CáncerCáncer

Importancia: Una de las principales causas de muerte en el mundo (13% del total de defunciones a nivel mundial en 2008).

Factores de riesgo: - Edad

- Factores de riesgo conductuales y dietéticos:

· Índice de masa corporal elevado · Ingesta reducida de frutas y verduras · Falta de actividad física · Consumo de tabaco · Consumo de alcohol

- Predisposición genética

- Enfermedades (obesidad, virus, etc.)

Causa: Acumulación progresiva de alteraciones genéticas que confieren a las células ventajas proliferativas.

(GLOBOCAN 2008)

Hay genes cuyas mutaciones son más susceptibles de dar lugar a cáncer debido a que regulan procesos esenciales como la estabilidad cromosómica y reparación del DNA, la señalización

celular, o el crecimiento y diferenciación celular.

Protooncogenes Supresores tumorales

Activados en cáncer (Oncogenes)

Inactivados en cáncer

- Ras- Ciclinas- RARα- c-Myc

- APC- PTEN- BRCA1- BRCA2

Alteraciones fisiológicasCáncer

Alteraciones fisiológicasCáncer

PROLIFERACIÓN

CRECIMIENTO

PROLIFERACIÓN

CRECIMIENTO

Alteraciones fisiológicas conferidas a las células cancerosas

Autosuficiencia en señales de proliferación

Insensibilidad a señales inhibitorias de la proliferación

Evasión de la apoptosis

Capacidad replicativa ilimitada

Capacidad de inducir angiogénesis

Capacidad de invadir tejidos

(Hanahan & Weinberg; Cell 2011)

DRO1DRO1

Secuencia y estructura de DRO1

SRPX

DRO1211 141 281 347 404 487 588 615 760 771 913 950aa

N-terminal C-terminal

Cys Cys Cys Cys Cys Cys

Cys Cys

Muy conservada en las diferentes especies de vertebrados (homología ~ 90%)

DRO1 contiene tres dominios con una similitud del 30% con el quinto dominio de la proteína SRPX, los cuales son dominios tipo Sushi con dos residuos de cisteína capaces de formar puentes disulfuro

entre ellos

Dominio muy conservado tanto en los diferentes ortólogos de DRO1 como en la proteína SRPX e incluso en proteínas procariotas, por lo que se ha propuesto la existencia de una nueva família de

proteínas con el dominio P-DUDES (Procariotas-DRO1-URB-DRS-Equarina-SRPUL).

(Aoki et al., BBRC 2002)

(Aoki et al., BBRC 2002.; Ichinose et al. , JBC 1990)

(Pawlowski et al., BMC Gen. 2010)

Secuencia y estructura de DRO1Secuencia y estructura de DRO1

DRO1211 141 281 347 404 487 588 615 760 771 913 950aa

N-terminal C-terminal

Cys Cys Cys Cys Cys Cys

Región rica en lisinasAugura a la proteína una localización nuclear.Estructura coiled-coil (hélice superenrrollada), presente en factores de transcripción e involucrada en la regulación de expresión de genes.

Región rica en treoninasGran similitud a ApoER2, lo que sugiere que podría estar involucrado en el acoplamiento con la matriz extracelular.

Esta región entre los dominios 1 y 2 es larga, flexible y desordenada, pudiendo permitir muchas interacciones entre los dominios P-DUDES covalentemente unidos unos con otros por puentes disulfuro.

(Liu et al., BBRC 2004; Lupas et al., Science 1991)

(Liu et al., BBRC 2004)

(Pawlowski et al., BMC Gen. 2010)

Secuencia y estructura de DRO1Secuencia y estructura de DRO1

DRO1211 141 281 347 404 487 588 615 760 771 913 950aa

N-terminal C-terminal

Cys Cys Cys Cys Cys Cys

N-Glic

.

N-Glic

.

N-Glic

.

Posee tres sitios de glicosilación

Péptido señal de reconocimiento por enzimas proteolíticas

Región N-terminal hidrofóbica característica de las proteínas de secreción

(Aoki et al., BBRC 2002)

(Liu et al., BBRC 2004)

(Aoki et al., BBRC 2002)

Expresión de DRO1

Tejidos Especie Referencia

(+) útero, hígado, pulmón, bazo, riñón, vesícula biliar, músculo esquelético y cerebro

(–) glándula mamaria e intestino

Rata Marcantonio et al. 2001a

(+) próstata Rata Marcantonio et al. 2001b

(+) tejido adiposo, cerebro, estómago, colon, recto, hígado, pulmón, riñón y testículos Ratón Aoki et al. 2002

(+) corazón, cerebro, hígado, médula espinal y nódulos linfáticos

(–) médula ósea

Humano Visconti et al. 2003

(+) células del estroma de médula ósea Ratón Liu et al. 2004

(+) corazón, timo, placenta, páncreas y bazo

(–) cerebro, músculo esquelético, riñón, hígado y pulmón.

Humano Liu et al. 2004

(+) células de la papila dérmica Humano Cha et al. 2005

(+) tejido adiposo Humano y ratón Okada et al. 2008

(+) cartílago Ratón Manabe et al. 2008

Regulación de la expresión de DRO1

(Marcantonio et al., JME 2001)

(Marcantonio et al., Endrocrinology 2001)

(Bommer et al., JBC 2005)

DRO1

Hormonas

Estrógenos

Andrógenos

Oncogenes

β- y γ-cateninaK-RasC-Mic

Gli

-DRO1 se encuentra reprimido en varios tipos de cáncer.-Importante conocer los mecanismos que regulan la expresión de DRO1 para poder establecer la relevancia de DRO1 en cáncer y la posibilidad de ser considerado como un marcador tumoral e incluso como una potencial diana terapéutica.

Funciones biológicas de DRO1

(Viscontti et al., Oncogene 2003)

(Bommer et al., JBC 2005)

Supresor tumoral

Reprimido en cáncer

Disminuye proliferación

Induce apoptosis

Diferenciación celular

Adipogénesis

Embriogénesis

Osteogénesis

Metabolismo

Expresión en tejido adiposo

Proteína de secreción

relacionada con adiponectina

(Liu et al., BBRC 2004)

(Tremblay et al., JBC 2009)

(Aoki et al., BBRC 2002)(Okada et al., BBRC 2008)

AIB1AIB1

Familia SRC (Coactivadores del Receptor de Estrógenos)

SRC1

SRC2 (GRIP-1, TIF2, NCoA2)

SRC3 (pCIP, RAC3, AIB1)

Función: Formar complejos coactivadores que se unen al receptor de estrógenos permitiendo la transcripción de sus genes diana

Mecanismo molecular de la activación transcripcional por SRC

ER ER

E E

SRC

CBP/p300

CARM/PRMT1

ERE

Me Me

MeMe

MeAc

AcAc Ac

Ac

RNA pol. IITBP

TAF II

mRNA

Región S/T

- Secuencia rica en serinas y treoninas.- Zona susceptible de sufrir fosforilaciones.- Papel importante en la regulación y en la actividad de AIB1.

Motivos LXXLL o LLXXL (L = Leucina; X = cualquier aminiácido)

- Motivos conservados a lo largo de toda la secuencia.- RID (Dominios de Interacción con Receptores): Responsables de la interacción con los

receptores nucleares

Dominio de activación 2 (AD2)

- Responsable de la interacción con metiltransferasas como CARM-1 y PRMT-1

Dominio de activación 1 (AD1)

- Responsable de la interacción con las histona-acetiltransferasas CBP y p300 a través de sus motivos LXXLL

Dominio histona-acetiltransferasa (HAT)

- Posee actividad HAT intríseca, por lo que podría participar en la remodelación de la cromatina

Región rica en glutaminas

- Q: gran porcentaje de glutaminas- Poli-Q: cadena de glutaminas cuya longitud (26-32 glutaminas) es un polimorfismo en

humanos que ha sido relacionado con susceptibilidad a cáncer (más agresivo cuanto más corta).

Estructura y dominios de las proteínas SRC

14241

bHLH/PAS AD-1 AD-2RID

AIB1

14411

SRC1

14641

SRC2

Q

Q

N-term. C-term.

HAT

HAT

S/T

S/T

S/T

Poli-Q

~ 160 KDa

~ 1400 aa

50-55% similitud

43-48% identidad

Dominio bHLH/PAS

- bHLH (Hélice-Lazo-Hélice básico): presente en muchos reguladores transcripcionales.- PAS: Característico de muchas proteínas nucleares como Per, AhR y Sim.- Involucrado en la dimerización de proteínas que contienen este motivo.- Interacción con factores miogénicos como miogenina y MEF-2C.

Modificaciones postraduccionales de AIB1

Fosforilación

- 11 residuos: T24, S101, S102, S505, S509, S543, S601, S857, S860, S867 e Y1357- MAPK múltiples sitios del AD1 reclutamiento de p300 T24, S857 y S860 translocación al núcleo y coactivación de ER-IKK S857 translocación al núcleo y coactivación de NFκB

(Font de Mora & Brown, MCB 200)

(Amazit et al., MCB 2007)

(Wu et al. MCB 2002)

Ubicuitilación

-3 residuos: K723, K786 y K1194-Monoubicuitilación en K723 o K786: aumento la capacidad coactivadora del ER.-Poliubicuitilación: degradación por el proteasoma. (Wu et al. Cell 2007)

Sumoilación

-3 residuos: K723, K786 y K1194-Ocurre en el núcleo y da lugar a la disminución de su actividad transcripcional.-La sumoilación de AIB1 impide la fosforilación y viceversa. (Wu et al. JBC 2006)

Acetilación

-CBP/p300 K629 y K630 disociación del complejo coactivador tras el inicio de la transcripción.(Chen et al. Science 1999)

Metilación

-Entre las argininas 1163-1195 y 839-961: restricción de la actividad transcripcional.(Naeem et al. MCB 2006)

(Xu et al., PNAS USA 2000)(Xu et al., PNAS USA 2000)

Funciones fisiológicas de AIB1

Desarrollo y reproducción

IGF-1

Estrógenos

Metabolismo

Metabolismo mitocondrial

Peso corporal y del

tejido adiposo

Otras

Inflamación

Vasoprotector

(Coste et al., PNAS USA 2008)(Louet et al., PNAS 2006) (Yuan et al, Circulation 2002)

(Wu et al., MCB 2002)

AIB1 y cáncer

Relacionado con un fenotipo agresivo y de mal pronóstico de la enfermedad

Amplificado en 20q12 en un 5% de los cánceres de mama y ovario

Sobreexpresado en el 60% de los distintos tipos de cáncer

Mecanismos moleculares de la oncogénesis mediada por AIB1

ERER

AIB1P

AIB1P

AIB1

Ciclina D1c-Myc

P

RTK RTK

EGF

MN

AIB1P

Ciclina ACiclina ECdk2E2F1AIB1

E2F1AIB1

P

IGF1IRS2

PI3K AKT

AKTP

GSK3BAD

NFκBMDM-2mTOR

AP-1

IGFI

RASRAF

MEK

MAPK

IRS1,2

AKT

E2E2

AIB1P

AIB1P

AIB1

IL-6Casp. proinfl.

IL1 TNFα

IKK

p50 p65

IKB

IKBP

p50 p65

p50 p65

NFκB

NFκB

EGFREGFR

EGF EGF

PAK1

SRC3Δ4

SRC3Δ4P P

P P

FAKP

C-Src

Migracióncelular

MEC

ER ER

PE2E2

E2E2

Proliferación celular Crecimiento celularDiferenciaciónSupervivencia

Metástasis

Proliferación celular Crecimiento celularDiferenciaciónSupervivencia

Papel de AIB1 en proliferación celular y apoptosis y su implicación en cáncer

Proliferación celular

Apoptosis

Crecimiento descontroladoCáncer

HipótesisHipótesis

Hipótesis

La expresión de DRO1 puede estar regulada por AIB1 y otros oncogenes.

DRO1 puede tener un papel importante en apoptosis y proliferación celular, el cual puede estar limitado por la sobrexpresión de AIB1.

Es posible que DRO1 intervenga en diferentes funciones metabólicas.

La fosforilación de AIB1 en S728 podría afectar a su función coactivadora de la transcripción.

ObjetivosObjetivos

Objetivos

Determinar el mecanismo por el que la expresión de DRO1 se encuentra reprimida por AIB1 y otros oncogenes.

Estudiar el efecto de DRO1 en apoptosis y proliferación y establecer la implicación de AIB1 sobre dicha actividad.

Elucidar el papel de DRO1 en diferentes funciones metabólicas.

Comprobar las consecuencias de la fosforilación de AIB1 en S728 sobre su función coactivadora de la transcripción.

Resultadosy

discusión

Resultadosy

discusión

Discusión

DRO1 está reprimido por AIB1

DRO1 (Ccdc80)

Val

ores

d(i

) ob

serv

ados

Valores d(i) esperados

nº Sonda delta P R Gen

Silvestres

AIB1-tg

Cultivos primarios de epitelio de mama

MicroarraysAffymetrix

Expresióndiferencial

Discusión

DRO1 está reprimido por AIB1

0

2

4

6

8

10

Control siRNA siAIB1

*

0

0.5

1

1.5

Ad-GFP Ad-AIB1

*

0

0.4

0.8

1.2

MCF-7 BT-474 ZR-75 HeLa A-549 U2OS HMEC MDA-MB-321

MDA-MB-468

H1299

Niv

eles

rel

ativ

os d

e m

RN

AA

IB1

y D

RO

1-tubulina

AIB1

-tubulina

AIB1

AIB1 DRO1

Niv

eles

rel

ativ

os d

e m

RN

A D

RO

1

Niv

eles

rel

ativ

os d

e m

RN

A D

RO

1HMEC MCF-7

Discusión

Nuevo mecanismo para explicar el potencial oncogénico de AIB1: La represión de supresores tumorales.

DRO1 está reprimido por otros oncogenes y por estrógenos

+E2 -E2

DRO1

-actina

*

Niv

eles

rel

ativ

os d

e m

RN

A D

RO

1

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

Control v-H-ras v-Src HER2

U2OS

0 8 24

0

2

4

6

8

Estradiol

Tamoxifeno

ICI182780

tiempo (horas)N

ivel

es r

elat

ivos

de

mR

NA

DR

O1

MCF-7

Discusión

DRO1 está reprimido por otros oncogenes y por estrógenos

-5959 ATCAACATTTACTCCCTCCCTTTAAAAAACAAAAAACAAAAAAACAACAAAAAAAACTCTTTCAAGTACGTATGTAGGCTTAGGTATTTTGTTTTTATTTTTATTGTCTGTTTCCCACCGTTGTAATGTAAGCTCCCGGGAGTCAGGGAATGTTCATTTATGTATCCCTAGTGAGTAGAATAGTGCCTTGCATTGAGTAAATATTTGTCGAATGAATGAGCTGCCATCCTGTTGGTTCACACTTTCTGATGTAAGGTGATATTCTGAGTGATGTGGTCAAGACCTGCCATGCAAGGTCAGTACAGTGAACCGACCACTAAAGGATAGGGCAATCCTAGCAGGACAGGTGCCGGGCCGAAATTGGGACTGGGAAAATGAGATACAACACTTGTCTGCCAGACAAGAGTATCTGGGACTCTAGGGGACTCCACAGCCAAAAGGACATACCAAGCAAGATCTTATAGGTGACACACAGTTGCTGCCATGGCAAGCCTCCTTCTGTGGAAAGCCTGCTCAAGGAATTGAAGAGGCAAATTCTCCAACAGAAATGAACTCTGTGCATACTGGCTGCAGCCATAGTCAGCACTGAACTTTTACATGCAGAGAAAGTTGGCAGCACTGCTGTGGAGAGTATAATATTTATCTTCTCCAATGGGCTGTGAACTTCTAGAGGGGAGAGTCTGCTTGGTTCTGTGTCATTCCCGGTGCTCAGTCTGCATTTTTGCCAAACATTTGAGAGAAGGATTGAAAAAAAGGAGAAAAAAATTATATCATCTTTATCTTCTTGGCCATACCTAAGGGCACGGAGAAAGGTACAATTGGAATGTTCTCCTTCAGATCCAATCGATGTAAATCTTTTGTATGCATTAAATAACCAATGATAAAGACTTTAAATCCACCCCTTCCAGACCCAAGCACTAGTCCCCCAAGCAGCAAATTCATATGCCCACAAGTTCACATCTTTTACATAAAATAACAACCAATAAATAATTGAACTTTAAATCATTCACTCTGGAGATTTAAAATGAATCTTTGGGCCATTCACACAGCTCCTTAATTTCTGCTAGGGCAAGATCTTTAATTTGTACTAGCTAGGAGATGGACATTTTCTTAATTAAGCAACCTGCTACAGGGACAAAAAGGTGCCTACAAGGTTTCCCCAGCAAACTCTAAGTAATTAAAAATAAATGCATAAAGAAAGAATATTAACAACTGTTCTCAAGAGCTTTGACCATTATCCCATTAGGTAACTTTTATTTTTAAAGTACACAGTTTCCTTCAATTTTGGATTAAACATGTGACTTTGTTGACATTTCATGGACAATACTAAGTGTTTCTTTTGGGGGTTACGCTTTCTCAGAACATCCCTGTGAGAAAGGAATAATACAGGGTGGTTGGAGGAGATTAGAAAATTCCAAGCAGCAGTTTCACATGACTAGCAAAATGAAGCTTGAAATAGCTTCGGAAGCTATGGCCTAATAAGATCCTGAAAAAACAGGGATCAAGAGGGCCAGGCGTGGTGGCTCATGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGTGGAGGTGGGCAGATCACGAGGTCAGTAGATCGAGACCATCCTGGCTAACATGGTGAAACCCCGTCTCTACTAAAAATACAAAAAAAAATTAGCTGGGTGTGGTGGCGGGCGCCTGTAGTCCCAGCTACTCGGGAGGCTGAGGCAGGAGAATGGTGTGAACCCGGGAGCAGAGGTTGCAGTGAGCCGAGATCATACCACTGCACTCCAGCCTGGGGGACAGAGCGAGGCTCTGTCTCAAAAAAAAAGAGTAAAGAAAAAGCACCCAGGCTTATGCTTACAGCTTGTCTGCTGGGGATCCTGAACGATACACTGTGGGGGCCACATCCGTGACTAGCAATGACCCTTACTGGAACTATCAACAGGACCAGGTTGATCTAAGAAAAATCATATGGTGACTTGTTTGGTGGAGGGAATGAAACAATATACCACTAAGCCCGCGAACTGTAATAAAATAAGATAAATAAGAAAAGGATGAAAACTCAGCTTTGTTTCAGGGGCACCTTTGTGGAGGACCTAAGAACATATACTAACATTGATCTCAGTACTGACGCTGGCCAAATTTTTCTACAGACACACTTTATTAGCCAGTCAGCACCTGACATAAGAAGAACATTACAGAAATTGGCTTTGGAACTCTACACACCTATTAATGAAATGTTTGGTGTGGCTTTTGGGGTATTCAATAATAGGGACAGAGCTAAAATGGCTGAAATGACCCAGAATGGCAAAAAATGGGATAGACAGCCAGCCCAAATGATTAGCAGTCACTGTAAACAGTGCCCTGCAACCTCAGGGTCACCCAGGAAGACGCTTCACCGCAGACCAAACAGGCTCAACAGCAAACCTGCAGGCAACGGTTGCTGCTCCAAGTGTGAGAAGTCAGGACACTGGAGAAAGGACTGTCCCAGCCAAGGGAGCCCACCCAGACCCTGTCCTCACTGCAAGCAGGAGGGCCATTGGAAAAGGAATTGCTCTCAGCTCTGAAGGGAGAGGAGGCCACCCAGTGCCGTAATGGCCATAACTGAGACTGAAGGGGCTTGAGGTCCCTGGCAGCTCCCATAAAAGGCATGGTCAACACAATTGAGGAGACTCTTGACGTGGCAGATTAGAATATCCTTGAATTCATTCTTTTGACAGTGTCAAGAGCCTGGACACTGGCTGGGGTCAAGGTCCCACTGGCACCTGGGAAACCCCCAGCTCACTGGTATCACCTGGGCTGCAGCAGCACCCTGCATTAATAGTCATCTTTGGCTTTCTCTCTGACCTGGCAACTTATTTATTTAGTCTGTCCTACACTGAAAATACTGAGAAAGAGAAGAATTCTTTTTTCATTCTGAAGGACACAAATGCAGCCTAAGACTGAACATTTGATTGAGTTCTGCAAATGGGAAGGAAAAACACATAGCCTCCTCAGTGTGAGTATTGTCTGTGCTTCTGCCACAAAGGTGTGATAAAATGGCTCAGCTAATTTTCTTGCTGGGGATACTGATGATCACAGAGCAGGAGAGGTGGTTTCCCTCCAAAACCACACTGAACAGCATGCTGTTATCCCCTCCTTTTCTTTTTATTCTTGTTTCTTCTTAAGCAAATGCTTTTTTATTTTAGCAATAGAATTCAGTTCAGTAACATCTCTGAGTGTTACTTTGTGCAAGAGAACCAACGGCATGTGACAGAAACCCTGGTTTCTCTAGCGTGCCTGTCACAGCGTGTTACCCTGAGCCTTGGTCCCAGGTTGCTGAAGTCTTGGATTAGTGTGGGTCTGACCAGTTAGCACACTCCTTTTTGGATGCCTTCTTACATTCACTCCAGCTTTCATCAAATAACTATCCCCACCCTAGTTTCTCTAAAGCAGTTCTAGTTTGTACATTCTTTCCTTTCCTCCCCACAAATTACTACAAAACAAATGTCAGGTAGTTTCCTATCAATTAATTCCCAAATTAGCATTTCTAAAGTCTACTTTAACATTTTCTTCCTTTCACCTTTTTCTGACTCAACATCAATGTCTTCCTTTCAGATATCACCAACCCCCACCACCCTCCCCCAACCCCTAGCACTAATTGGTTAATTGTTTCTTCAGTTGCAGAAAAATAGAAAGATCTAAATGGAGGACTTACAAAATATGGAGCTCTTAAATAACGGACTTGAAATTGAGAATTATTACAAGCCATTAATCATTATAGATCTCCCCGGAAATGAATGAATGAGAATTTATCATTGCTCTTATTAGGTACGTGCCTCCAATACTTCTTCAGGAGGATTTTCTGAAGCCCCAGGTAAGCGTTTAGGCATTGAGATGAAAACAAGCATGAGAAGCCCCACTTTGCCAGTGTGTGTGTATGTATCTGTGTGTGAGAAGAGACTGGGGGAAGGAGTTGGGTGTGGGGTGGGGACTAACGGCGGCGGTGGAGTGTTAGGTCCTCTCTGGTGTGTGTGTTTAGTGCGCCATCTGGTGACTGAAGCTCACAGAGGGAAGAAAGCCTGAGGTCCTAGGAAGACAGGCACAACCCAGGGTTGGGGTGGCTCCTCATGGTCAATTCGGGGTTGCTAAAGTGGCTGTATTTCAGCTTTACCAGCGCACAGGTGACAAATGTTGTGCACATCATGGAGAGGTTTGTGTAAGTCATGACTTATTCAAGAAAAATAATAAAGGGCTTTAAGGACCTATTGAGAAAAGCAAAAAGTACAGTTACACAATTATCCCAGACAGTAGGACTCTAAAAGTGTAAGTACTCTGGTTGAACAAATAAATGAAACTCTTCTACGAATGTGGGAAATGCAAAAAGGAATTGAAGGAAGGGAAAAAACTGAAGGTATGAGTAGAAAATTAAAGAGAGAGGCAGGATAGCATCACGCTTTGTAGGCTGTTCTAAACCTGGGTTCAAATTTCAGAGCTACTGCTTACCTTTTGTGGGACAATAGGCAATTTATTTAAACTCACCAAGCCTCAGTTTGCTCATCTATAAAATGAGGATCATTCTGTTTACTTTCTAAGGATACTGTGAGGGTTAAATAAAAGAATTCACAAAAATACTAAGCCCAAAGCTTCACATGTAAATGCTCAATAAATGGTAGTTGTTATAAGCAGAGAGAAGAGAAGAGGAAATGAAAAGCCAGAAGGGAGAAAGCTCAGTAAGGATAGTGTAGGACGCCTTAGAAAATTATGAGAAAGGAAGTAACATCTAGGACCCTCCAACTTAGCACAAGGCTAGGTTGATCAACCCAACAGGTGAATACCACGAAGGCTGCAATCTATGACTCCAGTGGACAGAGGGTCTCTGCCTGAAGCCCACTTTTGTTATTATCCTTACAAGTGTCTGAGAGAATGCCACAGCAGGGCTGGCCATCCTTCTTGGTACCCCTGGGACTTCAAGGTGTGGCCGGGCAACTCTATAGTTAACCTCTATACAGGACTTTCTCAGTTCCATGCTCGTAGCTTATGTGAAAAAAGTCAAATGTGACCAGGGCAAGATGGGGCTGATCAAGGCATAACAACTAGGGATGAAGTTTGATCCAGTGAGGGACGCTATTAGCATGACTGAGCTGGCAAGGAGGTTTCTGAGAACCCTGGCTTGTCACTGTTGGTGGCAGTTAATAGTGACATGGAGAGTCAGCTCGCCCAGCATGGCCGGAAGAAATATCCACGTAACCTGAGACCCCTTCCTTCTCCATTGAATCCTTATGGCAGACTCAGGAGGTGGAATCCCAAAGCTGCCTCACTCTCTCTTTCAGAACCTGATAAGTCTACTTCTATGGATTGCCTAAAGCCCTTCAGACATCTAAAGTCTCTGCAGAGGAAAATATTGCACTACACACACACACACAAACACACACACTCGGGACCTCCAAGGGAGCCCTTAGTCTACCATCTGCAGCCAGAGCTTTGAAGCTAGAGATCATAATGCCTGTTCCCTGATGTAACAGTCAACTGCAATCTCGACTTGCAGCCATTGCCTGCATTTCTAACCTTTTACCAGCTTCCTTCCATGCCGAGGAGAAACTAGGACCAAGAACACAGTAATATGATCCCCAATTAGCATAAAATAAAAACAACCTAGTCATGTTTTCCATGGGCTTTTCCAACCTCAAACTAAAAGCACAAAGCAGGGAGAAAGATATAAGAATATACACATGGGACTATAAATACATATATACTGTCTGTGTCAGCACAGCCAAGCACCCTGACCCAAATGAGTATCTGTCTCTAAGAAAAGAATGTAGCCTGATGCAGAAATCTGAGAATTTTCTCCTTCCAAAGTACAGTGTAAGAACAGACTGGAAGAGAAGTTACCCCGATGACTTGGTTTGGAAGGGGTTAAGGCACCAGTCATCCTCTTCTAAAGTGATTTATGATGATGTGTGGAGTTTAAAAACTTTACCCCACCCCAAAGAACAGCCTTCTCACTC -1

Discusión

La represión de DRO1 mediada por estrógenos podría ser debida a una regulación en cis por el receptor de estrógenos y AIB1 podría estar actuando como correpresor en dicha regulación.

AIB1 reprime a DRO1 a nivel de promotor

Promotor DRO1 DRO1

(-4813/+1829)

Luciferasa

Luciferasa

Luciferasa

-4813/-2134

-2094/-1

+5/+1829Luciferasa

-4813/-3795 Luciferasa

-3794/-2745Luciferasa

-2744/-2134

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

AIB1

*

(-4813/-3795) (-3794/-2745) (-2744/-2134)

- + - + - +

pGL3

Uni

dade

s re

lati

vas

de lu

cife

rasa

(-4813/-2134) (-2094/-1) (+5/+1829)

AIB1 - + - + - +

pGL3

*

Uni

dade

s re

lati

vas

de lu

cife

rasa

COS1

COS1

0

1

2

3

4

5

6

7

(-4813/-3795) (-3794/-2745) (-2744/-2134)

siAIB1 - + - + - +

pGL3

Uni

dade

s re

lati

vas

de lu

cife

rasa

* MCF-7

Discusión

DRO1 es reprimido por AIB1 a través de la secuencia de -4813/-3795 del promotor de DRO1.

Obtención de un sistema biológico para el estudio de DRO1

MCF7

pTetOn

Selección G418

pTRE2hyg DRO1-Flag

Selección higromicina y G418

MCF7TetOn MCF7-TetOn-DRO1-Flag

Dox+

Dox-

Clon

Flag

β -actina

Flag

β -actina

0

1

2

3

4

5

6

7

Dox- Dox+

Niv

eles

de

mR

NA

DR

O1

1 2 4 5 6 7 8 9 10 11

*I I

Discusión

Efecto de la expresión de DRO1 en cultivos celulares

Día 11

Día 8

Día 4

MCF7-TetOn-DRO1flag dox- MCF7-TetOn-DRO1flag dox+

Día 3

Discusión

Efecto de DRO1 en la expresión de genes implicados en diferentes procesos celulares

ApoptosisCiclo celular Metabolismo y DiabetesECM y moléculas de adhesión

Discusión

DRO1 está localizado en el aparato de Golgi y en la membrana citoplasmática

EndosomasDRO1-Flag

PeroxisomasDRO1-Flag

R. E.DRO1-FlagMitocondria

DRO1-Flag

GolgiDRO1-Flag

Discusión

La localización de DRO1 en el aparato de Golgi y en la membrana citoplasmática sugiere que podría tratarse de una proteína de secreción

DRO1 es un proteína de secreción

WT

IRS

2 K

O

CD

K4

tg

IRS

2 K

O /

CD

K4

tg

Medio condicionadoSubconfl. Confluentes

DRO1

- + - +(4 días) (7 días)

Inhibidores de proteasas

- 100 kDa

- 150 kDa

DRO1

MCF7-TetOn-DRO1-Flag Grasa subcutánea de ratón

Análisis de medios condicionados

Discusión

DRO1 es secretado al medio extracelular y procesado por

proteasas

- La secreción o la síntesis de DRO1 está modulada de manera conjunta por IRS2 y CDK4.

- El rescate frente a la diabetes por CDK4 en ratones que no expresan IRS2 podría ser en parte debido al aumento de secreción de DRO1.

DRO1 es un proteína de secreción

Flag

β- actina

BFA (h)Dox- + + + + +

0 0 2 4 8 24

0

5

10

15

20

25

30

35

Flag

siRNA C

-

siRNA D

RO1

β- actina

siControl siDRO1

% A

pop

tosi

s p

or B

FA

Discusión

- El bloqueo de la secreción de DRO1 por BFA produce su acumulación en el interior de la célula.

- La apoptosis por BFA no depende, al menos exclusivamente, de la acumulación de DRO1

Papel de DRO1 en apoptosis

CHX/TNFα- + - +

DRO1

Tubulina

Citocromo C

Citosol Mitocondria

MitocondriaDRO1-Flag

GolgiDRO1-Flag

Discusión

Discusión

Papel de DRO1 en apoptosis

ERDRO1-Flag

- ---+ +

++DoxiciclinaCaspasa-3

Flag

Caspasa-3 activa

Caspasa-3

- DRO1 se encuentra parcialmente retenido en el retículo endoplasmático tras estímulo apoptótico.

- DRO1 podría participar en la apoptosis inducida por estrés en el retículo endoplasmático.

-La expresión de DRO1 en células MCF7-TetOn-DRO1flag es suficiente para activar caspasa 3 sin necesidad de un estímulo apoptótico previo.

-DRO1 posee una gran importancia en la inducción de apoptosis.

Papel de DRO1 en apoptosis

0

10

20

30

40

Control siAIB1 siAIB1siDRO1

% a

pop

tosi

s in

du

cid

a po

r E

stau

rosp

orin

a en

MC

F7

AIB1

β- actina

DRO1

Con

trol

siAIB

1siA

IB1

-siD

RO

1***

Ensayo TUNEL

DoxiciclinaEstaurosporina

% a

pop

tosi

s

10

20

30

40

0

- +- +- + - +

**

*

- - +-

+ ++-

Campo claro

0

1

2

C DRO1

Niv

eles

rel

ativ

os d

e m

RN

A d

e B

CL

AF

1

0

10

20

30

40

50

% a

pop

tosi

s in

du

cid

a po

r E

stau

rosp

orin

a en

BT

-474

Control siAIB1 siAIB1siDRO1

AIB1

β- actina

DRO1

Con

trol

siAIB

1siA

IB1

-siD

RO

1

Discusión

-DRO1 duplica la población apoptótica y potencia el efecto apoptótico de estaurosporina.

-La actividad antiapoptótica de AIB1 está en gran parte mediada por la inhibición de la expresión de DRO1.

-DRO1 induce la expresión del gen proapotótico BCLAF1.

Efecto de DRO1 en proliferación

Proliferación celular

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1 2 3 4Días

Ab

sorb

anci

a (4

50n

m)

MCF7-TetOn-DRO dox-MCF7-TetOn-DRO dox+

PLZF

Lisado antes

IP

Lisado después

IP

IP anti-Flag

Discusión

-DRO1 interacciona con el factor de transcripción PLZF. -DRO1 disminuye la expresión de genes reguladores del ciclo celular como MCM2 y aumenta la de RBBP8.

-Posiblemente la disminución de la expresión de MCM2 por DRO1 impida la replicación del DNA y división celular, y el aumento de RBBP8 medie la inhibición de la proliferación tras daño al DNA.

Efecto de DRO1 sobre proteínas de adhesión celular y su implicación en migración transendotelial

Flag

- + Doxiciclina

β -catenina

ICAM-1

E-cadherina

β -actina

Vimentina

MCF7-TetOn-DRO1-Flag dox- MCF7-TetOn-DRO1-Flag dox+

0

500

1000

1500

2000

2500

Mig

raci

ón t

ran

sen

dot

elia

l (T

EM

)(F

luor

esce

nci

a 48

8nm

)

Control DRO1

*

β – catenina E - cadherina

MesenquimalEpiteliales

ICAM-1 Integrina DRO1

Endotelio

Discusión

-DRO1 disminuye la migración transendotelial.-Este efecto podría deberse a la represión de ICAM-1 y β-integrinas.

La fosforilación de AIB1 en S728 favorece la interacción con ERα y TFIIEα

4.5%lisadototal C A E C A E

Unido a sefarosa Sobrenadante

TFIIEα

16%ERαtotal C A E C A E

Unido a sefarosa Sobrenadante

ERα

- AIB1 se fosforila en las serinas S728 y S867 por CDK1/ciclina B al inicio de la mitosis.- Esta fosforilación permanece hasta la salida de la fase M.- No está asociada con ubicuitilación ni degradación de AIB1.- ¿Estará implicada en alterar la interacción con factores de transcripción durante la mitosis?

250 -150 -100 -

75 -

50 -

KDa C

S728A

S728E

Discusión

-Mutaciones que mimetizan o bloquean la fosforilación en S728 no alteran su capacidad de interaccionar con ERα ni su capacidad de coactivar a ERα. Incluso dicha fosforilación es capaz de aumentar la afinidad de AIB1 por el factor de transcripción TFIIEα.

La fosforilación de AIB1 en S728 lo excluye de la cromatina durante la mitosis

DAPI AIB1 β-tubulina

S I

AIB1

Lamina A/C

pAIB1AIB1

Nocodazol

Discusión

La fosforilación de AIB1 en S728 lo excluye de la cromatina durante la mitosis

Discusión

DAPIpAIB1β-tubulina

Nocodazol

AIB1pAIB1(S728)

β-actina β-actina

-La fosforilación de AIB1 en S728 por CDK1 no regula su actividad pero coincide con su restricción física de la cromatina, constituyendo un mecanismo alternativo de regulación transcripcional durante mitosis.-Es posible que esta exclusión de la cromatina sirva para impedir la transcripción inadecuada de genes (por ejemplo ciclinas D1, A1 y A2) durante la mitosis.

ConclusionesConclusiones

1- La transcripción de DRO1 está reprimida por AIB1 y por los oncogenes v-H-ras, v-src y HER2, coincidiendo con la disminución de los niveles de proteína.

2- La transcripción de DRO1 está inversamente regulada por moduladores del receptor de estrógenos.

3- AIB1 reprime a DRO1 a través de una región distal en su promotor, situada entre las bases -4813 y -3795.

4- DRO1 tiene actividad apoptótica y sensibiliza a estímulos apoptóticos.

5- El efecto antiapoptótico de AIB1 en células MCF-7 depende de la represión de DRO1.

6- DRO1 inhibe la migración transendotelial de células MCF-7.

7- DRO1 podría estar regulando el ciclo celular mediante interacción con PLZF y regulando la expresión de MCM2 y RBBP8.

8- DRO1 es una proteína de secreción.

9- La secreción de DRO1 está modulada por IRS2 y CDK4 en células de grasa subcutánea de ratón.

10- La expresión de DRO1 modula la expresión de genes importantes para el metabolismo y podría proteger contra el síndrome metabólico.

11- La fosforilación de AIB1 por CDK1 en S728 ocurre exclusivamente en células mitóticas.

12- La fosforilación de AIB1 por CDK1 en S728 lo excluye de la cromatina. Esta exclusión podría actuar como un mecanismo potencial de la regulación transcripcional durante la mitosis.