Kolo biološkega razumevanjaibk.mf.uni-lj.si/teaching/biokemija1/predavanja/... · 2011-05-23 ·...

www.bioteach.ubc.ca/.../ whatisbioinform/

Kolo biološkega razumevanja

19.stoletjeOdkritje zakonitosti dedovanja (G. Mendel)

20. stoletje1953- razkritje strukture DNA(J. Watson and F. Crick)

2000 – osnutek zaporedja človeškega genoma

21. stoletjeObdobje funkcijske genomike- transkriptom, proteom, metabolom, etc.

Preiskovanje vseh metabolitov –METABOLOMIKA

Izražanje vseh genov TRANSKRIPTOMIKA

Izražanje vseh proteinov PROTEOMIKA

PROTEOMIKA

DOLOČITEV STRUKTURE

INTERAKCIJE MED PROTEINI

Bioinformatika

IZRAŽANJE (EKSPRESIJA)

Razlika med “tradicionalno” biokemijo proteinov in proteomiko

www.chem.purdue.edu/

Lastnosti nekaterih proteinov

protein Mr (Da) št. ak. ostankov št. polipept. verig

citokrom c 13 000 104 1

lizocim 13 930 129 1

mioglobin 16 890 153 1

hemoglobin 64 500 574 4

RNA-polimeraza E.coli

450 000 4158 5

Titin** 2 993 000 26 926 1

Proteini: več kot 100 ak ostankov, Mr ≥ 10 000 Da oz. 10 kDa

Ločevanje in določevanje strukture proteinov

http://wolfson.huji.ac.il/purification/MarioColumns

Ločevanje proteinov z elektroforezo

Enodimenzionalna

Dvodimenzionalna

• Obarjanje z (NH4)SO4

• Ionska izmenjevalna kromatografija

• Gelska filtracija • Afinitetna kromatografija• Izoelektrično fokusiranje

• Dvodimenzionalna gelska elektroforeza

• HPLC• Masna spektroskopija• NMR• Kristalizacija• Itd.

Naravni proteini, izolirani iz bioloških sistemov

Rekombinantni proteini

faculty.ksu.edu.sa/.../Forms/AllItems.aspx

Čiščenje hipotetičnega proteina

Stopnja čiščenja

Vol (ml) Količina proteinov (mg)

Aktivnost (U) Specifična aktivnost (U/mg prot.)

Celični ekstrakt 1 400 10 000 100 000 10

Precipitacija z razt. visoke ionske moči

280 3 000 96 000 32

Ionska izmenjevalna kromatografija

90 400 80 000 200

Gelska filtracija 80 100 60 000 600

Afinitetna kromatografija

6 3 45 000 15 000

Gelska filtracija - ločevanje proteinov po velikosti na molekularnih sitih

http://bricker.tcnj.edu/tech/BIOL311chromatography.htm

Logarithmic scale

PROTEIN Native Mr (Da)

Subunits

Myoglobin 17,200 1TIM (triosephosphate isomerase) 53,300 2Hemoglobin 62,000 4IgG (immunoglobulin G) 140,000 4ATCase (aspartate transcarbamoylase) 307,900 12

Z gelsko filtracijo določamo molekulsko maso proteinov

Ionsko-izmenjevalna kromatografija – ločevanje proteinov glede na naboj

http://bricker.tcnj.edu/tech/BIOL311chromatography.htm

Pri ločevanju uporabljamo gradiente ionske moči in pH

Princip afinitetne kromatografije

Ligand – molekula, ki se veže na protein z visoko afiniteto

Ločevanje z afinitetno kromatografijo

Primeri uporabe afinitetne kromatografije

Čiščenje evkariontske mRNA

Čiščenje proteinov z Imunoafinitetno kromatografijo

http://www.bio.davidson.edu/

http://bricker.tcnj.edu/tech/BIOL311chromatography.htm

Avtomatizacija kromtografskih postopkov

HPLC – tekočinska kromatografija visoke ločkjivosti (pod visokim pritiskom)

Masni spekter mešanice insulina in beta-laktoglobulina

Kromatografija sklopljena z masno spektrometrijo- ločevanje mešanic proteinov- določevanje aminokislinskega zaporedja

LC/MSLC/MS/MS

-Hidroliza peptida v 6M HCl, 110C, 24h-Ločevanje AK z ionsko izmenjevalno kromatografijo-Določevanje koncentracije AK po barvanju z ninhidrinom

Določitev aminokislinske sestave

Določitev aminokislinskega zaporedja proteinov

Identifikacija sproščenih AK z metodo HPLC - kromatograma s PHT-označenih aminokislin

Edmanova razgradnja – postopno odcepljanke AK z N-konca

Phenylthiohydantoin (PHT)

19. StoletjeG. Mendel odkrije vzorce dedovanja

20. StoletjeJ. Watson in F. Crick leta 1953 razkrijeta strukturo DNA

21. StoletjeEra funkcijske genomike, celostnihraziskav genoma in njegovih funkcij

21. Stoletje - od genov, preko proteinov in metabolitov, do označevalcev bolezni in zdravil

Pristopi funkcijske genomike za odkrivanje bolezenskih markerjev in tarč za zdravila

transkriptom proteom metabolom

-Ekspresijske mikromreže -RT-PCR-siRNA

- 2D proteinske mape /MS-LC/MS(n)

- metabolično profiliranje-Metabolični pretoki (fluks)

Genomika, proteomika in druge “omike” so v medicinskih in farmacevtskih raziskavah močno pospešile razvoj novih zdravil (z manj stranskimi učinki) in odkrivanje novih bolezenskih markerjev.

-Obravnava sestavo genomov in njihovih genov

-Dele DNA genomov lahko organiziramo v knjižnice (genomske ali cDNA)

- Z reakcijo verižnega pomnoževanja PCR lahko pomnožimo katerikoli del genoma (potebujemo začetne oligonukleotide)

-Mednarodno povezovanje je omogočilo določitev zaporedja človeškega genoma in drugih genomov. Informacije so zdaj dostopne v javnih podatkovnih zbirkah

Genomika

Science, 2001

Polymerase Chain Reaction

Lehninger, str. 315

Reakcija verižnega pomnoževanja PCR – revolucija v raziskavah genoma (faza 1)

www.salisbury.edu/biology

Odkritje PCR je bilo ključno za pospešene raziskave genomov

Časovna skala določitve nukleotidnega zaporedja (sekvenciranja) genomov

Le dober procent človeškega genoma se prevede do proteinov……

Lehinger, 2008

Kaj pravzaprav pomeni sekvenciranje genoma, če pa ima vsak človek drugačen genom?

Med ljudmi je cca 1% razlike v nukleotidnem zaporedju (polimorfizmi)

• Razlike v eni sami bazi (SNPs),

• Mikrosateliti Microsatellites (short sequence repeats),

• Minisateliti (long sequence repeats),

• Delecije

• Duplikacije

Funkcijska genomika pri odkrivanju bolezenskih markerjev

education.scientity.com/Bioinformaticswww.well.ox.ac.uk/

Tehnologija DNA čipov in nova (naslednja, druga) generacija sekvenciranja

• Analiza genomske DNA (genotpizacija enojnih nukleotidnih polimorfizmov SNP, analiza variance števila kopij CNV oz. CGH, resekvenciranje).

• Analiza izražanja genov (ekspresijsko profiliranje: 3' ekspresijski, eksonski ali genski čipi, čipi za sledenje izražanja miRNA).

• Študije uravnavanja izražanja genov (kromatinska imunoprecipitacija na čipu ChIP-on-Chip, mapiranje prepisov).

.

Uporaba DNA mikromrežBazične (osnovne) raziskave– globalni pogled na izbrani biološki proces

Farmacevtska industrija - globalni pristop k testiranju potencialnih zdravilnih učinkovin- kreiranja tematskih DNA mikormrež za diagnosticiranje kompleksnih obolenj

Klinika – genotipizacija, odkrivanje normalnih in okvarjenih alelov- določanje enojnih nukleotidnih polimorfizmov (SNP) razvoj “osebne medicine”- odkrivanje genov, vključenih v bolezenski fenotip večfaktorskih obolenj

http://www.ieee.org/portal/

47 000 transkriptov 39 000 genov

Ekspresijsko profiliranje z mikromrežami

http://www.genomictree.com/images/bioimg09.jpg

Iskanje novih bolezenskih označevalcev - ekspresijsko profiliranje in pregled genoma z mikromrežami

DNA čipi so zbirka mikroskopskih “DNA točk”, cDNA ali oligonukleotidov, pritrjenih na trdo podlago. Omogočajo nam celostni vpogled v genom in transkriptom.

Uporabljajo se za:• Analizo genomske DNA (genotipizacija, SNP analiza, CHG, sekvenciranje).

• Analizo izražanja genov (ekspresijsko profiliranje) , kjer probe lahko predstavljajo 3'–konce genov, eksone ali različne dele genov. Posebni čipi pa so za sledenje izražanja miRNA.

• Študije uravnavanja izražanja genov (določanje vezavnih mest transkripcijskih faktorjev, metilacija kromatina), kjer probe predstavljajo 5’-neprevedene dele in nerepetitivne dele genov.

• Bistveno pripomogli k odkrivanju novih bolezenskih označevalcev, posebno pri različih vrstah raka.

DNA čipi - povzetek

Nova (naslednja, druga) generacija sekvenciranja

www.gatc.co.uk/cgi-bin/wPrintpreview.cgi?sour...

Nova generacija sekvenciranja- Sekvenciranje človeškega genoma je trajalo več let, z uporabo cca 20 kb BAC klonov, ki so vsebovali cca 100 kb dolge tarčne fragmente, in 8-kratnega pokrivanja vsakega dela tarče. Analiza s kapilarno elektroforezo.

-Nadaljnji razvoj sekvenciranja je temeljil na sočasnem sekvenciranju celotnega genoma, ki je bil vstavljen v vektorje. Metoda je hitrejša, pušča pa velike praznine v zelo polimorfnih ali repetitivnih genomih. Analiza s kapilarno elektroforezo.

-Naslednja generacija sekvenciranja (2004) – visokozmogljivostno paralelno čitanje odsekov DNA na ravni celega genoma preko PCR pomnoževanja enoverižnih fragmentov genomske knjižnice.

Za čitanje zaporedja celotnega genoma posameznika danes potrebujemo le nekaj dni

Naslednja generacije sekvenciranja – povzetek

• Nova generacija visokozmogljivostnega sekvenciranje omogoča razpoznavanje zaporedij DNA na ravni celega genoma, z resolucijo posameznega baznega para.

• Iz vsakega vzorca se pripravi knjižnica, ki vsebuje vse v vzorcu prisotne fragmente DNA ali RNA (cDNA).

• Vse platforme bazirajo na PCR pomnoževanju, imajo pa različne pristope sekvenciranja:

•Razvijajo se tudi metode, ki pred sekvenciranjem ne potrebujejo pomnoževanja (tretja generacija)

• Uporaba je podobna, kot pri klasičnih mikromrežah, prednost je v preprosti pripravi vzorca in zmožnosti procesiranja velikega števila vzorcev v kratkem času.

•Procesiranje velikega števila vzorcev na eni/več aparaturah lahko upravlja 1 človek.

•Analiza celotnega genoma traja nekaj dni.

•Cena analize posameznikovega genoma naj bi v nekaj letih padla pod 500 eur –nov pristop k osebni medicini

V Sloveniji (2011) tovrstne aparature še nimamo……

Ten years ago, two fingers were enough to count the number of sequenced humangenomes. Until last year, the fingers on two hands were enough. Today, the rate of such sequencing is escalating so fast it is hard to keep track. Nature attempted nevertheless: we asked more than 90 genomics centres and labs to estimate the number of human genome sequences they have in the works. Although far from comprehensive, the tally indicates that at least 2,700 human genomes will have been completed by the end of this month, and that the total will rise to more than 30,000 by the end of 2011.

Genomes by the thousand

Nature, October 2010