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Décontamination microbienne des surfaces : évaluation du potentiel de l'humidité relative sur la destruction et la
physiologie de Listeria monocytogenes
1
Fiona Zoz – Doctorante
Directeur de thèse : Pr Laurent Beney
Dr Cosette Grandvalet
Dr Stéphane Guyot
UMR Procédés Alimentaires et Microbiologiques
Plan
2
Problématique Approche expérimentale Résultats et Discussion Optimisation de conditions de séchage pour la destruction de L. monocytogenes
1) Influence de l’humidité relative 2) Influence de la vitesse de déshydratation 3) Impact de cycles de déshydratation et réhydratation 4) Impact de la réhydratation après séchage 5) Rôle de la perméabilisation membranaire après déshydratation et réhydratation 6) Observation de la morphologie bactérienne après séchage par Microscopie à Force Atomique (AFM)
Conclusions et perspectives
Plan
3
Problématique Approche expérimentale Résultats et Discussion Optimisation de conditions de séchage pour la destruction de L. monocytogenes
1) Influence de l’humidité relative 2) Influence de la vitesse de déshydratation 3) Impact de cycles de déshydratation et réhydratation 4) Impact de la réhydratation après séchage 5) Rôle de la perméabilisation membranaire après déshydratation et réhydratation 6) Observation de la morphologie bactérienne après séchage par Microscopie à Force Atomique (AFM)
Conclusions et perspectives
Listeria monocytogenes
Bacille, gram +, environnement : sol, lacs, rivières, eaux d’égouts, végétation…
Environnements hostiles :
- basse température
- pH faible
- forte concentration en sel
Persiste dans les ateliers et équipements agro-alimentaires
Contamination des aliments
Listériose : gastro-entérite, septicémie, infection du système nerveux central (population sensible), avortement chez les femmes enceintes Epidémiologie : - En France (2013) : 5,6 cas de listériose/millions d’habitants (InVS) - USA (2009-2011) : 2,9 cas de listériose/millions d’habitants/an (CDC) - Taux de mortalité de 20 à 30% InVs : Institut de Veille Sanitaire (http://www.invs.sante.fr/) CDC : Centers for Disease Control and Prevention (http://www.cdc.gov/)
4
Problématique
Procédures de nettoyage et désinfection en industries agro-alimentaires :
- détergents alcalins et acides
- enzymes
- désinfectants chimiques [1]
Nocif pour l’environnement
Résistance des souches de L. monocytogenes [2][3] [4]
Nombreux rappels de produits contaminés (FDA)
Impact sanitaire
Méthode éco-responsable : Séchage ?
[1] Van Houdt et al., 2010; [2] Mereghetti et al., 2000; [3] Ratani et al., 2012; [4] Xu et al., 2014
5
Séchage
Méthode de préservation (protectants, température, cinétique optimale)
Peu testé pour contrôler les populations cellulaires
L. monocytogenes résistante à la dessiccation : 91 jours à 43% HR sur de l’acier inoxydable à 15°C [6]
Principaux effets du séchage sur la cellule :
• Contrainte mécanique : perte d’eau de la cellule, diminution du volume cellulaire
• Contrainte structurale : désorganisation de la bicouche lipidique, agrégation des molécules, modification structurale des protéines
• Stress oxydatif : cellule en contact avec l’oxygène de l’air
Diminution du
nombre de
molécules d’eau
dans le milieu
1 H2O
ai
r
↗ π
air
[6] Vogel et al., 2010
6
6
Evaluer le potentiel de destruction des fluctuations de l’humidité relative sur L. monocytogenes
Objectif :
Plan
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Problématique Approche expérimentale Résultats et Discussion Optimisation de conditions de séchage pour la destruction de L. monocytogenes
1) Influence de l’humidité relative 2) Influence de la vitesse de déshydratation 3) Impact de cycles de déshydratation et réhydratation 4) Impact de la réhydratation après séchage 5) Rôle de la perméabilisation membranaire après déshydratation et réhydratation 6) Observation de la morphologie bactérienne après séchage par Microscopie à Force Atomique (AFM)
Conclusions et perspectives
8
Ventilateur
Solution saturée en sel avec aw contrôlée : NaCl = 0,75; KI=0,68, K2CO3 = 0,43; LiCl = 0,11
Air ventilé avec vitesse, HR contrôlées
Echantillon biologique
Enceinte à humidité relative contrôlée
Souches étudiées
Sélection de 4 souches de L. monocytogenes : EGDe (sérotype : 1/2a, origine : cas clinique animal)
CCL500 (sérotype : 1/2b, origine : lait)
Résistantes à la déshydratation CCL128 (sérotype : 4b, origine : industrie fromagère)
Modérément résistante à la déshydratation LO28 (sérotype : 1/2c, origine : cas clinique de listériose)
Sensible à la déshydratation
Criblage de 30 souches de L. monocytogenes à la déshydratation (différentes lignées, sérotypes, origines)
9
Protocole de séchage
Culture de L. monocytogenes à
25°C et lavage dans du PBS
Dépôt de 10 μL de suspension bactériennes ( ≃ 109 UFC/mL) sur coupon de
polypropylène
Echantillon Ventilateur
Solution saturée en sel : NaCl = 75% HR, KI = 68%, K2CO3 = 43% HR, LiCl = 11% HR Incubation à 25°C
Réhydratation cellulaire dans 1 mL de PBS = réhydratation rapide
Mesure de la viabilité par la méthode UFC sur boite gélosée
Pesée de l’échantillon avant et après séchage
11
Plan
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Problématique Approche expérimentale Résultats et Discussion Optimisation de conditions de séchage pour la destruction de L. monocytogenes
1) Influence de l’humidité relative 2) Influence de la vitesse de déshydratation 3) Impact de cycles de déshydratation et réhydratation 4) Impact de la réhydratation après séchage 5) Rôle de la perméabilisation membranaire après déshydratation et réhydratation 6) Observation de la morphologie bactérienne après séchage par Microscopie à Force Atomique (AFM)
Conclusions et perspectives
-6
-5
-4
-3
-2
-1
0
0 30 60 90 120 150 180 210 240 270
Pe
rte
de
cult
ivab
ilité
Lo
g 10
(N/N
0)
Temps (min)
75% HR
960 990 -6
-5
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-3
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0
0 30 60 90 120 150 180 210 240 270Temps (min)
68% HR
CCL500
EGDe
CCL128
LO28
960 990
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0 30 60 90 120 150 180 210 240 270
Per
te d
e cu
ltiv
abili
té L
og 1
0
(N/N
0)
Temps (min)
43% HR
-6
-5
-4
-3
-2
-1
0
0 30 60 90 120 150 180 210 240 270Temps (min)
11% HR
960 990 960 990
ND
Plus l’humidité relative est faible plus la perte de cultivabilité est rapide Entre 90min et 960min de séchage : la cultivabilité se stabilise (excepté 68% HR) Séchage à 68% HR : La mort cellulaire continue après l’étape transitoire de séchage Deux étapes sont observées : perte de cultivabilité et stabilisation de la cultivabilité Cultivabilité 75% HR > 11% HR> 43% HR> 68% HR
Influence de l’humidité relative sur la survie de L. monocytogenes
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0
2
4
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Pe
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(N/N
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Temps (min)
75% HR
960 990 0
2
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Temps (min)
68% HR
CCL500
EGDe
CCL128
LO28
Experimental
Série6 960 990
0
2
4
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(N/N
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Temps (min)
43% HR
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Mas
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(m
g)
Temps (min)
11% HR
960 990 960 990
ND
Théorique
Masse de l’échantillon
Influence de l’humidité relative sur la survie de L. monocytogenes
Perte rapide de cultivabilité pendant l’évaporation de l’échantillon : plus la perte de masse est rapide, plus la perte de cultivabilité est rapide
Entre 90min et 960 min de séchage : la cultivabilité se stabilise tout comme l’évaporation de l’échantillon (sauf 68% HR) Influence de la vitesse d’évaporation de l’échantillon ? 14
Plan
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Problématique Approche expérimentale Résultats et Discussion Optimisation de conditions de séchage pour la destruction de L. monocytogenes
1) Influence de l’humidité relative 2) Influence de la vitesse de déshydratation 3) Impact de cycles de déshydratation et réhydratation 4) Impact de la réhydratation après séchage 5) Rôle de la perméabilisation membranaire après déshydratation et réhydratation 6) Observation de la morphologie bactérienne après séchage par Microscopie à Force Atomique (AFM)
Conclusions et perspectives
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Influence de la vitesse de déshydratation sur la survie de L. monocytogenes
HR
enceinte
de
séchage
Vmax
(10-3
mg/min)
EGDe CCL500 CCL128 LO28
180 min 960 min 180 min 960 min 180 min 960 min 180 min 960 min
43%
0,72 - 2,32
(± 0,40)ab
-3,74
(± 0,6)c
-2,59
(± 0,41)abc
-3,02
(± 0,28)abc
-2,77
(± 0,29)ab
-3,49
(± 0,24)b
-3,11
(± 0,17)a
-3,97
(± 0,26)a
0,56 -1,95
(± 0,54)a
-2,27
(± 0,43)ab
-1,97
(± 0,21)a
-2,55
(± 0,16)abc
-2,24
(± 0,31)a
-3
(± 0,2)ab
-2,82
(± 0,21)a
-2,84
(± 0,52)a
0,32 -2,43
(± 0,78)ab
-3,36
(± 0,65)bc
-2,36
(± 0,72)ab
-3,1
(±0,35)bc
-2,51
(± 0,55)ab
- 3,48
(±0,35)b
-3,22
(± 0,31)a
-4,1
(± 0,54)a
68%
0,38 -3,85
(± 0,07)c < - 4,5 d
-3,63
(± 0,32)c < - 4,5 d
-4,15
(± 0,36)b < - 4,5 c < - 4,5 b < - 4,5 b
0,28 -3,08
(± 0,38)abc < - 4,5 d
-2,81
(± 0,76)abc < - 4,5 d
-3,47
(± 0,94)b < - 4,5 c
-3,82
(± 1,11)a < - 4,5 b
0,22 -2,66
(± 0,7)abc < - 4,5 d
-2,65
(± 0,61)abc < - 4,5 d
-2,93
(± 0,53)ab < - 4,5 c
-4,17
(± 0,98)a < - 4,5 b
Pour chaque souche, 180 min et 960 min: pas de différence significative de la survie pour 68% HR et 43% HR Pour une même vitesse de séchage à différentes HR : différence significative pour chaque souche la vitesse de séchage n’est pas un paramètre crucial pour améliorer la mort cellulaire Le paramètre le plus influent pour la mort cellulaire est le niveau d’HR (68% HR)
Perte de cultivabilité Log10(N/N0) (SD)
17
HR (%) Etat à 180
min
Cultivabilité entre 180 min
et 960 min
Hypothèses du phénomène induit pendant le séchage
75 (aw=0,75) Liquide Stable
68 (aw=0,68) Visqueux Diminution
43 (aw=0,43) Sec Stable
11 (aw=0,11) Sec Stable
Discussion
Mobilité moléculaire Oxydation Stress osmotique + +
Conservation
Plan
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Problématique Approche expérimentale Résultats et Discussion Optimisation de conditions de séchage pour la destruction de L. monocytogenes
1) Influence de l’humidité relative 2) Influence de la vitesse de déshydratation 3) Impact de cycles de déshydratation et réhydratation 4) Impact de la réhydratation après séchage 5) Rôle de la perméabilisation membranaire après déshydratation et réhydratation 6) Observation de la morphologie bactérienne après séchage par Microscopie à Force Atomique (AFM)
Conclusions et perspectives
Séchage à 68% et 43% d’HR de 180 min réhydratation rapide séchage 180 min réhydratation rapide
2 cycles de déshydratation-réhydratation entrainent une plus grande perte de cultivabilité
Deuxième cycle ne permet pas d'avoir une diminution logarithmique identique au premier cycle à 43% d’HR
Aucune cultivabilité bactérienne après 2 cycles à 68% d’HR
Hypothèses : Cellules fragiles tuées lors du 1er cycle
Cellules survivantes adaptation, résistance ?
cd
bcd
cd d ND ND ND ND
a
ab ab
abcd
abc
bcd
cd cd
-5
-4,5
-4
-3,5
-3
-2,5
-2
-1,5
-1
-0,5
0
EGDe CCL500 CCL128 LO28
Pe
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Lo
g 10
(N/N
0)
un cycle 68% HR
deux cycles 68%HR
un cycle 43% HR
deux cycles 43%HR
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Influence de cycles de déshydratation et réhydratation sur la survie de L. monocytogenes
Plan
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Problématique Approche expérimentale Résultats et Discussion Optimisation de conditions de séchage pour la destruction de L. monocytogenes
1) Influence de l’humidité relative 2) Influence de la vitesse de déshydratation 3) Impact de cycles de déshydratation et réhydratation 4) Impact de la réhydratation après séchage 5) Rôle de la perméabilisation membranaire après déshydratation et réhydratation 6) Observation de la morphologie bactérienne après séchage par Microscopie à Force Atomique (AFM)
Conclusions et perspectives
defg
cdef
defg
efg
cdef efg
g
efg
a a
ab
abc
abcd
bcde
cde
efg
-5
-4,5
-4
-3,5
-3
-2,5
-2
-1,5
-1
-0,5
0
EGDe CCL500 CCL128 LO28
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té L
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0(N
/N0)
RL 68% HR
RR 68% HR
RL 43% HR
RR 43% HR
43% HR : réhydratation rapide plus délétère pour les cellules Survie cellulaire influencée par le mode de réhydratation 68% HR : réhydratation rapide ou lente pas de différence significative dans la survie cellulaire
RL = Réhydratation Lente RR = Réhydratation Rapide
Hypothèse : Rupture membranaire lors d’une réhydratation rapide ?
(Séchage de 180 min)
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Impact de la réhydratation sur la survie de L. monocytogenes
L R L L L L L L L R R R R R R R
Plan
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Problématique Approche expérimentale Résultats et Discussion Optimisation de conditions de séchage pour la destruction de L. monocytogenes
1) Influence de l’humidité relative 2) Influence de la vitesse de déshydratation 3) Impact de cycles de déshydratation et réhydratation 4) Impact de la réhydratation après séchage 5) Rôle de la perméabilisation membranaire après déshydratation et réhydratation 6) Observation de la morphologie bactérienne après séchage par Microscopie à Force Atomique (AFM)
Conclusions et perspectives
Analyse par cytométrie en flux
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Séchage des 4 souches de L. monocytogenes à 68%
HR et 43% HR pendant 180 min + réhydratation lente
ou rapide
+
Iodure de propidium Cytométrie en flux
Témoin négatif : cellules vivantes + IP
Témoin positif: cellules mortes
(90°C ,45 min) + IP
Cellules stressées
Rôle de la perméabilisation membranaire après déshydratation et réhydratation
a a a a
c c
c
b
a a a a
b b b
a
0
20
40
60
80
100
CCL500 EGDe CCL128 LO28
Ce
llule
s n
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s o
u p
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ilisé
es
(%)
68% HR Cellules noncultivables RL
CellulesperméabiliséesRLCellules noncultivables RR
CellulesperméabiliséesRR
b b
b b
c
c c
c
a a a a ab
b
ab ab
0
20
40
60
80
100
CCL500 EGDe CCL128 LO28
43% HR Mesure en cytométrie en flux du % de cellules incorporant l’IP/ mesure de la cultivabilité par UFC
43% HR : % cellules non cultivables et perméabilisées montrent une différence significative entre RR et RL 68% HR : % cellules non cultivables ne montrent pas de différence significative mais % de cellules perméabilisées montrent une différence significative entre RL et RR Différence significative entre cellules non cultivables et perméabilisées quelque soit le type de réhydratation Perméabilisation joue un rôle dans la mort cellulaire pendant la déshydratation-réhydratation mais d’autres phénomènes sont également mis en cause (agrégation protéique, oxydation...)
24
Rôle de la perméabilisation membranaire après déshydratation et réhydratation
RL = Réhydratation Lente RR = Réhydratation Rapide
Plan
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Problématique Approche expérimentale Résultats et Discussion Optimisation de conditions de séchage pour la destruction de L. monocytogenes
1) Influence de l’humidité relative 2) Influence de la vitesse de déshydratation 3) Impact de cycles de déshydratation et réhydratation 4) Impact de la réhydratation après séchage 5) Rôle de la perméabilisation membranaire après déshydratation et réhydratation 6) Observation de la morphologie bactérienne après séchage par Microscopie à Force Atomique (AFM)
Conclusions et perspectives
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Principe : Détection des forces atomiques s’exerçant entre la surface de l’échantillon et une pointe d’à peine quelques micromètres de hauteur. Permet de balayer la surface d’un échantillon et de visualiser la topographie de la surface de l’échantillon
Observation de la morphologie bactérienne après séchage par microscopie à force atomique (AFM)
Observation de la morphologie bactérienne après des séchages de 180 min à 68% et 43% et 11% HR sans réhydratation
EGDe 68% HR
0,5 µm
0,5 µm
0,5 µm
27 Enveloppe cellulaire pas bien définie. Rugosité cellulaire.
Observation de la morphologie bactérienne après séchage par microscopie à force atomique (AFM)
28 Cellules individualisées, pas de différence de taille entre les cellules séchées à 68% et 43% d’HR.
EGDe 43% HR
0,5 µm
Observation de la morphologie bactérienne après séchage par microscopie à force atomique (AFM)
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EGDe 11% HR
0,5 µm
Cellules individualisées, plus petites qu’à 68% et 43% HR. L’enveloppe cellulaire semble s’étaler sur la surface contrairement aux autres séchages testés.
Observation de la morphologie bactérienne après séchage par microscopie à force atomique (AFM)
Plan
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Problématique Approche expérimentale Résultats et Discussion Optimisation de conditions de séchage pour la destruction de L. monocytogenes
1) Influence de l’humidité relative 2) Influence de la vitesse de déshydratation 3) Impact de cycles de déshydratation et réhydratation 4) Impact de la réhydratation après séchage 5) Rôle de la perméabilisation membranaire après déshydratation et réhydratation 6) Observation de la morphologie bactérienne après séchage par Microscopie à Force Atomique (AFM)
Conclusions et perspectives
Le comportement de L. monocytogenes face au séchage et à la réhydratation est souche dépendant
La condition optimale de séchage pour la destruction de L. monocytogenes est une HR de 68% (mort en continue au cours du temps)
Cycle de séchage : intéressant du point de vue technologique car plus de mortalité cellulaire mais possibilité de sélectionner des cellules résistantes
Etape de réhydratation après séchage importante car responsable de la majorité de la perte cellulaire : mais à 68% HR, le mode de réhydratation n’influence pas la survie
La perméabilisation membranaire joue un rôle dans la déshydratation-réhydratation mais elle ne semble pas être le seul facteur causant la mort cellulaire
Différences de la morphologie bactérienne à différentes humidités relatives
31
Conclusions
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Perspectives
Etude de la modification cellulaire lors du séchage:
- Etude de l’oxydation cellulaire pendant le séchage en cytométrie en flux et en spectroscopie à fluorescence
- Analyse de la structure cellulaire après séchage par Spectroscopie à Transformée de Fourier (FTIR)
• UMR-PAM : Laurent Beney, Patrick Gervais, Cosette Grandvalet, Stéphane Guyot
• ANSES : Brigitte Carpentier, Olivier Firmesse, Danielle Chassaing, Laurent Guillier, Anaïs Overney
• INRA Theix : Michel Hébraud, Ingrid Chafsey, Christophe Chambon
• IRSTEA Antony : Onrawee Laguerre, Denis Flick, Evelyne Derens, Jérome Gahartian, Graciela Alvarez, Logan Lecoq
• MF Conseil : Jacques Guilpart
• DESSICA : Adam Tchaikowski
• Groupe Labeyrie : Yves Gasnier
Remerciements
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Merci de votre attention !
34
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