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Caractérisation de l’écosystème broncho-pulmonaire chez les patients atteints de mucoviscidose : Structure et
Dynamique du microbiote pulmonaire dans l’évolution clinique de la mucoviscidose
1BDEEP-EA4547, CIIL – Institut Pasteur Institute de Lille, CHRU - Faculté de Pharmacie, Lille ; 2LMGE-ULCO Laboratoire d'Océanologie et de Géoscience, Wimereux, 3CHRU de Lille, 4CHU de Nice,
5Département de microbiologie, APHP Créteil - France.
L. Delhaes1-3, M. Chabé1, S. Monchy2, J. Salleron3, S. Leroy3-4, A. Prévotat3, B.Wallaert3, E. Dei-Cas1-3, E. Viscogliosi1, F Botterel5
Introduction
Fonction respiratoire : Enjeu de demain en santé publique- Troubles respiratoires: 1er motif de consultation dans le monde- BPCO: 4ème cause de décès dans le monde en 2030 selon l’OMS
- Asthme: constante augmentation [↑ prévalence de 7,3% à 8,4% - 2001-10 aux USA] - Mucoviscidose: Maladie génétique la + fréquente chez les caucasiens
(CHU de Rouen)
Rabe et al. « The year of the lung ». Lancet 2010 Akinbami et al. NCHS Data Brief , 94 -May 2012
-Diversité microbienne au niveau pulmonaire = Microbiote [Beck et al. 2012; Erb-Downward et al. 2011; Huang et al. 2011]
-Dans la mucoviscidose, cette communauté poly-microbienne semble être un élément clé dans l’évolution de la fonction respiratoire [Goddard et al. 2012; Madan et al. 2012; Fodor et al. 2012; Maughan et al. 2012; Guss et al. 2011; van der Gast et al. 2011; Rogers et al. 2010; Armougom et al. 2009; Bittar et al. 2008; Sibley et al. 2008; Tunney et al. 2008; Harris et al. 2007]
Fonction respiratoire : Enjeu de demain en santé publique- Troubles respiratoires: 1er motif de consultation dans le monde- BPCO: 4ème cause de décès dans le monde en 2030 selon l’OMS
- Asthme: constante augmentation [↑ prévalence de 7,3% à 8,4% - 2001-10 aux USA] - Mucoviscidose: Maladie génétique la + fréquente chez les caucasiens
Introduction
(CHU de Rouen)
Rabe et al. « The year of the lung ». Lancet 2010 Akinbami et al. NCHS Data Brief , 94 -May 2012
Quel(s) champignon(s) à l’étage pulmonaire ?
Mucoviscidose:
Introduction
Notion de co-colonisationco-infection pulmonaire
Objectif : Quel microbiote pour quel patient dans la mucoviscidose ?- Micromycètes+++- BactériesLe microbiote pulmonaire d’un patient
CF est-il stable dans le temps ?
La diversité et la richesse du microbiote pulmonaire est-elle associée à l’état
clinique du patient CF ? …⇒ Déterminer la structure/composition de la communauté microbienne
en utilisant les approches de séquençage haut-débit
Quel(s) champignon(s) à l’étage pulmonaire ?
Extraction d’ADN dépendante de la matrice
PCR ciblant des gènes conservés pour amplifier des espèces phylétiquement éloignées
(V3 du 16s rDNA – ITS2)
Séquençage massif (multi-parallélisé) - obtention de plusieurs centaines de milliers de séquences
Analyse bio-informatique Identification par comparaison à 2 banques de données
(BLASTN ≠ Silva SSU rRNA database release 102 et ≠ ITS2dbScreen (création de novo)
Assignement et regroupement des séquences (attribution à espèce/genre)
Permettant une interprétation biologique (comparaison de diversité grâce au logiciel MEGAN)
Stratégie méthodologique
Mucoviscidose Expectoration
- Pyroséquençage (454 FLX)
-326 277 pyroséquences /450-500 bp (93%) [V3 du 16s rDNA] -133 317 pyroséquences /300-450 bp (85%) [ITS2]
-Courbes de raréfaction ayant une distribution en plateau = bonne représen-tativité de la composition bactérienne et fongique
Résultats et Discussion
- 8 expectorations - 4 patients
Quel microbiote pour quel patient dans la mucoviscidose ?
Quel microbiote pour quel patient dans la mucoviscidose ?
Résultats et Discussion
Diversité bactérienne
Diversité fongique
Relation entre communauté microbienne / évolution clinique
Quel microbiote pour quel patient dans la mucoviscidose ?
Résultats et Discussion
Diversité bactérienne
Patient 2Mars 2008
Mars 2009
Confirmation la diversité bactérienne récemment décrite:
- Importance des anaérobies, des Pseudomonas, Streptococcus, Haemophilus, = genres majoritaires
Médiane [IQ] du nombre de bactéries = 6.5 [5; 13.5] (espèces/genres)
[Goddard et al. 2012; Madan et al. 2012; Fodor et al. 2012; Maughan et al. 2012; Guss et al. 2011; van der Gast et al. 2011; Rogers et al. 2010; Armougom et al. 2009; Bittar et al. 2008; Sibley et al. 2008; Tunney et al. 2008; Harris et al. 2007; Rogers et al. 2004].
Quel microbiote pour quel patient dans la mucoviscidose ?
Résultats et Discussion
Diversité fongiquePatient 2
Parmi les 24 espèces /genres de micromycètes identifiés par pyroséquençage, seuls 4 étaient aussi isolés en culture.
Mars 2008
Mars 2009
Quel microbiote pour quel patient dans la mucoviscidose ?
Résultats et Discussion
Diversité fongiquePatient 2
Mars 2008
Mars 2009
Médiane [IQ] du nombre de champignons par expectoration = 3.5 [3; 7.5] (espèces/genres) [Bouchara et al. 2009]
Patients 2
Pat. 3 (09/2007)
Patient 1 (01/2008)
Patient 4 (10/2008)
Pat. 3 (09/2008)
Patient 1 (01/2009)
Patient 4 (08/2008)
Richesse fongique (Chao1 index)
Richesse Bactérienne(Chao1 index)
S-K score= Score de Shwachman-Kulczycki
Indice de Masse corporelle (kg/m2)
Corrélation entre indexes de Chao1 (fongiques / bactériens) et S-K score et BMI (p<0.05).
Conforme aux données publiées pour les bactéries [van der Gast et al. 2011; Klepas-Ceraj et al. 2010].
Quel microbiote pour quel patient dans la mucoviscidose ?
Résultats et Discussion
Relation entre communauté microbienne / évolution clinique
% Capacité Ventilatoire Forcée (CVF)
VEMS1
Pat. 3 (09/2007)
Pat. 3 (09/2008)
Patient 1 (01/2008)Patient 1 (01/2009)
Patient 4 (10/2008)Patient 4 (08/2008)
Patients 2 (03/2008)
Patients 2 (03/2009)
Association entre indexes de Chao1 fongiques & bactériens et VEMS1, CVF (p<0.05)
Quel microbiote pour quel patient dans la mucoviscidose ?
Résultats et Discussion
Relation entre communauté microbienne / évolution clinique
Etude modeste (8 expectorations) mais prometteuse
Conclusion et Perspectives
Delhaes et al. PloS One 2012 ; 7 (4): e36313
⇒ Dans la mucoviscidose, composition du mucus = conditions favorables pour des co-infections chroniques :- Réduction de la tension en O2 favorise la croissance de P. aeruginosa, des anaérobies dont SMG, mais aussi de C. albicans et A. fumigatus-Capacité à former des biofilms, avec des interaction entre microorganismes
[Rybtke et al. 2011; Bandara et al. 2010; Mowat et al. 010; Sibley et al. 2008; Alvarez-Ortega et al. 2007; Dimitru et al. 2007; Semighini et al. 2006]
⇒ Microbiote (F/B) = évènement dynamique, indicateur de l’état clinique du patient ?
⇒ «Ecologie et dynamique des communautés microbiennes dans les expectorations des patients atteints de mucoviscidose sous ATB-thérapie: étude prospective multicentrique française par séquençage à haut débit » Projet C20120600697- F Botterel & L Delhaes -2013-14
Institut Pasteur-Lille / Université de Lille 2• Dr. Laurence Delhaes ([email protected])• Dr. Eric Viscogliosi • Dr. Emilie Fréalle• Dr. Eduardo Dei-Cas• Dr. Magali Chabé
Université Littoral Côte d’Opale
• Dr. Sébastien Monchy
• Dr. Christine Hubans• Dr. Stéphanie Ferreira
Faculté de Médecine de Lille
• Dr. Julia Salleron• Dr. Sylvie Leroy• Dr. Anne Prévotat•Dr. Fréderic Wallet•Dr. Benoit Wallaert
• Dr. Télesphore Sime-Ngando
Université Blaise-Pascal-Clermont-ferrand
Société Genoscreen-Lille
Remerciements