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EFECTO DE LA ECLOSIÓN ASISTIDA EN RELACIÓN ALPORCENTAJE DE GESTACIÓN EN EMBRIONES CRIOPRESERVADOS

Effects of Assisted Hatching on the rates of gestation in cryopreservation embryos.

Mónica Dorado*, Maria Hebles**, Beatriz Migueles*, Mercedes González*; Pascual Sánchez**, Fernando Sánchez***Fundación Guadalquivir de Investigación Médica.**Clínica Ginemed, c/Farmacéutico Murillo Herrera, nº 3, 41010, Sevilla, España.ginemed@ginemed.com

RESUMEN: El objetivo del estudio es comprobar el efecto de la eclosión asistida con ácido Tyrode en embrionesdescongelados. Se estudiaron un total de 1224 parejas sometidas a ciclos de reproducción asistida.Observamos y evaluamos la calidad de los embriones descongelados en relación al número de embriones quesobreviven y el porcentaje de blastómeras lisadas de dichos embriones. Comparamos el porcentaje de embarazos enciclos de descongelados con y sin eclosión asistida. Aparecen diferencias significativas en el porcentaje deembarazos en el grupo de embriones que han sido sometidos a eclosión asistida (P<0,05), y también observamosuna mejor tasa de embarazos en transferencias con embriones de calidad inferior (supervivencia inferior al 60%)cuando son sometidos a eclosión asistida.

Palabras clave: eclosión asistida, Tyrode, criopreservación de embriones

SUMMARY: The objetive of this study is to evaluate the impact of embryos assisted hatching with Tyrode’s acid inthawed embryos. It was studied a total of 1124 couples undergoing infertility treatment. We observed and evaluatethe quality of thawed embryo in relation to the number of that survived, and the rate of blastomeres death. Wecompared the rate of pregnancies on thawed embryos cycles with and without assisted hatching. There were somesignificant differences between two group, we also detect a better rate pregnancy using assisted hatching when thesurvival is badly (surviving rate is less than 60%).

Key words: Assisted hatching, Tyrode, cryopreservation embryos

INTRODUCCIÓN

La baja tasa de implantación del em-brión humano es uno de los factores limi-tantes para las técnicas de reproducciónasistida (Bernabeu et al., 2004).

La estimulación ovárica en los tra-tamientos de fecundación in vitro(FIV) pretende conseguir un desarro-llo folicular múltiple para la obtenciónde varios óvulos y consecuentementeun número mayor de embriones. Estopermite una mayor selección de em-briones para transferir. Con este au-

mento en el número de embrionesrespecto a un ciclo natural, buscamosen parte solucionar el menor poderimplantatorio de los embriones cultiva-dos in vitro ( Ernest Hung Yu Ng et al.2005). Habitualmente se transfieren 2 ó3 embriones, quedando embrionespara congelar según criterios de cali-dad, como número de blastómeras,grado de fragmentación y ausencia demultinucleación. Los embriones crio-preservados y posteriormente descon-gelados tienen una tasa de implanta-

ción y embarazo disminuida con res-pecto a los mismos en fresco (Turckeret al. 1991).

Una de las causas de la disminu-ción de la implantación puede ser de-bida al endurecimiento de la zona pe-lúcida (ZP) ( Gabrielsen et al 2004),producido durante el proceso de con-gelación - descongelación. Otra causapuede ser la presencia de blastóme-ros lisados e intactos en un embrión

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tras la descongelación, este hechopuede afectar la viabilidad de los in-tactos y comprometer el desarrolloembrionario (Belil et al 2002).

Ernest Hung Yu Ng et al. 2005han planteado la eficacia de la eclo-sión asistida sobre la implantaciónembrionaria, especialmente en em-briones que han sufrido congela-ción-descongelación. Estudios in vi-tro con embriones humanos hanmostrado que una abertura en la ZPmejora significativamente capacidaddel blastocisto para eclosionar (DeVos et al. 2000).

Dos recientes meta-análisis (Edi-Osagie et al. 2003 y Sallam HN et al.2003) refieren que el hatching asis-tido (AH) incrementa el porcentajede implantación y embarazos, espe-cialmente en mujeres mayores o convalores aumentados de FSH. Tao yTamis 1997 mostraron un aumentosignificativo en el porcentaje de em-barazos con hatching asistido me-diante acido de tyrode en pacientescon pobre pronóstico, en mujeresmayores de 38 años y embriones demala calidad. Cohen et al. 1999 tam-bién documentaron un aumento sig-nificativo en ciclos de donación deóvulos.

El objetivo de este estudio escomparar el efecto del hatchingasistido en la implantación y des-arrollo de los embriones que hansido sometidos a procesos de con-gelación - descongelación.

MATERIAL Y MÉTODOS

Selección de pacientes

Se realizó un estudio observacio-nal retrospectivo que incluye 1224ciclos de transferencia de embrio-nes descongelados procedentes deciclos de ICSI y que fueron conge-lados en día +1 y/o día +2 en un úni-co centro. Todas las parejas con em-briones congelados fueron informa-das para poder participar en el estu-

dio.

Realizamos un estudio compara-tivo de las tasas de embarazo e im-plantación embrionaria obtenidas enciclos de embriones congelados ydescongelados de pacientes que hansido sometidos a hatching frente alos que no se les ha realizado hat-ching.

Programación del ciclo inicial deFIV-ICSI

Los ciclos de ICSI seleccionadosfueron realizados en protocolo cortotras un mes de reposo ovárico conanticonceptivos. Para supresión seutilizó análogos de la GnRH (aGnRH,Decapeptyl diario®) comenzando enel Día 2º del ciclo menstrual a dosisde 1/2 vial al día. Según los nivelesséricos de FSH, LH y estradiol, y enfunción de la edad de la paciente, sefijan las dosis de estimulación ováricacon hormona folículo estimulante(FSH, Gonal-F®) y Menotropina(Menopur®).

La administración de estos se indi-vidualiza de acuerdo al control ecográ-fico del ciclo. El criterio para la admi-nistración de la hormona gonadotró-fica humana (10.000 UI de hCG,Lepori®) es la presencia de la mayo-ría de la cohorte de folículos con 16o más mm. de diámetro. La adminis-tración de aGnRH y FSH se suspen-de le día de la administración de lahCG.

Las punciones se realizaron a las36 horas de la administración de lahCG por vía vaginal ecoguiada. Lamicroinyección se llevó a cabo entrelas 3 y 6 horas de la captación ovoci-taria. La fecundación se evaluó a las16-20 horas y la selección de em-briones a transferir a las 42-44 horas(día 2) o las 66-68 horas (día 3) ca-talogando los embriones según elnúmero de blastómeras, simetría detamaño y la cantidad de fragmentoscitoplásmicos.Procedimiento de congelación de

embriones

Todos los embriones excedentesfueron crioconservados con Freezenkit 1™ (Vitrolife) en pajuelas de 0,5mL (CryoBio System) en un congela-dor manual Nicool MS21 de AirLiquide. El congelador fue programa-do para bajar 2ºC/min desde unatemperatura de 25ºC hasta -6,9ºC.Tras esperar 8 min a esta temperatu-ra se realiza el seeding de forma ma-nual. A continuación el congeladorestá programado para bajar0,3ºC/min hasta llegar a -29,9ºCcuando la pajuela es depositada enel nitrógeno líquido a -196ºC y alma-cenadas en cantaras adecuadashasta su utilización.

Preparación para las transferenciasen ciclo de congelados

Tras comprobar por ecografíasque el endometrio era delgado, el día5º del ciclo se comienza con unasustitución de estrógenos en parches(ESTRADOT®) comenzando conparches de 50 y aumentando en fun-ción de la respuesta a nivel endome-trial hasta obtener una endometrioque sea anecógeno, en triple línea ypor encima de 7 mm de espesor en-tre ambas capas. Durante todo eltiempo de tratamiento con estróge-nos se suplementa con AAS (AAS-100®) y se valora el flujo sanguíneoal útero. Los ciclos en los que hay unSOPQ la paciente se encuentra entratamiento con Metformina(Diamben 850®) con una o dos pas-tillas al día en función de tolerancia yde forma continua. En el caso de queen el Doppler que se hace de rutinaen la arteria uterina el flujo sea dis-continuo se añade un tratamientocon Pentoxifilina (HEMOVAS 400®)

Cuando el endometrio está listo(mayor de 7 mm en triple línea yanecógeno), se prepara para latransferencia de los embriones: seadministran por vía vaginal dos com-primidos de progesterona(Utrogestan 200mg®) cada 12 horas

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con un total de 800 mg al día. Se co-mienzan a administrar 3 días antesde la transferencia. El tratamientocon estradiol y progesterona se man-tiene igual hasta el día de la _-hCG(dos semanas) y si ésta es positiva semantiene hasta la semana 12 de em-barazo.

Todas las pacientes se suplemen-tan con ácido fólico a partir de latransferencia de los embriones.

Procedimiento de descongelación

Se procede a la extracción de laspajuelas de congelación y se eliminael exceso de nitrógeno de la pajuela.Se deja unos 30 segundos a tempe-ratura ambiente y se pasa al baño térmi-co a 30ºC otros 30 segundos. Después,pasamos los embriones por cada uno delos medios secuenciales de Thaw-kit1™ (Vitrolife) preparados en placasNunc™ para eliminar el crioprotector.

Una vez terminado el proceso dedescongelación se pasan los embrio-nes a la placa de cultivo hasta el mo-mento de la transferencia.

El protocolo de descongelaciónse lleva a cabo en función del día enque se congelaron los embriones: Sila congelación se hizo en pronúcleosla descongelación se realiza dos díasantes de la transferencia y si fue reali-zada en día +2, el día de antes de ladescongelación.

Una vez descongelados se verifi-ca la calidad de los embriones y deacuerdo con el protocolo se realizahatching asistido.

La transferencia se realiza aproxi-madamente una hora después dehaber realizado el hatching. El nú-mero de embriones transferidos va-ría de 1 a 3 en función de la calidad.Todas las transferencias fueron reali-zadas con medio G2™ version 3 deVitrolife y catéter de Gynetics®.

Procedimiento de AH

Los embriones que iban a sertransferidos fueron colocados en mi-crogotas de 25 µm de Oocyte WashBuffer (Cook) de forma individualbajo aceite mineral de Cook® . Parallevar a cabo el procedimiento se uti-lizó una placa Falcon 1006 (BectonDickinson, Dinamarca).

La pipeta Holding (20 µm) y la dehatching (9-10 µm) eran proporcio-nadas por Humagen. El control de sali-da del ácido de Tyrode (Medi-Cult) ha-cia la zona pelúcida era llevado a cabocon un microinyector (Narishige,Dinamarca).

Para la realización del hatchingse realizó un orificio de 30 µm dediámetro. Una vez efectuado, elembrión se llevó al otro lado de lagota para liberarlo del ácido. A con-tinuación fue pasado a la placa dedoble pocillo (Falcon 353037) enmedio Blastocyst (Cook) para laposterior transferencia. Se utiliza-ron 2 microinyectores Narishige enuna placa calefactora a 37ºC en unmicroscopio de contraste de faseNikon con óptica de Hoffman.

Análisis estadístico

La comparación estadística fuellevada a cabo mediante el test deStudent, test de Chi-Cuadrado ytest de ANOVA. Consideramos queexisten diferencias significativascuando se obtienen valoresP<0,05.

La edad media de las pacientesentre el grupo control (grupo al queno se realizó el AH) y el grupo estu-dio (grupo con AH) fue comparadautilizando el test de Student.

El embarazo clínico fue definidopor la presencia de 1 o más sacosde gestación. Para analizar la tasade embarazo entre ambos gruposse utilizó el test de ANOVA y el test

de Chi-cuadrado.

RESULTADOS

Los datos del presente trabajofueron obtenidos en el periodocomprendido entre Abril del 2003 yAbril 2006. Durante este tiempo serealizaron un total de 1224 ciclosde descongelación, de los cuales a590 ciclos se les practicó el hat-ching asistido (grupo estudio) y a634 ciclos no les fue practicado (gru-po control). Debido al proceso dedescongelación 61 ciclos fueron ex-cluidos por la no supervivencia de losembriones entre ambos grupos.

Nosotros comparamos 1726 em-briones a los que se les realizó AHen 590 transferencias con el grupocontrol de 1862 embriones en 634transferencias a los que no se les re-alizó. Los embriones no fueron da-ñados durante el procedimiento. Laedad de las mujeres en el momen-to de la aspiración de los ovocitosfue similar (33,32 frente a 33,17años). No existen diferencias en elnúmero previo de ciclos, respuestaovárica y número de ciclos de des-congelados.

La media de embriones transfe-ridos en el grupo estudio y grupocontrol fue de 2,92 y 2,93 respecti-vamente.

Consideramos embarazo cuan-do se observa en la ecografía latidofetal. Como muestra la tabla I exis-ten diferencias significativas entreambos grupos en el porcentaje deembarazo global 116 (19,66 %) fren-te a 101 (15,93 %). La tabla II com-para el porcentaje de embarazos enrelación a la tasa de supervivencia dela cohorte de embriones descongela-dos.

En esta tabla también observamosun mayor porcentaje de embarazoscuando realizamos hatching en embrio-nes que tienen una tasa de superviven-cia menor del 60%, en concreto 20

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Tabla I: Comparación de ciclos con y sin hatching

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(15,38%) frente a 8 (6,35%).

DISCUSION

La transferencia de embriones quehan sufrido un proceso de congelación-descongelación arroja una tasa de em-barazo menor que con la transferenciade embriones en fresco, incluso tratán-dose de embriones de igual calidad(Gabrielsen et al., 2004).

Como se ha comentado anteriormen-te, esto puede ser debido, entre otrascausas a una degeneración de blastóme-ras y a un endurecimiento de la zona pe-lúcida.

Turcker et al. (1991) explicaron quela reducción de implantación en ciclos deFIV-ET puede ser debido al endureci-miento de la zona pelúcida. Para embrio-nes tanto frescos como descongelados elcultivo in vitro puede llevar a un endure-cimiento de la zona pelúcida (Cohen etal., 1990)

En nuestro estudio hemos observadoque con la transferencia de 2 embrionesde calidad a los que se les practicó el hat-ching obtenemos tasas de embarazoequiparables a la transferencia de 3 em-briones de calidad; por tanto, podríamosdisminuir el número de embriones atransferir, bajando así la probabilidad deembarazo múltiple.

La tasa global de embarazo entre am-bos grupos muestra diferencias significa-tivas cuando realizamos el AH.Observamos que hay una tendencia auna tasa de embarazo mayor tras latransferencia de embriones a los que seles practicó el AH cuando no todos losembriones son de buena calidad, con locual estaría justificada su realización.

Gabrielsen et al. (2004) obtienenunos resultados que apoyan nuestro es-tudio. A pesar de ello, Al-Nuaim y Jenkins(2002) concluyeron que es inapropiadala realización por rutina por no existir evi-dencias del beneficio en embriones debuena calidad.

Cuando la tasa de supervivencia de losembriones descongelados es baja (<60%)

es aconsejables la realización del AH,pues observamos una diferencia significa-tiva entre ambos grupos, favorables al gru-po al que se le practicó el AH.

En conclusión, el AH con ácido deTyrode mejora considerablemente enembriones descongelados en transferen-cias en las que no todos los embrionesson de buena calidad. Hemos paliado lamala calidad embrionaria con la aplica-ción del AH consiguiendo las mismas ta-sas de embarazo que embriones de bue-na calidad.

En descongelaciones en las que latasa de supervivencia es menor del 60%también es recomendada su aplicaciónya que mejora significativamente la tasade embarazo.

Cuando la transferencia se lleva acabo con embriones de buena calidadno se observa un incremento en la tasade embarazo, por lo tanto no está justifi-cada su realización por rutina. La reali-zación del AH selectivo mejora la tasa degestación respecto a realizarla a todoslos embriones.

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