Identificação convencional de fungos filamentosos1

Identificação convencional de fungos filamentosos

e identificação automatizada e convencional de fungos

leveduriformes

Disciplina: Micologia Médica

Profº.: Luís Henrique

Acadêmicos:

Carlos Alberto; Joilce Portela; Marcos Allan; Maria Inês e Maria Josenilda

Introdução

• Identificação do fungo de maneira ideal seria: Gênero eespécie

• O processamento da amostra passa por 3 fases:

Pré-analítica

Analítica

Processamento da amostra

• Indicar a coleta• transporte

• Processamento• identificação do

microrganismo• laudo e estocagem

• Estudos • Dados epidemiológicos

Isolamento do fungo

Semear Exame direto

Macroscópico

Microcultivo/ análise bioquímica

Levedura Filamentoso

Gram

Identificação de fungos filamentosos

Cultura pura (Cultura mista é uma causa comum de erro)

• 1. Exame Macroscópico

Textura: algodonosa, velutina, pulverulenta (furfuráceas), penugentas

Identificação de fungos filamentosos

• 1. Exame Macroscópico

Relevo: cerebriformes, rugosa,apiculadas, crateriformes

Bordas: vários desenhos (franjas)

Pigmentação: anverso e reverso/difusível ou não

Tamanho: variável (quantidade equalidade do substrato)

Identificação de fungos filamentosos

• 2. Exame Microscópico:É a base do diagnóstico damaioria dos fungosfilamentosos

Se baseia nas diferençasmorfológicas das estruturasreprodutivas e na ontogeniados esporos

Os isolados primários esubcultivo devem sersubmetidos a avaliaçãomicromorfológica (40x)

Identificação de fungos filamentosos

• 2. Exame Microscópico - 2 técnicas podem serempregadas:

Técnica Material Montagem

Exame Microscópico Direto Amostra biológica Material é colocado entre lâmina e lamínula com líquido de montagem apropriado

Microcultivo Fragmento da cultura 1ª ou 2ª em meio sólido ou líquido,

Material é previamentedepositados sobre lâmina e/ou lâminulaLactofenol azul de algodão (hialinos)Lactofenol de Aman/ KOH/NaOH/ (demáceos)

Identificação de fungos filamentosos

• Exame microscópico Direto

• Agar “cornmeal”• Potato Dextrose Agar (PDA)• SDA Dextrose Agar (SDA)• Agar malte

Identificação de fungos filamentosos

• Técnica de microcultivo em lâmina (método 1)• 121ºC • 20-

30min • 30ºC • 3-5 dias

Identificação de fungos filamentosos

• Técnica de microcultivo em lâmina (método 1)

• Resistencia à cicloheximida

• Separar as culturas de:Blastomyces dermatitidis,Paracoccidiodes brasiliensis,Histoplasma capsulatum,Sporothrix schenckii,Coccidioides immitis,Epidermophyton floccosumMicrosporum ssp.,Trichophyton ssp.

Observação Meio Resultado

Crescimento SDA e Mycosel Resistente

Crescimento SDA Sensível

Não SDA Repetir

Identificação de fungos filamentosos

• 30°C • 7 dias

Fungos Oportunistas

Absidia, Rhizopus, Mucor

e Aspergillusfumigatus

Identificação de fungos filamentosos

• 4.Demonstração de balistosporos

• Alguns fungos Zygomycetes tem habilidade de produzirbalistosporos – dilatação propulsiva

Produção de balistosporos

Formação espontânea de colônias periféricas(Basidiobolus e Conidiobolus)

Identificação de fungos filamentosos

• 4.Demonstração de balistosporos

• 30ºC • 2-3 dias

Identificação de fungos filamentosos

• 5. Teste da Perfuração do fio de cabelo

Distinção entre

Trichophyton rubrum e T. Mentagrophytes

Extrato de levedura (10%) + fio de cabelo + culturasuspeita → incubar 30°C/ 10-14 dias

. Teste da Perfuração do fio de cabelo

Trichophyton mentagrophytes, Hair perforation test is positive.

Trichophyton rubrum, Hair perforation test is negative.

Perforations

Identificação de fungos filamentosos

• 6. Testes Fisiológicos

• Urease

• Habilidade de hidrolisar ou não a Uréia

• Distinguir isolados atipicos de Trichophyton rubrum (-) e

T. Mentagrophytes (+)

• Agar usado: Agar uréia Christensen

• Tempo: 3-4 dias

controle

Identificação de fungos filamentosos

• 7. Dimorfismo

Dimórficos são fungos filamentosos que podem, sobdeterminadas condições, assumir forma de levedura,diminuindo a capacidade de filamentação - colônias aspectocremoso

• Filamentosa a 25-30⁰C

• Levedura a 37 ⁰C

É um critério útil para identificação desses fungos patogênicos →Temperatura, composição do meio e concentração de CO₂

Identificação de fungos filamentosos

• 7. Dimorfismo

Histoplasma capsulatum,

Blastomyces dermatitidis,

Paracoccidiodes brasiliensis,

Sporothrix schenckii,

Coccidioides immitis,

gênero Emmonsia,

Penicillium marneffei

Técnica de conversão da fase micelial à fase leveduriforme

Todos os procedimentos devem ser feitos em câmara defluxo laminar

• Blastomyces dermatitidis e Paracoccidioides brasiliensis• Agar Kelley• Agar semente de

algodão• Sporothrix schenckii,

Histoplasma capsulatum• BHIB + glicose +cisteína

• Sporothrix schenckii,• BHIA

Exame direto – hifas em levedura (semanas)

• 1º - 30°C 2º - 37°C

Identificação de fungos leveduriformes

• 1 - Exame Macroscópico

• Características:

Textura TopografiaBordos Coloração

meios sólidos

Formação de película

meios líquidos

Colônias de cor laranja a vermelha, aspecto cremoso.

Rhodothorula spp

Macromorfologia (ágar Sabouraud)

Ágar Sabouraud: colônias decor branca a creme, cremosas elisas.

Candida albicans

Em ágar sangue, colônias de corcreme, com formação de franjasque lembram “ estrelas”.

Candida krusei

Colônia rosa

Macromorfologia em Chromagar

Macromorfologia

Identificação de fungos leveduriformes

• 2 - Exame Microscópico• Preparações diretas e/ou cultivo em lâmina

• Célula leveduras• Blastoporos• Blastosporos• Balistosforos• Pseudo-hifas• Tubos germinativos• Clamidosforos• Artrosporos• Ascos• Ascoporos• Cápsulas

Pseudohifas:abundantes e ramificadas

Clamidósporos terminaisestruturas arredondadas de parede espessa

Blastoconídeossão ovais e formam aglomerados no septo das pseudohifas.

Candida albicans

Micromorfologia

Identificação de fungos leveduriformes

• Tubo Germinativo

• Objetivo: Identificação presuntiva de Candida albicans eC. stellatoidea (incubado com soro humano a 37°C/ 2-3horas)

Descrição Método 1 Método 2

Meio de cultura

Soro humano ou animal Clara de ovo

Procedimento 0,3 - 0,5mL (tubo de ensaio) →cultura suspeita (idade 18-72h)→ incubar a 37°C / 2-3h →Inocular 1gt entre lâmina elamínula → microscópico

Inocular a cultura suspeita em clara de ovo → incubar a 37°C / 2 -3h → montagem microscópica (tubos germinativos)

Identificação de fungos leveduriformes

• Tubo Germinativo

CUIDADO: observar a constricçãomãe (início da formação da pseudohifa

ALMEIDA, G. M. D., et al.

Identificação de fungos leveduriformes

• Demonstração de cápsula• Indicar presuntivamente o agente

etiológico – Cryptococcusneoformans (cápsulas em torno dacélula)

• Realizada com preparaçõesmicroscópicas com nanquim ounigrosina

• Suspensão de levedura em águadestilada + tinta da China + lâmina elamínula → microscópio

Identificação de fungos leveduriformes

3 – Testes fisiológicos ou bioquímicos

São usados para identificação final deste grupo de fungos

Assimilação de carboidratos

Assimilação de nitrato

Fermentação de carboidratos

Teste de Urease → ZIMOGRAMA

Sistemas comerciais

AUXANOGRAMA}

Suspensãode células do fungo

Solução-padrão= 106

ufc/mL

Comparação para ajuste de turbidez:

espectrofotômetro ou visual

= INÓCULO

Auxanograma

• Presença de oxigênio

• Utilização de fontes de:

• Carbono (a partir de açúcares)

• Nitrogênio (a partir de nitrato)

Auxanograma

• Meio basal sem fonte de carbono

• Sólido ou líquido

• Yeast Nitrogen Base (YNB)- 40mL

• Inóculo: escala 1 McFarland (2mL)

• Incorporar suspensão de levedura ao meio

• Aplicação de discos ou açúcar in natura

• Incubação 30oC por 24-48h

Auxanograma

• Aplicação de compostos nitrogenados

• Peptona (controle positivo)

• Nitrato de potássio

• Incubação 30oC por 24-48 h até 7 dias

• Resultados: presença de zona de crescimento (leitura

visual)

Identificação de fungos leveduriformes

Teste da Urease

Hidrólise da Uréia

Cryptococcus neoformans (99%), Rhodotorula e Trichosporon→ urease positivo

Rápido crescimento em Agar Uréia de Christensen – coloraçãorosa escuro (30ºC/5 dias)

Teste da Urease rápida

Controle positivo: C. neoformans

Identificação de fungos leveduriformes

Sistemas Comerciais

Manuais

Automatizados (Vitek 2, ID 32C )

Para identificação específica de C. albicans

São empregados tiras ou cartelas contendo uma série degalerias plásticas com carboidratos desidratados ou outrosubstrato bioquímico

Inoculação nas galerias → incubação (varia de 4h-2-3 dias) →leitura

Cultura positiva

Exame direto

Bactéria Levedura

Cultura Pura

Sim Não

Obter Colônia Pura por isolamento

Cápsula

+

Macromorfologia

Colônia bege: Criptococcus spColônia salmão/laranja:Rhodothorula sp

-

Tubo Germinativo

- +

C. albicans

Provas Bioquímicas e Cultivo em Lâmina (continua)

Cultivo em lâmina

Obrigado!!!

Bibliografia

• LEVY, C. E. Manual de Microbiologia Clínica para o Controle de Infecção em Serviços de Saúde, 1ª edição, Módulo VII, Editora Agência Nacional de Vigilância Sanitária, Campinas SP., 2004. Disponível em: <http://www.anvisa.gov.br/ servicosaude/manuais/ microbiologia.asp>. Acesso em 17/10/12.

• SIDRIM, J. J. C.; ROCHA, M. F. G. Micologia Médica à Luz de Autores Contemporâneos, 1ª edição, Guanabara Koogan, 2004.

• ZAITZ. C, et al, Compêndio de Micologia Médica, 2º edição, Rio de Janeiro, Guanabara Koogan, 2010.

• Micologia Médica à Luz deAutoresContemporâneosSidrim JJC, RochaMFGGuanabara Koogan