedreicha }  Choroba układu nerwowego i mięśni

}  zaburzenia czucia }  obniżone napięcie mięśniowe }  kardiomiopatia, deformacje kręgosłupa i stóp

}  Autosomalna recesywna; 1/50 000 }  Mutacja dynamiczna w genie frataksyny }  Akumulacja żelaza w mitochondriach:

}  Zaburzenia systemów naprawczych mtDNA }  Zaburzenia w oddychaniu }  Stres oksydacyjny

Bramwell: Atlas of Clinical Medicine 88

YFH1 – drożdżowy homolog frataksyny }  Białko wiążące żelazo }  Mitochondrialny magazyn żelaza }  Detoksykacja nadmiaru żelaza }  Włączanie żelaza do centrów Fe-S

89

YFH1 – drożdżowy homolog frataksyny

}  Fenotyp delecji: }  defekt oddychania mitochondrialnego }  zwiększona wrażliwość na stres oksydacyjny }  akumulacja żelaza w mitochondriach: 10-krotnie większe

stężenie od szczepu dzikiego }  zależna od żelaza oksydacyjna degradacja centrów Fe-S

}  Ludzki gen kompensuje delecję genu drożdżowego

Cavadini i wsp., (2000), Hum Mol Genet, 9:2523-30 90

Drożdże w poszukiwaniu nowych leków

}  Systemy homologiczne }  Interaktory białek drożdżowych homologicznych do

białek ludzkich }  Białka docelowe dla znanych związków

drobnocząsteczkowych

}  Systemy heterologiczne }  Interaktory białkowe – system dwuhybrydowy }  Ekspresja w drożdżach białka (np. ludzkiego) i

poszukiwanie ligandów }  np. choroby degeneracyjne związane z agregacją białek:

choroba Alzheimera, Huntingtona itp. }  poszukiwanie ligandów toksyn bakteryjnych

91

Wielokomórkowe organizmy modelowe }  Arabidopsis thaliana }  Drosophila melanogaster }  Caenorhabditis elegans }  Danio rerio }  Gryzonie (mysz, szczur)

92

A. thaliana }  Modelowa roślina z rodziny krzyżowych }  Czas generacji ~ 6 tygodni

93

Fenotypy }  Wzrostowe }  Rozwojowe }  Fizjologiczne i biochemiczne }  Mechanizmy genetyczne }  Epigenetyka

94

Genom }  Stosunkowo niewielki (~150

Mb), znana sekwencja }  Techniki transformacji

genetycznej, wyciszania ekspresji genów itp.

}  Łatwa analiza mikroskopowa (przezroczyste siewki)

95

Transformacja Arabidopsis }  Transformacja komórek, regeneracja rośliny }  Infekcja Agrobacterium

96

Drosophila melanogaster }  Jeden z pierwszych organizmów modelowych genetyki,

wciąż używany

97

Drosophila melanogaster }  Genom (165 Mb)

98

Drosophila melanogaster }  Krótki cykl życiowy (~ 10 dni) }  Łatwa i tania hodowla }  Liczne potomstwo }  Znacząca homologia z

człowiekiem }  ok. 50% genów D. melanogaster

ma odpowiedniki u ssaków }  ok. 75% ludzkich genów

związanych z chorobami genetycznymi ma odpowiedniki u D. melanogaster

99

Drosophila i biologia rozwoju }  Modelowy organizm do badania genów kontrolujących rozwój }  Np. geny homeotyczne – genetyczna kontrola i ewolucja planów budowy

100

Geny HOX – regulatory rozwoju

101

Ewolucja genów HOX

Dzięki duplikacjom genów HOX wyewoluowały bardziej złożone plany ciała 102

Caenorhabditis elegans }  Nicień, długość ok 1,5 mm, ~1000 komórek }  Genom ~100 Mb }  Łatwa hodowla, przewidywalne zachowanie }  Modyfikacje genetyczne przez wyciszanie RNAi

103

Rozwój C. elegans Znane losy każdej komórki w rozwoju

104

Fenotypy i zastosowania }  Rozwój }  Apoptoza }  Układ nerwowy, behawior

Zaburzenia lokomocji

105

Danio rerio }  Model do badania biologii rozwoju kręgowców (łatwa obserwacja

mikroskopowa, przezroczyste jaja) }  Znany genom (~1,7�109 bp)

106

Mysz }  Modelowy ssak }  Genom (~3�109 bp) bardzo podobny do ludzkiego }  Możliwe manipulacje genetyczne, w tym ukierunkowane

uszkadzanie genów (“knock-out”) }  Szczury preferowane w badaniach neurobiologicznych,

trudniejsze manipulacje genetyczne

107

Myszy transgeniczne }  Wprowadzanie nowych sekwencji do genomu

}  np. geny reporterowe

}  Delecje genów (knock-out) }  Wprowadzanie mutacji punktowych

108

Myszy knock-out }  Izolacja komórek ES (zarodkowe macierzyste) z blastocysty }  Dawcą jest mysz szczepu białego

}  Modyfikacja i selekcja komórek ES z knock-out }  Wprowadzenie zmodyfikowanych komórek do blastocysty myszy

szczepu szaregu

109

Myszy knock-out }  Blastocysty zawierające zmodyfikowane komórki ES

wszczepia się myszy – matce zastępczej

110

Myszy knock-out }  Selekcja chimer z transgenem w linii płciowej

111

Nagroda Nobla 2007 }  Mario R. Capecchi, Martin J. Evans, Oliver Smithies }  Za opracowanie zasad wprowadzania specyficznych

modyfikacji genowych u myszy za pomocą zarodkowych komórek macierzystych

112