Holinesteraza 2014

1

Holinesteraza

Predavanja iz kliničke enzimologije Integrisane akademske studije: Farmacija-medicinska

biohemija Školska 2014/2015. godina

2

Holinesteraza

• Skraćenica: cholinesterase CHE ili HE 2 tipa holiesteraze 1. Acetil holinesteraza EC 3.1.1.7 acetilholin acetilhidrolaza

– Eritrocitna ili prava holinesteraza ili holinesteraza I

2. Pseudoholinesteraza EC 3.1.1.8 acilholin acilhidrolaza

– serumska holinesteraza ili butirilholinesteraza ili holinesteraza II

3

Acetilholinesteraza

• Eritrocitna ili prava holinesteraza ili holinesteraza I • Distribucija

– Prisutna u eritrocitima, plućima, slezini, na nervnim završecima i sivoj masi mozga

• Uloga: – Trenutna hidroliza acetilholina na nervnim završecima

4

Mesto delovanja acetilholinesteraze

ACHE

5

Serumska holinesteraza

Pseudoholinesteraza EC 3.1.1.8 acilholin acilhidrolaza

– serumska holinesteraza ili butirilholinesteraza ili holinesteraza II

– prisutna u jetri, pankreasu, srcu, beloj masi mozga i serumu

– prisutna u organizmu više od CHE I (3 x veća aktivnost)

– CHE II ima klinički značaj

– uloga tačna se ne zna

– uloga u metabolizmu ? deaktivacija oktanoil grelina

6

HN

Struktura holinesteraza

Trp 86

Estarsko mesto

ON

CH3CH3CH3

O

OH

Ser 203

Phe 338

Anjonsko mesto

CO

OGlu 327

N

HN

His 440

Aktivni centar holinesteraze: estarsko i anjonsko mesto Katalitička trijada: glutamat, histidin i serin

7

O

O

HN

Trp 86

Ser 203

Phe 338

HON

CH3CH3CH3

CO

OGlu 327

N

HN

His 440

Hidroliza acetilholina sa acetilholinesterazom

Anjonsko mesto

Estarsko mesto

8

O

O

HN

Trp 86

Ser 203

Phe 338

HON

CH3CH3CH3

holin

CO

OGlu 327

N

HN

His 440


Anjonsko mesto Estarsko mesto

9

O

O

HN

Trp 86

Ser 203

Phe 338

CO

OGlu 327

N

HN

His 440 HO H


Anjonsko mesto

Estarsko mesto

10

OH

HN

Trp 86

Ser 203

Phe 338

OH

Oacetat

CO

OGlu 327

N

HN

His 440


Anjonsko mesto

Estarsko mesto

11

Obe holinesteraze katalizuju sledeću reakciju

Kinetičke karakteristike holinesteraza Razlika u specifičnosti na supstrate

CHE II - benzoilholin

CHE I - deluje samo na holinestre, a ne deluje na alkil i aril estre

12

Kinetičke karakteristike acetilholinesteraze i holinesteraze

• Inhibicije holinesteraza • Inhibicija supstratom

– CHE I sa acetilholinom u konc 10 -2 mol/L – CHE II nije inhibirana supstratom

1. Reverzibilna inhibicija – oba enzima – alkaloidima: prostigminom i fizostigminom – kvarternerni azot u strukturi

2. Ireverzibilna inhibicija – oba enzima – organofosfatna jedinjenja: diizopropilfluorofosfat – fosfatna grupa se vezuje za mesto gde se normalno vezuje acil grupa – morfin, kinin, tercijalni amini, fenotijazini, pirofosfat, žučne kiseline, citrati,

floridi i borati

13

O

NH3C CH3CH3

N

O

CH3

CH3

Neostigmine(Prostigmin)

N

N

CH3

H

H3C

CH3

OHN

OPhysostigmine(Antilirium)

H3C

N

O N

O

CH3

CH3

Pyridostigmine(Mestinon)CH3

1. Reverzibilni inhibitori holinesteraza

• Vezivanje za anjonsko mesto • Kvarternerna ili tercijalna

amonijum grupa • Kovalentna modifikacija acetilholinesteraze

14

HN

Inhibicija ACHE sa neostigminom

Trp 86 OH

Ser 203

Phe 338

NON

O

Glu 327

His 440

Estarsko mesto

Anjonsko mesto

15

2. Ireverzibilni inhibitori holinesteraza O P

O

O

F

Isofluorophate; DFP(Floropryl)

H3CNH3CCH3

CH2 CH2 S P

O

OC2H5

OC2H5

I-

Echothiophate(Phospholine Iodide)

• Organofosfatna jedinjenja • Vezivanje za estarsko mesto • Kovalentna modifikacija acetilholinesteraze • Duže deluju

16

HN

Trp 86 OH

Ser 203

Phe 338

O P

O

F

O

Glu 327

His 440

Inhibicija ACHE sa organofosfatima

Estarsko mesto

Anjonsko mesto

17

Dejstvo reverzibilnih i ireverzibilnih inhibitora na acetilholinesterazu

Brza hidroliza u mikrosekundama

Spora hidroliza u satima-danima

Spora hidroliza u minutama

18

Izoforme CHE i genetski polimorfizam

• Elektroforeza razdvaja CHE II na 7 – 12 traka • Razlike u Mm i stvaranje agregata bazične jedinice • Genetske varijante • Dva genska lokusa E1 i E2

– Alelne forme genskog lokusa E1: Eu, Ea, Ef i Es – Genotipovi ukupno 10: – jedan normalan UU – 9 abnormalna UA, UF, US, AA, AS, AF, FF, FS, SS – Drugi genski lokus E2 ukupno 40 formi CHE II

19

Izoenzimi CHE i genetski polimorfizam Aloenzimi

1. Normalni uobičajeni fenotip je EuEu (UU) U uobičajeni 2. Atipični Ea

– Homozigoti EaEa (AA) slabo aktivni prema većini supstrata – rezistentnost na inhibiciju dibukainom

3. Fluorid rezistentni Ef

- smanjena aktivnost i povećana rezistencija na fluorid

4. Tihi ili silent Es - potpuno odsustvo enzimske aktivnosti ili - prisutan protein,ali minimalne katalitičke aktivnosti

20

Genetski polimorfizam serumske holinesteraze

• Mutacije Ea i Ef dovode do promene u strukturi aktivnog centra i snižene aktivnosti – aloenzimi su manje efektni katalizatori od uobičajenih formi – redukovan afinitet prema sustratima Km je povećan – snižen je afinitet prema kompetitivnim inhibitorima dibukainu i

fluoridu

• Učestalost aloenzima – Homozigoti AA ili FF 0,3-0,5 % kod Belaca – Kod Crnaca manje

• Povećane aktivnosti CHE u nekim familijama – uzrok – povećana sinteza uobičajenih aloenzima

21

Klinički značaj holinesteraze

• Određivanje aktivnosti CHE u serumu se koristi:

1. Test za funkciju jetre

sintetske funkcije jetre

2. Indikator trovanja insekticidima

3. Detekcija pacijenata sa atipičnom formom enzima koje

su podložne produženom odgovoru na izvesne

mišićne relaksanse koji se upotrebljavaju u hirurškim

procedurama.

22

Testovi za ispitivanje sintetske funkcije jetre

Albumin Faktori koagulacije Protrombinsko vreme

Serumska holinesteraza Ureja

Lipidi

Sinteza

23


1. Ispitivanje sintetske funkcije jetre • Senzitivan indikator sintetskog kapaciteta jetre • Svako sniženje aktivnosti CHE u odsustvu inhibitora i

genetskih uzroka reflektuje sintezu enzima u jetri • Serijsko merenje CHE ukazuje na prognozu kod pacijenta

obolelog od neke bolesti jetre • Praćenje funkcije jetre posle transplantacije jetre

24


2. Indikator trovanja insekticidima

• Paration, sarin, i tetraetilpirofosfat

• Radnici i hemijskoj industriji i u poljoprivredi

• Obe CHE su inhibirane

• Brži pad aktivnosti serumske holinesteraze

• Pad od 40% pre prvih simptoma

• Pad od 80% pojava neuromuskularnih efekata

• Davanje enzimskih reaktivatora

• Posle 3-5 dana povećanje CHE za 15 do 20%


3. Detekcija pacijenata sa atipičnom formom enzima

• Podložne produženom odgovoru na izvesne mišićne relaksanse koji se upotrebljavaju u hirurškim procedurama.

• Sukcinildiholin (suxametonium) i mivacurim lekovi se koriste u hirurgiji kao mišićni relaksansi i oni se hidrolizuju sa holinesterazom i njihov farmakološki efekat je normano prisutan dok teče hirurška intervencija.

• Kod pacijenata sa malom aktivnošću holinesteraze ili kod onih sa varijantom slabe aktivnosti, razgradnja leka se ne odvija dovoljno brzo i pacijenti mogu da uđu u apneju ili produženu paralizu respiratornih mišića. U tom slučaju je potrebno primeniti mehaničku ventilaciju sve dok se lek ne razgradi.

• Preoperativni skrining aktivnosti CHE se preporučuje u cilju identifikacije pacijenata kod kojih bi primena ovog leka dovela do komplikacija.

• Stepen osetljivosti na lek varira u zavisnosti od fenotipa pacijenta.

25


3. Detekcija pacijenata sa atipičnom formom enzima

• Najveća aktivnost je kod pacijenata homozigota sa uobičajenim alelom

• Progresivno je niža aktivnost kod pacijenata heterozigota i imaju jedan normalan i drugi alel neku varijantu.

• Homozigoti za neuobičajeni alel ili heterozigoti sa oba različita alela i oni koji imaju oba silent alela nemaju nikakvu aktivnost.

• Osobe heterozigoti koji imaju jedan uobičajen alel obično produkuju dovoljno dovoljno enzima da zaštite sebe od suksametonijumske aktivnosti, dok oni koji su heterozigoti ili homozigoti za neuobičajene varijante pokazuju različitu osetljivost.

• Fenotipovi koji su osetljiviji na apneju su:

• AA, AS, FF, FS, SS, AF i donekle UA.

• Merenje ukupne aktivnosti CHE i određivanje dibukainskog i fluoridnog broja je potrebno da bi se u potpunosti okarakterisali fenotipovi CHE.

26

27

Klinički značaj acetilholinesteraze

• Indikator trovanja insekticidima – organofosfatnim jedinjenjima

• Aktivnost se određuje u eritrocitima

• Određivanje aktivnosti ACHE u amnionskoj tečnosti

• Prisustvo ACHE kod defekta neuralne tube – spina bifida

28

Metode određivanja aktivnosti serumske holinesteraze

• Supstrati: – Soli joda acetiltioholina, propioniltioholina, butiriltioholina,

benzoiltioholina i sukciniltioholina

• Indikatorska reakcija – Oslobođeni tioholin reaguje sa

– DNTB – Elmansovim reagensom.

– 5,5’-ditio-bis(2-nitrobenzoat)

• Proizvod reakcije – 5-merkapto-2-nitro benzoik (5-MNBA)

– 410 nm

29

Određivanje aktivnosti holinesteraze sa butiriltioholinom kao supstratom i DTNB reagensom

Indikatorska reakcija

Merna reakcija

Elmansov reagens

30

Određivanje dibukainskog broja

• Kalow i Genest su koristeći kao supstrat benzoiltioholin ukazali na kvalitativne razlike holinesteraze.

• Prema osetljivosti na inhibiciju lokalnim anestetikom dibukainom oni su postavili metodu za jednostavnu identifikaciju osoba tj tipova holinesteraze uobičajeni, intermedijarni i atipični.

• Dibukainski broj – pri koncentraciji dibukaina od 10-5 mol/L

– uobičajena CHE je inhibirana 80 %,

– atipična svega 20 %

– heterozigoti sa normalnim i atipičnim alelom imaju 60 % inhibicije CHE.

• Za identifikaciju ostalih fenotipova koristi se natrijum fluorid.

31

Određivanje dibukainskog i fluoridnog broja

• Dibukainski broj DB ili fluoridni broj FB

1-enzimska aktivnost sa inhibitorom

DB = 100 X -------------------------------------------------

Enzimska aktivnost bez inhibitora

• Fenotipizacija holinesteraze zasnovana na određivanju

dibukainskog (DB) i fluoridnog (FB) broja

Zaključci:

• DB i FB ukazuju na procenat inhibicije

enzimske aktivnosti prema specifičnim

supstratima u prisustvu standardnih

koncentracija dibukaina i fluorida.

• Genotipizacija ovih mutacija bi

potvrdilo ove abnormalnosti CHE gena.

Fenotip DB FB UU ≥77 ≥ 55

UF 72-76 ≥53

UA 48-72 ≥44

AF 45-59 <44

FF 64-69 <44

AA <35 -

32

Referentne vrednosti

Biološki materijal

Metoda sa sukcinilditioholin/DTNB na 37oC Uobičajeni fenotip (UU) Ž 33 – 76 U/L M 40 – 70 U/L Heterozigoti (UA) medijana 22 U/L (opseg 5 do 35 U/L Homozigoti atipični (AA) medijana 1,5 U/L (opseg 1 – 4 U/L) Vrednost < 23 U/L se javljaju 5 x češće kod sukcinildiholin osetljivih osoba nego kod (UU)

Serum je uzorak izbora Enzimska aktivnost u serumu je stabilna nekoliko nedelja na 4oC nekoliko godina na -20oC. Blaga hemoliza ne smeta ukoliko je uzorak centrifugiran i uklonjene eritrocitne membrane

33

Uticaj starosti •Pri rođenju CHE je niža za 50 % nego kod odraslih

•Onda raste aktivnost od 3-6 godine i ona je za 30 % veća nego

kod odraslih.

•Posle 5 godine opada i stabilizuje se na nivo odraslih u

pubertetu.

•Značajno sniženje i do 30 % u toku trudnoće i ranog

puerperiuma se objašnjava hemodilucijom.

Health & Medicine

Holinesteraza 2014