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Identificação convencional de fungos filamentosos
e identificação automatizada e convencional de fungos
leveduriformes
Disciplina: Micologia Médica
Profº.: Luís Henrique
Acadêmicos:
Carlos Alberto; Joilce Portela; Marcos Allan; Maria Inês e Maria Josenilda
Introdução
• Identificação do fungo de maneira ideal seria: Gênero eespécie
• O processamento da amostra passa por 3 fases:
Pré-analítica
Analítica
Processamento da amostra
• Indicar a coleta• transporte
• Processamento• identificação do
microrganismo• laudo e estocagem
• Estudos • Dados epidemiológicos
Isolamento do fungo
Semear Exame direto
Macroscópico
Microcultivo/ análise bioquímica
Levedura Filamentoso
Gram
Identificação de fungos filamentosos
Cultura pura (Cultura mista é uma causa comum de erro)
• 1. Exame Macroscópico
Textura: algodonosa, velutina, pulverulenta (furfuráceas), penugentas
Identificação de fungos filamentosos
• 1. Exame Macroscópico
Relevo: cerebriformes, rugosa,apiculadas, crateriformes
Bordas: vários desenhos (franjas)
Pigmentação: anverso e reverso/difusível ou não
Tamanho: variável (quantidade equalidade do substrato)
Identificação de fungos filamentosos
• 2. Exame Microscópico:É a base do diagnóstico damaioria dos fungosfilamentosos
Se baseia nas diferençasmorfológicas das estruturasreprodutivas e na ontogeniados esporos
Os isolados primários esubcultivo devem sersubmetidos a avaliaçãomicromorfológica (40x)
Identificação de fungos filamentosos
• 2. Exame Microscópico - 2 técnicas podem serempregadas:
Técnica Material Montagem
Exame Microscópico Direto Amostra biológica Material é colocado entre lâmina e lamínula com líquido de montagem apropriado
Microcultivo Fragmento da cultura 1ª ou 2ª em meio sólido ou líquido,
Material é previamentedepositados sobre lâmina e/ou lâminulaLactofenol azul de algodão (hialinos)Lactofenol de Aman/ KOH/NaOH/ (demáceos)
Identificação de fungos filamentosos
• Exame microscópico Direto
• Agar “cornmeal”• Potato Dextrose Agar (PDA)• SDA Dextrose Agar (SDA)• Agar malte
Identificação de fungos filamentosos
• Técnica de microcultivo em lâmina (método 1)• 121ºC • 20-
30min • 30ºC • 3-5 dias
Identificação de fungos filamentosos
• Técnica de microcultivo em lâmina (método 1)
• Resistencia à cicloheximida
• Separar as culturas de:Blastomyces dermatitidis,Paracoccidiodes brasiliensis,Histoplasma capsulatum,Sporothrix schenckii,Coccidioides immitis,Epidermophyton floccosumMicrosporum ssp.,Trichophyton ssp.
Observação Meio Resultado
Crescimento SDA e Mycosel Resistente
Crescimento SDA Sensível
Não SDA Repetir
Identificação de fungos filamentosos
• 30°C • 7 dias
Fungos Oportunistas
Absidia, Rhizopus, Mucor
e Aspergillusfumigatus
Identificação de fungos filamentosos
• 4.Demonstração de balistosporos
• Alguns fungos Zygomycetes tem habilidade de produzirbalistosporos – dilatação propulsiva
Produção de balistosporos
Formação espontânea de colônias periféricas(Basidiobolus e Conidiobolus)
Identificação de fungos filamentosos
• 4.Demonstração de balistosporos
• 30ºC • 2-3 dias
Identificação de fungos filamentosos
• 5. Teste da Perfuração do fio de cabelo
Distinção entre
Trichophyton rubrum e T. Mentagrophytes
Extrato de levedura (10%) + fio de cabelo + culturasuspeita → incubar 30°C/ 10-14 dias
. Teste da Perfuração do fio de cabelo
Trichophyton mentagrophytes, Hair perforation test is positive.
Trichophyton rubrum, Hair perforation test is negative.
Perforations
Identificação de fungos filamentosos
• 6. Testes Fisiológicos
• Urease
• Habilidade de hidrolisar ou não a Uréia
• Distinguir isolados atipicos de Trichophyton rubrum (-) e
T. Mentagrophytes (+)
• Agar usado: Agar uréia Christensen
• Tempo: 3-4 dias
controle
Identificação de fungos filamentosos
• 7. Dimorfismo
Dimórficos são fungos filamentosos que podem, sobdeterminadas condições, assumir forma de levedura,diminuindo a capacidade de filamentação - colônias aspectocremoso
• Filamentosa a 25-30⁰C
• Levedura a 37 ⁰C
É um critério útil para identificação desses fungos patogênicos →Temperatura, composição do meio e concentração de CO₂
Identificação de fungos filamentosos
• 7. Dimorfismo
Histoplasma capsulatum,
Blastomyces dermatitidis,
Paracoccidiodes brasiliensis,
Sporothrix schenckii,
Coccidioides immitis,
gênero Emmonsia,
Penicillium marneffei
Técnica de conversão da fase micelial à fase leveduriforme
Todos os procedimentos devem ser feitos em câmara defluxo laminar
• Blastomyces dermatitidis e Paracoccidioides brasiliensis• Agar Kelley• Agar semente de
algodão• Sporothrix schenckii,
Histoplasma capsulatum• BHIB + glicose +cisteína
• Sporothrix schenckii,• BHIA
Exame direto – hifas em levedura (semanas)
• 1º - 30°C 2º - 37°C
Identificação de fungos leveduriformes
• 1 - Exame Macroscópico
• Características:
Textura TopografiaBordos Coloração
meios sólidos
Formação de película
meios líquidos
Colônias de cor laranja a vermelha, aspecto cremoso.
Rhodothorula spp
Macromorfologia (ágar Sabouraud)
Ágar Sabouraud: colônias decor branca a creme, cremosas elisas.
Candida albicans
Em ágar sangue, colônias de corcreme, com formação de franjasque lembram “ estrelas”.
Candida krusei
Colônia rosa
Macromorfologia em Chromagar
Macromorfologia
Identificação de fungos leveduriformes
• 2 - Exame Microscópico• Preparações diretas e/ou cultivo em lâmina
• Célula leveduras• Blastoporos• Blastosporos• Balistosforos• Pseudo-hifas• Tubos germinativos• Clamidosforos• Artrosporos• Ascos• Ascoporos• Cápsulas
Pseudohifas:abundantes e ramificadas
Clamidósporos terminaisestruturas arredondadas de parede espessa
Blastoconídeossão ovais e formam aglomerados no septo das pseudohifas.
Candida albicans
Micromorfologia
Identificação de fungos leveduriformes
• Tubo Germinativo
• Objetivo: Identificação presuntiva de Candida albicans eC. stellatoidea (incubado com soro humano a 37°C/ 2-3horas)
Descrição Método 1 Método 2
Meio de cultura
Soro humano ou animal Clara de ovo
Procedimento 0,3 - 0,5mL (tubo de ensaio) →cultura suspeita (idade 18-72h)→ incubar a 37°C / 2-3h →Inocular 1gt entre lâmina elamínula → microscópico
Inocular a cultura suspeita em clara de ovo → incubar a 37°C / 2 -3h → montagem microscópica (tubos germinativos)
Identificação de fungos leveduriformes
• Tubo Germinativo
CUIDADO: observar a constricçãomãe (início da formação da pseudohifa
ALMEIDA, G. M. D., et al.
Identificação de fungos leveduriformes
• Demonstração de cápsula• Indicar presuntivamente o agente
etiológico – Cryptococcusneoformans (cápsulas em torno dacélula)
• Realizada com preparaçõesmicroscópicas com nanquim ounigrosina
• Suspensão de levedura em águadestilada + tinta da China + lâmina elamínula → microscópio
Identificação de fungos leveduriformes
3 – Testes fisiológicos ou bioquímicos
São usados para identificação final deste grupo de fungos
Assimilação de carboidratos
Assimilação de nitrato
Fermentação de carboidratos
Teste de Urease → ZIMOGRAMA
Sistemas comerciais
AUXANOGRAMA}
Suspensãode células do fungo
Solução-padrão= 106
ufc/mL
Comparação para ajuste de turbidez:
espectrofotômetro ou visual
= INÓCULO
Auxanograma
• Presença de oxigênio
• Utilização de fontes de:
• Carbono (a partir de açúcares)
• Nitrogênio (a partir de nitrato)
Auxanograma
• Meio basal sem fonte de carbono
• Sólido ou líquido
• Yeast Nitrogen Base (YNB)- 40mL
• Inóculo: escala 1 McFarland (2mL)
• Incorporar suspensão de levedura ao meio
• Aplicação de discos ou açúcar in natura
• Incubação 30oC por 24-48h
Auxanograma
• Aplicação de compostos nitrogenados
• Peptona (controle positivo)
• Nitrato de potássio
• Incubação 30oC por 24-48 h até 7 dias
• Resultados: presença de zona de crescimento (leitura
visual)
Identificação de fungos leveduriformes
Teste da Urease
Hidrólise da Uréia
Cryptococcus neoformans (99%), Rhodotorula e Trichosporon→ urease positivo
Rápido crescimento em Agar Uréia de Christensen – coloraçãorosa escuro (30ºC/5 dias)
Teste da Urease rápida
Controle positivo: C. neoformans
Identificação de fungos leveduriformes
Sistemas Comerciais
Manuais
Automatizados (Vitek 2, ID 32C )
Para identificação específica de C. albicans
São empregados tiras ou cartelas contendo uma série degalerias plásticas com carboidratos desidratados ou outrosubstrato bioquímico
Inoculação nas galerias → incubação (varia de 4h-2-3 dias) →leitura
Cultura positiva
Exame direto
Bactéria Levedura
Cultura Pura
Sim Não
Obter Colônia Pura por isolamento
Cápsula
+
Macromorfologia
Colônia bege: Criptococcus spColônia salmão/laranja:Rhodothorula sp
-
Tubo Germinativo
- +
C. albicans
Provas Bioquímicas e Cultivo em Lâmina (continua)
Cultivo em lâmina
Obrigado!!!
Bibliografia
• LEVY, C. E. Manual de Microbiologia Clínica para o Controle de Infecção em Serviços de Saúde, 1ª edição, Módulo VII, Editora Agência Nacional de Vigilância Sanitária, Campinas SP., 2004. Disponível em: <http://www.anvisa.gov.br/ servicosaude/manuais/ microbiologia.asp>. Acesso em 17/10/12.
• SIDRIM, J. J. C.; ROCHA, M. F. G. Micologia Médica à Luz de Autores Contemporâneos, 1ª edição, Guanabara Koogan, 2004.
• ZAITZ. C, et al, Compêndio de Micologia Médica, 2º edição, Rio de Janeiro, Guanabara Koogan, 2010.
• Micologia Médica à Luz deAutoresContemporâneosSidrim JJC, RochaMFGGuanabara Koogan