El diagnóstico definitivo de la mayoría de las micosis requiere el aislamiento e identificación del hongo a partir del cultivo.El objetivo fundamental de la utilización de los medios de cultivo es optimizar el crecimiento de los microorganismos. Segun su composición, los medios de cultivo puede ser:generales enriquecidosselectivosdiferencialesespecializados

Generales El más característico y clásico es el Agar Dextrosa de

Sabouraud (SDA) utilizado para el aislamiento de hongos a partir de muestra clínicas y para su identificación.

Enriquecidos Se utilizan especialmente en micosis sistémicas endémicas

(histoplasmosis, paracoccidioidomicosis, etc.), un ejemplo es el agar infusión cerebro-corazón (BHIA).

Selectivos Son medios que favorecen el aislamiento de los microorganismos deseados impidiendo el de otros. Se utilizan con antibacterianos (cloranfenicol, gentamicina, penicilina, estreptomicina) y/o antimicóticos, (cicloheximida). Utiles en micosis cutáneas y sistémicas.Diferenciales Ayudan a la identificación del hongo basada en la apariencia de éste en dicho medio, gracias a la adición de determinados componentes (sustancias cromógenas, o indicadores de pH).

DTM para Dermatofitos, CHROMagar Candida.

EspecializadosSon aquellos medios que contienen algún componente destinado a aislar e identificar un agente concreto (semillas de girasol Guizotia abyssinica para (Cryptococcus neoformans) o a favorecer la identificación de ciertas especies (medio de Czapeck para las especies de Aspergillus).

Agar Dextrosa de Sabouraud, (SDA)Agar Infusión cerebro-corazón (BHIA) con o sin sangre de

cordero al 5%, con o sin antibacterianosAgar inhibidor para mohos (MIA)Mycosel/Mycobiotic(antibacterianos/cicloheximida)Agar Dextrosa de Papa (PDA). Agar agua Los hongos también pueden crecer en medios no

selectivos, incluidos la mayoría de los medios bacteriológicos, si se incuban el tiempo suficiente.

Agar de Urea: se utiliza para diferenciar entre levaduras e identificar diferentes especies de Trichophyton.

Agar de harina de maíz (“Corn Meal Agar”): Suplementado con Tween 80: para diferenciar

distintas especies de Cándida y para realizar subcultivos ya que estimula la esporulación de hongos miceliales.

Suplementado con 10 gramos de Glucosa: para diferenciar el Género Trichophyton

1 - Detección de la presencia del hongo

Examen directo

Examen histológico

2 - Cultivo

3 - Identificación

- No existen métodos rápidos, miniaturizados ni automatizados

- Ni tests nutricionales y fisiológicos que nos permitan identificar la mayoría de especies

—— IDENTIFICACIÓN ——

- Se pleomorfiza con facilidad - Esporulación escasa

MEDIOS DE CULTIVO USADOS EN CLÍNICA(agar de Sabouraud, agar glucosado de patata, ....)

Ricos en Nutrientes

Dificulta el diagnóstico micológicoDificulta el diagnóstico micológico

CULTIVO PUROCULTIVO PURO

Medios de cultivo adecuados:Medios de cultivo adecuados:- estimular la esporulación- estimular la esporulación- desarrollar estructuras fértiles similares a las que presenta en la - desarrollar estructuras fértiles similares a las que presenta en la naturalezanaturaleza- producir pigmentos- producir pigmentos- determinar tasas de crecimiento - determinar tasas de crecimiento ........

MEDIOS DE CULTIVO PARA:Estimular la esporulacion:

Agar patata zanahoria Agar harina de avena Agar V8 Agar harina de Maiz

Tasa de crecimiento y produccion de pigmento Agar patata dextrosa Agar Harina de avena

Identificacion de especies (Fusarium) Agar nutritivo sintetico Agar hojas de clavel

Identificacion de especies (Aspergillus y Penicillium) Agar extracto de malta al 2% Agar Czapek Dox

— INCUBACIÓN —

Condiciones estandar para un patógeno Condiciones estandar para un patógeno oportunista:oportunista:

Temperatura: 24-28ºC

Luz: - oscuridad- 12h UV / 12h oscuridad

CARACTERES MACROSCÓPICOS (diámetro de la colonia, color, textura...)

CARACTERES MICROSCÓPICOS(morfología de las hifas, de las estructuras fértiles....)

IDENTIFICACIÓNIDENTIFICACIÓNGenéroEspecie

ESTUDIO DE LOS CARACTERES MICROSCÓPICOS

PREPARACIONES DIRECTAS

MICROCULTIVO

—— IDENTIFICACIÓN DE ESPECIES IDENTIFICACIÓN DE ESPECIES ——

Preparaciones Directas Líquidos de MontajePreparaciones semipermanentes:

Lactofenol

Lactofenol-Azul Algodón

Ácido Láctico al 85

Ácido Láctico- Azul Algodón

Preparaciones permanentes:

Alcohol Polivinilo

Preparaciones con cinta adhesiva

MICROCULTIVO: preservar las estructuras frágiles

El hallazgo de un hongo en sangre certifica el diagnóstico de una micosis invasora;Sin embargo, el hemocultivo presenta baja sensibilidad y en general su positividad no supera el 50 % en pacientes con candidiasis invasorasLos hongos filamentosos, aun cuando invadan tejidos son difíciles de encontrar en sangreSe debe diferenciar los contaminaciones de los hongos filamentosos y levaduriformes de las verdaderas micosis invasoras

Botellas de hemocultivo del sistema

automatizado BacT/Alert ® (OrganonTeknika Corp.).

Botellas de hemocultivo del sistema

automatizado BACTEC ® (OrganonTeknika Corp.).

Botellas de hemocultivodel sistema automatizado

Vital® (bioMérieux-Vitek).

Tubos Isolator1,5® (pediátrico) e Isolator10® del sistema lisis-centrifugación(Oxoid).

Crecimiento en CHROMAgar :Candida de C. albicans (verde) C. tropicalis (azul), C. krusei (rosa y rugosa), C. parapsilosis (rosácea-lisa) Prototheca wickerhamii (crema, flecha).

Cultivo mixto de Cryptococcus neoformans y Candida albicans en Medio Staib (Agar de Staib (Guizotia abyssinica, Agar semillas de alpiste) mostrando el color marrón de las colodias de C. neoformans.

Prueba de la fenol-oxidasa (Medio de TOC). Producción de pigmento marrón oscuro por C. neoformans.

C. glabrata C. parapsilosis C. albicans

Geotrichum sp C. tropicalis Trichosporon sp.

C. krusei C. norvegensis TODAS

CHROMAgar. Levaduras del género CHROMAgar. Levaduras del género CandidaCandida

a bc

d

a,b,c. Levaduras género Candida.

d. Levaduras género Cryptococcus

• No todos los hongos tienen capacidad para producir una micosis invasora del tracto respiratorio inferior, por lo que hay que evaluar especialmente los aislamientos de aquellos hongos que con mayor frecuencia se han visto implicados en procesos clínicos.• El aislamiento de :

A. fumigatus o A. flavus en una muestra respiratoria de un paciente leucémico y/o neutropénico tiene un alto valor de infección fúngica invasora.

• La gravedad y agresividad de una mucormicosis pulmonar justifica siempre informar de la presencia de un mucoral en una muestra respiratoria correctamente procesada.• La corticoterapia prolongada es por sí sola un importante factor de riesgo para desarrollar una aspergilosis invasora.

El aislamiento de :C. neoformans en una muestra respiratoria es

indicativo de criptococosis pulmonar o de infección sistémica Scedosporium apiospermum y S. prolificans pueden

dar lugar a micosis pulmonares invasoras clínicamente indistinguibles de la aspergilosis.

La fusariosis pulmonar suele deberse a diseminación hematógena en un cuadro sistémico y, en más del 50% de los casos, cursa con hemocultivos positivos.

La especies del género Candida rara vez dan lugar a micosis pulmonares invasoras, si no es en pacientes terminales, estando presentes en las secreciones respiratorias del 20% de la población sana y en más del 50% de los pacientes que han recibido antibioticoterapia.