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Sara Sánchez Restrepo Catalina Urango GiraldoFacultad Ciencias de la Salud
A Mosaic Activating Mutation in AKT1 associated with the Proteus Syndrome
Marjorie J. Lindhurst, Julie C. Sapp, Jamie K. Teer, Jennifer J. Johnston, Erin M. Finn,
Kathryn Peters, et al.
Molecular Biology
PROTEUS SYNDROME
The Proteus syndrome is characterized by the overgrowth of skin, connective tissue, organs, brain, and other tissues.
Along with susceptibility to the development of tumors
I N T R O D U C T I O N
PROTEUS SYNDROME
• Described in 1979 by Cohen and Hayden.
• The syndrome is not frequent. Incidence less than 1 case per 1 million inhabitants.
• Currently, there is no report that categorizes the disease is inherited.
I N T R O D U C T I O N
PROTEUS SYNDROME
I N T R O D U C T I O N
• Proteus syndrome has been described hypothetically as a result of somatic or mosaic disorders
(A MOSAIC DISORDER IS ONE IN WHICH CELLS WITHIN THE SAME PERSON HAVE A DIFFERENT GENETIC COMPOSITION FROM ONE ANOTHER)
AKT 1
AKT (Protein kinase B, PKB) is a serine/threonine kinase that plays a key in regulating cell survival, insulin signaling , angiogenesis and tumor formation.
There are three isoforms of Akt: Akt 1, 2 and 3 (also known as PKBα, β and γ).
RELATIONSHIP OF SYNDROME WITH AKT-1
Clinical signs of the syndrome, such as excessive
growth of tissues and organs, is given by the activation of AKT1 to be phosphorylated as a result of a mutation
Proteus Syndrome
AKT 1 mutation
AKT 1 phosphorylation
Excessive tissue and organ growth
MAIN OBJETIVE
Identify the influence of somatic mutations in phosphorylation of
AKT-1 in Proteus Syndrome.
MATERIALES Y MÉTODOS
The New England Journal of Medicine, 27 July 2011
1. MUESTRA
29 Pacientes 158 muestras con criterio clínico positivo de
Síndrome de Proteus.
BIOPSIA PACIENTES ENFERMOS Secuencia exones ADNy comparación con tejidos afectados
• EXONES: son las porciones que codifican las proteínas. (Selección de regiones que codifican en un genoma humana para
identificar genes asociados con desordenes poco frecuentes)
The New England Journal of Medicine, 27 July 2011
MATERIALES Y MÉTODOS
CONFIRMACIÓN Y AMPLIACIÓN Medida de restricción para analizar 158 muestras de ADN.
Las endonucleasas o enzimas de restricción rompen la doble cadena de ADN al reconocer una secuencia especifica de bases, el cual consiste en deshacer la unión que forma el grupo fosfato entre dos moléculas de desoxirribosa de la hebra de ADN.
The New England Journal of Medicine, 27 July 2011
MATERIALES Y MÉTODOS
ANÁLISIS DE LA ACTIVACIÓN
DE LA PROTEÍNA AKT EN LOS TEJIDOS AFECTADOS, MEDIANTE LA FOSFORILACIÓN DE ANTICUERPOS ESPECÍFICOS (WESTERN BLOT O INMUNOBLOT)
The New England Journal of Medicine, 27 July 2011
MATERIALES Y MÉTODOS
WESTERN BLOT O INMUNOBLOT
Proteínas SDS = detergente polaridad (-)
Transferencia a filtro : Incubación con anticuerpos.
Ac + filtro = identificación proteína
SDS- PAGE Poliacrilámida gel electroforesis
Separación proteínas de extractos celulares por electroforesis según el tamaño
TÉCNICA
El análisis de seguimiento se efectúo por la secuencia de
Sanger (didesoxinucleotidos) y digestión enzima de restricción , utilizando métodos para la polimerasa de reacción en cadena (PCR)
The New England Journal of Medicine, 27 July 2011
MATERIALES Y MÉTODOS
PCR (polymerase-chain-reaction): tecnica desarrollada con el objetivo de amplificación in vitro directa de un gen o fragmento de DNA o indirecta de RNA.
- Principio del método:
Desnaturalizacion del DNA para dar hebras sencillas.
Hibridacion especifica: “primer”
Replicacion: DNA polimerasa. - Utilidad: rastreo de mutaciones AKT 1
RESULTADOS
• FILTRACION DE LA VARIANTESindrome de Proteus
FILTROS
Análisis de variaciones IDENTIFICOAKT1, c.49G→A
a.a.17Lys por
Gln
RESULTADOS
• VALIDACION: MUTACIÓN AKT1/SINDROME DE PROTEUS
Secuenciación de Sanger
Consistentes con datos de secuenciación de exones
Hipotesis: insensibilidad a bajos niveles de mosaicismo
RESULTADOS
DIGESTION POR ENZIMA DE RESTRICCIÓN
Mutación ausente en 25 linajes celulares y 2 muestras de tejido fresco en sujetos que no presentaban el síndrome.
De 29 pacientes con el síndrome de Proteus, 26 tenian mutación somática con activación de AKT1. Lo cual corresponde al 90% de la muestra.
RESULTADOS
Western blot imágenes de luminiscencia
DISCUSSION
Author’s Name What the author saidIs it related to the research
findings?Kharas MG, Okabe R, Ganis JJ, et al.
The AKT1 activating mutation is detrimental to hematopoiesis
YES
Carpten JD, Faber AL, Horn C, et al.
Constitutive activation of AKT1 through Ser473 and Thr308 phosphorylation underlies the oncogenic mechanism.
YES
DISCUSSION
Author’s Name
What the author said Is it related to the research findings?
Happle R.More circumscribed or
milder manifestation of the disorder would be
associated with a later occurrence of the somatic
mutation in an embryo.
NO
Cantley LC, Neel
BG.
AKT1 is activated by lossof-function mutations in PTEN.
NO
The New England Journal of Medicine, 27 July 2011
The gene mutation, is a predisposing factor for the phosphorilation of the AKT1 protein.
In the Proteus syndrome, the amino acid in which the higher phosphorilation occurs is the Serine.
CONCLUSIONS
CONCLUSIONS
The activation of the AKT1 by phosphorilation is related with the tissue overgrowth in the Proteus Syndrome.
The somatic mutation that characterizes the Proteus Syndrome, makes of it a non inherited disorder.
The New England Journal of Medicine, 27 July 2011
Catalina Urango Giraldo
Sara Sánchez Restrepo
GRACIAS
THANKS