Isolamento  DNA  e  Análises  Gené2cas  

Agradecimento  Especial:  Maribel  Funes-­‐Huacca,  PhD  

CFBio  –  Isol.  &  Pur.  Biomoleculas  

Tipos  de  DNA  

•  Eucariontes;  Ø DNA  nuclear;  Ø DNA  mitocondrial;  

Ø DNA  cloroplasto;  

•  Procariontes;  Ø DNA  bacterial;  Ø DNA  plasmidial;  

 Estrutura  de  DNA  

     •  DNA  =  Acido  Desoxyrribonucleico  

•  Carrega  informação  genética  •  Presente  ao  longo  do  

cromossomo  •  Hélice  Dupla  fita  •  ConsJtuído  de  nucleoLdeos  

•  Molécula  açúcar  •  Grupo  fosfato  •  Base  nitrogenada  

Alfabeto  do  DNA  

Quatro  Bases:      A  =  Adenina        G  =  Guanina        C  =  Citosina        T  =  Timina  

Pares  de  bases  complementares:  

   A  =  T      G  ≡  C  

DNA  Mitocondrial  

•  Mitocôndria    –  Localizada  for  a  do  núcleo;  –  >100,000  em  cada  célula;    

•  mtDNA  análise  –  Quando  o  DNA  nuclear  não  é  disponível;  – Mais  sensível,  maior  tempo  de  análise  e  custo;  –  Duas  regiões  altamente  variáveis  são  analisadas:  

•  HV1  e  HV2    

 

mtDNA  

Vantagem:  UJliza  pequenas  quanJdades  de  DNA  existe  tanto    mtDNA  quanto  mais  do  que  uma  cópia  por  célula;  

Desvantagens:  Herança  Materna,  onde  a  mãe  e  todos  os  filhos  terão  perfis  próximos;  

Degradação  de  DNA  

             Principal  ponto  de  degradação  (depurinação);                Degradação  oxidaJva;                Degradação  hidrolíJca;  

•   Hidrólise  química;  •   Hidrólise  enzimáJca;  ü     Exonucleases  (terminais    5’,  3’);  ü     Endonucleases  (DNAse  I)  

ESTRUTURA  DO  RNA  

Ø     Fita  única  de    ácido  ribonucléico.  Ø     As  unidades  monoméricas  são  consJtuídas  de:  

•     Uma  base:  Adenina,  Citosina,  Guanina  e    URACILA;  

•     Um  açúcar:  RIBOSE;  

•     Um  grupo  fosfato.  

Estrutura  de  RNA  

Fundamentos  de  Extração  de  DNA  

•  Aplicações  de  DNA    

Ø   DiagnósJco;  Ø   Medicina  (estudo  de  câncer;  idenJficação  doenças);  Ø   Processos  evoluJvos  (filogenias,  estudos  populacionais);  Ø   Genoma;  Ø   InvesJgações  forenses,  paternidade  

Extração  de  DNA  

•  Passos  principais:    Ø  Lise  das  membranas  plasmáJcas  e  nucleares;  Ø  Degradação  de  proteínas;  Ø  Purificação  do  DNA  

Extração  de  DNA  

•  Lise  de  membranas  e  degradação  de  proteínas  Ø A  lise  é  através  de  tampão  de  extração,  contendo  SDS,  EDTA,  DTT,  e  mais  agentes  tamponantes.  O  uso  da  Proteinase  K  para  degradação  das  Proteínas  (rapidamente  inaJva  as  nucleases,  que  degradam  o  DNA);  

Ø   A  membrana  é  solubilizada  por  agentes  que  rompam  associações  hidrofóbicas,  destruindo  a  bicamada  lipídica  e  desnaturando  as  proteínas;  

Extração  de  DNA  

•  Extração  em  solventes  orgânicos;  •  Purificação  de  DNA  (eliminação  de  resíduos  orgânicos);  Molécula  de  DNA  não  é  solúvel  em  álcool  (isopropanol  ou  etanol),  precipitando  em  meio  alcoólico  e  peleJzado  por  centrifugação;  

Ressuspenção  de  DNA  em  tampão  pH=7,4,  contendo  RNAse  para  degradar  o  RNA;  

•  Conservação  de  DNA  Estocagem  de  DNA  a  temperaturas  menores  de  -­‐20  °C,  evitando  descongelamentos  sucessivos;  

Métodos  de  Extração  

•  Fenol  /  clorofórmio;  •  Chelex;  •  IsoJocianato  de  Guanidina;  •  Minicolumnas  ;  •  Kits  Comerciais  com  sílica;  

       

Extração  de  DNA  

•  Pre-­‐tratamento  de  Amostras:  Ø Material  Vegetal  (calos,  folha,  plântula):  trituração  em  N2  liquido,  digestão  em  tampão  CTAB,  β-­‐mercaptoetanol,  EDTA;  

Ø Tecido  animal  e  fluído  biológico:  digestão  em  tampão  Tris-­‐EDTA,  SDS,  NaCl,  DTT  e  proteinase  K;  

Ø Osso  e  dente:  trituração  em  N2  liquido,  descalcificação  e  lavagem  com  EDTA  0,5M,  digestão  em  SDS,  NaCl,  DTT  e  proteinase  K;  

Ø Microorganismos:  Lavar  e  centrifugar  em  tampão  PBS  1X  antes  da  digestão  em  tampão  de  extração  (Tris-­‐EDTA,  SDS,  NaCl,    e  proteinase  K);  

Extração  Orgânica  de  DNA  

•  Fenol:  desnaturação  das  proteínas  de  maneira  eficiente,  remove  as  partes  orgânicas;  

•  Fenol:Clorofórmio:  eficiente  para  desproteinizar  e  sua  ação  se  fundamenta  na  propriedade  hidrofóbica  das  proteínas  que  apresentam  afinidade  por  solventes  orgânicos;  

•  Clorofórmio:  reJra  resíduos  de  fenol;    

Extração  Orgânica  de  RNA  

•  A  principal  preocupação  na  extração  de  RNA  consiste  na  sua  degradação  por  ribonucleases  (RNAses),  que  são  enzimas  extremamente  resistentes  a  vários  tratamentos,  inclusive  térmicos  (fervura,  autoclavagem  etc.);    

•  DEPC  (dieJlpirocarbonato):  diminuir  a  contaminação  com  RNAses  das  soluções,  equipamentos,  vidrarias  e  reagentes;  Bons  cuidados:  pipetas,  vidraria,  luvas.    

•  Extração  usa:  TRIZOL  consiste  num  reagente  pronto  para  o  uso  no  isolamento  de  RNA  total  de  células  e  tecidos;    

•  DNAse  I;  O  RNA  total  é  livre  de  contaminações  por  DNA  ou  proteínas    

Extração  de  DNA  em  amostras  forenses  

•  Tipos  de  amostra  de  DNA  Ø Sangue/saliva,  Urina  Ø Sêmen  Ø Tecido  Ø Osso    Ø Cabelo  Ø Marcas  e  pontas  de  cigarro;  Ø  Impressões  em  armas  de  fogo;  

Coleta  e  Preservação  de  Evidencias  de  DNA  

•  Antes  de  qualquer  coleta;    Ø Anotações,  rotular,  fotografias;  

•  Uso  de  Luvas  de  látex!!  

•  Não  sacolas  de  plásJco!!    Sacos  de  papel  ou  mini-­‐sacolas  com  boa  circulação  de  ar;  

 •  Luz  e  calor  são  inimigos  dos  DNA!    Refrigerar  amostras.  

Coleta  e  Referência  de  DNA  

•  Swab  Bucal  

Exemplo  de  extração  de  DNA  em  resíduos  de  sangue  

•  Mancha de sangue (3mm x 3mm) colocada em microtubo 2mL;

1.  Acrescentar tampão de extração:

(10mMTris,0,1MNaCl, 40mM DTT, 10mM EDTA, 2% SDS);

2.  Sais e detergentes ajudam solubilizar os componentes da célula; DTT reduz e quebra ligações disulfeto (entre cisteínas na proteína);

3.  Digerir proteínas com proteinase K

Extracão  de  DNA  

7)  Proteínas  são  separadas  na  interfase;  

8)  Fase  aquosa  é  removida  e  o  DNA  isolado  por    microcolunas  (microcon)    ou  precipitação  em  etanol;  

9)  Estocagem  em  água  ou  tampão  TE;  

4.  Fenol/Clorofórmio/Álcool  isoamílico  (25/24/1)  até  formar  uma  solução  turva;  

5.  Centrifugar  até  formar  duas  fases  (13000rpm);  6.  Fase  aquosa  conterá  DNA-­‐proteínas,  lipídeos;  

e  outros  interferentes  hidrofóbicos  ficarão  na  fase  orgânica;  

Fase aquosa (DNA)

Interfase (proteínas) Fase Orgânica (lipídeos)

Extracão  em  Chelex®  100  Ø  Chelex  é  uma  resina  de  intercâmbio  caJônico  uJlizado  para  análise  de  PCR.  Testes  demonstraram  ter  rendimento  elevado  em  6  X  do  que  a  extração  fenol-­‐clorofórmio;  Ø   Procedimento  onde  não  são  realizadas  digestão  de  proteínas  e  extração  de  DNA;  

Chelex  ®  100  

•  Resina  Chelex  é  um  copolímero  divinilbenzeno  esJreno  contendo  pares  iônicos  iminodiacetatos;  •     SeleJvidade  por  cáJons  divalentes  são  muito  mais  altos  do  que  cáJons  monovalentes  (~5000  a  1);  •     Suspensão  5%  tem  pH  entre  10  e  11.    

Vantagens  do  Chelex:  • Processo  simples  realizado  só  em  um  microtubo;  • Combinação  de  suspensão  alcalina  e  ebulição  quebra  a  membrana  celular  liberando  o  DNA;  • Os  metais  fortemente  quelantes  os  removem  da  suspensão  celular  .  Removendo  inibidores  hemo  e  também  outros  cá2ons  divalentes,  os  quais  catalisam  a  quebra  enzimá2ca;

Extracão  Chelex  Procedimento:  1. Amostra  (sangue)  suspendida  em  Chelex  5%  e  incubar  por  30min  a  56  °C;  2. Levar  a  ebulição  por  8min,  este  procedimento  lisa  as  células  e  precipita  hemoglobina;  3. Centrifugar  amostra,  e  uma  alíquota  do  sobrenadante  é  uJlizada  para  analise  de  PCR,  4. As  esferas  de  intercambio  iônico,  proteínas  desnaturadas  e  outros  interferentes  serão  precipitados.  

Suspensão  de  Chelex   Ebulição  de  amostra  em  Chelex  

Método  de  Extração  em  Fase  Solida  •  Esferas  de  vidro  ou  sílica  inseridas  em  membranas  Ø IsoJocianato  de  guanidina  e  Cl-­‐,    NaI  ou  NaClO4  

Ø Altas  concentrações  são  usadas  sob  condições  ácidas  para  quebrar  ligações  entre    moléculas  de  água  &  DNA;  

Ø O  DNA  é  absorvido  no  vidro  ou  membrana;    

Ø Teor  do  sal  é  reduzido  ,  e  em  meio  alcalino,  o  DNA  é  liberado    do  vidro    e  se  tornando  negaJvo;  

Membrana  de  sílica  

Separação  de  DNA  por  Adsorção  em  Sílica  

Mecanismo de adsorção de DNA em sílica

Extração  AutomaJzada  de  DNA  

•  Nova  tecnologia  com  parLculas  magnéJcas  (DNA  IQ®  Promega)  para  amostras  forenses;  

•  Lise  de  células  com  agentes  caotrópicos;  •  DNA  se  liga  à  super~cie  de  parLculas  magnéJcas  de  sílica;  •  Separação  do  lisado  via  magnéJca;  •  Lavagem;  •  Liberação  do  DNA  das  parLculas  magnéJcas;  •  Eluição;  

DisposiJvos  DNA  IQ®  (Promega)  

DNA  IQ®:  Maxwell™  16  

pH < 6.5 + +

H2O

Lavagem

pH > 8.5

ChargeSwitch™ Purificação

-

Extração  com  ChargeSwitch®  (Invitrogen)  

•  Ácido  nucléico  ionizado  se  liga  a  esferas  magnéJcas;  •  Carga  é  trocada  via  o  pH  do  meio;  •  Três  passos    do  processo:  ligação,  lavagem,  eluição;  •  Reagentes  aquosos;  

ChargeSwitch®  

Purificação de DNA utilizando kit forense iPrep™ ChargeSwitch

ChargeSwitch®:  iPrep™  

Comparações  

•  Maxwell  16  Ø 1-­‐16  amostras  Ø Equipamento:  $24.500  Ø $5  por  amostra  Ø 30-­‐45  min  Ø Não  manipulação  de  líquidos  

Ø Preparação  de  amostra  Ø Sais  caotrópicas    

•  iPrep  Ø 1-­‐13  amostras  Ø Equipamento:  $29.500  Ø $5,62  por  amostra  Ø 20  min  Ø Manipulação  de  líquidos  Ø Pouca  preparação  de  amostra  

Ø Reagentes  baseados  em  água  

http://www.fabcousa.net/catalog/rapekit.htm

Swab Vaginal

Extração  Diferencial:  Swab  vaginal  /  resíduos  de  sêmem  

Células epiteliais e espermatozóides

Proteinase  K  SDS  Incubar  

Ø  Amostra  swab  é  removido  e  colocado  em  um  microtubo;  

1. Sais,  tampão,  EDTA  e  detergente  SDS  (dodecil  sulfato  de  sódio)  são  acrescentados  para  digestão;  2. Incubar  com  Proteinase  K  a  37  °C  por  2  h;  3. Centrifugar  com  um  filtro  em  formato  de  cesto  inserido  no  microtubo,  e  depois  remover  o  swab;    

Centrifugar  Separar  Lavar  o  pellet  de  esperma  

Fração de célula de sêmem

DNA de células epiteliais

4.  Remover  cuidadosamente  o  sobrenadante  deixando  qualquer  material  pellet  no  microtubo;  §   A  solução  sobrenadante  é  a  fração  feminina;  §   O  pellet  precipitado  no  tubo  será  as  células  de  esperma;  

5.  Lavar  o  pellet  e  ressuspender  em  tampão  (10mM  Tris-­‐EDTA,  50mM  NaCl  e  SDS  2%;  

6.  Agitar,  centrifugar  e  lavar  o  pellet  4X;  

DTT  Proteinase  K  SDS  Incubar  

Fração  de  células  de  sêmem  

7.  Digerir  as  paredes  das  células  de  espermatozóides  no  tampão:  Tris-­‐EDTA,  NaCl,  SDS,  DTT  (quebra  as  proteínas  com  grupos  disulfeto,  comum  em  parede  celular  de  esperma)  e  Proteinase  K;  

8.  Agitar  vigorosamente  e  centrifugar;  9.  Incubar  novamente  o  pellet  no  tampão  a  37  °C  por  2-­‐5  h;  

DNA  de  sêmem  

 Separação  Microfluídica  de  células  de  esperma  

(Técnica  futura)    

Células epiteliais são separadas e filtradas antes do teste http://pubs.acs.org/cgi-bin/jcen?ancham/asap/html/ac0486239.html

Separação  de  Células  em  disposiJvos  microfabricados  

Esperma mobilizado depois de 5min. Fluxo (1µL/h) induzido por 5µL tampão PBS. Microcanal (2,5 cm × 50 µm × 90 µm). A micrografía de processo de separação. B tempo de separação das células dentro e fora dos reservatórios e microcanal.

QuanJficação  de  DNA  

•  Qualidade  da  Extração  (espectrofotômetro);  Ø Determinação  da  quanJdade  de  DNA  extraído;  Ø NucleoLdeos  podem  ser  detectado  por  espectrofotometria  260nm;  

Ø Razão  260/280;  para  esJmar  a  contaminação  de  proteínas;  Ø 1,7  a  2,0  amostra  de  DNA  com  pureza  adequada.  Valores  inferiores  indica  contaminação  com  proteína.  Um  valor  superior  indica  contaminação  com  RNA;  

Separação  de  DNA  

•     Eletroforese:    Ø   É  um  método  simples  e  muito  eficiente  para  separar  para  idenJficar  e  para  purificar  fragmentos  de  DNA,  RNA  e  de  proteínas;  Ø   Ela  consiste  na    separação  de  moléculas  ionizadas    de  acordo  com  sua  carga  elétrica  e  seu  peso  molecular;  Ø   Moléculas  com  carga  negaJva  migram  para  o  pólo  posiJvo  e  moléculas  com  carga  posiJva  migram  para  o  pólo  negaJvo;

Eletroforese  

Existem  dois  modelos  básicos  de  eletroforese  para  separação  de  DNA:  

Gel  de  Poliacrilamida  

Gel  de  Agarose  

Eletroforese  

Fatores  que  afetam  a  migração  de  fragmento  de  DNA  em  géis:  

Ø Tamanho  do  DNA;    Ø Concentração;    Ø Conformação  do  DNA;  

Eletroforese  em  gel  de  Agarose  

•       Ágar-­‐ágar  (ágar  ou  agarose);  •       É  um  hidrocolóide  componente  da  parede  celular,  extraído  de  diversas  algas  marinhas  vermelhas  da  classe  Rodophyta;  •       Insolúvel  em  água  fria,  dissolve  em  água  quente  formando  um  gel  não  absorvível  e  não  fermentável;  •       Concentrações  de  0,5%  -­‐  2,5%;  •       Diluídos  no  tampão  TBE  ou  TAE  (Tris-­‐borato  EDTA  ou  Tris-­‐acetato  EDTA  

Separação  de  Fragmentos  de  DNA  

Eletroforese  em  gel  de  Poliacrilamida  

•   UJlizado  para  DNA,  RNA  e  Proteínas;  •     Composto  por  Acrilamida  e  Bisacrilamida;  

Marcador  de  migração:  (Glicerol,  ficol,  azul  de  bromofenol)  aumentar  a  densidade  da  amostra,  adiciona  cor  às  amostras  e  permite  acompanhar  a  corrida;    

Brometo  de  EYdeo:  §   Intercala  entre  as  fitas  de  ácidos  nucléicos;  §   Fluorescente  na  luz  ultravioleta;    

Prata:  Maior  sensibilidade  

DNA  de  marcadores  moleculares  

DNA  genômicos  e  DNA  genômico  degradado  

1,6:  Marcador  DNA  10Kbp;  2,4:    DNA  plasmideo  não  digerido;  3,5:  DNA  plasmideo  digerido  com  enzimas  de  restrição  

QUANTIFICAÇÃO  E  DETECÇÃO  DO  RNA  

•  Espectrofotometria  a  A260nm/  A  280nm    (1,8  –  1,9);  

•     RNA  total  íntegro:  eletroforese  em  gel  de  agarose;  

23S

16S

 Eletroforese  em  gel  de  agarose  

Aplicações  de  Análise  de  IdenJdade  Humana  

•     Resolver  crime:  estabelecer  compa2bilidade  entre  suspeito  e  evidencia..  •     ViJmas  de  Acidentes–  acidente  de  avião…  •     Soldados  da  guerra  –  quem  é  o  soldado  “desconhecido”…  •     Provas  de  Paternidade  –  quem  é  o  pai  …  •     Reclamação    de  herança–  quem  obtém  o  dinheiro  …  •     InvesJgações  de  pessoas    desaparecidas  –  de  quem  é  o  corpo…  •     Base  de  dados  de  ofensores  convictos  –  resolver  casos  arquivados  

Como  é  realizada  a  análise  de  DNA?  

Comparar perfis genéticos de possíveis pessoas

Extração/Purificação DNA

Material Biológico

Quantificação DNA

Amplificação/ PCR

Separação e Detecção

Determinação Genotípica

Processo  de  Tipagem  de  DNA  via  PCR  

Conceitos  Básicos  

PCR  (reação  em  cadeia  da  polimerase)  –  método  de  amplificar  regiões  específicas  do  genoma  –  desde  1  até  mais  de  um  bilhão  de  cópias  em  2-­‐3  horas;    Locus:  região  do  genoma  a  ser  examinada;    Alelo:  é  o  estado  de  variação  genéJca  sendo  examinada;  

 STRs  =  repeJções  curtas  consecuJvas;      SNPs  =  seqüência  de  bases  no  lugar;  

 Cromossomos  são  pareados  por  tanto:  Homozigoto  –  Alelos  são  idênJcos  em  cada  cromossomo  Heterozigoto  -­‐  Alelos  diferentes  em  cada  cromossomo  

Replicação  DNA  

•  Polymerase  Chain  ReacJon  (PCR)  Ø   Uma  técnica  para  replicação  o  copia  de  uma  porção  de  uma  fita  de  DNA  .  Esta  técnica  produz  milhões  de  copias  da  fita  de  DNA.  

Kary Mullis, inventor da PCR

Premio Nobel em Química, 1993

Reação  em  Cadeia  da  Polimerase  

•  PCR  Mix:  §  DNA  alvo  §  dNTPs  §  Primers  §  Taq  DNA  polimerase  

•  Termociclador  §  Desnaturação  (92  °C)  §  Pareamento  de  primers  (55  °C)  §  Extensão  da  fita  (72  °C)  

•  Envolve  síntese  enzimáJca  de  várias  cópias  de  DNA;  •  UJliza  um  par  de  primers  e  enzima  Taq-­‐DNA  polimerase.  

Reação  em  Cadeia  da  Polimerase  (PCR)  

Mul2plex  PCR  

•  Aproximadamente  10  marcadores  podem  ser  copiados  ao  mesmo  tempo;  

•  Sensibilidade  a  níveis  menores  de  1  ng  de  DNA;  

•  Habilidade  para  manipular  amostras  misturadas  e  degradadas;  

•  Diferentes  corantes  Fluorescentes  para  disJnguir  alelos  STR;  

Short  Tandem  Repeats  (STRs)  

RepeJções  curtas  consecuJvas  pode  variar  entre  os  indivíduos  

AATG

7 repetições

8 repetições

AATG AATG

Posição dos primers define o tamanho do produto

Corante Fluorescente

Marcador  STR  uJlizado  em  Tipagem  de  DNA  

Ø  Produtos  de  tamanho  pequeno  são  geralmente  compaJveis  com  DNA  degradado  e  a  PCR  permite  a  recuperação  da  informação  de  mínimas  quanJdade  de  material;  

Ø  Amplificação  “mulJplex’”  com  detecção  por  fluorescência  permite  um  alto  poder  de  discriminação  em  uma  só  prova;  

Ø  Disponíveis    comercialmente  kit  de  STR  de  fácil  manipulação;  Ø  Grupo  uniforme  de  STRs  fornece  a  capacidade  para  comparJlhar  

através  de  base  de  dados,  perfis  criminais  de  DNA  a  nível  nacional  e  internacional;  

Posições  de  Marcadores  Forenses  de  STR  em  Cromossomos  Humanos  

O  FBI  tem  selecionado  13  locus  de  STR  os  quais  devem  ser  corridos  em  toda  análise  de  DNA  para  poder  fornecer  um  sistema  comum  de  perfis  de  DNA  

Slide courtesy of Jim Schumm, Bode Technology Group

P 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 P

Avaliação  de  Marcador  Penta  nucleoLdeo  (altamente  heterozigoto  em  24  amostras  de  diferentes  indivíduos)  

Resultado  de  STR  MulJplex  no  ABI  310  CE  (ABI  COfiler  kit)  

D3S1358 D16S539

amelogenin

TH01 TPOX

CSF1PO

D7S820

GS350-ROX

Padrões  de  Marcadores  alélicos  de  STRs    

GenoJpagem  STR    é  realizada  por  comparação  de  uma  amostra  e  um  marcador  de  tamanho  alélico  

gender ID

A

B

C

D

E F G

H I J

gender ID

A

B C D E F

G

H I

J

DNA Size (base pairs)

Análise  simultâneo  de  11  STRs  

DNA Mulher

DNA Homem

D3S1358 vWA FGA suspect

Victim

Crime Scene

Victim

Suspect

Scene

Análise de Misturas com Marcadores STR

Promega  Powerplex  16  

← 5 loci

← 6 loci

← 5 loci

← Padrão ← interno

Power of discrimination = 1/1017

AMEL

D3

TH01 TPOX

Penta D Penta E

FGA D21 D18

CSF D16

D7

D13 D5 VWA D8

PCR com kit STR Fluorescene Separação/CE

Análise  STR  de  DNA  Humano  

Genotipagem por Comparação a padrão alélico

 Amplificação  STR  de  DNA  naturalmente  Degradados  

 

Recuperação  de  perfis  de  DNA  de  restos  humanos  deixados  na  super~cie  (University  of  Tennessee’s  Forensic  Anthropology  Center).  Amostras  amplificadas  com  PowerPlex  16.  

Comparação  de  STR  na  degradação  de  DNA  (PowerPlex16  kit)  

DNA  Control  500pg  

DNA  500pg  /  DNAseI    

DNA  500pg  /  H2O2  

 Amplificação  STR  de  DNA  Oxidados  

 

Comparações   de   amostra   de   DNA   de   sangue   oxidados.   Amostras   foram   amplificadas   com  PowerPlex  16  kit.  Produtos  de  DNA  de  sangue,  DNA  de  sangue  oxidado  com  1%  H2O2      por18h  e  DNA  de  sangue  oxidado  com  NaClO  0,5%  em  200pg  DNA.