PRATIKUM MIKROBIOLOGI UMUM TEKNIK ISOLASI DAN TRANSFER KULTUR

By kutankrobek

Isolasi bakteri merupakan suatu cara untuk memisahkan atau memindahkan mikroba tertentu dari lingkungannya sehingga diperoleh kultur murni atau biakan murni. Ada beberapa cara umum yang dapat dilakukan untuk mengisolasi mikroba antara lain, untuk mengisolasi bakteri dapat dilakukan dengan cara goresan (streak plate), cara taburan atau tuang (pour palte), cara sebar (spread plate), cara pengenceran (dilution method), serta mikromanipulator (the micromanipulator method) (Lim, 1990).Persyaratan utama bagi isolasi dan kultivasi fage adalah harus adanya kondisi optimum untuk pertumbuhan organisme inangnya. Sumber bakteriofage yang paling baik dan paling utama adalah habitat inang. Sebagai contoh fage koli yang di jumpai di dalam pencernaan dapat diisolasi dari limbah atau pupuk kandang. Hal ini dilakukan dengan sentifugasi atau filtrasi bahan sumbrnya dan penambahan kloroform untuk membunuh sel-sel bakterinya (Adams, 2000).Ada beberapa metode yang digunakan untuk mengisolasi bakteri, fungi, dan khamir dengan menggunakan metode gores, metode tuang, metode sebar, metode pengenceran serta micromanipulator. Dua diantaranya yang paling sering digunakan adalah tekhnik cawan tuang dan cawan gores. Kedua metode ini didasarkan pada prinsip yang sama yaitu mengencerkan organisme sedemikian rupa sehingga individu spesies individu spesies dapat dipisahkan dari lainnya.Mikroorganisme dibiakkan di laboratorium pada medium yang terdiri dari bahan nutrient. Biasanya pemilihan medium yang dipakai bergantung kepada banyak faktor seperti seperti apa jenis mikroorganisme yang akan ditumbuhkan (Pelezar, 1986).Perbenihan untuk pertumbuhan bakteri agar dapat tetap dipertahankan harus mengandung semua zat makanan yang diperlukan oleh organisme tersebut. Faktor lain seperti PH, suhu, dan pendinginan harus dikendalikan dengan baik (Buckle, 1987)

Selain untuk tujuan diatas medium juga memiliki fungsi lain, seperti tempat untuk mengisolasi, seleksi, evaluasi dan diferensiasi biakan yang didapatkan. Agar tiap-tiap medium memilki karakteristik yang sesuai dengan tujuan sehingga seringkali digunakan beberapa jenis zat tertentu yang mempunyai pengaruh terhadap pertumbuhan dan perkembangbiakan mikroba (Suriawiria, 2005).Beberapa indikasi pembiakan pada laboratorium mikrobiologi meliputi:

1. Pengasingan (isolasi) mikroba pada biakan bakteri2. Menunjukan sifat khas mikroba.3. Untuk menentukan jenis mikroba yang diisolasi dengan cara-cara tertentu.4. Untuk mendapatkan bahan biakan yang cukup untuk membuat antigen dan percobaan serologi lainnya.5. Menentukan kepekaan kuman terhadap antibiotik.6. Menghitung jumlah kuman7. Mempertahankan biakan mikroba.

Pengembangbiakan dalam cawan ini ada beberapa metode, yaitu :1.Metode cawan gores (streak plate)Prinsip metode ini, yaitu mendapatkan koloni yang benar-benar terpisah dari koloni yang lain, sehingga mempermudah proses isolasi.Cara ini dilakukan dengan membagi cawan petri menjadi 3-4 bagian. Ose steril yang telah disiapkan dilekatkan pada sumber isolat, kemudian menggoreskan ose tersebut pada cawan berisi media steril. Goresan dapat dilakukan 3-4 kali membentuk garis horisontal di satu sisi cawan. Ose disterilkan lagi dengan api bunsen, setelah kering ose tersebut digunakAn untuk menggores goresan sebelumnya pada sisi cawan kedua. Langkah ini dilanjutkan hingga keempat sisi cawan tergores.

2. Metode cawan sebar (spread plate)Teknik spread plate (lempeng sebar) adalah suatu teknik di dalam menumbuhkan mikroorganisme di dalam media agar dengan cara menuangkan stok kultur bakteri atau mengapuskannya di atas media agar yang telah memadat. Bedanya dengan pour plate adalah, pencampuran stok kultur bakteri dilakukan setelah media agar memadat sedangkan pour plate kultur dicampurkan ketika media masih cair (belum memadat). Kelebihan teknik ini adalah mikroorganisme yang tumbuh dapat tersebar merata pada bagian permukaan media agar.

3. TEKNIK DILUSI (PENGENCERAN)Tujuan dari teknik ini pada prinsipnya adalah melarutkan atau melepaskan mikroba dari substratnya ke dalam air sehingga lebih mudah penanganannya. Sampel yang telah diambil kemudian disuspensikan dalam akuades steril. Teknik dilusi sangat penting di dalam analisa mikrobiologi. Karena hampir semua metode perhitungan jumlah sel mikroba mempergunakan teknik ini, seperti TPC (Total Plate Count).Ada beberapa tahap yang harus dilakukan sebelum melakukan teknik penanaman bakteri (inokulasi) yaitu :1. Menyiapkan ruanganRuang tempat penanaman bakteri harus bersih dan keadannya harus steril agar tidak terjadi kesalahan dalam pengamatan atau percobaaan .dalam labotarium pembuataan serum vaksin dan sebagainya. Inokulasi dapat dilakukan dalam sebuah kotak kaca (encast) udara yang lewat dalam kotak tersebut dilewatkan saringan melalui suatu jalan agar tekena sinar ultraviolet (Pelezar, 1986).2. Pemindahan dengan dengan pipetCara ini dilakukan dalam penyelidikan air minum atau pada penyelidikan untuk diambil 1 ml contoh yang akan diencerkan oleh air sebanyak 99 ml murni (Pelezar, 1986).3. Pemindahan dengan kawat inokulasiUjung kawat inokulasi sebaliknya dari platina atau nikel .ujungnya boleh lurus juga boleh berupa kolongan yang diametrnya 1-3mm. Dalam melakukuan penanaman bakteri kawat ini terlebih dahulu dipijarkan sedangkan sisanya tungkai cukup dilewatkan nyala api saja setelah dingin kembali kawat itu disentuhkan lagi dalam nyala (Pelezar, 1986).Beberapa metode dalam teknik isolasi: Biakan agar cawanKultur mikroba dibiakan dengan cara menginokulasi pada agar cawan, dimana penyebaran kultur dilakukan dengan goresan di atas agar. Ada beberapa cara untuk

menggoreskan kultur pada agar cawan, yaitu:1. goresan langsung2. goresan kuadran3. goresan radian

Biakan agar tuangDigunakan untuk mengencerkan dan mengisolasi yang terdapat pada contoh. Setelah inkubasi pada suhu dan waktu tertentu, koloni akan tumbuh pada permukaan dan bagian bawah agar.

Biakan agar miring dan agar tegakDapat dilakukan dengan cara menggoreskan secara zig-zag pada permukaan agar miring menggunakan jarum ose yang bagian atasnya dilengkungkan. Selain itu dapat dilakukan dengan cara menusukkan loop pada bagian tengah tabung. Cara ini juga dilakukan pada agar tegak untuk meminimalisir pertumbuhan mikroba dalm keadaan kekurangan oksigen,

Usaha mencegah masuknya mikroorganisme yang tidak diinginkan dan untuk menanam suatu spesies terdapat beberapa cara yaitu:

• Penanaman dengan penggoresanCara ini untuk mengasingkan kuman agar didapatkan biakan murni.

• Penanaman lapangan

Berguna untuk penentuan jenis kuman dengan bakteriofage dan uji kepekaan terhadap antibiotik.

• Biakan agar tabung

Biasanya dipergunakan untuk menunjukan adanya pertumbuhan murni mikro untuk aglutinasi gelas alas.

Untuk mendapatkan biakan murni ada beberapa cara yang dapat dilakukan yaitu dengan Pengenceran, penuangan dan penggesekkan untuk menumbuhkan mikroba anaerob

http://kutankrobek.wordpress.com/2009/10/20/pratikum-mikrobiologi-umum-teknik-isolasi-dan-transfer-kultur/

a.1. Spread Plate (agar tabur ulas)

Spread plateadalah teknik menanam dengan menyebarkan suspensi bakteri di permukaanagar diperoleh kultur murni. Adapun prosedur kerja yang dapat dilakukanadalah sebagai berikut :

· Ambil suspensi cairan senamyak 0,1 ml dengan pipet ukur kemudian teteskan diatas permukaan agar yang telah memadat.

·Batang L atau batang drugal diambil kemudian disemprot alkohol dandibakar diatas bunsen beberapa saat, kemudian didinginkan dan ditunggubeberapa detik.

· Kemudian disebarkan denganmenggosokannya pada permukaan agar supaya tetesan suspensi merata,penyebaran akan lebih efektif bila cawan ikut diputar.

· Hal yang perlu diingat bahwa batang L yang terlalu panas dapat menyebabkan sel-sel mikroorganisme dapat mati karena panas.

a.2. Pour Plate (agar tuang)

Teknik ini memerlukan agar yang belum padat (>45oC)untuk dituang bersama suspensi bakteri ke dalam cawan petri lalukemudian dihomogenkan dan dibiarkan memadat. Hal ini akan menyebarkansel-sel bakteri tidak hanya pada permukaan agar saja melainkan selterendam agar (di dalam agar) sehingga terdapat sel yang tumbuhdipermukaan agar yang kaya O2 dan ada yang tumbuh di dalamagar yang tidak banyak begitu banyak mengandung oksigen. Adapunprosedur kerja yang dilakukan adalah sebagai berikut :

· Siapkan cawan steril, tabung pengenceran yang akan ditanam dan media padat yang masih cair (>45oC)

· Teteskan 1 ml secara aseptis.suspensi sel kedalam cawan kosong

· Tuangkanmedia yang masih cair ke cawan kemudian putar cawan untukmenghomogenkan suspensi bakteri dan media, kemudian diinkubasi.

Alasanditeteskannya bakteri sebanyak 0,1 ml untuk spread plate dan 1 ml untukpour plate karena spread plate ditujukan untuk menumbuhkandipermukaanya saja, sedangkan pour plate membutuhkan ruang yang lebih luas untuk penyebarannya sehingga diberikan lebih banyak dari pada spread plate.

b. Teknik Penanaman dengan Goresan (Streak)

Bertujuan untuk mengisolasi mikroorganisme dari campurannya atau meremajakan kultur ke dalam medium baru.

b.1 Goresan Sinambung

Cara kerja :

· Sentuhkan inokulum loop pada koloni dan gores secara kontinyu sampai setengah permukaan agar.

· Jangan pijarkan loop, lalu putar cawan 180oC lanjutkan goresan sampai habis.

Goresansinambung umumnya digunakan bukan untuk mendapatkan koloni tunggal,melainkan untuk peremajaan ke cawan atau medium baru.

b.2 Goresan T

Cara kerja :

· Bagi cawan menjadi 3 bagian menggunakan spidol marker

· Inokulasi daerah 1 dengan streak zig-zag

· Panaskan jarum inokulan dan tunggu dingin, kemudian lanjutkan streak zig-zag pada daerah 2 (streak pada gambar). Cawan diputar untuk memperoleh goresan yang sempurna

· Lakukan hal yang sama pada daerah 3

B.3 Goresan Kuadran (Streak quadrant)

Cara kerja :

Hampirsama dengan goresan T, namun berpola goresan yang berbeda yaitu dibagiempat. Daerah 1 merupakan goresan awal sehingga masih mengandung banyaksel mikroorganisma.Goresan selanjutnya dipotongkan atau disilangkandari goresan pertama sehingga jumlah semakin sedikit dan akhirnyaterpisah-pisah menjadi koloni tunggal.

http://www.try4 know.co.cc/2009/10/tekhnik-isolasi-mikroba-dan-bakteri.html

Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak digunakan. Disebut sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat warna untuk mewarnai organisme tersebut. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarnaan-pewarnaan

sederhana karena sitoplasamanya bersifat basofilik (suka dan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkolin. Dengan pewarnaan sederhana dapat mengetahui bentuk dan rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna basa yang biasa digunakan untuk pewarnaan sederhana ialah memilen biru, krisdal violet dan karbol fuehsin.http://makalahdanskripsi.blogspot.com/2008/08/pewarnaan.htmlpewarna sederhana” dapat diartikan dalam mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja (Gupte, 1990). Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif). Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna , substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup.http://firebiology07.wordpress.com/2009/04/19/teknik-pewarnaan-mikroorganisme/