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REVISTA DE BIOLOGIA E CIÊNCIAS DA TERRA ISSN 1519-5228

Volume 15 - Número 2 - 2º Semestre 2015

ESTUDO FITOQUÍMICO, ATIVIDADE MICROBIOLÓGICA E CITO TÓXICA EM

Artemia salina DA PERIDERME DE Sclerolobium paniculatum VOGEL (CAESALPINIOIDEAE)

Gian Braian Silva Furtado1; Sheylla Susan Moreira da Silva de Almeida2

RESUMO Esta pesquisa objetivou avaliar a citotoxidade, atividade antibacteriana e composição farmacognóstica dos extratos etanólicos da periderme de Sclerolobium paniculatum. Realizou-se a triagem fitoquímica, foram realizadas reações testes, dos quais oito foram positivos: ácidos orgânicos, fenóis/taninos, açúcares redutores, alcaloides, saponinas espumídicas, saponinas hemolíticas, depsídeos/depsidonas e antraquinonas; e os negativos para: flavonoides, resinas, esteroides/triterpenoides e polissacarídeos. O ensaio de letalidade com Artemia salina L. foi realizado e apresentou nenhuma morte, sugerindo nenhuma toxidade. Para o estudo antimicrobiano por difusão em discos, foram utilizadas cepas de bactérias Gram positiva: Staphylococcus aureus (ATCC25923) e Gram negativas: Escherichia coli (ATCC25922) Klebsiella pneunomiae (ATCC13883), no qual foram submetidas aos antibióticos e ao extrato diluído, nas seguintes concentrações: 25, 50 e 100mg/mL. A espécie S. paniculatum apresentou atividade contra em todas as cepas, considerando as seguintes concentrações inibitórias a partir de: 50mg/mL para S. aureus; 25 mg/mL para E. coli e 100 mg/mL para K. pneunomiae que pode estar relacionada pela presença de fenóis, taninos e alcaloides, devido a ação antimicrobiana. Palavras-chave: Fitoquímica, atividade microbiológica, ação citotóxica, periderme, Sclerolobium paniculatum.

PHYTOCHEMICAL STUDY, CYTOTOXIC ACTIVITY AND MICROBI OLOGICAL IN Artemia salina PERIDERM OF THE Sclerolobium paniculatum VOGEL

(CAESALPINIOIDEAE)

ABSTRACT This research aimed to evaluate the cytotoxicity, antibacterial activity and pharmacognostic composition of ethanol extracts of the periderm Sclerolobium paniculatum. Held the phytochemical screening, reaction tests were performed, eight of which were positive: organic acids, phenols/tannins, reducing sugars, alkaloids, sparkling saponins, haemolytic saponins, depsides/depsidones and anthraquinones; and negative to: flavonoids, resins, steroids/triterpenoids and polysaccharides. The lethality assay with Artemia salina L. was performed and showed no death, suggesting no toxicity. To study antimicrobial for the disc diffusion, strains of bacteria were used Gram positive: Staphylococcus aureus (ATCC25923) e Gram negative: Escherichia coli (ATCC25922) Klebsiella pneunomiae (ATCC13883), in which underwent antibiotic and the extract diluted, the following concentrations: 50 mg / mL for S. aureus; 25 mg/mL for E. coli and 100 mg/mL for K. pneunomiae which may be related to the presence of phenols, tannins and alkaloids, due to antimicrobial action. Keywords: Phytochemical, microbiological activity, cytotoxic activity, periderm, Sclerolobium paniculatum.

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INTRODUÇÃO Sclerolobium paniculatum Vogel

pertence à família Leguminosae-Caesalpinioideae (LORENZI, 2008), perenifólia com 8 a 30 m de alturade altura na idade adulta (RIZZINI, 1976;). Conhecida popularmente como taxi-branco-da-terra-firme, madeira de boa reputação para produção de lenha e de carvão vegetal, sendo também recomendada para produção de álcool e coque (PAULA, 1980). O uso medicinal pela decocção de sua casca é relatado pela população para tratamento de feridas (OLIVEIRA, 2006). Por isso, fez-se uma pesquisa preliminar da casca deste vegetal, determinando de forma qualitativa os metabólicos secundários, por meio de uma triagem fitoquímica, que é de extrema importância para descoberta de novos agentes com atividade farmacológica. A análise citotóxica com Artemia salina, método experimental alternativo, simples e barato, para a determinação da atividade biológica de compostos ou extratos naturais, toxinas contaminantes do meio ambiente (MAYER et al., 1982); e como também atividade antimicrobiana do extrato bruto etanólico da periderme do Sclerolobium paniculatum Vogel, faz-se necessário, devido ao surgimento de novos agentes antimicrobianos se faz necessária devido ao surgimento de microrganismos resistentes e de infecções oportunistas fatais, associadas a AIDS, quimioterapia antineoplásica e transplantes (PENNA et al., 2001). Desta forma, tais pesquisas contribuem, significativamente, no desenvolvimento do campo da saúde em nível mundial, encontrando substâncias mais eficazes e menos tóxicas na corrida contra a resistência e o surgimento de microrganismos patogênicos (LEITÃO et al., 2006; BARBOSA-FILHO et al., 2007). MATERIAL E MÉTODOS Coleta e identificação do material vegetal

Foram coletadas cascas de S. paniculatum, encontradas no município de Pedra Branca do Amapari-AP, setembro de 2011. A planta foi identificada pelo Profa. Dra. Wegliane Campelo da Silva Aparício, do Laboratório de Botânica da Universidade

Federal do Estado do Amapá (UNIFAP), onde uma exsicata foi depositada no Herbário cujo voucher 438. Preparação e caracterização dos extratos

As partes da periderme do vegetal foram inicialmente secas em uma estufa de ar não circulante, e fragmentada mecanicamente em um moinho de facas. Os fragmentos (120 g) foram submetidos a um processo de extração etanólica a ar quente sob refluxo, 45 min. a 45º, sendo este processo repetido 3 vezes. Em seguida, os materiais foram filtrados e os extratos etanólicos obtidos concentrados em evaporador rotatório, sob pressão reduzida, obtendo-se assim, aproximadamente 12,2g o Extrato Bruto de Etanólico da periderme S. paniculatum (EBEPS) (SIMÕES 2007; FARMACOPEIA BRASILEIRA, 2010;). Avaliação da atividade citotóxica

A atividade citotóxica dos extratos foi avaliada através do teste de letalidade contra A. salina Leach, de acordo com o método proposto por McLaughlin e Rogers, (1998) e por Mayer et al. (1982). Cerca de 25mg de cistos de A. salina L., provenientes do Laboratório de Farmacognosia e Fitoquímica, sob refrigeração a 50C. Inicialmente, foram preparados 500mL de solução de sal marinho. Foram encubados em um recipiente que possui dois compartimentos separados por uma parede vazada no centro, contendo água do mar artificial à temperatura de 20 a 300C. Fez-se o uso de uma bomba de aquário para saturar de oxigênio o meio salino, além do uso de uma lâmpada de 40 watts (lâmpada incandescente) incidindo em apenas um dos compartimentos para onde migrarão os náuplios, obtidos com a eclosão dos cistos, após 24 horas de incubação. Os ensaios foram realizados em triplicata, buscando-se a determinação da relação dose-resposta. Houve um grupo controle, apenas com a solução marina artificial, e os grupos teste: água do mar artificial com EBEPS nas concentrações de 1000, 750, 500, 300, 100, 30, 10, 3 e 1 µg/mL. A solução mãe foi feita com 20mg do extrato. Em cada tubo foi colocados dez larvas de A. salina L., incluindo o controle, sendo completado até o volume final de 1mL com solução marinha artificial e solução mãe a cada concentração.

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Após 24 horas sobre o efeito do meio e sob incidência de luz, foram contabilizados os números de mortos e vivos e calculada a concentração letal média (CL50), determinada pelo método estatístico de Probits (PARRA et al., 2001; MCLAUGHLIN; ROGERS, 1998) Prospecção fitoquímica

Os extratos brutos foram submetidos a uma série de reações de caracterização fitoquímica para detecção da presença de metabólitos secundários como compostos fenólicos e taninos (reação de precipitação com cloreto férrico), caracterização de flavonoides (solução etanólica com limalha de magnésio e ácido clorídrico fumegante), determinação de alcaloides (reação com Mayer, Dragendorff, Bouchardt e Bertrand), caracterização de antraquinonas (reação com solução de benzeno e hidróxido de amônio); determinação de saponinas espumídicas por agitação (determinação do índice de espuma), e hemolíticas por hemólise de sangue bovino com anti-coagulante; identificação de ácidos orgânicos (reação com reativo pascová); açúcares redutores identificados pelo reativo de Fehling A e B; polissacarídeos determinados pelo Lugol; esteroides e triterpenoides (reação com solução de clorofórmio, anidrido acético e ácido sulfúrico); depsídios e depsidonas (reação com solução de éter dietílico, metanol e cloreto férrico); resinas ( material botânico em banho-maria, depois dissolvido em etanol), segundo metodologia descrita por Simões (2007) e pela Farmacopeia, (2010). Amostras bacterianas

Foi utilizado no presente trabalho cepas de bactérias Gram positiva: Staphylococcus aureus (ATCC25923) e Gram negativas: Escherichia coli (ATCC25922) Klebsiella pneunomiae (ATCC13883), oriundas do Laboratório Central do Amapá (LACEN-AP). Determinação da atividade antimicrobiana

O teste de difusão em disco é aceito pelo Food and Drug Administration (FDA) e estabelecido como padrão pelo National Committe for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) (BARRY; THORNSBERRY, 1991).

O teste de difusão em disco sugerido por Voravunthikunchai et al. (2004), porém com

algumas alterações. A metodologia consiste em determinar de forma qualitativa dos extratos etanólicos e aquosos de plantas medicinais que produziam zonas de inibição utilizando o método de difusão em ágar em colocar os discos sobre o meio de cultura sólido, 1 μL de cada cultura de bactérias foi colocado em Mueller Hinton Agar (MHA), previamente inoculado em placas de Petri de carga microbiana 108 UFC (Unidade Formadora de Colônia)/mL para bactérias, (CHATTOPADHYAY et al., 2002; KARAMAN et al., 2003). A disposição dos discos deve ser tal que sua distância até a lateral da placa seja maior que 15 mm e de modo a não sobrepor as zonas de inibição. O pH do meio de cultura deve estar entre 7,2 e 7,4, e a profundidade recomendada é de aproximadamente 4 mm (BARRY; THORNSBERRY, 1991). Os discos de papel de filtro de 6 mm de diâmetro foram embebidos por três concentrações: 25, 50 e 100mg/mL do extrato bruto etanólico da periderme de S. paniculatum em solução metanólica. Utilizou-se como controle positivo: Cefotaxina (CTX30), Ceftazidina (CAZ30), Ceftriaxona (CRO30), Norfloxacina (NOR10), e Levofloxacina (LVX05). Após incubação por 24 h a 35 ºC observou-se as zonas de inibição. RESULTADOS

A triagem fitoquímica preliminar do extrato etanólico da periderme de Sclerolobium paniculatum L. revelou a presença de compostos fenólicos; taninos; alcaloides; saponinas espumídicas e hemolíticas; ácidos orgânicos; açúcares redutores; antraquinonas onde os resultados encontra-se na Tabela.1.

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Tabela 1. Resultados das análises fitoquímicas Metabólicos EBEPS

Ácidos orgânicos +++ Áçúcares redutores +++

Alcalóides +++ Antraquinonas ++

Bases Quarternária 0 Cumarina 0

Depsídeos/Depsidonas + Fenóis +++

Flavonoides S Esteroides -

Heterosídeo Cardíaco 0 Polissacarídeos -

Resinas - Saponina Espumídicas +++ Saponinas Hemolíticas +++

Triterpernoides - Taninos +++

PARÂMETROS: ausente (-), não realizado (0), fraco (+), médio (++), forte (+++), Suspeita (S).

Para o estudo antimicrobiano, verificou-se atividade contra todas as cepas, considerando as seguintes concentrações inibitórias a partir de: 50mg/mL para S. aureus; 25 mg/mL para E. coli e 100 mg/mL para K. pneunomiae.

Quanto o teste de letalidade frente à A. salina L., verificou-se nenhum óbito dos crustáceos nas diferentes concentrações das frações testadas, como também os do controle, sugerindo nenhuma toxidade para a concentração menor/igual a 1000 µg/mL. Não se obteve a CL50. DISCUSSÃO A ausência de citoxicidade do extrato no teste de letalidade contra Artemia salina é um indicador de que a planta pode ser bem tolerada frente ao sistema biológico. Entretanto, estudos mais detalhados para a avaliação da toxicidade dos extratos bioativos, empregando-se outros modelos (in vitro e in vivo), se fazem necessários. Quanto ao estudo fitoquímico, deve-se fazer algumas observações. Há suspeita da existência de flavonoides no vegetal, por isso, faz-se necessário o uso da cromatografia. Antes da identificação de esteroides/triterpenoides, fez-se primeiro a determinação de resinas, como este último foi ausente, foi sugerido à ausência também dos mesmos na forma livre, pois a composição molecular das resinas é baseada

principalmente em terpenóides e compostos fenólicos (LANGENHEIM, 1990), hipótese confirmada com o teste, apesar de presentes na constituição das saponinas (SIMÕES, 2007). Devido à presença forte de fenóis, suspeitou-se da presença de antraquinona, pois ela pode ser considerada produto da oxidação de fenóis (CARVALHO; ALMANÇA 2003). As drogas antimicrobianas podem funcionar de cinco modos: inibição da síntese de parede celular, inibição da síntese de proteínas, inibição da síntese de ácidos nucleicos, dano à membrana plasmática ou inibição da síntese de metabólicos essenciais (Tortora et al., 2012). Os agentes antimicrobianos naturais são uma alternativa atrativa para oferecer produtos saudáveis e seguros.

A atividade antimicrobiana do vegetal está relacionada a presença de fenóis: por causarem lesão nas membranas plasmáticas lipídicas, o que resulta no vazamento do conteúdo celular; taninos: pela inibição de enzimas; saponinas: pela ação sobre as membranas celulares, alterando a permeabilidade ou a destruição da mesma (Tortora et al, 2012; Simões 2007). Este último, também pode estar relacionado à atividade da resposta imune, e no desenvolvimento de vacinas, ambas as propriedades, imunoadjuvante e hemolítica, exercem atividades antagônicas, contudo, as informações sobre as relações estrutura-atividade são relativamente escassas e, às vezes, conflitantes (Kaiser, 2009). Os alcalóides, que possuem ampla gama atividades biológicas investigadas, como amebicida, anticolinérgico, anti-hipertensivos e entre outros. Ácidos orgânicos podem estar relacinados a população microbita no trato digestivo de animais, favorencendo na engorda do animal (Freitas, 2006). A boa produção de álcool da madeira deste vegetal se deve pela presença de açúcares redutores (Paula, 1980). Devido a grande quantidade de metabólicos secundários presentes no Sclerolobium paniculatum V., faz-se necessário fazer uma investigação quantitativa para se determinar os metabólicos mais predominantes no vegetal, isola-los e submete-los a estudos in vivo e in vitro, proporcionando a esta espécie uma fonte promissora na busca de novos fármacos.

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AGRADECIMENTOS

Programa de Educação Tutorial (PET), Universidade Federal do Amapá (UNIFAP), Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA). REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BARBOSA-FILHO, J. M.; et al. Natural products with antileprotic activity. Rev Bras Farmacogn. v. 17, p. 141-148, 2007. BARRY, A. L; THORNSBERRY C. Susceptibility tests: Diffusion Test Procedures. In: BALOWS A., et al. Manual of clinical microbiology. 5. ed. Washington, DC: American Society for Microbiology, p. 1117-1125, 1991. CARVALHO J. C. T.; ALMANÇA C. C. J. Formulário de Prescrição Fitoterápica. São Paulo: Editora Atheneu, 2003. CHATTOTADHYAY, D.; et al. Antimicrobial and anti-infl ammatory activity of folklore: Mallotus peltatus leaf extract. J. Ethnopharmacol v. 82, p. 229-237, 2002. FARMACOPÉIA BRASILEIRA 2010 5.ed. Brasília: ANVISA. FREITAS, L. S. Ácidos orgânicos na alimentação de leitões desmamados. R. Bras. Zootec. v. 35, p. 1711-1719, 2006. KAISER S.; PAVEI. C.; ORTEGA, G. G. Estudo da relação estrutura-atividade de saponinas hemolíticas e/ou imunoadjuvantes mediante uso de análise multivariada. Revista Brasileira de Farmacognosia v. 20, p. 300-309, 2010. KARAMAN, İ; et al. Antimicrobial activity of aqueous and methanol extracts of Juniperus oxycedrus L. J Ethnopharmacol v. 85, p. 231-235, 2003. LANGENHEIM, J. H. Plant resins. American Scientist, v. 78, p. 16,-24, 1990.

LEITÃO, S. G,.; et al. Screening of Central and South American plant extracts for antimycobacterial activity by the Alamar Blue test. Rev Bras Farmacogn 16: 6-11, 2006. LORENZI, H.; SOUZA, V. C. Botânica sistemática. Nova Odessa: Instituto Plantarum, 2ª edição, 2008, 383p. MCLAUGHLIN, J. L.; ROGERS, L. L. ANDERSON, J. E. The use of biological assays to evaluate botanicals. Drug Inf J v. 32, p. 513-524, 1998. MEYER, B. N.; et al. Brine Shrimp: a convenient general bioassay for active plant constituents. Planta Med v. 45, p. 31-34, 1982. OLIVEIRA, F. C. S.; BARROS, R. F. M.; MOITA NETO, J. M. Plantas medicinais utilizadas em comunidades rurais de Oeiras, semiárido piauiense. Rev. Bras. Pl. Med., Botucatu, v. 12, p. 282-301, 2010. PAULA, J. E. Madeiras que produzem álcool, coque e carvão. CNP - Atualidades, Brasília-DF, v. 72, p. 31-45, 1980. PENNA C.; et al. Antimicrobial activity of Argentine plants used in the treatment of infectious diseases. Isolation of active compounds from Sebastiania brasiliensis. J Ethnopharmacol v. 77, p. 37-40, 2001. RIZZINI, C. T. Contribuição ao conhecimento das floras nordestinas. Rodriguésia, Rio de Janeiro, v. 28, p. 137-193, 1976. SIMÕES, C. M. O.; et al. Farmacognosia: da planta ao medicamento. Santa Catarina: Editora UFSC. 2007 TORTORA, G.J.; FUNKE, B. R.; CASE, C. L. Microbiologia. Porto Alegre-RS: Editora Artmed, 2012. VORAVUTHIKUNCHAI, S; et al. Effective medicinal plants against enterohaemorrhagic Escherichia coli. J Ethnopharmacol v. 94, p. 49-54, 2004.

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______________________________________ 1-Graduando do Curso de Farmácia. Laboratório de Farmacognosia e Fitoquímica. Departamento de Ciências da Saúde. Curso de Farmácia. Universidade Federal do Amapá – Rodovia Juscelino Kubistchek, KM-02. Jardim Marco Zero – 68.902-280 – Macapá-AP, Brasil. 2-Doutora em Química de Produtos Naturais. Laboratório de Farmacognosia e Fitoquímica. Departamento de Ciências da Saúde. Curso de Farmácia. Universidade Federal do Amapá – Rodovia Juscelino Kubistchek, KM-02. Jardim Marco Zero – 68.902-280 – Macapá-AP, Brasil.