ISPITIVANJE NEKIH BIOLOŠKIH KARAKTERISTIKA ... filei identifikovan metodama Reverse transcriptase PCR i Real-Time PCR uz sekvenciranje F gena. Dokazivanje prisustva HN i F antigena

337

* Rad primljen za štampu 18.02.2016.**Drsc.vet.med.NenadMilić,profesor;drsc.vet.med.JakovNišavić,profesor;drsc.SunčicaBorozan,profesor;dvmAndreaZorić,asistent,FakultetveterinarskemedicineUniverzitetauBeogradu,Beograd,Srbija;drsc.vet.med.SavaLazić,drsc.vet.med.TamašPetrović,Naučni institutzaveterinarstvo“NoviSad”,NoviSad,Srbija;drsc.vet.med.ZoranRašić,Veterinarskispecijalističkiinstitut“Jagodina”,Jagodina,Srbija

ORIGINALNI RAD / ORIGINAL PAPER

DOI:10.2298/VETGL1506337M UDC:636.5.09:616.98-371

ISPITIVANJE NEKIH BIOLOŠKIH KARAKTERISTIKA GLIKOPROTEINSKIH SUBJEDINICA SOJA PHY-LMV.42 VIRUSA NEWCASTLE

BOLESTI ŽIVINE* EXAMINATION OF SOME BIOLOGICAL PROPERTIES OF GLYCOPROTEIN

SUBUNITS OF PHY-LMV.42 STRAIN OF NEWCASTLE DISEASE VIRUS

Nenad Milić, Jakov Nišavić, Sunčica Borozan, Andrea Zorić, Sava Lazić, Tamaš Petrović, Zoran Rašić**

Cilj našeg istraživanja je bilo ispitivanje bioloških karakteristika prečišćenih glikoproteinskih subjedinica soja PHY-LMV.42 virusa Newcastle bolesti izolovanog iz golubova radi njihovog korišćenja za pripremanje vakcine. Soj PHY-LMV.42 virusa Newcastle bolesti je umnožavan sukcesivnim pasažama u kokošijim embrionima i identifikovan metodama Reverse transcriptase PCR i Real-Time PCR uz sekvenciranje F gena. Dokazivanje prisustva HN i F antigena u uzorcima virusnih subjedinica vršeno je metodom inhibicije hemaglutinacije sa referentnim imunim serumima. Biohemijska karakterizacija glikoproteinskih subjedinica izvršena je primenom metoda SDS-PAGE i tečne hromatografije sa masenom spektrometrijom (LC ESI-TOF-MS/MS). Ispitivanje imunogenosti virusnih subjedinica sprovedeno je u biološkom ogledu na ukupno 75 kokoši nosilja Tetra-SSL i 25 pilića Isa Brown uz izvođenje veštačke infekcije sojem Hertz 33 navedenog virusa. Niske koncentracije virusnih antigena od 0,36 mg/ml sa glikoproteinskim frakcijama od 77 i 58 kDa su ispoljavale snažnu hemaglutinacionu aktivnost od 4096 HJ/0,1ml. Subjedinične vakcine od 256 i 128 HJ/0,5 ml, indukovale su imunološki odgovor zaštitnog karaktera kod svih vakcinisanih životinja. Na osnovu dobijenih rezultata može se zaključiti da se niske

338

Vet.glasnik69(5-6)337-355(2015)NenadMilićisar.:IspitivanjenekihbiološkihkarakteristikaglikoproteinskihsubjedinicasojaPHY-LMV.42virusaNewcastlebolesti...

koncentracije prečišćenih virusnih subjedinica soja PHY-LMV.42 mogu koristiti za pripremanje efikasne vakcine.

Ključne reči: virus Newcastle bolesti, glikoproteinske subjedinice, SDS-PAGE, LC ESI-TOF-MS/MS, imunizacija.

Ispitivanjebiološkihkarakteristikaiimunogenihsvojstavaglikoproteinskihantigena lentogenih sojevavirusaNewcastlebolesti u ciljunjihoveprimenezapripremanjevakcinabilojepredmetistraživanjamnogihautora(Milićisar.,1996;Tanabayashi i Compans, 1996;Alexander, 2000; Panshin i sar., 2001). VirusNewcastlebolestijejedanodnajznačajnijihpatogenaupopulacijipticaidomaćeživine koji izazivaatipičnu kugu živine, kontagioznooboljenje kojeprati visokastopamorbiditetaimortaliteta,štoimazaposledicuivelikeekonomskegubitkeuživinarstvu.Sobziromdajezapripremanjeefikasnihvakcinazasprovođenjeimunoprofilakse atipične kuge živine od posebnog značaja izbor imunogenihvakcinalnih antigena, vršena su mnoga ispitivanja strukture, genetičkih iantigenskih karakteristika velikog broja lentogenih i mezogenih sojeva virusaNewcastle bolesti sa posebnim osvrtom na hemaglutinaciona i imunogenasvojstva njihovih glikoproteinskih komponenti (Maas i sar., 2003;Arora i sar.,2010; Chatuverdi i sar., 2011; Ganar i sar., 2014). Najznačajnije strukturnekomponenteprečišćenihvirionavirusaNewcastlebolestipredstavljajunajmanje6 virusnih proteina koji obuhvataju: hemaglutininsko-neuraminidazni protein(HN), fuzioni protein (F), matriksni protein (M), nukleokapsidni protein (NP),fosfoprotein(P)ivelikiprotein(L),međukojimasuimunološkinajznačajnijiHNiFglikoproteinispoljašnjegvirusnogomotačakojiimajuključnuuloguiuprocesuostvarivanjainfekcijejeromogućavajuadsorpcijuvirusanapovršinumembranećelijedomaćina (Alexander,2000;Rӧmer-Oberdorfer isar.,2003).DosadašnjaiskustvauprimeniinaktivisanihiživihvakcinauimunoprofilaksiNewcastlebolestiživinesuukazaladaiste,poredtogaštovakcinisanimživotinjamaomogućavajupostizanjezadovoljavajućegimuniteta,imajuiizvesnenedostatke.Takonaprimer,živevakcineprotivvirusaNewcastlebolestikodvakcinisanihživotinjastimulišustvaranjeimunitetazaštitnogkaraktera,aličestodovodeidopojavenepoželjnihpostvakcinalnih efekata koji semanifestuju pojavom respiratornih poremećaja,dokunekimslučajevimapostojimogućnostdavakcinalnisojevivirusapovratesvojuvirulencijuposlevišekratnihretrogradnihpasažakrozprijemčiveorganizmeuterenskimuslovima(Roth,1999;Alexander,2000).Zarazlikuodživihvakcina,imunogenipripremljeniodinaktivisanihsojevavirusaNewcastlebolestisumnogobezbedniji za vakcinisane životinje, ali su često slabije imunogeni tako da senajčešćekonjugujusarazličitimadjuvansimaodkojihsenajčešćekoristeuljaneemulzije,štočestodovodidozapaljenskihprocesanamestuaplikacijevakcine(Homhuanisar.,2004).Uciljuprevazilaženjanedostatakaklasičnihvakcinaprotivatipične kuge živine u novije vreme se sve više istraživanja usmerava prema

Uvod / Introduction

339


ispitivanjumogućnosti korišćenja vakcina pripremljenih od prečišćenih virusnihantigena ili pojedinih imunološki značajnih virusnih komponenti (subjedinica)koje sadržeglikoproteinskeHN iFantigene virusa, odgovorne za stimulisanjespecifičnogimunološkogodgovorakodvakcinisanihživotinja,doksuoslobođeneodinfektivnihdelovavirusnečesticekaoibalastnihproteinakojibimoglidelovatikao pirogeni (Milić i sar., 1996; Seal i sar., 2000; Panshin i sar., 2001). Iz tihrazlogasuinašaistraživanjabilausmerenanaispitivanjestrukturnihkomponentiinekihbiološkihkarakteristikasojaPHY-LMV.42virusaNewcastlebolestiživineizolovanogizgolubova,aprvenstvenohemaglutinacionihaktivnostiiimunogenihsvojstavanjegovihsubjedinicakojesadržehemaglutininsko-neuraminidazne(HN)i fuzione (F) glikoproteinske virusne antigene u cilju pripremanja subjediničnevakcine.

Sojevi virusa / Virus strains

Ispitivani soj virusa Newcastle bolesti živine, izolovan iz golubova jeprethodno umnožavan u alantohorijalnim šupljinama kokošijih embrionastarosti od 9 do 11 dana tokom perioda od 72 časa na temperaturi od 37°C.Pre ispitivanja strukturnih, hemaglutinacionih i imunogenih svojstava virusnihantigenaizvršenajeidentifikacijaizolovanogsojaPHY-LMV.42virusaNewcastlebolestiprimenomlančanereakcijepolimeraze–ReversetranscriptasePCR(RT-PCR) iReal-TimePCRsasekvenciranjemnukleotidauzkorišćenjespecifičnihprajmerazaFgen–MV1iB2.ZaizvođenjemetodeRT-PCRbilojeneophodnonajpre izvršiti ekstrakcijuRNK virusaNewcastle bolesti uz korišćenjeQIAampviral RNA mini kita (Qiagen, SAD) po uputstvu prizvođača. Posle ekstrakcijevirusne nukleinske kiseline, metoda RT-PCR izvođena je uz primenu F-5-CCTTGGTGAITCTATCCGIAG-3 i R-5-CTGCCACTGCTAGTTGIGATAATCC-3prajmerazaFprotein.Protokolzaizvođenjenavedenemetodesesastojaood25ciklusadenaturacijenukleinskekiselinenatemperaturiod94oCutrajanjuod30sek.,vezivanjaprajmeranatemperaturiod50oCutrajanjuod30sek.ielongacijena72oCutrajanjuod10minuta.Veličinadobijenogproduktajeiznosila254bp.Porednavedenogprotokolauispitivanjimajekorišćeniprotokolkojiporedekstrakcijevirusnenukleinskekiselineprimenomprethodnonavedenogkitapodrazumevaikorišćenjedegenerisanihprajmera5-ATGGGC(C/T)CCAGAC(C/T)CTTCTAC-3i5-CTGCCACTGCTAGTTGTGGTGATAATCC-3kojiograničavajudeogenavirusnenukleinskekiselinekojikodirasintezuFproteinavirusaNewcastlebolesti.Veličinaočekivanogproduktadobijenogu reakciji je iznosila535bp.KorišćenametodaRealTimeRT-PCRodgovaraproceduriopisanojuispitivanjimaWiseisar.(2004).IzvođenjumetodesekvenciranjajeprethodilaekstrakcijaiprečišćavanjePCRproizvodaizgelaagaroze.PrečišćavanjePCRproizvodajevršenopomoćukitazaekstrakciju-QIAquckgelextractionkit(Qiagen)pouputstvuproizvođača.Takođe, pre sekvenciranja virusnoggenoma izvršena je kvantifikacija dobijenevirusne DNK pomoću molekularnog standarda GeneRuler, dok je metoda

Materijal i metode rada / Material and methods

340

sekvenciranja izvođena uz korišćenje automatizovanog kapilarnog sistema poSangermetodiprimenomBigDyeTerminatorv3.1kita(AppliedBiosystems).ZaizvođenjemetodeRealTimeRT-PCRradiidentifikacijenukelinskekiselinevirusaNewcastle bolesti korišćena je procedura koja odgovara proceduri opisanoj uispitivanjimaWiseisar.(2004)saprajmerimaiprobomzaMgen.OvajprotokoljenamenjenzabrzodokazivanjeprisustvavirusaNewcastlebolestiuuzorcimasuspektnogmaterijalabezobziranapatotipvirusa,odnosnozabrzuipouzdanudetekcijunjegovihvelogenihilentogenihsojeva.

Sukcesivnim pasažama virusnog antigena u kokošijim embrionima tokomperiodaodmesecdanaisakupljanjemnjihovealantoisnetečnostisaumnoženimvirusom, dobijena je dovoljna količina virusne suspenzije sa titrom virusa odlog=10-8,9 EID50/0,1mlihemaglutinacionimtitromod512HJ/0,1ml.SojLaSotavirusaNewcastlebolestisadržanukomercijalnojinaktivisanojvakcinijekorišćenuuporednomispitivanju imunogenostisubjediničnihantigenasojaPHY-LMV.42navedenogvirusanaeksperimentalnojživini.

Koncentrisanje i prečišćavanje glikoproteinskih antigena virusa Newcastle bolesti / Concentration and purification of Newcastle disease virus glycoprotein antigens

Sakupljenaalantoisnatečnostporeklomodinokulisanihkokošijihembrionakoja je sadržavalaumnoženi sojPHY-LMV.42virusaNewcastlebolesti jeprvoprečišćavana centrifugovanjem na 3.200 o/min tokom vremenskog perioda od30minuta,poslečegajevirusnasuspenzijatretiranaistomzapreminomrastvora12g/dlpolietilenglikola-PEG8000(SigmaAldrichGmbH,Germany)uprisustvu0,5mol/lnatrijumhloridatokom3časanatemperaturiod4°Cicentrifugovanana3.500o/mintokom10minuta.Sakupljeniprecipitatikompletnihvirusnihčesticasuzatimresuspendovaniupodlozizakulturutkiva(Minimalessentialmedium-MEMwithEarle’ssalts;PAALaboratoriesGmbH,Austria)sa2g/dlfetalnoggoveđegseruma (Fetal bovine serum Gold; PAA Laboratories GmbH, Austria). Uzorciresuspendovanih viriona od po 2 ml su prečišćavani metodom preparativnogultracentrifugovanjaulinearnimgradijentimagustineod12-38g/dlkalijum-natrijumtartarata u 0,2 mol/l fosfatnom slanom puferu (PBS) na 27.000 o/min tokom2 časa. Posle sakupljanja iz gradijenata, prečišćeni virioni su tretirani sa 10%Triton-X-100(SigmaAldrichGmbH,Germany) tokom25minutana temperaturiod20°C (Mountcastle i sar., 1971;Milić i sar., 1991) i zatimcentrifugovani na39.000o/mintokom1časaradiizdvajanjavirusnihsubjedinicaodnukleokapsida.Prečišćavanjesuspenzijeglikoproteinskihsubjedinicavirusauzoslobađanjeoddeterdžentakorišćenogzarazgradnjuviriona(Triton-X-100),vršenojeprimenomjonoizmenjivačaAmberliteXAD-2(SigmaAldrichGmbH,Germany)(Cheetham,1979;Kruseisar.,1981;Milićisar.,1991).


341

Određivanje ukupne koncentracije proteina / Determining the total protein concentration

Ukupna koncentracija proteina u uzorcima prečišćenih viriona i virusnihsubjedinicanavedenogsojavirusaNewcastlebolestijeodređivanametodompoLowryisar.(1951)uzprimenufolin-fenolreagensa.

Određivanje hemaglutinacionih aktivnosti prečišćenih viriona i virusnih subjedinica / Determining the hemagglutination activity of purified virions and viral subunits

Hemaglutinacioneaktivnostiprečišćenihviriona ivirusnihsubjedinicasojaPHY-LMV.42 određivane su primenom metodom direktne hemaglutinacije umikrotitracionimpločama(OIE,2012).

Određivanje prisustva glikoproteinskih antigena u uzorcima prečišćenih viriona i virusnih subjedinica / Determining the presence of glycoprotein antigens in purified virions and viral subunit samples

Dokazivanjeprisustvavirusnihglikoproteina (HN iFantigena)uuzorcimaprečišćenih viriona i virusnih subjedinica vršeno je primenom testa inhibicijehemaglutinacije(HItesta)sareferentnimpoliklonskimimunimserumomimono-klonskim 7D4 serumom protiv antigena lentogenih vakcinalnih sojeva virusaNewcastle bolesti (Veterinary Laboratory Agency, UK) (OIE, 2012). Prisustvopomenutih antigena u ispitivanim uzorcima je dodatno potvrđeno testovimainhibicije hemolitičke aktivnosti i ćelijske fuzije na ćelijskoj liniji Vero posleaktivacijeprečišćenihvirionaiglikoproteinskihsubjedinicapomenutogsojavirusasa0,025g/dl tripsin-versenauPBS i njihoveneutralizacijenavedenim imunimserumima(ScheidiChoppin,1973;Milićisar.,2003;Nišavićisar.,2007).

Izdvajanje i vizuelizacija strukturnih komponenti prečišćenih viriona i virusnih subjedinica metodom SDS-PAGE / Separation and visualization of structural components of purified virions and viral subunit using SDS-PAGE method

Biohemijska analiza strukturnih virusnih proteina u uzorcima kompletnihprečišćenihvirusnihčesticakaoiuzorakaizolovanihglikoproteinskihsubjedinicajevršenaprimenommetodeSDS-PAGEudiskontinuiranompuferskomsistemupo Laemmli (1970) sa selektivnim bojenjem virusnih glikoproteina sa Šifovimreagensom(SigmaAldrichGmbH,Germany)poGordon (1983).MetodaSDS-


342

PAGE je sprovedena na poliakrilamidnom gelu (4% gel za koncentrovanjeuzoraka–stackinggel,12,5%gelzarazdvajanje–runninggel)podredukujućimuslovima.Elektroforeziranisuuzorciprečišćenihvirionazapremineod25µlsaukupnim koncentracijama proteina od 14,5 µg do 16,1 µg i uzorci prečišćenihvirusnihsubjedinicasaukupnomkoncentracijomproteinaodpribližno1,75µg.Posle elektroforeze, gel je obojen bojom Coomassie Blue G-250 i nakon 3hobezbojenpomoću10%rastvorasirćetnekiselinei40%metanolaudestilovanojvodi.Poredtoga,elektroforeziraniuzorcikompletnihvirionaivirusnihsubjedinicasuispitivaniiselektivnimbojenjemvirusnihglikoproteinametodom„Stains-all”poCampbellisar.(1983).Kaokoelektroforeznimarkerisukorišćenireferentniuzorcikojisusadržavaliproteinepoznatihmolekulskihmasaod250-10kDa(PageRulerplusPrestainedproteinLadder–ThermoScientific,USA).

Karakterizacija virusnih proteina u uzorcima prečišćenih viriona i virusnih subjedinica primenom metode tečne hromatografije kuplovane sa masenom spektrometrijom (LC ESI-TOF-MS/MS) / Characterisation of virus proteins in purified virions and viral subunit samples using liquid chromatography coupled with mass spectrometry (LC ESI-TOF-MS/MS)

Determinacija virusnih proteina u uzorcima prečišćenih viriona i njihovihsubjedinicavršenajeimetodomtečnehromatografijekuplovanomsamasenomspektrometrijom(LCESI-TOF-MS/MS)uzkorišćenjeHPLCinstrumenta(Agilent1200Series) saZorbaxEclipseXDBC18RRHTkolonom (150x4,6mm i.d.;1,8µm) i diodnimdetektorom (DAD)uduruženimsa6210Time-of-flight LC/MSsistemom (Agilent Technologies).Mobilna faza se sastojala od 0,2% vodenograstvoramravljekiseline(rastvorA)i100%acetonitrila(rastvorB)saispiranjemugradijentu:0-60min2-80%B,60-61min2%Bsaprotokomod0,35ml/min.

Vakcine / Vaccines

Subjedinična vakcina je pripremljena od virusnih komponenti soja PHY-LMV.42virusaNewcastlebolestirastvorenihu0,1mol/lfosfatnogslanogpufera(PBS) takoda su dobijeni imunogeni sa koncentracijama virusnih antigenaod0,022i0,011mgpodozivakcineod0,5mlihemaglutinacionomaktivnošćuod256i128HJ.KomercijalnevakcinekorišćeneuogledimaimunizacijesuvakcinaPEST-OL (Veterinarski ZavodSubotica) pripremljena od inaktivisanog LaSotasojavirusaNewcastlebolestititraod109 EID50virusnihantigenapodoziod0,5ml.


343

Ispitivanja imunogenosti pripremljene subjedinične vakcine / Immunogenicity trials of prepared subunit vaccines

Posleodređivanjahemaglutinacioneaktivnostiprečišćenihvirusnihsubjedi-nica metodom direktne hemaglutinacije, ispitivana je njihova imunogenost ubiološkomogledunaukupno75kokošinosiljaTetra-SSLstarosti16nedeljai25pilićaIsaBrownstarih14danauzizvođenjeveštačkeinfekcijepilićasojemHertz33 navedenog virusa.Uzorci krvnih seruma svih eksperimentalnih životinja suispitivaninaprisustvoititarspecifičnihHIantitelaprotivvirusaNewcastlebolestimetodominhibicijehemaglutinacije-HItestom(OIE,2012).

Prvi deo ogleda imunizacije je sproveden na ukupno 32 Tetra-SSLkokoši seroronegativne na antigene virusa Newcastle bolesti, podeljenih u trioglednegrupeod kojih suprvedvegrupeodpo11 životinja, intramuskularno(i/m) vakcinisane sa 0,022mg i 0,011mg prečišćenih virusnih subjedinica sahemaglutinacionom aktivnošću od 256 HJ (prva grupa) i 128 HJ po dozi od0,5ml(drugagrupa)irevakcinisane14.danaogleda,dokjetrećagrupaod10nevakcinisanihkokošislužilakaokontrolauogledu.

Drugideoogledaimunizacije jevršennačetirigrupeodukupno43Tetra-SSL kokoši nosilja uzetih iz proizvodnog procesa i seropozitivnih na antigenevirusaNewcastle bolesti jer su ranije imunizovaneprotiv navedenogpatogenaidrugihvirusauskladusaProgramommerazdravstvenezaštiteživotinja.Prvedve ogledne grupe od po 11 kokoši nosilja su i/m imunizovane subjediničnimvakcinamakojesusadržavale256HJ(prvagrupa)i128HJpodozi(drugagrupa)kao što je prethodno opisano, a treća grupa od 11 kokoši je i/m imunizovanadozamaodpo0,5mlinaktivisanePEST-OLvakcinekojajesadržavala109 EID50 vakcinalnogsojaLaSotauuljanomadjuvansuirevakcinisana21-ogdanaogleda,dokčetvrtakontrolnagrupaod10kokošinijepodvrgnutavakcinaciji.

Imunogena svojstva i zaštitni karakter niskih koncentracija vakcinalnogimunogena od 0,011 mg prečišćenih virusnih subjedinica po dozi od 0,5 mlpotvrđeni su u ogledu izvršenomna 25 pilića IsaBrown, starosti od 14 dana,negativnihnaprisustvospecifičnihantitelaprotivvirusaNewcastlebolesti.Prvagrupaod14oglednihpilićajei/mvakcinisanadozamaod0,5mlvakcinesa128HJ,revakcinisanaposle14danaii/mveštačkiinficfiranadozamaodpo200.000EID50virulentnogsojaHertz33virusaNewcastlebolesti28-ogdanaogleda,dokjedrugagrupaod11nevakcinisanihpilićaseronegativnihnaantigenepomenutogvirusa na isti način veštački inficirana prethodno navedenim virulentnim sojemvirusaatipičnekugeživine.

Za statističku analizu dobijenih rezultata ogleda imunizacije korišćene suneparametrijskestatističkemetodeitoKruskal-WallisgrupnitestiDunn’sMultipleComparisonTest kaoposthok test.Statističkaanaliza rađena jeu statističkompaketuGraphPadPrism5.


344

IdentifikacijavakcinalnogsojaPHY-LMV.42virusaNewcastlebolestiizvršenajeprimenom lančane reakcijepolimeraze–Reverse transcriptasePCR iReal-TimePCRsasekvenciranjemnukleotidauzkorišćenjespecifičnihprajmerazaF

Slika 1. FilogenetskostablozasnovanonasekvencidelaFgena(pozicijenukleotida47-421).SojPHY-LMV42jeobeležensau

Picture 1. Phylogenetic tree based on the sequence of F gene part (nucleotide positions 47-421). Strain PHY-LMV42 is marked with u


Rezultati / Results

345

gen–MV1iB2.SekvenciranjemprvogdelaFgenaizolovanogsojavirusa,naosnovupozicijenukleotidaod47do421,potvrđenajepotpunahomologija(100%)sasojemPHY-LMV.42virusaNewcastlebolestikojipripadaklasi II igenotipuIlentogenihsojevanavedenogvirusa(Slika1).

Ukupna koncentracija proteina u uzorcima koncentrisanih i prečišćenihviriona resuspendovanih u 0,2mol/l PBS iznosila je 0,58mg/ml sa značajnimhemaglutinacionimtitromod4096HJ/0,1mlpričemusuniskekoncentracijevirusnihsubjedinicaod0,36mg/mltakođeispoljavalesnažnuhemaglutinacionuaktivnostod4096HJ/0,1mlštojeutvrđenoprimenomtestadirektnehemaglutnacije.

Navedene virusne subjedinice su razređene u 0,1 mol/l PBS u ciljupripreme imunogena sa hemaglutinacionim titrima od 256 i 128HJ i ukupnimkoncentracijamaproteinaod0,022i0,011mgpodozivakcineod0,5ml.

Uzorci prečišćenih viriona soja PHY-LMV.42 virusa Newcastle bolestiispitivanimetodomSDS-PAGEibojenihsaCoomassieBrilliantBlue,sadržavalisu

Slika 2. Elektroforegramiuzorakaprečišćenihviriona iglikoproteinskihsubjedinicaviru-saNewcastlebolesti,razdvojenihna12%gelu–SDS-PAGE,obojenisaCoomassieBrilliantBlue(1-Referentniproteiniod250-10kDa;2i4-proteinskefrakcijekomplet-nogvirionaod250-11kDa

Picture 2. Electrophoregrams of the samples of purified virions and glycoprotein sub-units of Newcastle disease virus, disjuncted in 12% gel – SDS-PAGE, stained with Coomassie Brilliant Blue (1-Referent proteins of 250-10 kDa; 2 and 4- protein fraction of complete virion of 250-11 kDa


346

7proteinskihfrakcijamolekulskihmasaodoko250,77,69,58,45,41i11kDakojesuodgovarale:velikomproteinu(L),hemaglutininsko-neuraminidaznomproteinu(HN), neaktivisanomprekursoru F proteina (F0), F1 proteinu, nukleokapsidnomproteinu(NP)ifosfoproteinu(P),matriksnomproteinu(M)imalomfragmentuFproteina (F2). Uzorci virusnih subjedinica koji su dobijeni razlaganjem pomoćuelektroforeze sadržavali su 5 proteinskih frakcija, među kojima su proteinskekomponentemolekulskihmasaod77,69i58kDaodgovaraleHN,F1iF0proteinima(Slika 2). Uzorci prečišćenih viriona, dobijeni elektroforezom u redukujućimuslovimasaŠifovimreagensom,sadržavalisu3glikoproteinskefrakcijeod77,58i11kDakojesuodgovaraleHN,F1iF2proteinima,doksukodnjihovihsubjedinicautvrđenadvaglikoproteinaod77i58kDakojisuodgovaraliHNiF1proteinima.

Oveglikoproteinske frakcijeuelektroforeziranimuzorcimaprečišćenihviriona ivirusnih subjedinica ispitivanog soja virusa su se obojile u ružičasto (Slika 3).Odsustvovirusnihnukleokapsidasainfektivnomribonukleinskomkiselinomvirusa(RNK) u uzorcima virusnih glikoproteinskih subjedinica je potvrđenometodomSDS-PAGEsaselektivnimbojenjemvirusnihproteinametodom„Stains-all”(Slika4).Poredtoga,brojproteinskihfrakcija ivrednostinjihovihmolekulskihmasauuzorcima elektroforeziranih prečišćenih viriona i virusnih subjedinica obojenihmetodom„Stains-all”jebioistikaoikoduzorakaispitivanihmetodomSDS-PAGEobojenihsaCoomassieBrilliantBlue.

Proteinskefrakcijeutvrđeneuuzorcimakompletnihvirusnihčesticakojesuimalemolekulskemasevećeod78.000Da,kaoštosufrakcijeod107.150,131.800i 151.600 Da, nisu ustanovljene u uzorcima prečišćenih virusnih subjedinica.Prečišćenevirusnesubjedinicekojesusadržavaledvaglikproteinamolekulskihmasaod77 i58kDakoji suodgovaraliHN iF1proteinimapomenutogvirusa,zajednosaproteinskimkomponentamaod69,45 i 41kDačije sumolekulske

Slika 3. Elektroforegrami uzoraka prečišćenih viriona i gli-koproteinskih subjedinica virusa Newcastle bolesti,razdvojenihna12%gelu–SDS-PAGE,obojenisaŠifo-vimreagensom(1-Referentniproteiniod250-10kDa;2i4-glikoproteinskefrakcijekompletnogvirionaod77,58i11kDa;3-glikoproteinskefrakcijevirusnihsubjedi-nicaod77i58kDa)

Picture 3. Electrophoregrams of the samples of purified vi-rions and glycoprotein subunits of Newcastle disease virus, disjuncted in 12% gel – SDS-PAGE, stained with Schiff’s reagent (1- Referent proteins of 250-10 kDa; 2 and 4- glycoprotein fraction of complete virion of 77. 58 and 11 kDa; 3- glycoprotein fraction of virus subunits of 77 and 58 kDa)


347

maseodgovaraleF0,PiMproteinima,korišćenesuzapripremanjesubjediničnevakcine.

Subjediničnavakcinazaizvođenjeogledaimunizacijenaeksperimentalnimkokošima i pilićima je pripremljena od prečišćenih virusnih komponenti sojaPHY-LMV.42 virusa Newcastle bolesti koji su sadržavali imunološki značajneglikoproteinskemolekulekojiobuhvatajuhemaglutininsko-neuraminidazniifuzioniprotein.IdentifikacijaglikoproteinskihantigenaizvršenajemetodamaSDS-PAGE,hemaglutinacije(HAtestom)iinhibicijehemaglutinacije(HItestom).

Metoda tečnehromatografijesamasenomspektrometrijom (LCESI-TOF-MS/MS)jekorišćenazaproteomskuanalizuikarakterizacijustrukturnihproteina kompletnih prečišćenih viriona soja PHY-LMV.42 virusa Newcastle bolesti i njegovih virusnih subjedinica. Na osnovu hromatograma dobijenih metodomLC ESI-TOF-MS/MS, izvršena je karakterizacija uzoraka prečišćenih viriona iizolovanih virusnih subjedinica ispitivanog soja PHY-LMV.42 virusa Newcastlebolesti(Slika5).Šestglavnihproteinskihtrakajeutvrđenouuzorcimaprečišćenihviriona,dok je5proteinskih trakaustanovljenouuzorcimaprečišćenihvirusnihsubjedinica. Primenom ove metode, maseni spektri proteina su određivani

Slika 4.ElektroforegramiuzorakaprečišćenihvirionaiglikoproteinskihsubjedinicavirusaNewcastlebolesti,razdvojenihna12%gelu–SDS-PAGE,obojenimetodomStains-all(1-Referentniproteiniod250-10kDa;2i4-proteinskefrakcijekompletnogvirionaod250-11kDa;3-proteinskefrakcijevirusnihsubjedinicaod77,69,58,45i41kDa)

Picture 4. Electrophoregrams of the samples of purified virions and glycoprotein subunits of Newcastle disease virus, disjuncted in 12% gel – SDS-PAGE, stained with Stains-all method (1-Referent proteins of 250-10 kDa; 2 and 4- protein fraction of complete virion of 250 -11 kDa; 3- protein fraction of virus subunits of 77. 69, 58, 45 and 41 kDa)


348

na osnovu intenziteta signala, na osnovu čega su utvrđeni maseni spektriglavnih glikoproteinskih traka od 77.266 i 59.950 Da (Slika 6). Molekulskemase utvrđenih proteinskih komponenti zaHN protein su se kretale od 71-77kDa, za F protein od 59-69 kDa, dok su zaM protein iznosile od 37-43 kDa.Nukleokapsidniprotein(NP),ustanovljenuuzorcimakompletnihvirusnihčestica,nijebioprisutanuuzorcimaprečišćenihvirusnihsubjedinica.MolekulskamasaNPproteinauuzorcimaprečišćenihviriona je iznosilaoko49kDa.Molekulskemase proteinskih komponenti utvrđenih kod kompletnih prečišćenih viriona ivirusnih subjedinica navedenog soja virusa, utvrđene tečnom hromatografijomsamasenomspektrometrijom(LCESI-TOF-MS/MS)suseminimalnorazlikovale

Slika 5.HromatogramiiretencionavremenadobijenimetodomLCESI-TOF-MS/MS:A)Zauzorkekompletnihviriona;B)Zauzorkevirusnihsubjedinica

Picture 5. Chromatograms and retention times obtained by LC ESI-TOF-MS/MS method: A) For complete virion samples; B) For virus subunits samples

Slika 6.MasenispektriglavnihglikoproteinskihkomponentidobijenihmetodomLCESI-TOF-MS/MSuuzorcimavirusnihsubjedinica:A)Hemaglutininsko-neuraminidazniprotein–HN;B)Fuzioniprotein–F1

Picture 6. Mass spectra of main glycoprotein components obtained by LC ESI-TOF-MS/MS method in virus subunits samples: A) Hemagglutinin-neuraminidase protein – HN; B) Fuzion protein – F1


349

odmolekulskihmasapomenutihproteinaustanovljenihmetodomSDS-PAGEudiskontinuiranompuferskomsistemu.

Niske koncentracije napred navedenih glikoproteinskih antigena sustimulisale sintezuspecifičnihHIantitelauorganizmusvih vakcinisanih kokošiizprveidrugeoglednegrupekojesuprepočetkaimunizacijebileseronegativnenaantigenevirusaNewcastlebolesti.Srednjigeometrijskititri(GMTlog2/25µl)utvrđeniuuzorcimakrvnogserumaprveidrugegrupeeksperimentalnihkokošiiznosilisu14.danaodvakcinacije4,95i4,14;21.dana7,86i6,05;28.dana8,18i7,27,a35.dana5,9i5,73(Grafikon1).StatističkomanalizomjeutvrđenodaizmeđuvrednostisrednjihgeometrijskihtitaraspecifičnihHIantitelaprotivvirusaNewcastlebolesti (GMT log2/25µl)kodprvedvegrupevakcinisanihkokošiunavedenimvremenskimintervalimanepostojeznačajnerazlike(p>0,05).

Vrednosti srednjih geometrijskih titara specifičnih HI antitela protiv virusaNewcastle bolesti (GMT log 2/25 µl) utvrđene u krvnom serumu imunizovanihkokošiizprveidrugeoglednegrupeuzetihizproizvodnogprocesasuneposrednopre vakcinacije iznosili 1,18 i 2,27; posle 14 dana od vakcinacije 4,32 i 4,73;21-ogdanaogleda6,59 i6,14;28-ogdana7,45 i8,a35-ogdana4,84 i6,82.VrednostisrednjihgeometrijskihtitaraspecifičnihHIantitelaukrvnimserumimatrećeeksperimentalnegrupekokošinosiljaimunizovanihsapo0,5mlinaktivisanePEST-OL vakcine bili su 2,31 neposredno pre vakcinacije; 14-og dana ogleda

Grafikon 1. SrednjigeometrijskititrispecifičnihHIantitelaprotivvirusaNewcastlebolesti(GMTlog2/25µl)uuzorcimakrvnogserumakokošinosiljaTetra-SSLuprvomdeluogledaimunizacije

Graph 1. Geometric mean titers of specific HI antibodies against Newcastle disease virus (GMT log 2/25 µl) in blood serum samples of laying hens Tetra-SSL in the first part of immunization experiment


350

5,18;21-ogdana8,35i35-ogdana6,35,doksuuzorcimakrvnogserumačetvrtekontrolne grupe nevakcinisanih kokoši iznosili 3,50 pre početka ogleda; 14-ogdanaogleda2,9;21-ogdana2,15;28-ogdana1,35i35-ogdana0,5(Grafikon2). Statističkom analizom rezultata dobijenih posle imunizacije seropozitivnihTetra-SSLkokošiutvrđenojedanepostojesignifikantnerazlike(p>0,05)između

Grafikon 2.SrednjigeometrijskititrispecifičnihHIantitelaprotivvirusaNewcastlebolesti(GMTlog2/25µl)uuzorcimakrvnogserumakokošinosiljaTetra-SSLudrugomde-luogledaimunizacije

Graph 2. Geometric mean titers of specific HI antibodies against Newcastle disease virus (GMT log 2/25 µl) in blood serum samples of laying hens Tetra-SSL in the second part of immunization experiment


351

srednjihgeometrijskihvrednostititaraHIantitelameđutrioglednegrupekokošivakcinisanihsubjediničnimimunogenomod256i128HJiinaktivisanomvakcinomPEST-OLsauljanimadjuvansom.

Grupaod14eksperimentalnihpilićaIsaBrowni/mvakcinisanihirevakcinisanihvirusnim subjedinicama od 128HJ po dozi vakcine od 0,5ml je u potpunostipreživelaogledveštačkeinfekcijevirulentnimsojemnaprednavedenogpatogena(100%),bezpojaveikakvihkliničkihsimptomaoboljenja,doksusvinevakcinisanipilićiuginuliza3-5danaodveštačkeinfekcije.VrednostisrednjihgeometrijskihtitaraHIantitelaustanovljeneuuzorcimakrvnogserumavakcinisanihpilićasu14-ogdanaposlevakcinacijebili3,4;21-ogdanaogleda4,25;28-ogdana5,4i35-ogdana5,3(Grafikon3).

Istraživanja Panshin i sar. (2001), Kim i sar. (2003), Rӧmer-Oberdorferi sar. (2003), Ren i sar. (2012) omogućila su sticanje kompletnog uvida ukompleksnu strukturu i biološke aktivnosti komponenti virusa Newcastlebolesti živine, što je predstavljalo osnovu za naša ispitivanja strukturnihkarakteristika, hemaglutinacionih aktivnosti i imunogenosti prečišćenihglikoproteinskih subjedinica lentogenog soja PHY-LMV.42 virusa Newcastlebolestiuciljupripremanjaefikasnogineškodljivogvakcinalnogantigena,potpunooslobođenogod infektivnevirusneRNKinestrukturnihproteinskihkomponenti.Veomaniskekoncentracijevirusnihsubjedinicaodsvega0,36mg/mlsuposleprocesa prečišćavanja ispoljavale izraženu hemaglutinacionu aktivnost od4096HJ/0,1ml što jeomogućilonjihovokorišćenjeuogledima imunizacijenaeksperimentalnoj živini. Rezultati biohemijskih ispitivanja proteinskih frakcijavirusnihsubjedinicametodomSDS-PAGEuzkorišćenjenapredopisanihbojenjauzorakavirusnihproteinadobijenihrazlaganjempomoćuelektroforezeimetodom tečne hromatografije sa masenom spektrometrijom (LC ESI-TOF-MS/MS) su potvrdili da iste sadrže ključne HN i F glikoproteinske antigene molekulskihmasa od 77 i 58 kDa i omogućili sticanje potpunog uvida u njihovu strukturu.PomenutaispitivanjauzorakaprečišćenihvirionaivirusnihsubjedinicasojaPHY-LMV.42 virusa Newcastle bolesti su potvrdila prisustvo imunološki značajnihHNiFglikoproteinskihantigena,poredostalihprethodnonavedenihstrukturnihproteinskih komponenti virusne čestice, čije su vrednosti molekulskih masa upotpunosti odgovarale onima dobijenim u istraživanjima Heckert i sar. (1996),Maas i sar. (2003), Arora i sar. (2010). Niske koncentracije glikoproteinskihsubjedinicasahemaglutinacionimaktivnostimaod256i128HJpodozivakcineod0,5ml,stimulisalesusnažanhumoralniimunološkiodgovorkodsvihvakcinisanihirevakcinisanihkokošinosilja,doksuimunizovanimpilićimaIsaBrownomogućile

Grafikon 3.SrednjigeometrijskititrispecifičnihHIantitelaprotivvirusaNewcastlebolesti(GMTlog2/25µl)uuzorcimakrvnogserumaeksperimentalnihpilićaIsaBrown

Graph 3. GeometricmeantitersofspecificHIantibodiesagainstNewcastlediseasevirus(GMTlog2/25µl)bloodserumsamplesofexperimentalIsaBrownchickens


Diskusija / Discussion

352

potpunuzaštituodveštačkeinfekcijevirulentnimsojemHertz33virusaNewcastlebolestiživine.

Naosnovurezultatanavedenihispitivanjamožesezaključitidaseprečišćenevirusne subjedinice lentogenog soja PHY-LMV.42 virusa atipične kuge živine,oslobođenenukleokapsida(NP)savirusnomribonukleinskomkiselinom(RNK),velikogproteina(L) imanjegfragmentafuzionogproteina(F2)mogukoristitizapripremanjenoveformulacijeimunogenazaspovođenjevakcinaciježivineprotivvirusaNewcastlebolesti.

ZAHVALNICA / ACKNOWLEDGEMENTS:RadjerealizovanuokviruprojektaTR31008podnaslovom:“Razvojiprimenamolekularnihmetodazasnovanihnalančanojreakcijipolimeraze(PCR)ubrzojidirektnojidentifikacijisojeva virusa Newcastle bolesti živine i ispitivanje imunogenosti subjedinične vakcinepripremljeneodnjihovihantigena”,finansiranogodstraneMinistarstvaprosvete,naukeitehnološkograzvojaRepublikeSrbije.This work was realized within the Project TR 31008 under the title: “Development and application of molecular methods based on polymerase chain reaction (PCR) in quick and direct identification of Newcastle disease virus strains and investigation of immunogenicity of subunit vaccine prepared of their antigens” financed by The Ministry of Education, Science and Technological Development of the Republic of Serbia

1. AlexanderDJ.Newcastlediseaseandotheravianparamyxoviruses.RevSciTech.2000;19:443-62.

2. AroraP,LakhchauraDB,GargKS.Evaluationof immunogenicpotentialof75kDaand56kDaproteinsofNewcastlediseasevirus(NDV).IndJExpBiol.2010;48:889-95.

3. CampbellKP,MacLennanDH,JorgensenAO.StainingoftheCa2+ -bindingproteins,calsequestrin,calmodulin,troponinC,andS-100,withthecationiccarbocyaninedye“Stains-all”.JBiolChem.1983;258:11267-73.

4. ChaturvediU, KalimS,DesaiG,RattaB, KumarR,RavindraPV,KumarS,DashBB,TiwariS,SahooAP,TiwariAK.Developmentand in vitro characterizationof abivalentDNAcontainingHNandF genes of velogenicNewcastle disease virus. Indian JExpBiol.2011;49:140-45.

5. Cheetham PSJ. Removal of Triton X-100 from aqueous solution using amberlite XAD-2.AnalBiochem.1979;92:447-52.

6. GanarK,DasM,SinhaS,KumarS.Newcastlediseasevirus:Currentstatusandourunderstanding. VirusRes.2014;184:71-81.

7. Gordon AH. Electrophoresis of proteins in polyacrylamide and starch gels. In: LaboratoryTechniquesinbiochemistryandmolecularbiology.NewYork:Elsevier,1983:1.

8. HeckertRA,RivaJ,CookS,McMillenJ,SchwartzRD.Onsetofprotectiveimmunityinchicksaftervaccination with a recombinant herpesvirus of turkeys vaccine expressing Newcastlediseasevirusfusionandhemagglutinin-neuraminidaseantigens.AvianDis.1996;40(4):770-77.

Literatura / References


Zaključak / Conclusion

353

9. HomhuanA,PrakongpanS,PoomvisesP,MaasRA,CrommelinDJA,KerstenGFA,JiskootW.VirosomeandISCOMvaccinesagainstNewcastledisease:preparation,characterizationandimmunogenicity. EurJPharmSci.2004;22:459-68.

10. KimS,WanasenN,PalduraiA,XiaoS,CollinsPL,Samal SK.Newcastlediseasevirus fusionprotein is the major contributor to protective immunity of genotype-matched vaccine.PLoSOne.2003;8: e74022.

11. Kruse CA, Spector EB, Cederbaum SD, Wisnieski BJ. Micro-injection of arginase intoenzymedeficientcellswith the isolatedglycoproteinsofSendavirusasFusogen.ActaBiochimBiophys.1981;645(2):339-45.

12. Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during assembly of the head bacteriophage T4.Nature.1970;227:680-85.

13. LowryOH,RosenbraughNJ,FarrAL,RandallRJ.Proteinmeasurementfolin-phenolreagent.JBiolChem.1951;193:265-75.

14.Maas AR, Komen M, van Diepen M, Oei LH, Claassen MTJI. Correlation of hemagglutinin-neuraminidase and fusion protein content with protective antibody response afterimmunisationwithinactivatedNewcastlediseasevaccines.Vaccine.2003;21(23):3137-42.

15.MilićN,Gadjanski-OmerovićG,AšaninR,MarkovićB.Utilization de l’ hydrochlorure deD-(6-3) glucosaminedans le procédédepurificationet de séparationdes sous-unitésglycoprotéiquesduvirusPara-influenzae3bovin(PI3).BullAcaddeFrance.1991;64:365-73.

16. MilićN,Gadjanski-OmerovićG,AšaninR,MarkovićB,PalićT,SimonovićLj,RašićZ,KrnjaićD,CrvakB,MilisavljevićS.ExaminationoftheimmunogenicityofexperimentalsubunitvaccineagainstNewcastlediseasevirus.ActaVet.1996;46(5-6):307-16.

17. Milić N, Gadjanski-Omerović G, Ašanin R, Nišavić J, Radojičić M. Examination of antigenicstructureandsomebiologicalactivitiesofhemagglutinin-neuraminidase(HN)andfusion(F)glycoproteinantigensofparainfluenza3virus,in vitro.ActaVet.2003;53(5-6):321-31.

18. MountcastleWE,CompansWR,ChoppinWP.ProteinsandglycoproteinsofParamixoviruses:acomparisonofSimianvirus5,NewcastlediseasevirusandSendaivirus. JVirol.1971;7(1):47-52.

19. Newcastledisease.In:ManualofDiagnosticTestsandVaccinesforTerrestrialAnimals 2012.OIE,2012:3-8.

20. NišavićJ,MilićN,VeljovićLJ.ExaminationoftheactivityofHNandFglycoproteinantigensoftheouterenvelopeofNewcastlediseasevirusbyusingfusional,hemolytic,hemagglutinationandhemadsorptiontests,in vitro.ActaVet.2007;57(1):3-10.

21. PanshinA,ShihmanterE,WeismanY,ÖrvellC,KydyrmanovA,SayatovM,AsanovN,NyagaPN,KasiitiJL,MacharijaMJ,LipkindM.ThecomparativeantigeniccharacterizationofNewcastlediseasevirusstrainsisolatedinKenyaandKazakhstan.CompImmunol,Micr&InfDis.2001;24(1):21-37.

22. RenX,XueC,KongQ,ZhangC,BiY, CaoY.ProteomicanalysisofpurifiedNewcastlediseasevirusparticles.Prot.Sci,2012;1:10-32.

23. Rӧmer-OberdorferA,WernerO,VeitsJ,MebastionT,MettenleiterTC. ContributionofthelengthoftheHNproteinandthesequenceoftheFproteincleavagesitetoNewcastlediseaseviruspathogenicity.JGenVirol.2003;84:3121-29.

24.RothJA.MechanisticbasesforAdverseVaccineReactionsandVaccineFailures.AdvVeterMed.1999;41:681-700.

25.ScheidA,ChoppinWP.IsolationandpurificationoftheenvelopeproteinsofNewcastlediseasevirus.Virol.1973;11(2):263-71.

26. Seal SB, King JD, Sellers SH. The avian response to Newcastle disease virus. Dev CompImmunol.2000;24(2-3):257-68.


354

27. TanabayashiK,CompansRW.Functionalinteractionofparamyxovirusglycoproteins:identificationofadomaininSendaivirusHNwhichpromotescellfusion.JVirol.1996;70(9):6112-18.

28. WiseMG,SuarezDL,SealBS,PedersenJC,SenneDA,KingDJ,KapczynskiDR,SpackmanE. Development of a Real-Time Reverse-Transcription PCR for detection ofNewcastle disease virus RNA in clinical samples. J Clin Micr. 2004; 42: 329-38.

EXAMINATION OF SOME BIOLOGICAL PROPERTIES OF GLYCOPROTEIN SUBUNITS OF PHY-LMV.42 STRAIN OF NEWCASTLE DISEASE VIRUS

Nenad Milić, Jakov Nišavić, Sunčica Borozan, Andrea Zorić, Sava Lazić, Tamaš Petrović, Zoran Rašić

The objective of our work was to investigate some biological characteristics ofpurified glycoprotein subunits of Newcastle disease virus strain PHY-LMV.42 isolatedfrom pigeons for the purpose of vaccine production. PHY-LMV.42 strain of Newcastlediseaseviruswasmultipliedbysuccessivepassagesinembryonatedeggsandidentifiedby themethodsof Reverse transcriptasePCRandReal-TimePCRalongwithFgenesequencing.ProvingthepresenceofHNandFantigeneinthevirussubunitssampleswascarriedoutbyhemagglutinationinhibitionmethodwithreferentimmunesera.BiochemicalcharacterizationofglycoproteinsubunitswasperformedbySDS-PAGEmethodaswellasliquidchromatographywithmassspectrometry(LCESI-TOF-MS/MS).Testingforthevirussubunitsimmunogenicitywascarriedoutinbiologicalexperimenton75layinghensTetra-SSLand25chickensIsaBrownbyinducinganartificial infectionwithHertz33strainofthevirus.Lowconcentrationsofthevirusantigensof0.36mg/mlalongwithglycoproteinfractionsof77i58kDamanifestedastronghemagglutinationactivityof4096HJ/0,1ml.Thesubunitvaccinesof256and128HJ/0.5ml inducedaprotective immuneresponseinallthevaccinatedanimals.BasedontheobtainedresultsitcanbeconcludedthatlowconcentrationsofpurifiedvirussubunitsofPHY-LMV.42straincanbeusedforpreparingofeffectivevaccines.

Key words: Newcastle disease virus, glycoprotein subunits, SDS-PAGE, LC ESI-TOF-MS/MS,immunization.

ИССЛЕДОВАНИЕ НЕКОТОРЫХ БИОЛОГИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК ГЛИКОПРОТЕИНОВЫХ СУБЪЕДИНИЦ ШТАММА PHY-LMV.42 ВИРУСА ПТИЧЬЕЙ

БОЛЕЗНИ НЬЮКАСЛА

Ненад Милич, Яков Нишавич, Сунчица Борозан, Андреа Зорич, Сава Лазич, Тамаш Петрович, Зоран Рашич

Цельнашегоисследованиязаключаласьвизучениибиологическиххарактеристикочищенных субъединиц гликопротеинов штамма PHY-LMV.42 вируса болезниНьюкасла,изолированногоотголубейдляиспользованияприизготовлениивакцины.ШтаммPHY-LMV.42вирусаболезниНьюкаслабылполученпутемпоследовательныхпассажейв куриныхэмбрионахиидентифицированметодомReverse transcriptase


ENGLISH

РУССКИЙ

355

PCRиReal-Time PCRссеквенированиемгенаF.ДоказательствоналичияантигеновHN и F в образцах вирусных субъединиц выполнено методом ингибированиягемагглютинации с соответствующими иммунными сыворотками. Биохимическаяхарактеристика субъединиц гликопротеинов выполнена с применением методаSDS-PAGE и жидкостной хроматографии с масс-спектрометрией (LC ESI-TOF-MS/MS). Тестирование иммуногенности вирусных субъединиц было проведенов биологическом опыте над 75 курами-несушками Tetra-SSL и 25 цыплятами Isa BrownсвыполнениемискусственногоинфицированияштаммомHertz33указанноговируса.Низкиеконцентрациивирусныхантигенов0,36мг/млсгликопротеиновымифракциями 77 и 58 kDa показали высокую гемагглютинационную активность -4096HJ/0,1ml.Субъединичныевакцины256и128HJ/0,5ml вызвалиобразованиезащитного иммунного ответа у всех вакцинированных животных. На основанииполученных результатов можно заключить, что низкие концентрации очищенныхвирусныхсубъединицштаммаPHY-LMV.42могутиспользоватьсядляприготовленияэффективнойвакцины.

Ключевые слова: вирус болезни Ньюкасла, гликопротеиновые субъединицы,SDS-PAGE,LC ESI-TOF-MS/MS,иммунизация.


356

Documents

ISPITIVANJE NEKIH BIOLOŠKIH KARAKTERISTIKA ... filei identifikovan metodama Reverse transcriptase PCR i Real-Time PCR uz sekvenciranje F gena. Dokazivanje prisustva HN i F antigena