Osnovne metode molekularne biologije...1. Denaturacija (95°C, 30’’) (prekidanje vodikovih veza)...

Osnovne metode molekularne biologije

• PCR (lančana reakcija polimerazom)

• KLONIRANJE GENA

• HIBRIDIZACIJA

PCR

(engl. Polymerase chain reaction)

LANČANA REAKCIJA POLIMERAZOM

PCR - karakteristikeTehnika kojom se u kratkom vremenu (nekoliko sati)

može proizvesti milijarde kopija određenog fragmenta dvolančane molekule DNA bez kloniranja.

(Zapravo replikacija DNA u epruveti, in vitro)

Razvijena 1980tih, Kary Mullis (Nobelova nagrada 1993)

Jako osjetljiva metoda - dovoljna je DNA iz čak samo jedne stanice

Velika primjena u istraživanjima i biotehnologiji

Što sve trebamo znati za uspješan PCR

• Trebamo znati što tražimo, odnosno slijed nukleotida DNA (sekvencu) našeg (dio) gena = ciljna sekvenca

• Trebamo imati uzorke ciljne DNA koji će poslužiti kao KALUP u reakciji umnožavanja

• Trebamo imati DNA polimerazu, dNTP-ove i začetnice ili početnice (DNA helikaza?),

i pufer

• Trebamo imati uređaj za izvođenje reakcije!

ds-DNA uzorak, ciljna sekvenca

začetnice

začetnice su komplementarne suprotnim krajevima ciljne sekvence

Izvor:Tom Madej

Ciklus PCR-a• Napravi se smjesa svih potrebnih sastojaka u epruveti

• Smjesa se grije 1-2 min. na 95ºC (trebamo razdvojiti lance da bi se vezale začetnice!) Kakva treba biti DNA polimeraza da “preživi” visoku temperaturu?

• Temperatura se spušta na 40-60ºC da bi se vezale začetnice s komplementarnom DNA

• Temperature se podiže na 68-72ºC kroz 1-5 minuta da DNA polimeraza može sintetizirati nove lance

• Opaska: koristi se Taq DNA polimeraza iz organizma Thermus aquaticus, bakterije koja živi u toplim izvorima

1. Denaturacija (95°C, 30’’)

(prekidanje vodikovih veza)

2. Vezanje začetnica (40-60°C, 30’’)

3. Sinteza (72°C, 1000 nt/min)

3’

5’

3’

3’

5’

5’

5’

3’

Ciklusi se ponavljaju 25-35 puta

Količina DNA se po ciklusu povećava eskponencionalno – 2n

http://www.youtube.com/watch?v=DkT6XHWne6E

Važne napomene o PCR

• Odabir začetnica je jako bitan. Trebaju biti duge oko 20 pb da bi bile dovoljno specifične

• Treba paziti na nema komplementarnih slijedova unutar iste začetnice (zašto?)

• Začetnice međusobno ne smiju biti komplementarne! (zašto?)

• Udio GC i AT parova unutar jedne začetnice trebao bi biti podjednak (50%)

Važne napomene o PCR

• Tm (melting temperature) je temperatura koja se računa za svaku pojedinačnu začetnicu da bi se odredila optimalna temperatura za vezanje

• Formula: Tm = 4(G + C) + 2(A + T) oC.

• Paziti da Tm začetnica budu slične

• Produkti PCR reakcije se analiziraju tehnikom agarozne gel elektroforeze

Agarozna gel elektroforeza

Molekule se razdvajaju u gelu (polisaharid iz morskih algi), koji sadrži male pore, pomoću električnog polja

Služi za razdvajanje molekula DNA ili RNA prema veličini

Agarozna gel elektroforeza

DNA/RNA se vizualizira bojanjem gela etidij bromidom koji se interkalirau DNA i fluorescira pod UV svjetlom

Marker poznatih veličina fragmenata DNA

Uzorci različitihfragmenata DNA

Primjena PCR• Analiza stare DNA (izumrle životinje, mumije i slično)

• Medicinska dijagnostika: otkrivanje virusa (npr. HIV, hepatitis, HPV i slično prije pojave simptoma)

• Otkrivanje raka (otkrivanje mutacija u genima odgovornim za nastanak raka)

• U forenzici (analiza DNA iz krvi na mjestu zločina)

• U laboratorijima: za kloniranje gena, otkrivanje mutacija, uvođenje ciljanih mutacija, priprema za sekvenciranje itd.

Modifikacije PCR

• “obični” PCR

• ugnježđeni PCR

• fuzijski PCR

• RT-PCR

• Q-PCR

• Q-RT-PCR

• RACE

• inverzni PCR

• multiplex PCR

• Izotermalni PCR!

Ugnježđeni PCR

povećana osjetljivost kad jepočetna količina DNA mala

30 cycles

30 cyclesDrugi set početnica je unutarprvog produkta PCR reakcije

Fuzije gena pomoću PCR

međuprodukti

I II III

PCRovi:

konačni produkt

A B C D A D

Nucleic Acids Res. 1989 Jun 26;17(12):4895

Multiplex PCR

• Istovremena analiza više segemnata DNA u istom uzorku

• Koristi se više parova početnica koje moraju biti slične po temepraturi vezanja

• Optimiranje je teško

• Primjena: identifikacija ljudi, očinstva…

Izotermalni PCR

• Razvijeni su protokoli za PCR na samo jednoj temperaturi

• Umjesto različitih temperatura, u izotermalnom PCR koristi se samo jedna temperatura. Za razdvajanje lanaca se dodaje enzim DNA helikaza ili se koriste posebne DNA polimeraze koje mogu odmicati jedan lanac tijekom sinteze DNA

Real-time PCR (RT-PCR) ili PCR u stvarnom vremenu

(Quantitative PCR = Q-PCR ili qPCR)

Primjena:-Određivanje početnog broja molekula DNA koji služi kao kalup, npr. u istraživanjima za određivanje transkripcije gena- Velika primjena u dijagnostici (jako pomogla u dijagnosticiinfektivnih bolesti) - Određivanje udjela GMO (0.9%)

Naviše se koristi metoda TaqMan (proba, sonda)

fluorescenti biljeg prigušivač fluorescencije

Image created by Dan Pierce.

Ova proba je dizajniranada poveća osjetljivostqPCR. To je unutarnja,hidrolizirajuća proba

Sparuje se unutar regijekoja se umnaža

Prilikom sinteze DNA 5’→3 egzonukleazna aktivnost Taq polimerazeuklanja 5’ kraj unutarnje probe- fluorescentni biljeg se fizičkiodvaja od prigušivača

Pojačava se fluorescencija probe što se detektira ekscitacijom pomoću lasera

Image created by Dan Pierce.

Real-time PCR (RT-PCR) ili PCR u stvarnom vremenu

(Quantitative PCR = Q-PCR ili qPCR)

Unutarnje probe mogu biti obilježene s različitim biljezima što je pogodno za multipleks analize

Povećanje količine DNA u stvarnom vremenu prati povećanje fluorescencije

Princip rada Taqman probe

Povećanje količine DNA u stvarnom vremenu pratipovećanje fluorescencije

https://www.youtube.com/watch?v=pRwoOBuk00c

Broj ciklusaserije decimalnih razrjeđenja

Int

enz

itet

fluo

resc

enc

ije

Real-time PCR (RT-PCR) ili PCR u stvarnom vremenu

(Quantitative PCR = Q-PCR ili qPCR)

Skupa oprema!

http://www.youtube.com/watch?v=TkCBcL_xUUsApplied biosystems AB 7500 FAST

Razdvajanje visoke rezolucije (High Resolution Melt)

• Relativno nova metoda za otkrivanje mutacija, polimorfizama i epigenetičkih promjena u fragmentu dvolančane DNA

• Prvo se DNA koja se treba analizirati umnoži metodom PCR, a zatim umnoženi fragment precizno zagrijava od 50 C do 95 C

Lanci DNA se razdvajajuna visokoj temperaturi u realnom vremenu

https://en.wikipedia.org/wiki/High_Resolution_Melt

Razdvajanje visoke rezolucije (High Resolution Melt)

Koriste se fluorescentne boje koje se ugrađuju u dvolančanu DNA. Kad je boja ugrađena u DNAonda jako fluorescira. Kad se lanci DNA razdvoje, boja se ne može vezati pa slabije fluorescira. Fluorescencija se mjeri kamerom i rezultate prikazuje grafički.

Fluorescencija s vremenom pada

https://en.wikipedia.org/wiki/High_Resolution_Melt

Razdvajanje lanaca ovisi o sekvenci DNA

Interpretacija

Osoba ima dva alela – različiti izgled krivulje ovisno o tome je li mutacija u jednom ili oba kromosoma. Homozigoti imaju pomak u temperaturi, dok heterozigoti imaju drugačiji oblik krivulje

Prvo se radi umnažanje DNA pomoću qPCR, a zatim se radi HRM analiza

… niz metoda i tehnika kojima je moguće izolirati točno određeni gen iz genoma, umnožiti ga,

promijeniti i vratiti u genom iste ili bilo koje druge vrste…

Genetičko inženjerstvo ilitehnologija rekombinantne DNA

Temeljna oruđa

-Restrikcijske endonukleaze

-Plazmidi

-DNA-ligaza

- bakterija E. coli

– enzimi iz bakterija koji prepoznaju točno određeni redoslijed nukleotida u molekuli DNA i precizno režu oba lanca

- osnovno oruđe u kloniranju gena

- restrikcijski enzimi ne razlikuju DNA iz različitih organizama – prepoznaju svoje specifično mjesto cijepanja u DNA

- sekvenca koju prepoznaju je PALINDROM (ima os simetrije, isto glasi kad se čita s oba lanca )

Restrikcijske endonukleaze

• Neki enzimi režući ostavljaju 5’ stršeće krajeve (npr. EcoRI)

• Neki enzimi ostavljaju 3’ stršeće krajeve (npr.

PstI)

Restrikcijske endonukleaze

tupi krajevi

Copyright : ASM Press; Cooper: Stanica

Copyright : ASM Press; Cooper: Stanica

• Stršeći krajevi se zovu još “ljepljivi” ili kohezivni

• Restrikcijski enzimi su temeljno oruđe tehnologije rekombinantne DNA (genetičko inženjerstvo) –ugradnja strane DNA u vektor (PLAZMID)

• Još su potrebni: plazmidi i DNA ligaza i ostali enzimi za manipuliranje s krajevima DNA

Restrikcijske endonukleaze

Plazmidi - male kružne dvolančane molekule DNA

Temeljna tehnika genetičkog

inženjerstva

- kloniranje gena

Izrezivanje gena

ATGCGTGGATCCTATGGGACATTAACGAGCTATGGATCCTGAATATACGCACCTAGGATACCCTGTAATTGCTCGATACCTAGGACTTAT

ATGCGTGGATCCTATGGGACATTAACGAGCTATGGATCCTGAATATACGCACCTAGGATACCCTGTAATTGCTCGATACCTAGGACTTAT

Endonukleaza EcoRI

GATCCTATGGGACATTAACGAGCTATGGATACCCTGTAATTGCTCGATACCTAG

gen 45

gen 45

Povezivanje krajeva gena s krajevima plazmida (DNA-ligaza)

GATCCTATGGGACATTAACGAGCTATGGATACCCTGTAATTGCTCGATACCTAG

gen 45

GATCCTATGGGACAGATACCCTGT

jedan kraj plazmida

GCTATGCGATACCTAG

drugi kraj plazmida

i gen i vektor moraju biti porezani s ISTIM enzimom!

Ligaza iz bakteriofaga T4 za povezivanje ravnih krajeva

Plazmid pogodan za kloniranje gena mora sadržavati:

1) Mjesto za početak replikacije

2) Mjesto pogodno za ugradnju gena (polylinker)

3) Gen za otpornost na antibiotik

KLONIRANJE GENA U E. coli

Kloniranje drugim načinima

invitrogen

Kloniranje drugim načinima

NEBuilder

Nastavak kloniranja

• Ugrađena DNA u plazmidu se mora UNIJETI u bakteriju (transformacija)

• U bakteriji će doći do umnažanja plazmida (replikacije) zašto?

• Dodatak antibiotika osigurava da se selektiraju samo one bakterije koje su primile plazmid

• Jednostavnom diobom dobivaju se KLONOVI od jedne početne stanice

• Klonirani gen se može eksprimirati i dati PROTEIN

Copyright : ASM Press; Cooper: Stanica

Proizvodnja proteina u bakterijama

Medicina (farmacija)

• cjepivo za hepatitis B

• hormon rasta

• interferon alfa-2a (leukemije, hepatitis C)

• interferon beta 1-B (multipla skleroza)

• lepirudin (antikoagulant)

• koagulacijski faktori VIII i IX (hemofilije A i B)

• dornaza alfa (cistična fibroza)

• gonadotropin (sterilnost)

• inzulin (šećerna bolest)

• agluceraza (Gaucher)

• darbepoetin alfa (anemija)

• alteplaza (infarkt, pl. embolija, ishemija)

Prehrambena industrija

• kimozin

• lipaze

• riboflavin

• amilaze

• acetolaktat dehidrogenaza

2 500 ampula

Iz goveda (ili svinja)

3150

41,6 g inzulina

2 500 ampula

E. colis genom za

ljudski inzulin

41,6 g inzulina

Ekstrakcija

1500 Lpodloge

bioreaktor

826 L

Delić, 2004

Upotreba kloniranja - nastavak

• Genetička promjena biljaka ili životinja – transgeni

organizmi

• Tehnologija može pomoći u razvoju novih terapija za liječenje bolesti - genska terapija

Za proizvodnju eukariotskih proteina u bakterijama potrebne su dodatne obrade gena:

1) Gen ne smije imati introne (?)

2) Ispred gena treba ugraditi prokariotskipromotor

3) Terminator

Kloniranje RNA

Prvo je potrebno prevesti molekulu mRNA u cDNA (komplementarna RNA)

Najčešće se koristi poli-dT početnica

Zatim nastaviti kao kloniranje s DNA

Copyright : ASM Press; Cooper: Stanica

Po čemu se cDNA razlikuje od genomske DNAkod eukariota?

Genomsko (terapeutsko) kloniranje -ovca Dolly

• Prvi klonirani sisavac iz somatske stanice koristeći metodu prijenos jezgre

• Ovcu Dolly su klonirali Keith Campbell i Ian Wilmut sa instituta Roslin, dio Sveučilišta u Edinburghu i biotehnološke kompanije PPL Therapeutics

• Ovca Dolly je rođena 05. 07. 1996. i uginula je od bolesti pluća pet mjeseci prije sedmog rođendana. Smatra se da bolest nije povezana s kloniranjem

• Donorske stanice jezgre bile su iz stanica mliječnih žlijezda i mogućnost stvaranja cijelog organizma je dokaz da je moguće stvoriti zdrav organizam iz već diferencirane stanice

Razmislite, pronađite i odgovorite do petka 20.03.2020.

• Usporedite metodu PCR i kloniranje (navedite sličnosti i razlike)

• Usporedite kloniranje gena i genomsko kloniranje!

• Navedite razlike između novih načina kloniranja gena i „klasičnog” kloniranja

• Što je cDNA? Odgovorite na pitanje sa slajda 51.

• Pronađite koliko je bilo uspješno kloniranje ovce Dolly. Koliko je zametaka isprobano?

Osnove hibridizacije

• Hibridizacija nukleinskih kiselina se zasniva na glavnom svojstvu DNA ili RNA molekula –komplementarnosti lanaca. Jedna je od osnovnih metoda u molekularnoj genetici - služi za otkrivanje (detekciju) sljedova DNA

• Za hibridizaciju se upotrebljavaju probe ili sonde(DNA ili RNA oligonukleotidi)

• Obilježene probe se dodaju smjesi denaturirane ciljne DNA. Sve se inkubira u uvjetima koji stimuliraju nastanak vodikovih veza između komplementarnih lanaca.

Princip hibridizacije nukleinskih

kiselina

sonda

Copyright : ASM Press; Cooper: Stanica

http://sites.sinauer.com/cooper7e/animation0410.html

Southern BlotSouthern blot analizom ispituje se prisutnost određenog slijeda nukleotida u DNA pomoću hibridizacije obilježenom DNA probom (sondom)

Southern Blot

• DNA koja se analizira razgradi se na manje fragmente

• Dobiveni fragmenti se razdvoje na gelu

• Gen koji se želi otkriti se prethodno klonira u vektor i obilježi (radioaktivno ili neradioaktivno)

• DNA iz gela se denaturira i prenese na najlonsku membranu

• Membrana se uroni u otopinu s obilježenom probom

• Na principu komplementarnosti, proba će se vezati za DNA

• Nevezana DNA se ispere i na membranu se stavi film osjetljiv na X zrake

• Zacrnjenja na filmu se mjesta gdje se vezala proba

http://www.youtube.com/watch?v=1Q-_qgCtk3c

http://sites.sinauer.com/cooper7e/animation0411.html

Osnove hibridizacije nukleinskih kiselina

Otkrivanje specifičnih sekvenci u kompleksnoj smjesi

Northern Blot

Metoda za pretraživanje ukupne stanične RNA

Slična je metodi Southern blot: RNA se prenosi na membranu i detektira hibridizacijom s obilježenom (radioaktivnom) sondom

Koristi se za analizu ekspresije gena

Tehnika RFLP (restriction fragment lenght polymorphism)

Ovom tehnikom moguće je pronaći razlike između individua (npr. ljudi). Humani genom sadrži male promjene u sekvenci DNA = POLIMORFIZAM. Te male promjene u sekvenci mogu stvoriti nova ili poništiti stara mjesta prepoznavanja za restrikcijski enzim

Otkrivanje bolesti thenikom RFLP(pr. srpasta anemija)

Mutacijom se izgubilo MstII restrikcijsko mjesto

pitanja

• Koja suvremenija metoda može zamijeniti Northern blot da bi analizirali ekspresiju gena?

• Koja suvremenija metoda od RFLP može otkriti polimorfizme?

Tehnologija CRISPR/Cas9 –uređivanje genoma

Doudna and Charpentier, 2014, Nature 346

CRISPR = clustered regularly interspaced short palindromic repeats

Wright et al. 2016. Cell 164: 29-44

Normalna uloga sustava CRISPR-Cas(zaštita bakterija od napada stranom DNA)

Cas9 je endonukleaza koja usmjerena pomoću dvije male crRNA itracrRNA pronalazi ciljnu DNA (virus) i cijepa ga

crRNA

tracrRNA

Prenamjena sustava CRISPR-Cas za uređivanje genoma

Uz pomoć odabrane gRNA (oko 20 pb) može se uvesti dvolančani lom bilo gdje u genomu – zato je sustav CRISPR-Cas idealan alat za uređivanje genoma!

https://www.youtube.com/watch?v=5gQGWJraptU

Biljke i životinje promijenjene uređivanjem genoma

• Divlji kupus promijenjen tako da je otporan na herbicid

• Svinje s mutiranim genom RELA – pretpostavlja se da će biti otpornije na gripu

• Svinje s mutiranim genom MSTN imat će veću mišićnu masu jer ovaj gen sprječava rast mišića

• Svinje bez provirusa – lakša moguća upotreba u transplantaciji

Liječenje uređivanjem genoma

• Primjer na HIV-u

• Protein CCR5 je površinski receptor za vezanje virusa HIV-a

• Oko 10% ljudi ima mutaciju koja uklanja 32 nukleotida iz gena za CCR5 što dovodi do sinteze kraćeg proteina i nemogućnosti vezanja virusa

• „Berlinski pacijent” Timothy Ray Brown se nalazi u remisiji nakon što je 2007. primio koštanu srž donora s mutacijom u genu CCR5

• Ideja – metodom uređivanja genoma promijeniti gen CCR5 u T stanicama pacijenata (a možda i drugim) i vratiti ih natrag. 12 pacijenata testirano između 2011-2013 – uočeno prolazno smanjenje broja virusa

• CRISPR Targets Cancer in First Human Trial

• 21.06.2016. US National Institutes of Health (NIH) odobrio prvo istraživanje na ljudima “to use CRISPR–Cas9 to help augment cancer therapies that rely on enlisting a patient’s T cells, a type of immune cell.”

CRISPR bebe i moratorij• Unatoč problemima oko same metode i preporukama da se embriji ne

modificiraju, u studenom 2018. su u Kini rođene dvije blizanke za koje se tvrdi da im je mijenjan gen za receptor CCR5 iako nije bilo medicinski opravdano – dokazi nisu pokazani! (znanstvenik He Jiankui). Treća beba je navodno na putu

• Prijedlog od navedenih znanstvenika za moratorij na kliničku upotrebu uređivanja DNA ljudskih spolnih stanica (jajne stanice i spermiji) u svrhu stvaranja genetički modificirane djece. Ovo se ne odnosi na uređivanje genoma u istraživačke svrhe koje neće rezultirati trudnoćom ili somatskih stanica

Nature 2019; 257:165-168

Zanimljivosti

• Svađa između dvije istraživačke grupe oko „Gene-editing” patenta („uređivanje gena”)

• Jedna grupa je pod voditeljstvom dr. Jennifer Doudna, University of California, Berkeley, i dr. Emmanuelle Charpentier, Max Planck Institute for Infection Biology in Berlin.

• Druga grupa je pod voditeljstvom Feng Zhang, Broad Institute MIT i Harvard, Cambridge, MassachusettsNature, 07 March 2016

https://thenib.com/bad-blood

Pitanja

• Navedite bar dvije mane sustava CRISPR-Cas

• Što je dCas9 i? navedite bar dvije primjene