Alkalna fosfataza i_2014

1

Alkalna Alkalna fosfatazafosfataza

Predavanja iz Kliničke enzimologijeIntegrisane akademske studije: Farmacija-medicinska

biohemijaŠkolska 2014/2015. godina

2


Ciljevi predavanja:

• Uloga i karakteristike enzima• Distribucija enzima u organizmu

• Izoenzimi i izoforme• Klinički značaj

• Analitika enzima i izoenzima ALP• Preanalitičke varijacije

• Referentne vrednosti

3


• Skraćenica: ALP alkaline phosphatase

• Enzimski broj: (EC 3.1.3.1; ortofosfatna-monoestar fosfohidrolaza (alkalni

optimum);

• Mala supstratna specifičnost

– Katalizuje alkalnu hidrolizu velikog broja različitih prirodnih i sintetičkih supstrata.

– Katalizuje hidrolizu estarske veze monofosfata pod alkalnim uslovima (pH 8-10)

uz oslobañanje alkohola ili derivata fenola

• Distribucija enzima u organizmu

– ALP je membranski enzim (ektoenzim) prisutna u velikom broju organa, a pre

svega onim sa apsorptivnom ili sekretornom funkcijom

– vezana za površinski deo ćelijske membrane u mukozi intestinuma i

proksimalnim izuvijanim cevčicama tubula bubrega, kostiju (osteoblastima), jetri

(kanikulima) i placenti.

4

Alkalna fosfataza u jetri senalazi i na membranama

sinusoida i na kanikularnimmembranama

Lokalizacija enzima u hepatocitima

5

Mitohondrije

Lizozimi

Golñijevkompleks

Glatki endoplazmati čniretikulum

Zrnasti endoplazmati čniretikulum

LokalizacijaLokalizacija enzimaenzima u u hepatocitimahepatocitimaMembranski Membranski enzimenzim

AST, GDH

ALT, LAP,AST, GDH, LD

ALP, GGT, 5-NTP

Citoplazma

6


• Distribucija enzima u organizmu

• Široko rasprostranjena • Najviši nivoi alkalne fosfataze se nalaze u:

• intestinumu• jetri• kostima (osteoblastima) • bubrezima• placenti• slezini

• Sintezu alkalne fosfataze kodiraju četiri različita gena i to za: tkivnonespecifičnu alkalnu fosfatazu TNALP, intestinalnu, placentarnualkalnu fosfatazu i placentarnom nalik izoenzimu.

7

Distribucija alkalne Distribucija alkalne fosfatazefosfataze u u organimaorganimaIzoenzimiIzoenzimi i i izoformeizoforme

• ALP se javlja u multiplim formama, pri čemu su neki pravi izoenzimi, kodirani sa posebnim genskim lokusima

Izoenzimi• Tkivno nespecifična alkalna fosfataza hromozom 1• Intestinalna hromozom 2• Placentalna hromozom 2• ALP nalik placentalnoj hromozom 2

• ALP fetalna intestinalna hromozom 2Tumori produkuju izoenzime- neoplastične izoenzime• placentarnu ALP, fetalnu intestinalnu ALP i placentarnoj nalik ALP

8

Distribucija alkalne Distribucija alkalne fosfatazefosfataze u u organimaorganimaIzoenzimiIzoenzimi i i izoformeizoforme

Izoforme nastaju post-translacionim modifikacijama

Izoforme• Tkivno nespecifična alkalna fosfataza 3 izoforme

– Jetrena– Koštana

– Bubrežna

• Ove forme su N-glikozilirane i samo jetrena ALP ne sadrži 0-vezane glikane.

. Izoforme: koštana, jetrena i bubrežna forma ALP imaju istu uobičajenu

primarnu strukturu, ali se razlikuju po sadržaju ugljenih hidrata

9

Genetsko poreklo Genetsko poreklo izoenzimaizoenzima alkalne alkalne fosfatazefosfataze

Neoplastični izoenzimi: Regan, Kasahara i Nagao

10

Svojstva alkalne Svojstva alkalne fosfatazefosfataze

• ALP je vezana za spoljašnju ćelijsku membranu sa glikozil-fosfatidilinozitol(GPI) kao sidrom (vezom)

• Ektoenzim

• Serumska ALP je homodimerni enzim

– GPI se uklanja dejstvom endogene ili egzogene (serumske) GPI-specifične fosfolipaze D.

– Kidanje ovih veza sa membranom može uzrokovati nastanak dodatnih

izoformi

11

MultipleMultiple forme alkalne forme alkalne fosfatazefosfataze

• Koštana ALP se dalje može razdvojiti sa jonoizmenjivačkom HPLC ili izoelektrofokusiranjem u četiri forme:

– BI; B1x; B1 i B2

– Razlikuje se meñusobno u sadržaju sijalinske kiseline

• Koristeći isti postupak jetrena ALP je razdvojena na 3 izoforme.

• Placentarna alkalna fosfataza – aloenzimi

12

Uloga alkalne Uloga alkalne fosfatazefosfataze u humanom organizmuu humanom organizmu

• Dugo vremena se nije znala tačna metabolička uloga alkalne

fosfataze.

• Predpostavka da ona ima dvostruku ulogu u našem organizmu:

1. Alkalna fosfataza na neki način vezana je za transport lipida u

intestinumu, pre svega masnih kiselina, ali i kalcijuma i fosfata

Intestinalni izoenzim

Hipoteza: ALP vrši defosforilaciju metabolita i tako olakšava

njihov prolaz kroz selektivno permeabilnu membranu

2. Novija saznanja ukazuju na ulogu koštane alkalne fosfataze u

procesima remodelovanja kostiju tj. za procese kalcifikacije u

kostima.

Remodelovanje kostijuRemodelovanje kostiju

13

14

Funkcija koFunkcija košštane alkalne tane alkalne fosfatazefosfataze

• Tokom mineralizacije kostiju glavna funkcija ALP je hidroliza neorganskog pirofosfata (PPi) pri čemu se oslobaña fosfat Pi

• Vezikule matriksa su bogate NTALP• Ravnoteža izmeñu Pi i PPI je kritično za mineralizaciju zato što

PPi inhibira stvaranje hidroksiapatita.

ALP ima ulogu u stvaranju hidroksiapatitaHidrolizuje PPi koji nastaje dejstvom nukleozid trifosfat pirofosfohidrolaze iz NTP ALP utiče na mineralizaciju kostiju tako što kontroliše inhibitorni pool PPi

15

Funkcija koFunkcija košštane alkalne tane alkalne fosfatazefosfataze

• Ispitivanja su pokazala da je koštana alkalna fosfataza neophodna za fazu propagacije ali ne i za inicijaciju mineralizaciju.

• Koštana ALP se produkuje u osteoblastima u toku faze maturacije kada se novoforminari kolageni matriks priprema za deponovanje minerala.

• Pošto je ALP čvrsto vezana za membranu ćelije oslobañanje enzima je produženo i povećanje u plazmi zahteva izvesno vreme.

Faze u razvoju osteoblasta

Rast ćelija i diferencijacijaEkspresija gena

16


Aktivatori i inhibitori enzima

Uticaj metalnih jona

• Dvovalentni joni Mg2+, Co2+ i Mn2+ su aktivatori ovog enzima

• Zn2+ je konstitutivan elemenat enzima.

• Pravilan odnos Mg2+/Zn2+ je neophodan

da se izbegne zamena Mg2+ i održala

optimalna aktivnost enzima.

• Uloga serina u aktivnom centru ALP

Inhibitori ALP

• Fosfat, borat, oksalat i joni cijanida

17


Uticaj pH i pufera na aktivnost ALP

• Varijacije u Mg 2+ i u koncentraciji supstrata menjaju pH optimum.

• Tip prisutnog pufera (izuzev u niskim koncentracijama) utiče na brzinu

enzimske aktivnosti.

• Puferi se mogu klasifikovati kao:

1. inertni (karbonatni, barbitalni)

2. inhibirajući (glicinski i propilamin)

3. aktivirajući (2-amino-2-metil-1-propanol (AMP), Tris hidroksi metil

aminometan (TRIS) i dietanolamin (DEA).

Aminoalkoholi deluju kao puferi jer vezuju H jone za azot ali i kao

akceptori fosfata i zato su aktivirajući.

Povećana aktivnost za 2-6X

Najveći stepen fosforilacije ima grupa : –Alkil-NH-C-C-OH

18

Serumska alkalna Serumska alkalna fosfatazafosfataza• Alkalna fosfataza prisutna u serumu odraslih prevashodno

potiče od jetre i kostiju.• Odnos 1:1 • Odnos ova dva izoenzima u serumu varira sa godinama.

Promene aktivnosti izoenzimaalkalne fosfatazesa godinama

19

Serumska alkalna Serumska alkalna fosfatazafosfataza

• Minimalne količine intestinalne ALP takoñe mogu biti prisutne,

posebno u serumu osoba sa krvnim grupama O i B (one koje su

sekretori supstance krvnih grupa).

• Intestinalna ALP se može povećati posle jela i zato je treba

odreñivati isključivo natašte.

20

KlirensKlirens alkalne alkalne fosfatazefosfataze

– Intestinalna alkalna fosfataza

• galaktozil ostaci reaguju sa galaktozil receptorima i vrlo

brzo se uklanja iz seruma

– Ostale alkalne fosfataze su sijalinizirane

(sijaloglikoproteini) i ostaju duže u plazmi

– Maligne ćelije produkuju ovu sijalo formu ALP i

duže ostaje u plazmi

21

KliniKliniččki znaki značčaj alkalne aj alkalne fosfatazefosfataze

Odreñivanje aktivnosti alkalne fosfataze važno je kod oboljenja dva organa (sistema):

• jetre

• koštanog sistema

Povišene vrednosti ALP se javljaju kod:

• Hepatobilijarnih bolesti

• Bolesti kostiju praćene povećanom aktivnošću osteoblasta

Snižene vrednosti ALP (retko)

• genetski defekti, deficijencija Zn

Fiziološki povećane vrednosti:

• Deca u pubertetu

• Trudnoća

22


Značaj odre ñivanja alkalne fosfataze u bolestima jetre

• ALP je prvi enzim koji je izučavan kod hepatičnih bolesti

• Opstrukcija žu čnih puteva

• Uzroci povišenih vrednosti ALP

• oslobañanje membranski vezane alkalne fosfataze

• indukcija sinteze ALP u hepatocitima.

– Novosintetisani enzimi (neki) ulaze u cirkulaciju i povećavaju enzimsku

aktivnost u serumu.

– Povećanje je uočljivije (tri puta veće) kod ekstrahepatične opstrukcije

(kamenom, kancer glave pankreasa) nego kod intrahepatične opstrukcije i

veće je što je veća opstrukcija.

– Vrednosti ALP u serumu mogu dostići vrednosti od 10 do 12 puta od URL –

upper reference limit (gornje granice referentnog intervala)

– Vraćaju se na normalu nakon hirurškog uklanjanja opstrukcije

– Povišene vrednosti žučnih kiselina utiču na solubilizaciju i oslobañanje

membranski vezane ALP

23


Značaj odre ñivanja alkalne fosfataze u bolestima jetre

• Povećanje ALP kod primarnog kancera jetre i pojave metastaza u jetri.

• Bolesti jetre koje primarno oštećuju parenhimske ćelije, kao što je infektivni hepatitis, tipično pokazuju umereno povećanje ALP (ispod 3 puta) ili čak ALP ostaje u normalnim granicama

• Povećanje se može javiti i kao odgovor na terapiju

• Intestinalni izoenzim alkalne fosfataze, koji je asijaloglikoproteinnormalno se uklanja pomoću odgovarajućih asijaloglikoproteinreceptora (galaktozil receptori), obično je povećana kod ciroze jetre

24


• Alkalna fosfataza je normalno povećana 2-3 puta u serumu kod

trudnica u trećem trimestru

• Prisutan je izoenzim placentarnog porekla

• Ispitivanja su pokazala i postojanje familija sa benignim

povećanjem intestinalne alkalne fosfataze

• Prolazno benigno povećanje ALP je prisutno i kod dece sa

promenama koje su 10 puta veće od gornje granice.

– Povećanja i koštane i jetrene ALP.

– Promene su verovatno rezultat redukovanog uklanjanja ALP iz krvi

zbog prolaznih modifikacija enzimske glikozilacije.

25


• Alkalna fosfataza kao tumorski marker

• Primenom elektroforetskih tehnika razdvajanja izoenzima ALP u

serumu otkriveni su forme enzima identične normalnom

placentarnom enzimu u serumu pacijenata sa malignim bolestima.

• Karcinoplacentarni izoenzimi (Reganovi izoenzimi) pojavljuju se

zbog de-represije placentarnog ALP gena.

– Identifikacija na osnovu termostabilnosti na 650 C.

• Pronañeno je da tumori produkuju ALP koja je modifikovana forma

neplacentarnih izoenzima (Kasahara izoenzimi).

26

• Enzimi su produkti osteoblasta i osteoklasta– Osteoblasti alkalnu fosfatazu– Osteoklasti kiselu fosfatazu

• Biohemijski markeri remodelovanja kostiju– Enzimski markeri stvaranja kostiju ALP

– Enzimski markeri razgradnje – resorpcije kostiju ACP

• Izoenzimi i izoforme markeri remodelovanja kostiju– BALP Bone alkaline phosphatase Koštana alkalna fosfataza

– TRACP tartarat rezistentna kisela fosfataza

ZnaZnaččaj odreñivanja alkalne aj odreñivanja alkalne fosfatazefosfataze u bolestima u bolestima kostijukostijuEnzimski markeri bolesti kostiju

AcPALP

27

Alkalna Alkalna fosfatazafosfataza -- kokošštana tana izoformaizoforma

• Koštana, jetrena i bubrežna izoforma ALP su posttranslacione

modifikacije jednog te istog genskog produkta i identifikuju se na

osnovu specifičnog ugljenohidratnog sadržaja

• Koštana alkalna fosfataza se produkuje u osteoblastima gde se

nalazi u specifičnim vezikulama matriksa nastalih iz plazmatske

membrane

• Enzim je odličan indikator globalne aktivnosti stvaranja kostiju.

• Kod hipofosfatemije, retke nasledne bolesti genetski defekt je u

nesposobnosti produkcije tkivno nespecifične alkalne fosfataze, pa i

koštane ALP

• Posledica ove hipofosfatemije je teška bolest kostiju i nepravilni rast

kostiju

28


Klinički značaj u bolestima kostiju

• Prednost korišćenja koštane alkalne fosfataze u serumu kao markera formiranja kostiju u kliničkoj praksi su:

1. Mala diurnalna varijacija

2. Nema uticaja funkcija bubrega

3. Dug poluživot

4. Stabilnost u serumu i in vitro

29

Meñu bolestima kostiju najviša aktivnost

se dobija kod Pagetove bolesti

(osteitis deformans)

kao rezultat dejstva osteoblastnih ćelija

koje pokušavaju da ponovo izgrade kost nakon

nekontrolisane aktivnosti osteoklasta.

Vrednosti su 10 do 25 X iznad URL

i to povećanje odražava težinu bolesti.

Rentgenski snimak Osteolitička mesta na delu osteoklastneresorpcije kostijuSklerotična mesta na delu aktivnosti osteoblasta

Alkalna Alkalna fosfatazafosfataza u u PagetovojPagetovoj bolestibolesti

30


• Koštana ALP je povećana u svim metaboličkim bolestima kostiju:

– Osteoporozi, osteomalaciji, rahitisu, primarnom i sekundarnom

hiperparatiroidizmu, renalnoj osteodistrofiji, tirotoksikozi, akromegaliji i

druge bolesti sa povećanom izgradnjom kostiju

– Osteogeni karcinom kostiju i metastaze kostiju

• Vrlo visoke vrednosti koštane alkalne fosfataze

– Osteoporoza blago povišenje ALP• Inverzna korelacija sa gustinom kostiju

• Kod deficijencije vitamina D (osteomalacije i rahitisa) koncentracije su 2 do 4 puta veće od normalnih.

– vrednosti se vraćaju na normalu nakon tretmana.

• Prelomi kostiju: prolazna povećanja u toku zarastanja

31


• Fiziološki rast kostiju dovodi do prolaznog povećanja aktivnosti koštane

ALP u serumu dece koja rastu.

– U serumu dece ALP je 1,5 do 7 puta veća nego kod odraslih zdravih osoba.

– Maksimum se pre postiže kod devojčica.

32


• Klinički značaj koštane alkalne fosfataze (BALP) u praćenju efekta terapije

Pošto je poluživot ALP relativno dug (približno 40 sati), manje senzitivan je od prokolagen propeptida ili osteokalcina na akutno dejstvo lekova, kao što

su velike doze intravenskog metilprednizolona.

• Tokom teriparatidnog tretmana (rekombinovani parathormon), ALP nije povećan kao što su povećani prokolagen iili osteokalcin.

33

Svojstva koSvojstva košštane alkalne tane alkalne fosfatazefosfataze u poreñenju sa u poreñenju sa

drugim markerima stvaranja kostijudrugim markerima stvaranja kostiju

• Koštana alkalna fosfataza je korisniji marker od osteokalcina kod pacijenata sa

oštećenim bubrezima zato što se ne eliminiše glomerularnom filtracijom.

• Vitamin D (1,25-dihidroksi vitamin D) reguliše sintezu koštane alkalne fosfataze i

osteokalcina

– oba ova parametra su promenjeni kod tretmana pacijenata sa kalcitriolom i

kod pacijenata sa povećanim abnormalnim koncentracijama ovih hormona.

34


• Snižene vrednosti alkalne fosfataze

1. Malnutricija

• Deficijencija Zn, B6, folne kiseline i vitamina C

2. Hipofosfatemija• Retko genetsko oboljenje

3. Drugi uzroci snižene aktivnosti ALP

• Hipotiroidizam

• Oštećenje paratiroideje• B12 deficijencija (Pernicious anemia)

• Višak unosa vit D-intoksikacija

• Aplastična anemia • Vilsonova bolest

• Deca sa ahrondoplazijom i kretenizmom and cretinism

• CML – Chronic Myelogenous Leukemia • Menopause and anemia

35

Alkalna fosfataza - intestinalna

• Uloga intestinalne alkalne fosfataze

• Protektivna uloga ?

• Reguliše pH intestinuma

• Utiče na apsorpciju lipida, detoksikaciju slobodnih nukleotida i bakterijskih

lipopolisaharida, smanjuje intestinalnu inflamaciju i na enterobakterije(modulaciju)

• Uticaj nutritienata na intestinalnu ALP

• Protektivna uloga – defosforilacija proinflamatornih faktora i smanjenje inflamacije ?

• Ispitivanja kod hroničnih bolesti GIT

Health & Medicine

Alkalna fosfataza i_2014