ISOLASI DAN IDENTIFIKASI BAKTERI

DARI SPESIMEN URIN

PRAKTIKUM BAKTERIOLOGI

HARI 1

Hari, tanggal : Senin, 26 November 2012

Tujuan : Mengetahui ciri bakteri yang

tumbuh pada media BAP dan

MC

“Isolasi bakteri dari sampel urin pada

media BAP, MC, dan BHI”

Ose Spiritus

loop

Inkubator

Mikro pipet+tip Korek api

Pipet ukur Objek glass Cover glass

Centrifuge Bola hisap Mikroskop

Bahan :

Blood Agar Plate (BAP) Manitol Salt Agar (MSA)

Pengenceran Urin

Dipipet NaCl 0,85% sebanyak 9,8 ml dan urin sebanyak 0,2 ml (200 mikron)

Dimasukkan ke dlm tabung reaksi, dihomogenkan

Panaskan ose loop hingga berpijar, lalu dinginkan

Diambil koloni dr sampel urin yg telah diencerkan, kmd ditanam pada media BAP dan MC

Digoreskan dgn goresan Radian ( Seperti Papan

catur)

Diinkubasi pd suhu 37o C selama 24 jam

Dipanaskan ose hingga berpijar, di dinginkan

Ambil 1 ose urin, masukkan ke dalam media BHI secara aseptik

Inkubasi pada suhu 37o C selama 24 jam

Urin di Centifuge dgn kec 3500 rpm selama 5 menit

Buang supernatan dgn membalikkan tabung scr cepat

Kocok endapan, lalu ambil 2 tetes letakkan pd objek

glass, tutup dgn cover glass

Amati Sel Leukosit pd perbesaran 10x

Pemeriksaan leukosit

0-1 sel/LPB

HARI 2

Hari, tanggal : Selasa, 27 November 2012

Tujuan : Mendapatkan biakkan bakteri

dari sampel urin yang telah

ditanam pada media BHI

“Isolasi bakteri”

Ose Spiritus

loop

Inkubator

Mikro pipet+tip Korek api

Bahan :

Blood Agar Plate (BAP) Manitol Salt Agar (MSA)

Kultur bakteri pd

media BHI

Dipipet bakteri dari BHI sebanyak 50 mikron ke media BAP dan MC

Dibuat goresan radian dengan ose loop (seperti papan catur)

Diinkubasi pd suhu 37o C selama 24 jam

Pada media BAP :

Koloni Bakteri berwarna

putih abu-abu

Pada media MC

Koloni berwarna kuning,

media juga berwarna

kuning

HARI 3

Hari, tanggal : Rabu, 28 November 2012

Tujuan : Mengidentifikasi bakteri

“Identifikasi bakteri”

Ose Spiritusloop

Inkubator

OseJarum

Pipet tetes Korek api

Objek glass

Mikroskop

Media :

Gula-gula

(Glukosa, laktosa, Manitol, Maltosa, Sukrosa)

Malonate broth

Nitrat broth

MRVP

Glukosa oF Parafin & non Parafin

SIM

PAA

TSIA

Simmon citrate

Urea agar

Gentien violet

Lugol

Alkohol absolut

Safranin

1. Diamati pertumbuhan bakteri pd media BAP & MC

2. Dilakukan pewarnaan gram

3. Dilakukan penanaman pd media Identifikasi

Sterilkan ose, kmd dinginkan

Diambil koloni dgn ose tsb

Ditanam koloni bakteri ke dlm media

u/ Media cair (Gula-gula, MRVP, Nitrat broth, Malonate,

Glukosa oF), ose yg telah terisi koloni bakteri

dimasukkan ke dlm tabung & di goyangkan

U/ media padat tabung miring (Simon citrate, Urea, TSIA), ose yang telah tersi koloni bakteri digoreskan zig-zag dr bagian pangkal ke bawah. Dan untuk media TSIA jg dilakukan penusukkan use pd bagian tengah hingga

dasar

U/ media semi solid (SIM), ose yg telah terisi koloni bakteri ditusukkan dr permukaan media hingga bagian

tengah (tdk sampai dasar)

Disterilkan kembali ose,Diinkubasi pada suhu 37o C selama 24 jam

Pewarnaan gram

Ditemukan bakteri berwarna merah, berbentuk basil

HARI 4

Hari, tanggal : Kamis, 29 November 2012

Tujuan : Mengetahui respon bakteri

yang tumbuh terhadap test-

test biokimia

“Test Biokimia”

Pipet Tetes

Nitrit I dan Nitrit II

KOH 40%

α- naftol 5%

Metil red

FeCl2

Kovac

Diamati perubahan pada media Gula-gula, Malonate, Urea, Simon citrate, TSIA, dan Glokosa oF, tanpa penambahan

reagen tertentu

Lakukan tes-tes biokimia dengan menambahkan reagen-reagen tertentu ke dldalam media sbb:

Media MR + reagen Metil red 3 tetes

Media VP + reagen α-naftol 5% dan KOH 40%,

masing-masing setengah volume media

Media Nitrat broth + reagen Nitrit I dan Nitrit II,

dgn perbandingan 1:1

Media PAA + reagen FeCl2 3

tetes

Media SIM + reagen kovac 3 tetes

GlukosaTerjadi perubahan warna menjadi kuning

LaktosaTerjadi perubahan warna menjadi kuning

ManitolTerjadi perubahan warna menjadi kuning

MaltosaTerjadi perubahan warna menjadi kuning

SukrosaTerjadi perubahan warna menjadi kuning

Malonate brothPositif (+)Terjadi perubahan warna menjadi biru

Nitrat brothPositif (+)Terjadi perubahan warna manjadi

Simmon CitratePositif (+)Terjadi perubahan warna biru

TSIA H2S : Tidak

terdapat warna hitam pada

tusukkan Lereng/dasar :

Kuning/kuning Reaksi asam

Gas : Pada dasar media pecah dan

terangkat

PAA

Negatif (-)

Tidak terjadiperubahan warna

Urea

Negatif (-)

Tidak tejadiperubahan warna

SIM Sulfur

Negatif (-)Tidak terdapat warna hiam padatusukan

IndolNegatif (-)Tidak terjadi perubahan warna padareagen

motilPositif (+)Terdapat kekeruhan menyebar disekitar tusukan

Glukosa OF Parafin

Positif (+)Terjadi perubahan warna menjadi kuning

Non parafinPositif (+)Terjadi perubahan warnakuning

MR

Negatif (-)

Tidak terjadiperubahan warna

VP

Positif (+)

Terbentuk cincinmerah

Dari praktikum yang telah dilakukan dapatdisimpulkan bahwa bakteri yang terdapatdalam sampel urin ini adalah Enterobacter sp

PRAKTIKUM BAKTERIOLOGI

TES SENSITIVITAS BAKTERI

HARI 1“TES SENSITIVITAS BAKTERI”

• Hari/tanggal : Senin/03 Desember 2012

• Tujuan : Untuk mengetahuikemampuan suatuantibiotik dalammenghambatpertumbuhan bakteri.

• Metode : Diffusion Test (Kirby Bauer)

Ose Spiritusloop

Inkubator

Mikro pipet+tip Korek api

Alat :

Pipet ukur Bola hisap Pinset

Lidi kapas steril

Bahan :

Mueller Hinton Agar

Koloni pada media MC

• Disc obat : 1. Nitrofurantoin

2. Norfloxacin

3. Ceftriaxone

4. Ampycilin

5. Polymycin

» Reagen : a. Asam sulfat (H2SO4 )

b. Barium klorida (BaCI2)

c. Natrium klorida (NaCl)

SKEMA CARA KERJA

Pembuatan standard Mac Farland (5 ml H2SO4 + 25 μl BaCI2 )

Pembuatan Suspensi Bakteri yang kekeruhannya sama denganstandard Mac Farland yang dibuat

Penanaman bakteri pada media Mueller Hinton

Penempelan Disc Obat kemudian inkubasi suhu 35 ̊c selama 16-18 jam.

• Cara kerja :

A. Pembuatan standar Mac Farland

1. pipet 5 ml H2SO4 ke dalam tabungreaksi.

2. pipet lagi 25 mikroliter BaCI2 dandimasukkan ke dalam tabungreaksi tersebut.

3. homogenkan

B. Pembuatan suspensi bakteri

1. pijarkan ose pada lampu spiritus, lalu dinginkan kembali.

2. koloni bakteri pada media MC diambil menggunakan ose tersebutdan dimasukkan dalam tebungreaksi yang berisi NaCl 0,95%.

3. homogenkan dengan ose.

C. Perbandingan dengan standar Mac Farland

1. larutan suspensi bakteri tadidibandingkan dengan standard Mac Farland yang telah di buat.

2. perbandingan kekeruhan antara 2 larutan tersebut di amati dan hasilkekeruhan harus disamakan.

D. Penanaman pada media Mueller Hinton

1. Dicelupkan lidi kapas sterilke dalam suspensibakteri yang sudah di standarisasi, didiamkan beberapa saat agar cairan dapatmeresap ke dalam kapas.

2. Selanjutnya lidi kapas itu digoreskan padapermukaan media Mueller Hinton denganpola zig zag, seluruh permukaan media harus penuh.

3. Setelah selesai media MH didiamkanselama 5-15 menit supaya suspensibakteri meresap ke dalam agar.

E. Penempelan Disc Obat

1. dengan menggunakan pinset, disc obat satu per satu diletakkan padapermukaan media MH, jarak antaramasing-masing disc tidak kurangdari 15 mm.

2. di inkubasi pada suhu 35 ̊c selama16-18 jam.

HARI KEDUA“Pengamatan Hasil Test Sensitivitas”

• Hari /bahan : Selasa/ 04 Desember 2012

• Tujuan : mengamati dan mengukurzona bening yang terbentuksebagai hasil dari tessensitivitas.

• Alat : penggaris

• Bahan : media MH yang berisi disc obat yang telah di inkubasi

Alat

Penggaris

Bahan

Cara Kerja

Dengan latar belakang gelap, dilakukan pengamatan terhadap zona bening yang terbentuk disekitar disc obat yang ditanam

Diameter zona bening yang terbentuk di ukur dengan menggunakan penggarisdan di catat hasilnya.

Hasil pengukuran di bandingkan dengan quality kontrol intuk memperolehkepastiannya (resisten, intermediet, atau sensitif).

• Quality control :

Namaantibiotik

PotencyDisc

Diameter Zona Bening (mm)

Resisten Intermediate Sensitive

1 Nitrofurantoin (F) 300 μg ≤ 14 15-16 ≥ 17

2 Norfloxacin (NOR) 10 μg ≤ 12 13-16 ≥ 17

3 Polymycin B (PB) 300 unit - - >11

4 Ampicilin (AMP)• Gram negatif,

Staphylococcus• Hemophilus,

influenza

10 μg

≤ 11 12-13 ≥ 14

≤ 19 - ≥ 20

Hasil

• Nitrofurantoin= 20 mm= sensitive

• Polymyxin-B = 13 mm= sensitive

• Ampycilin = 0 mm = resistent

• Norfloxacin = 17 mm= sensitive

• Ceftriaxone = 0 mm = resistent

Kesimpulan

Dari praktikum yang telah di lakukan dapatdisimpulkan bahwa dari 5 disc obat yangditempelkan, 3 diantaranya bersifat sensitiveyaitu Nitrofurantoin, Norfloxacin dan Polynyxin-B. Sedangkan Ampycilin dan Ceftriaxone bersifatresistent

Sekian dan

terima kasih