METODE PROUČAVNJA ĆELIJA/STANICA · ´Metode kojjje se najčešće ppjjjrimjenjuju za...

METODE PROUČAVNJA ĆELIJA/STANICA

Sva naučna eksperimentalna istraživanja, a top j ,podrazumijeva i istraživanja ćelija, zavise odlaboratorijskih metoda koje se koriste u ispitivanjustrukture i funkcije ćelije.

2

Metode koje se najčešće primjenjuju za j j p j j jproučavanje ćelija i tkiva uključuju

Pripremanje tkiva (fiksacija, bojenje)Promatranje tkiva pod mikroskopomRazvajanje frakcija

Subcelularna frakcionacija tkiva. Tkivo se prvo mehanički homogenizira kako bi seTkivo se prvo mehanički homogenizira kako bi se stanice razdrobile te oslobodile organele u vodenimedij koji obično sadrži saharozu.

3

BOJENJEBOJENJE

Da bi se povećao kontrast između različitih dijelova p jstanice i time povećao kontrast, stanice se bojebojama koje reaguju sa proteinima ili nukleinskim kiselinama kiselinama.

(tehnike bojenja ubijaju stanice pa to nije pogodan način pripremanja za analizu živih stanica)bojenje se obavlja mješavinom boja, koje manje ili više selektivno prikazuju sastojke tkivaBoje imaju kisele ili bazne osobine; dijelovi tkiva koji se boje Boje imaju kisele ili bazne osobine; dijelovi tkiva koji se boje bazičnim bojama nazivaju se bazofilni, a oni koji imaju afinitet za kisele boje nazivaju se acidofilnim

4

FIKSACIJAFIKSACIJA

Prije bojenja vrši se fiksacija, kako bi se stabilizirala i j j j j ,očuvala stanična struktura.

(formaldehidom, alkoholom, sirćetnom kiselinom , živin hlorid, pikrinska kiselina...)hemijske reakcije koje se dešavaju za vrijeme fiksacije su složene; reakcija se desava na amino grupi proteina složene; reakcija se desava na amino grupi proteina postupak se obično izvodi tako da se tkivo uroni u otopinu fiksativa u kojem dolazi do stabiliziranja ili međusobnog povezivanja proteinasvaki fiksativ ima i pozitivne i negativne učinke

5

SVJETLOSNA MIKROSKOPIJASVJETLOSNA MIKROSKOPIJA

Zbog činjenice da je većina stanica premalena da bi se posmatralagolim okom istraživanja uveliko zavise o upotrebi mikroskopagolim okom, istraživanja uveliko zavise o upotrebi mikroskopa.

Upravo su mikrosopska istraživanja biljnih i animalnih tkiva dovela doistog zaključka da su svi organizmi građeni od stanica pa seistog zaključka da su svi organizmi građeni od stanica, pa seprepoznavanje stanice kao osnovne jedinice svih živih organizamapripisuje upravo opažanjima pomoću svjetlosnog mikroskopa.

Uz tehnička poboljšanja koja dopuštaju vizualizaciju današnjisvjetlosni mikroskopi povećavaju posmatrane objekte i do 1000 puta.

Moć razlučivanja je mogućnost mikroskopa da susjedne bliskeobjekte razlikuje kao odvojene strukture, (maksimalna moćrazlučivanja svjetlosnog mikroskopa je 0.2 μm).

6

METODE ISTRAŽIVANJA STANICAMETODE ISTRAŽIVANJA STANICA

Mikroskopski – (mikroskop sa faznim kontrastom, p ( pinterferentni, ultramikroskop, ultravioletni i polarizacioni i elektronski mikroskop)

Mikromanipulatori – moguće je izdvojiti ili u stanicu ubaciti pojedine dijelove i posmatrati učinak tih postpakapostpaka.

Radioaktivni izotopi - obilježavanje staničnih dijelova p j j jradioaktivnim izotopima

7

SVJETLOSNI MIKROSKOP

Temelji se na uzajamnom djelovanju fotona i sastojaka tkiva koje se posmatra

P t j b j i i i l i j tlPosmatraju se obojeni pripravci u polarizovanom svjetlu

Optički dio se sastoji od tri sistema leća;Optički dio se sastoji od tri sistema leća;kondenzator (sakuplja i fokusira svjetlo te stvara snop koji osvjetljava predmet), objektiv ( povećava osvjetljenu sliku i prenosi do leće okulara)objektiv ( povećava osvjetljenu sliku i prenosi do leće okulara)okular (još više povećava sliku i prenosi do mrežnice oka promatrača)

8

Svjetlo se fokusira na uzorak pomoću leće kondenzatora a onda svjetlost leće kondenzatora, a onda svjetlost sakuplja leća objektiva mikroskopa.

SVJETLOSNI MIKROSKOP

9

Snaga svjetlosnog mikroskopa može se unaprijediti g j g p p jupotrebom videokamera i kompjutera za analizu i obradu slika.

Svjetlosna mikroskopija dostigla je nivo molekularnih analiza, metodama obilježavanja pomoću specifičnih molekula koje se unutar stanica mogu vizualizirati.

10

FLUORESCENTNA MIKROSKOPIJAFLUORESCENTNA MIKROSKOPIJA

primjenjuje se kao izuzetno osjetljiva metoda p j j j j jistraživanja unutarstanične raspodjele molekula.

Fluorescentna boja se primjenjuje za označavanje d đ l k l t fik i ih ili ži ih t i određene molekule unutar fiksiranih ili živih stanica,

sama apsorbira svjetlost jedne valne duljine, a emitira svjetlost druge. Fluorescencija se postiže osvjetljavanjem uzorka svjetlošću vane duljine koja pobuđuje fluorescentnu boju a kroz odgovarajuće filtere izabire se specifična boju, a kroz odgovarajuće filtere izabire se specifična valna duljina svjetlosti koju potom emitira fluoresentna boja.

11

FLUORESCENTNA MIKROSKOPIJAFLUORESCENTNA MIKROSKOPIJA

Svjetlost prolazi kroz eksitacijski filter, koji selekcionira svjetlo d đ l d lji i k iti l b j Dih ič određene valne duljine, i ekscitira plavu boju. Dihronično

ogledalo tad odbija eksitacijsko svjetlo usmjeravajući ga na uzorak. Fluorescentno svjetlo koje emituje uzorak, prolazi kroz dih ič l d l i d i filt k j d bi j tl d đ dihronično ogledalo i drugi filterkoje odabire svjetlo određene valne duljine, koje emitira fluorescentna boja.

12

ELEKTRONSKA MIKROSKOPIJAELEKTRONSKA MIKROSKOPIJA

Može doseći znatno većerazlučivanje od svjetlosnogmikroskopa jer je valna duljinaelektrona kraća od valne duljinesvjetlosti.

Valna duljina elektrona uelektronskom mikroskopu može biti ido 0,004 nm, što je 100 puta manjeod valne duljine vidljive svjetlosti

Dva osnovna tipa elektronskogmikroskopa su;

transmisijskipretražni (scanning)p ( g)

13

TRANSMISIJSKI ELEKTRONSKI MIKROSKOPTRANSMISIJSKI ELEKTRONSKI MIKROSKOP

Transmisijska elektronska mikroskopijaUzorci se fiksiraju i boje solima teških metala koje Uzorci se fiksiraju i boje solima teških metala koje omogućavaju stvaranje kontrasta, jer raspršuju elektrone Snop elektrona prolazi kroz uzorak i elektrone. Snop elektrona prolazi kroz uzorak i fokusira se na fluorescentnom zaslonu gdje se stvara slika.

14

SCANNING ELEKTRONSKI MIKROSKOPSCANNING ELEKTRONSKI MIKROSKOP

Pretražni (scanning) elektronski mikroskopPretražni (scanning) elektronski mikroskopKoristi se za dobivanje trodimenzionalne slikeSnop elektrona ne prolazi kroz biološki uzorakSnop elektrona ne prolazi kroz biološki uzorakPovršina stanice se prekriva teškim metalom, a snop elektrona se koristi za pretraživanje po snop elektrona se koristi za pretraživanje po uzorku. Elektroni koji se raspršuju ili emitiraju sa površine Elektroni koji se raspršuju ili emitiraju sa površine uzorka, sakupljaju se da stvore trodimenzionalnu sliku, kako se snop elektrona pomiče po stanici.

15

Kako bi se moglo posvetiti brojnim pitanjimaKako bi se moglo posvetiti brojnim pitanjima vezanim uz funkciju staničnih organela, pokazalo se da je neophodno izoliratipokazalo se da je neophodno izolirati organele eukariotskih stanica u takvom obliku koji se može upotrjebiti u biohemijskimobliku koji se može upotrjebiti u biohemijskim ispitivanjima.

16

Prvi korak u staničnom frakcioniranju je razbijanje stanične membrane u uslovima koji ne uništavaju ostale unutar stanične komponente. Primjenjuje se nekoliko metoda uključujućiPrimjenjuje se nekoliko metoda, uključujući

sonikaciu (izlaganje uzorka visokim frekvencijama zvuka), usitnjavanje u mehaničkom homogenizatorutretiranje u miješalici velike brzine.

Svi ti postupci dovode do kidanja stanične membrane iendoplazmatskog retikula na male fragmente dok ostaleendoplazmatskog retikula na male fragmente, dok ostalekomponente stanice (jezgra, lizosomi, peroksisomi, mitohondrijii kloroplasti) ostaju neoštećeni.

17

HOMOGENIZACIJAHOMOGENIZACIJA

Uslovi homogeniziranja moraju biti tako odabranida ne dođe do razaranja strukture i gubitkaproteina koji se želi izolirati.

Homogenizacija se vrši u otopini pri čemu se moravoditi računa o;;

TemperaturipHO t k iti kOsmotskom pritiskuRedoks potencijaluNeželjenom dejstvu enzimaNeželjenom dejstvu enzima

18

TEMPERATURATEMPERATURA

Homogenizacija se vrši pri niskim temperaturama Homogenizacija se vrši pri niskim temperaturama na kojima su proteini stabilni (4°C).

Više temperature mogu dovesti do denaturacije.Više temperature mogu dovesti do denaturacije.Na višim temperaturama su aktivni i enzimi koji mogu razgraditi željeni protein. g g j p

19

pHHomogenizacija se vrši pri fiziološkom pH uz upotrebu najčešće fosfatnih pufera.

Osmotski pritisakOsmotski pritisakHomogenizacija se mora izvesti u izotoničnim otopinama, a to znači da da je osmotski pritisak jednak p , j p jonom u ćeliji. Neizotonične otopine dovode do pucanja svih membranskih struktura ćelijemembranskih struktura ćelije.Pri zabijanju ćelijskih strukture i oslobađanju njihovog sadržaja dolazi domnogobrojinh nekontroliranih greakcija

U takvom slučaju dolazi do neželjenog djelovanja peptidaza koje se sprečava dodatkom smjese inhibitora ili dodatkom koje se sprečava dodatkom smjese inhibitora ili dodatkom goveđeg seruma koji postaje supstrat peptidazama.

20

Homogenizacija se može izvesti na više načina;Ultrazvukom (da ne bi došlo do denaturacije zbog zagrijavanja potrebno je hlađenje ledom)Zamrzavanje i otapanje, dovodi do razbijanja ćelija radi nastanka kristala leda.Osmotski šok (izvodi se neizotoničnim otopinama) Osmotski šok (izvodi se neizotoničnim otopinama)

Za homogenizranje se mogu koristiti i mješači sa Za homogenizranje se mogu koristiti i mješači sa nožićima postavljenim pod različitim uglovima.

tako se razbijaju ćelijske strukture ali i oštećuje tako se razbijaju ćelijske strukture ali i oštećuje hromozomska DNA, pa se za njenu izolaciju primjenjuju “nježnije” metode (teflonski homogenizer)j j ( g )

21

SUBCELULARNA FRAKCIONACIJA TKIVASUBCELULARNA FRAKCIONACIJA TKIVA

Frakcioniranje staničnih organelaOrganeli eukariotskih stanica mogu se izolirati

Diferencijalnim centrifugiranjemUltracentrifugomCentrifugiranjem u gradijentu gustoćeCentrifugiranjem u gradijentu gustoćeRavnotežnim centrifugiranjem

za biohemijsku analizu.

Tkivo se prvo mehanički homogenizira kako bi se stanicerazdrobile te oslobodile organele u vodeni medij koji običnosadrži saharozu (izotonična otopina) sadrži saharozu (izotonična otopina).

Frakcioniranjem tkiva, odnosno stanica moguće je odreditijih h ij ki tnjihov hemijski sastav.

22

Frakcioniranje stanice

Stanice se liziraju, a stanične komponente odvajaju serijom p j j jcentrifugiranja pri sve većim brzinama. Nakon s akog centrif giranja Nakon svakog centrifugiranja, pojedini se organeli sedimentirani na dnu mogu izdvojiti iz taloga. Supernatant se zatim ponovo centrifugira na većoj brzini da centrifugira na većoj brzini da bi se sedimentirali organeli koji su sljedeći po veličini.

23

Centrifugiranje ugradijentu gustoćegradijentu gustoće

Uzorak se stavi u oblikusloja na vrh gradijentasaharoze.Čestice različitih veličinaČestice različitih veličinasedimentiraju se dužgradijenta kao odvojeneprugepruge.Odvojene čestice semogu sakupiti u pojedinefrakcije gradijenta što sefrakcije gradijenta, što sepostiže probadanjemdna epruvete za

t if gi j icentrifugiranje isakupljanjem frakcija.

24

06.03.2013.

25