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BM Microbienne S4 2012

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Text of BM Microbienne S4 2012

Facult des Sciences Rabat

Laboratoire de Microbiologie et Biologie Molculaire -------------------------------------Universit Mohamed V - Agdal Facult des Sciences B.P. 1014 - Rabat - MAROC

Filire SVI S4 Module de Biochimie et Biologie Molculaire Elment 2: Biologie Molculaire

Biologie Molculaire des Procaryotes

Pr. B. BELKADIAnne universitaire 2011 - 2012

Biologie Molculaire?Etude des gnes portant linformation gntique, leurs transformations et leurs fonctions

Que faut il tudier? Les complexes macromolculaires de lADN, de lARN et des protines Transfert de linformation: Rplication, Transcription, Traduction

Ex. de dcouvertes ralises grce aux bactries:- Recombinaison intra-gnique; - Rplication de lADN; - Code gntique; - Rgulation (opron); - Enzymes de Biologie Molculaire : Enzymes de restriction, Ligases, Polymrases (ADN et ARN), Polymrases thermostables (PCR), etc..

Quelles sont les consquences du dveloppement de la biologie molculaire? des connaissances dans le domaine fondamental des applications pratiques: - production de protines dintrt mdical - vaccins - diagnostic en mdecine - plantes et animaux transgniques

PLAN

q Introduction q Transmission dinformation q Expression gntique et rgulation

I- IntroductionLes 3 domaines du vivant

Plantes

Fungi

Cyanobacteria Gram positif Proteobacteria

Animaux

Sulfolobus Mthanognes

Archaea

Halophiles

Les 3 domaines du vivant

Cellule vgtale

PROCARYOTE

Bactrie

Cellule animale

EUCARYOTE

Procaryotes ou BactriesDeux grands groupes, les eubactries et les archaebactries avec des fonctionnements diffrents au niveau molculaire mais une organisation similaire

Structure:v Petite taille gnralement (avec des exceptions) v Leur structure est trs simple, le plus souvent sans cytosquelette ni rseau de membrane interne v Prsence d'une paroi complexe v Dans le cytoplasme, il y a prsence des ribosomes et d'une masse "plus claire", le nuclode qui contient l'ADN sous forme dun ou quelques chromosomes ( svt circulaire)

Procaryotes ou BactriesDivision binaire: Par scissiparit (fission binaire): 1 cellule donne par division 2 cellules filles gntiquement identiques (notion de clone) Pas d'individualisation de chromosomes visibles en cytologie aucun moment de leur cycle de vie Multiplication exponentielle: Xn = 2n X0

X0 : nombre de cellules au dpart Xn: nombre de cellules obtenues un temps donn n: nombre de divisions ou de gnrations

Temps de Gnration : 20 min (E.coli) dans des

conditions optimales quelques heures Taux de croissance : 2 divisions / h ou moins Echange gntique se fait par transferts horizontaux (transformation, conjugaison, transduction)0 min cellule mre 18 heures de croissance

109 bactries/ ml 2 cellules filles identiques

20-30 min

Grande complexit de mtabolisme et de fonctionnement au niveau molculaireTrs diversifies et prsentes dans TOUS les milieux et Biotopes Adaptation rapide diverses conditions et divers environnements (mers froides, sources thermales) Des plus dangereuses (pathognes) au plus utiles et exploitables: Biotechnologies

Escherichia Coli Legionella spBactrie du desert

Clostridium botulinum

GFAJ-1 (arsenic) sdiments du lac Mono Lactococcus lactis en Californie

Deinococcus radiodurans

Les lments gntiques dans une cellule1- Le chromosome (unique et circulaire en gnrale) porte les gnes essentiels la croissance 2- Les lments gntiques non chromosomiques, principaux processus dvolution rapide des bactries - Les plasmides - Les transposons - Les virus - Le gnome des organelles

II Transmission de linformation gntique( Les plasmides, les transposons, les virus) Forme la plus connue de transfert : Recombinaison gntique: change physique de gnes entre les lments gntiques (chromosome, plasmide..)

Recombinaison homologue : change rciproque entre une paire de squence homologue dADN entre cellule donneuse et receveuse

Trois principaux mcanismes dchange gntique chez les bactriesBactrie rceptrice

1- Transformation Bactrie + ADN libre

2- Conjugaison Bactrie + bactrie 3- Transduction Bactrie + bactriophage

Transferts d'ADN par conjugaisonLe transfert entre les organismes donneur et accepteur de plasmide se fait en 4 grandes tapes: Conjugaison F+ X F- 2 F+

1- Reconnaissance entre donneur (F+) et accepteur (F-) grce la synthse du pili (tube creux) 2- Transfert d'un des deux brins du plasmide 3- Synthse du brin complmentaire chez l'accepteur 4- Re circulisation du plasmide chez l'accepteur

Objectifs du cours :- Dfinir un plasmide ? - Prciser les proprits biologiques codes par les plasmides ? - Les consquences mdicales de ce type de transfert ? - dfinir la transposition et le transposon ?

I- Introduction gnrale II- Transmission de linformation A- Les Plasmides I- Gnralits II- Mthodes dtude: extraction, purification et curage des plasmides (TD) III- Proprits des plasmides IV- Diffrents types de plasmides et rles biologiques V- Expression et rgulation VI- Utilisation des plasmides B- Les transposons

A- Les Plasmides

I- Gnralits

A- Les PlasmidesPlasmides Milliers pb

Chromosome bactrien circulaire 4millions pb

BactrieEn gnral circulaire, le nombre de copies par cellule peut varier de 1 quelques centaines. * Petit nombre de copies/ cellule (1 3) = Plasmide Stringent / Rplication stringente. * Grand nombre de copies / cellule (20 2000) = Plasmide relch / Rplication relche

1- Dfinition: Molcules dADN double brin libres le plus souvent circulaire, localisation extrachromosomique, capacit de rplication autonome et procure un avantage slectif.

2- Structure et organisation:Prsents chez la plupart des espces bactriennes: Tailles trs variables entre 1Kb 1 mgabase (gnralement infrieures 5% de celle du chromosome) ADN double brin Superhlicale avec 3 formes:

Confrent la bactrie-hte une grande souplesse gntique. Augmentent son patrimoine gntique.

Diffrentes formes des plasmidesForme I: CCC: Circular Covalently Closed (circulaire, covalemment ferm) Forme II: OC: Open Circular ( circulaire relch, un des 2 brins coup) Forme III: Linaire (2 brins coups)

3- Caractristiques gnrales: Ils sont porteurs de gnes non essentiels mais utiles et donc non indispensables au mtabolisme normal de la cellule hte. Leur transmission naturelle au cours des divisions cellulaires est stable et se fait habituellement par conjugaison. Ils possdent plusieurs proprits confrant aux bactries une meilleure adaptation lenvironnement.

II- Mthodes d'tudes des plasmides : TD

III- Proprits des plasmides:Les plasmides sont des associations modulaires de gnes regroups en units fonctionnelles. Ils comportent: Zone obligatoire de rplication: Origine de rplication Rgion de transfert (opron tra) chez les plasmides conjugatifs codant pour: pili et protines de conjugaison Des lments gntiques mobiles ou non (IS, Tn, Int) Gnes divers (rsistance aux antibiotiques, etc)

1: Gne codant la rsistance un antibiotique 2: Gnes de transfert (opron Tra) 3: Origine de rplication

IV- Type de plasmides et rles biologiques Plasmides cryptiques: aucun rle connu Les plasmides peuvent coder pour diverses fonctions Quelques plasmides clbres: u Facteur R: Plasmides de rsistance aux antibiotiques et aux mtaux lourds (conjugatifs le plus souvent) u Facteur F: (Rle de fertilit) gros plasmide conjugatif petit nombre de copies, confrant la capacit de synthse de Pili sexuels chez la bactrie dite F+ ou Hfr. u pBR322: Vecteur de clonage trs utilis aux premier temps du clonage et du gnie gntique

V- Expression gntique et rgulation: Gnes codant diffrentes fonctions1- Les gnes impliqus dans la rplication

2- Les gnes de transfert: Plasmides conjugatifs 3- Les gnes confrant des proprits supplmentaires la cellule hte

V 1- Les gnes impliqus dans la rplication :La fonction ori : cest lorigine de la rplication, elle est responsable de linitiation de la rplication et du contrle du nombre de copies d'un mme plasmide prsent dans une bactrie.

Ce systme de rgulation est lorigine du phnomne dincompatibilit Des plasmides incompatibles ne peuvent coexister dans la mme cellule, car leur rplication est soumise au mme systme de rgulation, >>> ils sont fortement apparents structuralement do prsence de fortes homologies ADN/ADN Ces plasmides sont ainsi classs en groupe dincompatibilit ou groupe Inc.

V 2- Les gnes de transfert, Plasmides conjugatifs: Un plasmide conjugatif est autotransfrable dune bactrie mle une autre femelle par conjugaison. Sa taille est suprieure 30 kb

Ex: chez Escherichia coli, 90 kb, dont 30 50 kb pour les gnes ncessaires au transfert conjugatif. Ces plasmides sont en faible nombre de copies de 1 3 par cellule.

Lensemble des gnes ncessaires la conjugaison est organis en un opron tra codant pour les pili sexuels et les protines de conjugaison. Principaux lments des plasmides conjugatifs

Le transfert se ralise de manire oriente et progressive.

Rle trs important dans la dissmination de linformation gntique et particulirement des gnes de rsistance aux antibiotiques.

Cas de Bactrie Hfr (Haute frquence de recombinaison) Grace la prsence des squences IS, le facteur F peut sintgrer dans le chromosome dune bactrie F+, appels pisomes.IS

Bactrie F+

Bactrie Hfr

>>> Les squences IS du plasmide F ont des squences homologues sur le chromosome. Linsertion se fait par recombinaison site spcifique. >>> La rplication est sous le contrle du chromosome.

Lors dune conjugaison entre bactrie Hfr et bactrie F-

Le plasmide peut mobi