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Di che cosa abbiamo bisogno?Un Nucleo NMR-attivoUn campo magnetico statico B0
Un trasmettitore di radiofrequenza
PRINCIPI DI BASE
Parole Chiave
Esperimenti in Onda continua ed in Trasformata di Fourier
PRINCIPI DI BASE
Thank you, Mr. Fourier!
F() F(t)
FOURIER TRANSFORMATIONS
F()=(0)
F()=A(sin)/ centered at 0
F()=T2/1+(2T2)2 -i 2(T2)2/1+(2T2)20
F()=T2/1+(2T2)2 -i 2(T2)2/1+(2T2)20
F(t)=exp(-t/T2)
F(t)=exp(-t/T2)exp(i2A)
Why bother with FT?
FT allows to decompose a function in a sum of sinusoidal function(deconvolution).
In NMR FT allows to switch from the time domain, i.e. the signal emitted by the sample as a consequence of the
radiofrequency irradiation and detected by the receiving coil to the frequency domain (NMR spectrum)
The FT allows to determine the frequency content of a squared function
Aspetti delle Trasformate di Fourier importanti per NMR
Una somma di onde, puo’ essere decomposta nelle singole onde che l’hanno generata e puo’ essere convertita in una serie di frequenze
Una radiazione elettromagnetica v applicata per un tempo corto ha la proprietà di eccitare non solo la frequenza v ma
anche tutte le frequenze intornoTanto piu’ l’impulso è corto e tanto più è largo il range di
frequenze eccitate
La Trasformata di Fourier del prodotto di due funzioni è uguale al prodotto delle trasformate delle due funzioni
A “real” F.I.D.
The NMR Experiment The NMR Experiment After the pulse is After the pulse is switched off, the switched off, the magnetization magnetization
precesses in the xy precesses in the xy plane and relaxes plane and relaxes to equilibriumto equilibrium
The current induced in a coil The current induced in a coil by the magnetization by the magnetization precessing in the xy plane is precessing in the xy plane is recorded. It is called recorded. It is called FIDFID..
zz
yy
xx
zz
yy
xx
zz
yy
xx
MM
BB11
90°90° tt
II
II
tt
2T
t
e
)(
2
1I
To have a spin transition, a To have a spin transition, a magnetic field Bmagnetic field B11 , oscillating , oscillating
in the range of in the range of radiofrequencies and radiofrequencies and
perpendicular to z, is applied perpendicular to z, is applied ((perturbing pulseperturbing pulse) )
The BThe B11 field creates field creates
coherence among the coherence among the spins (they all have spins (they all have
the same phase) and the same phase) and net net magnetizationmagnetization in in
the x,y plane is the x,y plane is createdcreated
FTrelax.
x90
Preparation Detection
x
y
z
x90 t2
0
dte)t(f)(F ti
Signal to noiseScans S/N1 1.00 80 8.94 8 2.83 800 28.28 16 4.00
Sensibilità dell’Esperimento NMR
S/N N 5/2 B03/2
N = Numero di spins che contribuiscono al segnale
rapporto giromagnetico del nuclide studiato
Camp magnetico utlizizzato
Ubiquitin
76 amino acids, 8,5 kDa
1D experiment
Could be nice but...
..Too crowded..
What do we learn?
Chemical shifts relaxation rates
Not enough to get a structure
Occorrono informazioni strutturali, e correlazioni tra i
vari spin che permettano l’assegnamento.
Per ottenere cio’ é necessario osservare tutti i possibili accoppiamenti scalari e dipolari.
NMR MULTIDIMENSIONALE
Gli spettri NMR monodimensionali permettono questo solo per molecole semplici e di basso peso molecolare.
All’aumentare del PM, diventa impossibile individuare tutti gli accoppiamenti scalari dall’analisi dei
multipletti e tutti gli accoppiamenti dipolari dagli esperimenti NOE monodimensinoali.
The need for multidimensional NMR
COSA SIGNIFICA Spettro NMR
BIDIMENSIONALE
Cosa è un esperimento bidimensionale ?
Dopo un impulso a 90° il segnale è pronto per essere acquisito
Facciamo l’acquisizione ma NON terminiamo l’esperimento ed applichiamo ancora uno o piu’ impulsi in modo da perturbare ulterioremente il sistema
Attraverso una combinazione di impulsi e delays noi facciamo in modo che ci sia uno scambio di magnetizzazione tra spin accoppiati
SUCCESSIVAMENTE, acquisiamo il segnale una seconda volta,Registrando il segnale NMR che rimane sul piano xy dopo la perturbazione
PREPARAZIONE-ACQUISIZIONE t1- PERTURBAZIONE- ACQUISIZIONE (t2)
90°
Aq F1
HAA (F1)
HB
Aq F2
A (F1) B (F2)
HAA (F1) A (F2)
Perché la magnetizzazione di uno spin dovrebbe trasferirsi su quella di
un altro spin?
Perché ci sono gli accoppiamenti scalari e gli accoppiamenti dipolari
Eccito (impulso a 90°)-Acquisisco (t1)- Perturbo (trasferisco)- Acquisisco (t2)
Se la perturbazione non ha effetto e se non c’è trasferimento di alcun tipo,Ottengo lo stesso spettro in ciascuna delle 2 dimensioni tempo (t1 e t2)Dopo la trasformate di Fourier io otterro’ uno spettro dove i segnali appaiono su una diagonale di una matrice quadrata
Se durante la perturbazione una parte della magnetizzazione si traferisce da un nucleo ad un altro, per esempio per effetto di accoppiamento scalare, allora lo spettro della dimensione t2 sarà diverso da quello della dimensione t1.
Il risultato è che avro’ dei segnali fuori dalla diagonale. Ciascun segnale fuori dalla diagonale darà l’informazione sugli accoppiamenti scalari attivi nel sistema
M (I t1) (St2)
Acquisisco (t1)- Perturbo (trasferisco)- Acquisisco (t2)
EXAMPLEN
H H
CC
O
We make a 1H experiment and we acquire.
Then all signals transfer the information because of scalar coupling
N
H H
C
Then I observe Hc
I observe Hn
I consider the first and the second acquisition as two indpendent dimensions
Spectrum afterThe J coupling
Spectrum beforeThe J coupling
EXAMPLEN
H H
CC
O
N
H H
C
Spectrum afterThe J coupling
Spectrum beforeThe J coupling4 ppm9 ppm
Signal!This indicates that there is a scalar coupling
between Hn and Hc
EXAMPLEN
H H
CC
O
N
H H
C
Spectrum afterThe J coupling
Spectrum beforeThe J coupling4 ppm9 ppm
Signal!This indicates that there is a scalar coupling
between Hn and Hc
Hn Hn
Hc
J-coupling
EXAMPLEN
H H
CC
O
Spectrum afterThe J coupling
Spectrum beforeThe J couplingHc Hc
Hn
J-coupling
If you begin from Hc , the situation is the same !
EXAMPLEN
H H
CC
O
Spectrum afterThe J coupling
Spectrum beforeThe J coupling
Hc Hc
Hn
J-coupling
Therefore, if I consider only this system
Hn Hn
Hc
J-coupling
The first dimension = t1
The second dimension = t2
the series of pulses that I have to apply to my system = PULSE SEQUENCE
example
t1 t2
t1 dimensionOr F1
t2 dimensionOr F2
Usually t1 is also defined as indirect dimension
t2 is also defined as direct dimension
the series of pulses that I have to apply to my system = PULSE SEQUENCE
example
t1 t2
t1 dimensionOr F1
t2 dimensionOr F2
F1
F2
Definitions
Cross peak Two different frequencies are observed in the two dimensions
Diagonal peakThe same frequency is observed in both dimensions
CROSS PEAK= Yes, There is a COUPLING between the two frequencies
Accoppiamento scalare
L’accoppiamento scalare puo’ comunque essere osservato attraverso esperimenti NMR bidimensionali, quali il COSY
Example: COSY
Through-bond connectivities
COSY= COrrelation SpectroscopY
H4-H5
H4’-H5’
Example: COSY
Through-bond connectivities
COSY= COrrelation SpectroscopY
H4-H5
H4’-H5’
1
2
3
4
5
6
Beyond COSYCOSY is not the only 2D experiment
It is possible to transfer the information from spin A to spin B via several possible mechanisms
The most important routes, which is COMPLEMENTARY
TO J-couplingIs THROUGH SPACE
COUPLING
Accoppiamento dipolareL’accoppiamento dipolare si ha tra due spin che sono vicini nello spazio
Si tratta della interazione tra due dipoli magnetici, tra i quali, quando essi sono vicini nello spazio, si ha uno scambio di energia
L’entità dell’effetto dipende dal campo magnetico e dalle dimensioni della molecola. Nel caso di spin 1H, l’accoppiamento dipolare si trasferisce per spin che si trovano a distanze inferiori ai 5 A.
NON si osservano doppietti
L’accoppiamento dipolare da luogo ad un trasferimento di magnetizzazione da uno spin all’altro. Questo effetto va sotto il nome di effetto NOE
Nuclear Overhauser Effect
Perturbo A Aumenta la intensità di B
Accoppiamento dipolare
L’accoppiamento dipolare è “indipendente dall’accoppiamento scalare2 spin possono essere accoppiati :-Scalarmente E dipolarmente se sono vicini nello spazio e legati da legami chimici-scalarmente ma non dipolarmente se sono legati da legami chimici ma non vicini nello spazio-dipolarmente ma non scalarmente se sono spazialmente vicini ma non legati da legamei chimici
Pensate a degli esempi, per favore
L’effetto NOE è osservabile in un esperimento NMR bidimensionale , detto NOESY(in realtà si puo’ anche osservare in esperimenti monodimensionle (1D NOE) di cui pero’ non parleremo
Through space AND throuhg bonds
Through space
Through bond
Quando lo spettro è troppo affollato di segnali, non è possibile fare esperimenti monodimensionali, perché non tutti i segnali sono disttinguibili dagli altri
E’ quindi necessario u nesperimento bidimensionale, ovvero un esperimento che permette di trasferire la magnetizzazinoe da uno spin all’altro utilizzando l’accoppiamento dipolare
Example:Nuclear Overhauser Effect SpectroscopY
NOESYNOE Effect:
If two spins that are close in space are excited out of equilibrium, they will mutually transfer their magnetization
AAAA ABAB
Example:
Cross peaks: A and B Cross peaks: A and B are closeare close
Diagonal peakDiagonal peak
The real The real case:case:Some 1500 Some 1500 peaks are peaks are observed observed for a for a protein of protein of 75 75 aminoacidaminoacidss
AAAA ABAB
NOESY experiment
2D NOESY Spectrum
Distance constraints
NOESY volumes are proportional to the sixth power of the interproton distance and to the correlation time for the dipolar coupling
BB00
II
JJ
rr
6IJ
cIJ r
The “old times” approachNOESYNOESY
CCOOSYSY
Identify through space connectivitiesIdentify through space connectivitiesHN(i)-Ha(i) and HN(i)Ha(i-1)HN(i)-Ha(i) and HN(i)Ha(i-1)
Identify through bond connectivitiesIdentify through bond connectivitiesHN(i)-Ha(i)HN(i)-Ha(i)
NOESY conn.NOESY conn.
COSCOSY connY conn
La Spettroscopia NMR che utilizza sono spin 1H è solo un caso particolare della spettroscopia NMR bidimensinoale
In effetti, accoppiamenti scalari e dipolari sono possibili anche tra spin diversi, es1H e 13C1H e 15N13C e 15N13C e 13C
In particolare, gli esperimenti che utilizzano accoppiamenti scalari tra spin diversi permettono di usare le 1J che di solito hanno valori maggiori e quindi danno esperimenti piu’ sensibili.
Sarà pertanto possibile effettuare esperimenti bidimensionali dove in ciascuna delle due dimensioni si acquisicono nuclei diversi, per esempio 13C e 1H
Otterremo un segnale nello spettro SE E SOLO SE abbiamo nel nostro sistema due spin (1H e 13C) che sono tra di loro accoppiati.
Questi esperimenti offrono molti vantaggi e aprono molte possibilità:
1. Spin 1H e 13C potranno essere direttamente accoppiati tra di loro aiutando la identificazione dei varigruppi e semplificando l’assegnamento
2. 2. Ogni picco permette di individuare due spin, semplificando il problema della identificazione dei segnali
3. Un esperimento bidimensionale offre una risoluzione molto maggiore perchéi segnali non sono separati solo in una dimensionale ma in una matrice bidimensionale, permettendo cosi’ l’analisi di sistemi anche piu’ complessi e non risolvibili in 1D
1J couplings for
backbone resonances
1J couplings for
backbone resonances
The 2D Hetcor experiment
Two dimensional Heteronuclear correlation Experiment
The 2D Hetcor experimentTwo dimensional Heteronuclear correlation Experiment
E’ possibile, in uno stesso esperimento mandare impulsi su nuclidi diversi (Es: 1H, 13C)
’ possibile, combinare questa possibilità con ciò che sappiamo a proposito degli accoppiamenti scalari e quindi UTILIZZARE gli accoppiamenti scalari per trasferire la magnetizzazione dauno spin 1H ad uno spin 13C ad esso scalarmente accoppiato
E’ possibile, in uno stesso esperimento mandare impulsi su nuclidi diversi (Es: 1H, 13C)
Inoltre possiamo combinare tutto cio’ con quello che sappiamo sugli esperimenti bidimensionali
Eccito (impulso a 90°) 1H Acquisisco (t1) 1H –Perturbo (Trasferisco la magnetizzazione da 1H a 13C utilizzando l’accoppiamento scalare 1JHC
Acquisisco (t2) 13C
2D HETCOR Expriment
2D HETCOR Expriment
2D HETCOR Expriment
Prima dimensione
2D HETCOR Expriment
Prima dimensione
2D HETCOR Expriment
Prima dimensione
Seconda dimensione
2D HETCOR Expriment
Prima dimensione
Seconda dimensione
Esempio
COSY
Esempio
COSY
N.B. In questo caso non si osserva solo l’accoppiamento 3J ma si osserva una “propagazione” dell’informazione attraverso gli accoppiamenti scalari
EsempioHETCOR
514
32
Heteronuclear Single Quantum coherence
2D HSQC Experiment
2D HSQC Expriment
Heteronuclear Single Quantum coherence
2D HSQC Experiment
Prima dimensione
Seconda dimensione
Heteronuclear Single Quantum coherence
2D HSQC Expriment
Prima dimensione
Heteronuclear Single Quantum coherence
2D HSQC Experiment
Seconda dimensione
Prima dimensione
Heteronuclear Single Quantum coherence
2D HSQC Experiment
Heteronuclear Single Quantum coherence
Seconda dimensione
Prima dimensione
E’ possibile progettare esperimenti per trasferire la magnetizzazione da un nucleo all’altro anche indipendentemente dall’acquisizione
In questo esperimento il primo spin che viene eccitato è 1H, la magnetizzazione viene trasferita da 1H a 13C PRIMA della acquisizione della prima dimensione, che quindi è 13C. SOLO i 13C che sono accoppiati ad 1H possono essere osservati!
Successivamente la magnetizzazione e di nuovo trasferita 1H utilizzando sempre l’accoppiamento scalare ed alla fine osservo 1H
Eccito (impulso a 90°) 1H Trasferisco la magnetizzazione da 1H a 13C utilizzando l’accoppiamento scalare 1JHC
Acquisisco (t1) 13C –
Perturbo -Trasferisco la magnetizzazione da 13C a 1H utilizzando l’accoppiamento scalare 1JHC
Acquisisco (t2) 1H
2D HSQC Experiment
Questo tipo di esperimento si chiama anche Out and backSignifica che parto da 1H, trasferisco da 1H a 13C (out), acquisisco 13C nella prima dimensione e poi torno (back) sullo stesso nucleo da cui sono partito
2D HSQC Experiment
Il doppio trasferimento fa si che l’esperimento sia molto piu’ selettivo
Osservo solo 1H e 13C che sono accoppiati tra di se per effetto di 1J
The HSQC experiment
Caratteristiche dell’esperimento HSQC
Non esiste la diagonaleNon esiste la diagonale
La magnetizzazione viene trasferita da 1H al 13C ad esso accoppiato
Successivamente si acquisisce, nella dimensione indiretta, 13C
Infine si ri-trasferisce su 1H e si osserva 1H
Tutti gli Tutti gli 11H che non sono accoppiati a H che non sono accoppiati a 1313C NON si osservanoC NON si osservano
Heteronuclear NMR
OBSERVE 13C during t1
Transfer the information to all 1H coupledOBSERVE 1H during t2
1H
13C
No more diagonal
Each peak indicate A different H-C pair
Heteronuclear NMROBSERVE 13C during t1
Transfer the information to all 1H coupledObserve 1H during t2
1H
13C
No more diagonal
Two protons are bound to the same carbon
CH2
The HSQC experiment
Heteronuclear cases
The scheme of 1J scalar couplings
The 1H- 15N HSQC experiment
Heteronuclear Single Quantum Coherence
The HSQC experiment
In 5 minutes you may know….if your protein is properly foldedif all aminoacids gives rise to an
observable peak
Each amide NH group gives rise to one peak
Detect H-N couplings
Same sensitivity of a 1H experiment (although you are
observing 15N)but much larger resolution
if you can do the job (whatever is your job)
Heteronuclear NMR in proteinsexample: 15N labelled proteins
Heteronuclear NMR in proteinsexample: 15N labelled proteins
The HSQC experiment
In 5 minutes you may know….if your protein is properly foldedif all aminoacids gives rise to an
observable peak
Each amide NH group gives rise to one peak
Detect H-N couplings
Same sensitivity of a 1H experiment (although you are
observing 15N)but much larger resolution
Ca2+
Apo Cb @ 3.3 M GdmCl
Loss of secondary structure elements: unfolded protein
Refolding
Ca2Cb @ 3.3 M GdmCl
The role of metal cofactor in protein unfolding
Metal triggered protein folding
7795
5935
26
60
45 96 7
33
20
34
27
75
15 6
62
65
9472
90
137812
80
100
8
8846
4286
87
81
8568
102
582
5254 55
71
56 91
29
66
36
328
38101
2558
98 5376
1674
84
30
21
3969
40
9767
37
41
99 1443
6489
2448
5147
11
23
9357 19
4 10
83
22
1779
HN1 83
HN 28
HN 32
Apo vs holo protein, mapping the environment of the Apo vs holo protein, mapping the environment of the metal ionmetal ion
15N
15H
The need for multidimensional NMR
Troppi segnali 1H ?
Isotope labelingFor biomolecules, tipically, 15N or 13C and 15N, or 13C, 15N, 2H
15N Only
A more effective fingerprint-characterization-folding-dynamics
protein size >10000Homonuclear 2D experiments donot have enough resolution
HSQC or HMQCHSQC-NOESY or HSQC TOCSY
Isotope labelingFor biomolecules, tipically, 15N or 13C and 15N, or 13C, 15N, 2H
15N and 13C
Scalar couplings through 13C atoms-triple resonance-assignment-structure
protein size >20000
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