Moleküler Biyoloji

GIDA456

Yrd. Doç. Dr. Barçın KARAKAŞ

Bahar 2015-2016

T.C. AKDENİZ ÜNİVERSİTESİ

• Protein saflaştırma ve analizi (devam)

Bir önceki derste … • Proteinlerin saflaştırılması-saflık, verim ekonomi

• Hücre ekstraktı; hücre parçalama

• Büyüklüğe göre (MA, ebat) ayırma: • Santrifüj işlemleri (diferansiyel ve zonal santrifüjleme)

• Membran teknikleri – diyaliz, ultrafiltrasyon

• Jel filtrasyonu

• İyonik şiddete bağlı çöktürme (salting-out)

• Yüklerine göre ayırma: • İyon değişim kromatografisi

• Elektroforez: SDS-PAGE

Bu derste…

• Yüklerine göre ayırma(devam)…Elektroforez…

• Bağlanma özelliğinden faydalanarak ayırma (affinity)

• Elektroforetik yöntemler…İzoelektirik odaklama ve SDS

PAGE, 2 boyutlu elektroforez,

• Saflaştırma işleminin değerlendirilmesi

• Maldi-TOF ile protein MA tayini

• Amino asit dizilerinin belirlenmesi

• İmmunolojik analizler

Afinite (bağlanma) özelliğinden

faydalanarak ayırma

• “Affinity chromatography”

• Ör: bir bitkisel protein olan Concanavalin A glikoza meyillidir (ortamdaki glikoza bağlanır)

• Con A önce kolon malzemesinde bulunan G’a bağlanır; glikoz içeren çözelti kolondan geçirilince ise Con A serbest glikoza bağlanmayı tercih eder ve elüsyon sağlanmış olur

Afinite (bağlanma) özelliğinden

faydalanarak ayırma • Dolgu malzemesinin maliyetinden

ötürü pahalı bir yöntem olmakla birlikte son derece spesifik oluşu sebebiyle tercih edilebilir.

• DNA’da belirli dizileri tanıyarak bağlanan ve transkripsiyonda görev alan bazı proteinler vardır (transkripsiyon faktörleri); bunların ayrılmasında kolon matrisinde DNA dizisini içeren moleküller kullanılır.

• Ayırma için son derece etkili ve seçici bir yöntemdir

Jel Elektroforezi

• Jel elektroforezi, saflaştırılmış nükleik asit ve proteinlerin molekül ağırlığı, miktarı ve alt tiplerinin saptanmasında yaygın olarak kullanılan moleküler bir inceleme yöntemidir.

• Yöntemin avantajı; basit ve hızlı

• En çok kullanılan jel elektroforezi yöntemleri agaroz jel elektroforezi ve poliakrilamid jel elektroforezidir.

• Nükleik asitler için genellikle agaroz jel,

• proteinler için ise poliakrilamid jel elektroforezi kullanılmaktadır.

• SDS poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) hemen tüm protein tiplerinin analizinde uygulanabilmektedir.

SDS poliakrilamid jel

elektroforezi (SDS-PAGE) • SDS (sodyum dodesil sülfat) anyonik bir deterjan

olup iki amino asitte bir peptit zincirine bağlanarak

protein moleküllerini oluşturan alt birimleri

biribirinden ayırır.

• Ayrıca (-) yük taşıdığından peptitlerede yüksek

oranda '(-) yük kazandırır. Böylece elektrik yükü

açısından karışım içerisindeki bütün protein

molekülleri eşit duruma getirilir. Jel

konsantrasyonu arttırılarak protein moleküllerinin

molekül ağırlıklarına göre ayrışmaları sağlanır.

PolyAcrylamide Gel

Electrophoresis

https://proteabio.com/productFiles/BR-000/BR-000_PP.png

Protein saflaştırma işlemlerinin her basamagında örnek

alınarak bu örnekler bir SDS-PAGE ile incelenebilir

• Herbir fraksiyondan jel kuyularına aynı miktarda yüklenmiştir

• Son fraksiyonda saflaştırılması hedeflenen proteine ait bant tek bant olarak kalmıştır ve kalınlaşmıştır

M: marker

H: homojenat

F1-3: farklı saflaştırma

işlemleri ile elde edilen

fraksiyonların örnekleri

M H F1 F2 F3 M

100 kDa

50 kDa

10 kDa

İzoelektirik odaklama • İzozimleri ya da özellikleri çok benzeyen proteinleri ayırmak için

kullanılır

• pH gradienti oluşturulan jel üzerinde elektroforez yapılarak, proteinlerin pI değerleri tayin edilir

• pH gradienti: Küçük molekül ağırlıklı organik asit ve bazları içeren bir amfolit ya da amfolin (katyonik/anyonik polistiren elektrolitler) çözeltisi ilave edilen jele elektrik alanı uygulanır

• Amfolit çözeltisindeki H+ve OH- iyonları, biri diğerini nötralize ederek sürüklenirken, jel üzerinde pH gradienti oluşur

İzoelektirik odaklama • protein karışımı izoelektrik jele uygulanıp

elektroforez yapıldığında, karışımdaki her

protein kendi izoelektrik noktasına kadar jel

üzerinde sürüklenir ve durur

İki boyutlu SDS-page Elektirik yüküne bağlı olarak ayrışma

↔ M

A’y

a b

ağlı o

lara

k a

yrı

şm

a

↕

• E. coli proteinleri, bu şekilde belirli uygulamalar sonucunda hangi proteinlerin üretiminin arttığı, hangilerinin ise azaldığı araştırılabilir

• (not: tür isimleri yazılırken klavye kullanılıyorsa MUTLAKA italik yazılır. El yazısı ile tür isimleri yazılırken ise MUTLAKA altı çizilir)

Proteom

• Proteom (ing: “proteome”): bir organizmanın sentezlediği proteinlerin tamamı

• En iyi ayırma yöntemi 2 boyutlu jel elektroforezidir (>10 000 protein ayrıştırılabilir)

• Klasik proteom analizi 3 aşamada gerçekleştirilir: • Jel elektroforezi/kutle spektrometrisi

• Kısmi dizi belirleme

• Veritabanlarının taranması

• Proteinin molekül ağırlığı kütle spektrometrisi ile belirlenebilir

• Proteinin aa dizisi klasik olarak Edman dizi belirleme yöntemine göre gerçekleştirilebilir.

Saflaştırma işleminin değerlendirmesi

• Taplam protein: bir fraksiyonda mevcut olan protein miktarı protein konsantrasyonu belirlenerek ve fraksiyon hacmi ile çarpılarak bulunur

• Toplam aktivite: aktivite analizinde kullanılan miktar için tespit edilen aktivite değeri belirlenir ve toplam fraksiyon hacmi ile çarpılarak toplam aktivite hesaplanır

• Spesifik aktivite: toplam aktivitenin toplam proteine bölünmesiyle hesaplanır

• Verim: herbir saflaştırma aşaması sonrasında fraksiyonda kalan aktivitenin ham ekstredeki aktiviteye oranının yüzdesel ifadesidir

• Saflaştırma seviyesi: bu parametre saflık artışının göstergesidir ve herbir aşamada hesaplanan spesifik aktivitenin başlangıçtaki spesifik aktiviteye bölünmesi ile hesaplanır.

Proteinlerin karakterizasyonu

• Protein homojen bir çözeltide saflaştırıldığı

taktirde

– aa bileşimi

– molekül ağırlığı

– aa dizisi

belirlenerek karakterize edilebilir.

Kütle Spektrometrisi • Kütle spektrometrisi organik kimyada çok uzun

yıllardan beri kullanılagelen bir analiz yöntemidir. • Bileşikler iyonize edilerek gaz fazına geçirilir ve belirli bir mesafeyi

kat etmeleri sağlanır; moleküllerin dedektöre ulaşması kütlelerine bağlı olduğu için buradan molekülün kütlesi hesaplanabilir.

• Proteinlerin (ve diğer makromoleküllerin) spektrofotometride analizi bu büyük moleküllerin gaz fazına geçmesini sağlayan tekniklerin geliştirilmesi sayesinde mümkün olmuştur.

• Matrix-Assisted Laser Desorption-Ionization (MALDI)

time of flight (TOF)

• Matris-destekli lazer desorpsyonu

uçuş süresi

• Electrospray Spectrometry (ES)

• Elektrosprey spektometrisi

MALDI spektrometrisi

• Bu yöntemde proteinler iyonize edilir ve

oluşan yüklü gruplar elektirik alan içinde

hızlandırılır • En küçük iyonlar daha hızlı yol alır…dedektöre

daha çabuk ulaşır

• TOF (yani uçuş süresi) » kütle/yük oranı (m/z)

• Bu yöntemle pikomol (pmol; 10-12) veya

fmol (femtomol; 10-15) gibi küçük

miktardaki örneklerin analizi mümkündür

Maldi-TOF-MS ile protein MA tayini

(1) Uygun bir matris içinde hazırlanmış protein örneği üzerine lazer ışını verilerek iyonizasyon sağlanır

(2) Oluşturulan elektrik alanı sayesinde iyonların detektöre doğru ilerlemesini sağlanır

(3) En hafif iyonlar daha çabuk ulaşır

(4) İyonize edici lazer ayrıca uçuş süresinin (TOF) belirlenmesini sağlayan bir “kronometre”yi başlatır

MALDI-TOF …………150 0 000 – 700 000 €

Maldi-TOF-MS ile protein MA tayini

• Yukarıda β-laktoglobulin ve insülin içeren bir protein karışımına ait MALDİ-TOF spektrumu verilmiştir

• β-laktoglobulin ve insülin için aa dizilerinin bilinmesi sayesinde hesaplanarak bulunmuş olan MA değerleri sırasıyla 5733.5 ve 18388 Da’dur. Spektrumdan okunan MA değerleri ise sırasıyla 5733.9 ve 18364 Da.

• MALDI-TOF’un proteinin kütlesinin belirlenmesinde ne kadar etkin bir araç olduğu görülmektedir.

• Kütle spektrometrisi ile peptid parmak izinin alınması (ing:“peptide fingerprinting”) adında bir yöntem geliştirilmiştir.

• Peptidlerin tanınmasını sağlayan bu teknik sayesinde 2 boyutlu jellerin kullanılırlığını büyük ölçüde arttırmıştır.

• Burada… • 2 boyutlu jelden kesilerek

alınan protein lekesi jelden ekstrakte edilir.

• Protein enzimatik veya kimyasal olarak spesifik noktalardan kesilir.

• Spektrometre ile peptid parçalarının kütleleri belirlenir.

• Elde edilen peptid kütleleri (yani “parmak izi”) internet veri tabanlarında bulunan proteinlerin “elektronik ortamda kesilmesi” ile elde edilen parmak izleri ile eşleştirilerek taranır.

Tripsin K ve R aa

kalıntısından keser.

The major soluble proteins of

Schistosoma mansoni identified by

peptide mass fingerprinting,

illustrated on an annotated 2D gel of

material from eggs.

• Bu şekilde 2

boyutlu jellerdeki

protein lekelerinin

büyük oranda

tanımlanabilmesi

mümkün

olmaktadır.

Saflaştırma → MA belirleme → aa dizisi (primer yapı)

aa bileşiminin belirlenmesi…

• Peptid / protein hidrolize edilir (6 N HCl, 110 ºC, 24 saat)

• Hidrolize olmuş amino asitler iyon değişim kromatografisi ile sulfone polistiren kolon ile ayrıştırılır.

• aa.lerin tanımlanması: Kolondan çıkan aa.ler elüsyon zamanına (hacmine) bağlı olarak tanımlanır.

• aa.lerin miktarları: miktar belirleme (quantification) aa fraksiyonlarının ninhidrin ile ısıtılarak tepkimeye sokulması ve absorbansın belirlenmesi yoluyla gerçekleştirilir.

• Prolin dışında bütün aa.ler ninhidrin ile koyu mavi renk verir; prolinde bulunan ikinci amin grubu nedeniyle sarı renk oluşur.

• Bir peptid hidrolizatında bulunan aa.ler sulfone edilmiş polistiren reçine (ör: Dowex-50)

kolondan geçirilerek ayrıştırılabilir.

• Burada elüsyon için artan pH’da tampon çözelti (bu örnekte sodyum sitrat) kullanılır.

• Absorbans ölçülerek her bir amino asidin miktarı belirlenir

• Asidik yan zinciri olan aspartat kolondan en hızlı çıkar, bazik yan zinciri olan arjinin ise

en son çıkar.

• Bu örnek peptidde (Asp1, Gly2, Ala1, Phe1, Arg1) vardır, bu gösterime göre sadece

aa içeriği verilmiştir, sıra bilinmemektedir

• Bu hidroliz ve kromatografiye dayalı yöntemle 10 ng kadar küçük miktarda aa belirlenebilmektedir.

• Bir parmak izinde her aa.ten yaklaşık bu miktarda bulunur.

• Kendiliğinden ışıma yapmayan bileşiklere floresan özellikte guruplar bağlanarak ışıma yapmaları sağlanabilir.

• Ninhidrin kullanımı yerine fluorescamine maddesi ile etiketleme yapıldığında analiz daha hassas olur (1 ng = 10 pmol amino asit tayin edilebilir.)

• Fluorescamine aa ile tepkimeye girerek floresan bir türev oluşturur.

• Bir sonraki aşamada hedef N-terminus amino asidini belirlemektir.

• Bunun için Frederick Sanger tarafından ilk olarak florodinitrobenzen (fluorodinitrobenzene; FNB) maddesi kullanılmıştır.

• Şimdilerde floresan türevler oluşturduğu için daha hassas sonuçlar veren dabsilklorid maddesi kullanılmaktadır.

• N-terminus ucundan dabsilklorür ile etiketlenen protein hidrolize edilir.

• Ortaya çıkan dabsilCl-aa türevi kromatografik olarak tanımlanabilir (yukardaki ör: alanin)

• Bu yöntem bir protein için sadece 1 defa gerçekleştirilebilir; zira protein hidroliz aşamasında tamamen bozunur, dizi bilgisi kaybolur.

• Sonuç olarak sadece son amino asit belirlenmiş olur.

Ala (N-terminus)

Edman dizi belirleme

• Pehr Edman tarafından geliştirilen peptid

amino asit dizisini belirleme tekniğidir.

• Bu yönteme göre aa dizisinin son

kalıntısına (ing: “N-terminus veya terminal

residue”) bir “etiketleme” yapılır ve bu

kalıntı zincirden koparılır. (ing: “cleaved”)

• Bu sırada peptid aa dizisi değişmez.

Edman dizi belirleme • Edman yönteminde peptidin

amino ucundan sırayla birer

amino asit ayrılır.

• Fenil izotiyonat peptidin

yüksüz terminal ucu ile

tepkimeye girerek bir fenil

tiyokarbomil türevi oluşturur.

• Bunu takiben, hafif asidik

koşullar altında uçtaki amino

asidin halka yapıda (cyclic) bir

türevi serbest bırakılır.

• Halka yapıdaki bu türev

phenylthiohydantoin

bileşiğidir; kısaca bu amino

aside PTH-amino asit denir.

Edman degredasyonu ile aa dizisinin

belirlenmesi

• PTH-amino asitleri

kromatografik yollarla

tanımlanabilmektedir.

• Edman prosedürü

tekrar edilerek

sırasıyla amino asitler

belirlenebilir.

Otomasyonlu Edman degredasyonu ile aa

dizisinin belirlenmesi

• Otomasyonu sağlanmış dizi belirleme cihazları

geliştirilmiştir.

• Bu cihazlar sayesinde Edman yöntemi ile

yapılan bir döngü (yani 1 aa etiketleme, kesimi

ve belirleme işlemi) bir saatten kısa sürede

gerçekleştirilebilir.

• Otomasyonlu dizi belirleme cihazları ile 50

kalıntıya kadar aa içeren peptid zincirlerinin N-

terminus aa dizisi belirlenebilir.

Peptidler belirli noktalardan kesilerek dizi belirleme

analizi kolaylaştırılabilir.

• Edman yöntemi teorik olarak sonsuz

sayıda döngü halinde gerçekleştirilebilir.

• Ancak, pratikte 50'den fazla sayıda kalıntı

analiz edilememektedir.

• Bunun sebebi her döngüde bazı PTH-

aa.lerin serbest bırakılmasında sorunlar

olur, yani ayrılma %100 verimle

gerçekleşmez, … (ör: verim %98 olsa? → 60 döngü

sonrasında 0.9860=0.30…oldukça heterojen bir örnek olur)

Peptidler belirli noktalardan kesilerek dizi

belirleme analizi kolaylaştırılabilir.

• Bu sorunu aşmak için peptid zinciri belirli noktalardan kesilir, sonra dizi belirlenir.

• Strateji: böl ve fethet!

• Spesifik kesim (spesifik kırma) kimyasal veya enzimatik yolla gerçekleştirilebilir.

Kimyasal kesme

• Örneğin siyanojen bromür (cyanogen bromide; CNBr) polipeptid zincirlerini sadece metiyonin kalıntılarının karboksil tarafından parçalar.

• Örneğin 10 metiyonin kalıntısı içeren bir polipeptid CNBr ile muamele sonrasında 11 adet peptid zinciri oluşturur.

Enzimatik kesme

• Oldukça spesifik kesim sağlayan bir diğer madde tripsin enzimidir.

• Tripsin pankreasın salgıladığı proteolitik bir enzimdir.

• Bu enzim polipeptidleri arjinin ve lisin kalıntılarının karboksil taraflarından kesime uğratır.

• Örneğin 9 arjinin ve 7 lisin kalıntısı içeren bir polipeptid tripsin ile muamele edildikten sonra 17 peptid zinciri ortaya çıkarır. Bu peptidlerin C-terminal ucunda ya arjinin ya da lisin bulunacaktır.

Başka kimyasal / enzimatik kesim yöntemleri

• Polipeptidleri parçalayarak Edman

yöntemiyle dizileri belirlenen parçalar tam

olarak proteinin dizisini vermez – peptid

parçalarının dizilişini bilemeyiz!!

• Bunun için ilave bilgiye ihtiyaç vardır.

• Peptidlerin çakıştırılarak analiz edilmesi

gerekir ~ ing: “overlapping peptides”

• Yani ikinci bir yöntemle daha kesim yapılır.

• Ör: polipeptid önce tripsin ile kesilip, sonrasında kimotripsin enzimiyle 2. kesim gerçekleştirilebilir.

• Tripsin Ala veya Lys kalıntılarından keser; kimotripsin aromatik ve büyük yan zincirli kalıntıların bulunduğu noktadan keser (fenilalanin-triptofan gibi).

• OLİGOMERİK proteinler, non-kovalent bağlar

ve disülfid köprüleriyle birleşmiş, birden

fazla alt üniteden oluşurlar.

• Eğer protein 2 veya daha fazla sayıda polipeptid

zincirinden oluşmuş ise o halde önce bunların

sayısı ve yaklaşık uzunlukları SDS-PAGE ile

belirlenebilir

• Alternatif olarak farklı tipteki N-terminal amino

asitler var mı, bakılabilir.

Proteinler, üre, guanidin HCl, vb kaotropik ajanlar ile denature edilir.

Bu işlemlerin sonucunda, primer yapı bozulmaksızın,

polipeptid zincirleri birbirinden ayrılmış olur.

Bireysel polipeptid zincirlerinin elde edilmesi

• SDS-PAGE • Kromatografik yöntemler

Oksidan/ redüktanlar ile sistin yapısındaki S-S bağı kırılır. Bunun için β-merkaptoetanol veya ditiyotreitol gibi maddeler kullanılır.

1- Hidrojen bağlarının koparılması

2- Disülfid köprülerinin yıkılması

3- Altünitelerin birbirinden ayrılması

• Disülfit bağının indirgenmesi

• Bunun için önce DTT varlığında disülfit bağları kırılır

• Daha sonra da alkilleme ile bağların tekrar kurulması engellenir

Kükürt köprülerinin konumu?

• Diyagonal elektroforez yöntemi ile belirlenebilir.

• Önce protein, kükürt köprüleri sağlam kalacak şekilde kesime uğratılır.

• Peptid zincirlerini içeren karışım kağıdın bir köşesine uygulanarak elektroforeze tabi tutulur.

• Daha sonra kağıda performik asit uygulanır, bu madde sülfit bağlarını parçalar; sisteik asit kalıntıları oluşur.

• Disülfit bağı içermeyen polipeptidlerin hareketliliği değişmeyeceği için bunlar çapraz çizgi üzerinde hizaya girerler.

• Sülfit bağları olan polipeptidlerde ayrışma olur ve çaprazlama giden çigiden farklı yerde gözlenirler

Electrophoresis

map of the

CNBr-cleavage

products of the

prochymosin

solubilized from

inclusion bodies

with 8 M urea at

pH 11

aa dizilerini bilmek ne işe yarar?

1. Araştırılan proteinin dizisi bilinen diziler ile kıyaslanır, fark olup olmadığı ortaya çıkar. Eğer protein dizisinde bilinen protein ailelerinden birine özgü bir dizi olduğu tespit edilebilirse, söz konusu proteinin de benzer bir işlevi olduğu görüşü oluşabilir.

• Ör: kimotripsin ve tripsin serin proteazlar ailesinden proteinlerdir

• Bu ailedeki proteinlerin aktif bölgelerinde bulunan reaktif bir serin kalıntısına bağlı olarak proteolitik etki gösterir

• Eğer incelenen proteinin dizisi bu iki proteine benzerlik gösteriyorsa bunun da bir serin proteazı olma olasılığı yüksektir sonucu çıkarılabilir

aa dizilerini bilmek ne işe yarar?

2. Farklı kaynaklardan izole edilmiş aynı işleve sahip proteinlerin aa dizileri kıyaslanarak türler arasındaki (evrimsel) mesafeler araştırılabilir

4. Proteinin çeşitli görev/işlevleri yerine getirmesine yarayan aa dizileri belirlenebilir

• Ör: proteinlerin amino ucunda bulunan 20 kalıntılı belirli bir dizi bu proteinin hücre membranı dışına salgılanacağını gösterebilir; 20 hidrofobik kalıntıdan oluşan bu diziye sinyal dizisi veya öncü dizi denir.

3. aa diziler incelenerek tekrar eden dizilerin olup olmadığı belirlenebilir

• Ör: Calmodulin kalsiyuma duyarlı bir proteindir. Bu protein birbirine benzer aa dizisi içeren 4 bölgeden oluşur. Herbir bölge bir Ca++ iyonu bağlar.

aa dizilerini bilmek ne işe yarar?

5. Belirli bir proteinin analizine yönelik antikorun hazırlanabilmesi için o proteinin aa dizisinden faydalanılır.

• Bir proteinin aa dizisi incelendiğinde belirli dizilerin, protein fare veya tavşana enjekte edildiği taktirde dizideki belirli bölgelerin antikor üretimini tetiklemede daha etkili olacağı görülebilir.

• Bu dizileri içeren peptidler tasarlanarak antikorların üretimi tetiklenebilir.

• Çok spesifik olan bu antikorlar daha sonra bu proteinin çözeltideki veya kan içindeki konsantrasyonunun belirlenmesinde, bir hücre içinde proteinin hangi bölgelerde bulunduğunun belirlenmesinde ve proteini kodlayan genin klonlanmasında kullanılabilir.

aa dizilerini bilmek ne işe yarar? 6. aa dizileri kullanılarak

spesifik DNA probları

sentezlenebilir, • Bir proteinin primer yapısını

bilmek “tersine” genetik

yöntemlerin uygulanabilmesini

sağlar

• Aa genetik şifre ile

oluşturulduğu için aa dizisinin

bilinmesi genetik şifreye uyumlu

DNA problarının

sentezlenebilmesini sağlar

• Proteinde dizi analizi moleküler

genetik biliminin ayrılmaz bir

parçasıdır

Inverse table

Ala/A GCU, GCC, GCA, GCG

Leu/L UUA, UUG, CUU, CUC, CUA, CUG

Arg/R CGU, CGC, CGA, CGG, AGA, AGG

Lys/K AAA, AAG

Asn/N AAU, AAC

Met/M AUG

Asp/D GAU, GAC

Phe/F UUU, UUC

Cys/C UGU, UGC

Pro/P CCU, CCC, CCA, CCG

Gln/Q CAA, CAG

Ser/S UCU, UCC, UCA, UCG, AGU, AGC

Glu/E GAA, GAG

Thr/T ACU, ACC, ACA, ACG

Gly/G GGU, GGC, GGA, GGG

Trp/W UGG

His/H CAU, CAC

Tyr/Y UAU, UAC

Ile/I AUU, AUC, AUA

Val/V GUU, GUC, GUA, GUG

START AUG

STOP UAA, UGA, UAG

Rekombinant DNA teknolojisi proteinlerde dizi

analizinde devrim yaratmıştır.

• Edman yöntemi ile dizi analizi oldukça pratik bir

yöntem olmakla birlikte 1000 kalıntıdan daha

fazla sayıda aa içeren proteinlerin analizinde

günümüzde rekombinant teknolojinin

kullanılması daha iyi bir çözüm olmaktadır.

• Bu sayede proteini kodlayan uzun DNA dizileri

klonlanarak çoğaltılabilir, ve bu DNA’nın dizisi

doğrudan kodladığı proteinin aa dizisini verir

Rekombinant DNA teknolojisi proteinlerde dizi

analizinde devrim yaratmıştır.

• Edman yöntemi ile dizi analizi oldukça pratik bir

yöntem olmakla birlikte 1000 kalıntıdan daha

fazla sayıda aa içeren proteinlerin analizinde

günümüzde rekombinant teknolojinin

kullanılması daha iyi bir çözüm olmaktadır.

• Bu sayede proteini kodlayan uzun DNA dizileri

klonlanarak çoğaltılabilir, ve bu DNA’nın dizisi

doğrudan kodladığı proteinin aa dizisini verir

Rekombinant teknoloji var…proteini

izole etmeye ne gerek var?

• DNA baz dizileri yardımıyla proteinin primer yapısı aydınlatılabilse bile yine de proteinleri izole etmeye gerek duyulur.

• DNA baz dizisi ile elde edilen dizi sadece ham proteinin aa dizisini belirlememizi sağlayabilir. Halbuki protein hücrede sentezlenirken uygun katlama işlemi ile tersiyer yapısına kavuşmuştur.

• Protein sentezi takip eden bazı translasyonu izleyen (ing: posttranslational) modifikasyonlar sayesinde biyolojik işlevini / aktivitesini kazanabilecek forma kavuşur:

• Pek çok protein sentez işlemleri sırasında kırpılır

• veya çok daha büyük polipeptid zincirlerinin uygun şekilde kesilmesiyle oluşturulur

• Bazı proteinlerde sistein kalıntıları kside edilerek kükürt bağları oluşturulur

• Bazı proteinlerde bulunan bbelirli yan zincirler modifiye edilir

• Dolayısıyla genomik ve proteomik analizler birbirini tamamlayıcı şekilde bir arada yürütülmelidir.

İmmünglobulinler

• Vücudun savunmasında çok önemli görev alan, B lenfositler tarafından bir enfeksiyon mevcudiyetinde yapılarak kana salınan güçlü savunma maddeleridir (vücudun savunma silahlarıdır).

• Plazmada bulunan protein yapısında maddelerdir. Gammaglobulinler veya Antikorlar olarak da bilinir.

• “ Ig ” kısaltılmış sembolü ile gösterilirler.

• İmmünglobulinler viral enfeksiyonlara, bakteriyel enfeksiyonlara, allerjilere, mantarlara karşı vücudu üst düzeyde korur.

• Kolostrum'da 5 çeşit immünglobulin vardır: IgA, IgD, IgE, IgG, IgM

• İnek kolostrumu (Bovin Kolostrum) temel olarak IgG içerir. Diğer Ig'ler daha az düzeydedir.

İmmün ~ bağışıklık

İmmünolojik Analizler

• Etiketlenmiş antikorlar (ing: “antibodies”)

kullanılarak hedef protein izole edilebilir,

miktarı belirlenebilir ve gözlenebilir.

Antikor ile

etiketlenmiş

hücrelerin

floresan ışıma

görüntüsü

antikor - antijen

• İmmünolojik yöntemler belirli bir proteine duyarlı antikorların (diğer bir deyişle immünoglobulinlerin; kısaca Ig) sentezlenmesi ile başlar.

• Antikor, antijen adı verilen yabancı bir maddenin varlığına duyarlılık göstererek hayvan bünyesinde sentezlenen proteindir. Sentezlenmelerinin nedeni hayvanın bünyesini enfeksiyondan korumaktır.

• Antikorların sentezlenmelerine sebep olan antijenlerine karşı çok yüksek bir afiniteleri (bağlanma meyilleri) vardır.

• Proteinler, polisakaritler veya nükleik asitler etkin antijenler olabilmektedir.

IgG

Antigen binding fragment (Fab)

Crystalizable fragment (Fc)

V indicates variable portion

62

• IgG antikorları disülfit bağları ile birbirine bağlanmış 2 ağır

(mavi) 2 hafif (kırmızı) olmak üzere 4 zincirden oluşmuştur.

• Hafif ve ağır zincirler biraraya gelerek uçlarında antijen

bağlama noktalarının bulunduğu Fab bölgelerini (Fab

domains) oluşturur.

• İki ağır zincir biraraya gelerek Fc bölgesini oluşturur. Fab

bölgeleri esnek bağlayıcılar ile Fc bölgesine bağlanmıştır.

• Antikorlar antijen üzerindeki belirli bir grubu veya aa kümesini

tanıyabilirler. Tanımayı sağlayan bu bölgeye antijen determinantı

veya epitop (ing: epitope) denir.

• Sentetik polipeptid zincirleri de antikor sentezini tetikleyebilir, yeter ki

küçük molekül, makromoleküler bir taşıyıcı üzerinde yer alsın ve

tanınan bir epitopa sahip olsun.

• Bu durumda küçük yabancı moleküle “hapten” adı verilir.

• Hayvanlarda antikor sentezleyebilme kapasitesine sahip çok fazla sayıda hücre bulunmaktadır. Bunlardan her biri belirli bir antijene duyarlı antikoru üretebilir.

• Canlıya verilen antijenin etkisi bu antijene spesifik antikoru üreten az sayıda hücrenin aniden çoğalmasıyla ve sayısının artmasıyla ortaya çıkar. Böylece bol miktarda antikor sentezlenir.

antijen antikor

Bir protein antijen (bu

örnekte lizozim) Fab

bölgesinin ucuna

bağlanır. Antikorun ucu

ve protenin birbirine

uyumlu yüzeyleri vardır,

bağlanma sırasında hatrı

sayılır bir yüzey alanında

(yani kuvvetli bir)

kenetlenme olur.

Antikorlar heterojendir - poliklonal

• Bir tavşana 3 hafta arayla belirli bir antijen enjekte edilir, haftalar sonra artık tavşanın kanında bu antijene karşı oluşturduğu antikorlar dolaşmaktadır.

• Bu uygulama ile verilen antijene duyarlı antikorları üreten hücrelerin üremesi sağlanmıştır.

• Antikorlar incelendiğinde görülür ki bu antikorların antijene afinitesi farklı seviyelerdedir…birden fazla sayıda (türde) antijen oluşmuştur.

• Bunun sebebi tavşanda antijenin farklı tarafını (epitop) tanıyabilen çeşitli antikorların mevcut olmasıdır. Diğer bir deyişle antijende birden fazla epitop vardır.

• Bu şekilde üretilen antikorlara poliklonal antikor denir.

• Poliklonal antikorlar heterojen antikor karışımlarıdır ve bunlar belirli bir antijende farklı epitoplar üzerinden bağlanabilir.

• Bu heterojenlik araştırmalarda antikorların kullanımını kısıtlayıcıdır.

• Monoklonal antikorlar birbirilerinin kopyasıdır. Bunlar belirli bir antikoru üreten tek tip hücre tarafından üretilirler.

• Monoklonal antikorlar antijende sadece belirli bir epitopa duyarlıdır.

• Monoklonal antikorların sentezlenebilmesi immünolojik yöntemlerde antikorların kullanımını büyük ölçüde arttıran bir gelişme olmuştur.

• Hibridoma hücreleri antikor üreten hücreler ile miyelom hücrelerinin birleştirilmesiyle oluşturulur

• Seçici besiyerinde geliştirilen hibridoma hücrelerinin çoğalması sağlanır

• Hücreler, arzu edilen özellikte (spesifisite) antikor üretimi yapan hücrenin seçimi için taranır.

Proteinler, enzim ilintili immün testi

(ELISA) ile teşhis ve tayin edilebilir. • ELISA, Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay

testinin İngilizce kısaltmasıdır. • ELISA yönteminde: renksiz bir substrat ile renkli

bir ürün oluşturan belirli bir enzim belirli bir antijene duyarlı antikora kovalent bağ ile bağlanmıştır.

• Eğer antijen ortamda mevcutsa, antikor antijene bağlanır, enzim katalizi ile gerçekleşen tepkime ile de renk oluşur

• Dolayısıyla rengin oluştuğu yerde antijen mevcuttur

• Bu analiz çabuk ve spesifiktir. Nanogram miktarlarda antikor bu yöntemle analiz edilebilir.

• ELISA analizlerinde monoklonal antikorların kullanımı daha güvenilir sonuçlar vermektedir.

• 2 tipi vardı: dolaylı ve sadviç

E

Dolaylı ELISA • Dolaylı ELISA:

– Antijenin olup olmadığı belirlenir

– HIV testi bu temele göre gerçekleştirilir

– Antijen (viral proteinler) bir kuyucuğun dibine yerleştirilir/sabitlenir, insan kanı kuyucuğa alınır, insanda antikor varsa antijene bağlanır, bağlanmamış antikorlar ve kan yıkanarak uzaklaştırılır, insan antikorlarına duyarlı enzim etiketli antijen eklenir

Sandviç ELISA

• Sandviç ELISA – Antikor kuyunun dibine sabitlenir, antijeni içeren kan (veya sıvı)

kuyu içine alınır, antijen antikora bağlanır, antijene duyarlı ikinci ve ilkinden farklı bir antikor ilave edilir,

– enzim etiketi sayesinde çok etkili şekilde miktar belirlemek mümkün olur

Bir sonraki derste

• Western blot tekniği

• Floresan etiketleme

• Peptidlerin sentezi

• Proteinlerin NMR ve X-ışını ile 3 boyutlu

yapılarının belirlenmesi

• DNA, RNA ve genetik bilginin akışı

Rekombinant teknoloji var…proteini

izole etmeye ne gerek var?

• DNA baz dizileri yardımıyla proteinin primer yapısı aydınlatılabilse bile yine de proteinleri izole etmeye gerek duyulur.

• DNA baz dizisi ile elde edilen dizi sadece ham proteinin aa dizisini belirlememizi sağlayabilir. Halbuki protein hücrede sentezlenirken uygun katlama işlemi ile tersiyer yapısına kavuşmuştur.

• Protein sentezi takip eden bazı translasyonu izleyen (ing: posttranslational) modifikasyonlar sayesinde biyolojik işlevini / aktivitesini kazanabilecek forma kavuşur:

• Pek çok protein sentez işlemleri sırasında kırpılır

• veya çok daha büyük polipeptid zincirlerinin uygun şekilde kesilmesiyle oluşturulur

• Bazı proteinlerde sistein kalıntıları kside edilerek kükürt bağları oluşturulur

• Bazı proteinlerde bulunan bbelirli yan zincirler modifiye edilir

• Dolayısıyla genomik ve proteomik analizler birbirini tamamlayıcı şekilde bir arada yürütülmelidir.

İmmünolojik Analizler

• İmmün ~ bağışıklık

• Etiketlenmiş antikorlar (ing: “antibodies”)

kullanılarak hedef protein izole edilebilir,

miktarı belirlenebilir ve gözlenebilir.

Antikor ile

etiketlenmiş

hücrelerin

floresan ışıma

görüntüsü

antikor - antijen

• İmmünolojik yöntemler belirli bir proteine duyarlı

antikorların (diğer bir deyişle immünoglobulinlerin; kısaca Ig) sentezlenmesi ile başlar.

• Antikor, antijen adı verilen yabancı bir maddenin varlığına duyarlılık göstererek hayvan bünyesinde sentezlenen proteindir. Sentezlenmelerinin nedeni hayvanın bünyesini enfeksiyondan korumaktır.

• Antikorların snetezlenmelerine sebep olan antijenlerine karşı çok yüksek bir afiniteleri (bağlanma meyilleri) vardır.

• Proteinler, polisakaritler veya nükleik asitler etkin antijenler olabilmektedir.

• Antikorlar antijen üzerindeki belirli bir grubu veya aa kümesini tanıyabilirler. tanımayı sağlayan bu bölgeye antijen determinantı veya epitop (ing: epitope) denir.

• Sentetik polipeptid zincirleri de antikor sentezini tetikleyebilir, yeter ki küçük molekül makromoleküler bir taşıyıcı üzerinde yer alsın ve tanınan bir epitopa sahip olsun.

• Bu durumda kücük yabancı moleküle “hapten” adı verilir.

• Hayvanlarda antikor sentezleyebilme kapasitesine sahip çok fazla sayıda hücre bulunmaktadır. Bunlardan herbiri belirli bir antijene duyarlı antikoru üretebilir.

• Canlıya verilen antijenin etkisi bu antijene spesifik antikoru üreten az sayıda hücrenin aniden çoğalmasıyla ve sayısının artmasıyla ortaya çıkar. Böylece bol miktarda antikor sentezlenir.

• IgG antikorları disülfit bağları ile birbirine bağlanmış 2 ağır

(mavi) 2 hafif (kırmızı) olmak üzere 4 zincirden oluşmuştur.

• Hafif ve ağır zincirler biraraya gelerek uçlarında antijen

bağlama noktalarının bulunduğu Fab bölgelerini (Fab

domains) oluşturur.

• İki ağır zincir biraraya gelerek Fc bölgesini oluşturur. Fab

bölgeleri esnek bağlayıcılar ile Fc bölgesine bağlanmıştır.

antijen antikor

Bir protein antijen (bu

örnekte lizozim) bir

Fab bölgesinin ucuna

bağlanır. Antikorun

ucu ve protenin

birbirine uyumlu

yüzeyleri vardır,

bağlanma sırasında

önemli bir yüzey

alanında kenetlenme

olur.

Antikorlar heterojendir - poliklonal

• Bir tavşana 3 hafta arayla belirli bir antijen enjekte edilir, haftalar sonra artık tavşanın kanında bu antijene karşı oluşturduğu antikorlar dolaşmaktadır.

• Bu antikorlar verilen antijenin antikor üreten hücrelerin üremesini sağlamıştır.

• Antikorlar incelendiğinde görülür ki bu antikorların antijene afinitesi farklı seviyelerdedir…birden fazla sayıda (türde) antijen oluşmuştur.

• Bunun sebebi tavşanda antijenin farklı tarafını (epitop) tanıyabilen çeşitli antikorların mevcut olmasıdır. Diğer bir deyişle antijende birden fazla epitop vardır.

• Poliklonal antikorlar heterojen antikor karışımlarıdır ve bunlar belirli bir antijende farklı epitoplar üzerinden bağlanabilir.

• Bu heterojenlik araştırmalarda antikorların kullanımını kısıtlayıcıdır.

• Monoklonal antikorlar birbirilerinin kopyasıdır. Bunlar belirli bir antikoru üreten tek tip hücre tarafından üretilirler.

• Monoklonal antikorlar antijende sadece belirli bir epitopa duyarlıdır.

• Monoklonal antikorların sentezlenebilmesi immünolojik yöntemlerde antikorların kullanımını büyük ölçüde arttıran bir gelişme olmuştur.

• Hibridoma hücreleri antikor üreten hücreler ile miyelom hücrelerinin birleştirilmesiyle oluşturulur.

• Seçici besiyerinde geliştirilen hibridoma hücrelerinin çoğalması sağlanır.

• Hücreler, arzu edilen özellikte (spesifisite) antikor üretimi yapan hücrenin seçimi için taranır.

Floresans

mikroskopisi

• Belirli bir proteine duyarlı

floresan etiketler

monoklonal antikor ilgi

Gelişmekte olan Drosophila (meyve sineği)

embriyosunun floresan mikrografı

Proteinler enzim ilintili immün testi

(ELISA) ile teşhis ve tayin edilebilir • ELISA yönteminde: renksiz birsubstrat ile renkli bir ürün

oluşturan belirli bir enzim belirli bir antijene duyarlı antikora kovalent bağ ile bağlanmıştır.

• Eğer antijen ortamda mevcutsa, antikor antijene bağlanır, enzim katalizi ile gerçekleşen tepkime ile de renk oluşur

• Dolayısıyla rengin oluştuğu yerde antijen mevcuttur

• Bu analiz çabuk ve spesifiktir. Nanogram miktarlarda antikor bu yöntemle analiz edilebilir.

• ELISA analizlerinde monoklonalantikorların kullanımı daha güvenilir sonuçlar vermektedir.

Birkaç tip ELISA yöntemi vardır

• Dolaylı ELISA: – Antijenin olup olmadığı belirlenir

– HIV testi bu temele göre gerçekleştirilir

– Antijen (viral proteinler) bir kuycuğun dibine yerleştirilir/sabitlenir, insan kanı kuyucuğa alınır, insanda antikor varsa antijene bağlanır, bağlanmamış antikorlar ve kan yıkanarak uzaklaştırılır, insan antikorlarına duyarlı enzim etiketli antijen eklenir

Birkaç tip ELISA yöntemi vardır

• Sandviç ELISA – Antikor kuyunun dibine sabitlenir, antijeni içeren kan (veya sıvı)

kuyu içine alınır, antijen antikora bağlanır, antijene duyarlı ikinci ve ilkinden farklı bir antikor ilave edilir,

– enzim etiketi sayesinde çok etkili şekilde miktar belirlemek mümkün olur

Bir sonraki derste

• Western blot tekniği

• Floresan etiketleme

• Peptidlerin sentezi

• Proteinlerin NMR ve X-ışını ile 3 boyutlu

yapılarının belirlenmesi

• DNA, RNA ve genetik bilginin akışı