DESARROLLOS ANALÍTICOS MODERNOS PARA LA

DETERMINACIÓN DE RETARDADORES BROMADOS DEL FUEGO A NIVEL DE VESTIGIOS EN MUESTRAS DE ORIGEN

BIOLÓGICO, ALIMENTICIO Y AMBIENTAL

UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN LUIS FACULTAD DE QUÍMICA, BIOQUÍMICA Y FARMACIA

Área de Química Analítica

Presentado por:

Bqco. Ariel R. Fontana

Lugar de Trabajo: CCT-CONICET Mendoza

Para optar al grado de:

DOCTOR EN QUÍMICA

Director: Dr. Rodolfo G. Wuilloud

Co-Director: Dr. Luis D. Martínez

INTRODUCCIÓN

Policarbonato, poliestireno, espuma de poliuretano y materiales sintéticos de circuitos eléctricos o electrónicos

Plásticos, productos textiles, computadoras

Retardantes de llama bromados

(BFRs)

Aditivos Reactivos

Br Br

Br Br

Br Br

A:B → A˙ + B˙ → A:Br + B:Br calor BFR

Importancia del análisis de PBDEs

Absorción

dérmica Ingestión Inhalación

Exposición

humana

Biodisponibilidad Bioacumulación

Biomagnificación Persistencia 2,2′,4,4′-tetrabromodifenil éter

(BDE-47)

2,2′,4,4′,5-pentabromodifenil éter

(BDE-99)

2,2′,4,4′,6-pentabromodifenil éter

(BDE-100) 2,2′,4,4′,5,5′-hexabromodifenil éter

(BDE-153)

Bromo Carbono Oxígeno

¿Por qué desarrollar técnicas de

extracción, limpieza y preconcentración?

Bajos niveles de

concentración Complejidad de

las muestras

Técnicas cromatográficas sensibles,

selectivas y confiables

Extracción, limpieza y

preconcentración eficientes

Bajos niveles de

concentración

SOX (Extracción Soxhlet)

USAL (Lixiviación asistida por ultrasonido)

MSPD (Dispersión de la matriz en fase sólida)

MAE (Extracción asistida por microondas)

SFE (Extracción con fluidos supercríticos)

LLE (Extracción líquido-líquido)

SPE (Extracción en fase sólida)

SPME (Microextracción en fase sólida)

SBSE (Extracción con barra adsorbente)

LPME (Microextracciones en fase líquida)

Determinación de PBDEs

Muestras sólidas Muestras líquidas

Limpieza

Met. Destructivos (H2SO4) y no destructivos (AC, GPC, SPE)

GC-MS/MS, GC-MS, GC-ECD

Técnicas de microextracción líquido-líquido

Miniaturización de la LLE convencional, basada en la partición

del analito entre un microvolumen (1 - 100 µL) de solvente

orgánico (fase de extracción) y una fase acuosa (muestra)

Incrementos en los factores de preconcentración y por lo tanto

en la sensibilidad de la metodología analítica así como también

reducción en los límites de detección

Bajo costo Bajo costo Rapidez Simplicidad

operativa

Química

verde

MICROEXTRACCIÓN EN FASE LÍQUIDA

EMULSIFICADA POR ULTRASONIDO PARA

PRECONCENTRACIÓN DE PBDEs EN

MUESTRAS DE AGUA

•Microextracción líquido-líquido

•Radiación ultrasónica

•Análisis de agua

Radiación ultrasónica y su efecto en la

emulsificación

US

Sistema

bifásico

Agua Solvente

Efectos

cavitacionales Emulsión

(< 1 µm)

Transferencia de masa

Superficie de contacto

Tiempos de extracción

Metodología

Muestra

filtrada

Remoción

sobrenadante

10 mL de muestra +

500 µL NaCl 6,15

mol L-1 + 100 L de

CHCl3

USAEME, 5

min 35 °C

Emulsión

Centrifugación,

3500 rpm 2 min

Inyección

Análisis

GC-MS/MS

Agitación, 2 seg

40 kHz,

potencia

600W

USAEME: Microextracción en fase líquida emulsificada por ultrasonido

Condiciones de separación y determinación

mediante GC-MS/MS

Columna: VF-5ms (5% fenil y 95 % dimetilsiloxano) 30 m x 0,25 mm, 0,25 µm espesor de fase

estacionaria, T inyección: 300 °C modo splitless, Velocidad de flujo He: 1 mL min-1

Programa de

temperatura

Temperatura (°C) Velocidad de incremento

(°C min-1)

Tiempo a temperatura

constante (min)

150 0

250 15 0

300 10 10

Analito tR

’

(min)

Rango

m/z

Ión

Precursor

(m/z)

Iones de

Cuantificación

(m/z)

Ventana de

aislamiento (m/z)

Nivel de

excitación (m/z)

BDE-47 0,82 300-500 486 324+326+328 8 214,6

BDE-100 0,93 380-580 566 402+404+406 8 250,0

BDE-99 0,96 380-580 566 402+404+406 8 250,0

BDE-153 1,11 400-650 644 482+484+486 8 284,5

tR’: tiempo de retención relativo al tiempo de retención del estándar interno PCB-209 (IS)

Espectro MS BDE-47

Espectro MS/MS BDE-47

Estudio de variables

Tipo y volumen de solvente de extracción

Presión de vapor CHCl3 → emulsificación

10 mL solución patrón 1 ng mL-1 PBDEs

0

20

40

60

80

100

C2HCl

3CHCl

3

Re

sp

ue

sta

re

lati

va

(%

)

Solvente de extracción

BDE47

BDE100

BDE99

BDE153

CCl4

Tiempo de extracción Temperatura de extracción

10 20 30 40 50 60 70 80

30

40

50

60

70

80

90

100

Re

sp

ue

sta

re

lati

va

(%

)

Temperatura de extracción (°C)

BDE47

BDE100

BDE99

BDE153

Viscosidad

CHCl3

Solubilidad de PBDEs

en la fase acuosa

Estudio del tiempo de centrifugación: 2 – 15 min (3500 rpm). No se observaron

diferencias significativas. Tiempo seleccionado: 2 min

10 mL solución patrón 1 ng mL-1 PBDEs, solvente de extracción 100 µL CHCl3,

USAEME 5 min 35 °C

0 2 4 6 8 10 12 14 160

20

40

60

80

100

Re

sp

ue

sta

re

lati

va

(%

)Tiempo de extracción (min)

BDE47

BDE100

BDE99

BDE153

Emulsifi-

cación

0,0 0,5 2,5 3,0 3,510

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Re

sp

ue

sta

re

lati

va

(%

)Concentración NaCl (mol L

-1)

BDE47

BDE100

BDE99

BDE153

Modo de emulsificación

Sonicado Agitación manual

Aplicación 5 min

RR%

RSDs

RR%

RSDs

Microgotas

Fuerza iónica

Coeficientes de partición

Viscosidad

Absorción de las ondas

US en el medio viscoso

Emulsificación

Fuerza iónica

seleccionada: 500 µL

NaCl 6,15 mol L-1

Efecto del pH: pH 2 – 12, no se observaron cambios

significativos

Muestras reales

0,01 a 1,5 mol L-1

Cifras de mérito analítico

PBDE RSD

(%) FP

Rango lineal

(pg mL-1) r2

LOD

(pg mL-1)

BDE-47 8,3 333 5– 5000 0,9987 2

BDE-100 9,4 328 5– 5000 0,9988 2

BDE-99 9,8 324 5–10000 0,9984 1

BDE-153 10,4 319 5–10000 0,9985 1

Intervalo de confianza 95 %; n=5.

Eficiencia de extracción: > 99 % para todos los analitos 0C

CFP ext

M. Polo et al. Analytical Chemistry 76 (2004) 1054-1062

J.X. Wang et al. Journal of Chromatography A 1137 (2006) 8-14

Y. Li et al. Analytica Chimica Acta 615 (2008) 96-103

0,02 - 0,20 SPME-GC-MS/MS

3,6 - 8,6 SPME-GC-ECD

32 - 52 DLLME-HPLC-VWD

4 - 20 SPME-GC-MS/MS

7 - 9 SPME-GC-ECD

3,8 - 6,3 DLLME-HPLC-VWD

R% satisfactorias→Cuantificación por calibración externa

utilizando soluciones patrones de PBDEs preparadas en CHCl3

Estudio de recuperación y análisis de muestras

BDE

Agua corriente Agua de lago Agua de río

Nivel

Base

10 pg mL-1 50 pg mL-1

Nivel

Base

10 pg mL-1 50 pg mL-1

Nivel

Base

10 pg mL-1 50 pg mL-1

Ea R%b Ea R%b Ea R%b Ea R%b Ea R%b Ea R%b

47 nd 9,7±2,0 97 48±4 96 nd 10,0±2,0 100 51±4 102 nd 10,3±1,5 103 52±3 104

100 nd 10,5±2,5 105 53±5 106 nd 9,8±1,5 98 52±2 104 nd 10,1±1,5 101 53±3 106

99 nd 10,1±2,0 101 51±5 103 nd 9,7±2,0 97 53±2 106 nd 9,8±2,0 98 53±2 106

153 nd 9,8±2,5 98 48±5 97 nd 9,5±2,5 95 48±5 96 nd 10,1±2,0 101 50±4 100

a E: Encontrado. Resultados expresados como n=3; Intervalo de confianza, 95 %; pg mL-1.

nd: inferior al límite de detección

b R%: Recuperación=[(Encontrado - Nivel base)/Agregado]x100

;n

SDtx

0 2 4 6 8 10 12 14 160

3

6

9

12

15

Tiempo (min)

BDE47

BDE100BDE99

BDE153

I.S.

Agua del río Las Tunas, Tupungato, Mendoza adicionada

con 10 ng mL-1 PCB-209 (IS) y 50 pg mL

-1 de PBDEs

0

3

6

9

12

15

I.S.

Cu

en

tas (

x 1

03)

Agua del río Las Tunas, Tupungato, Mendoza

adicionada con 10 ng mL-1 PCB-209 (IS)

EIC para 324, 326, 328, 402, 404, 406, 426, 428, 430, 482, 484, 486 y 496 m/z

Conclusiones parciales

La USAEME resultó una alternativa original, simple, eficiente

y de bajo costo para la extracción y preconcentración de

vestigios de PBDEs en muestras de agua

La reducción del consumo de solventes y reactivos, y consecuentemente desechos, conduce a una metodología

de bajo costo y ambientalmente sustentable

EXTRACCIÓN Y PRECONCENTRACIÓN DE

PBDEs EN MUESTRAS DE AGUA MEDIANTE

EXTRACCIÓN POR PUNTO NUBE Y

RETROEXTRACCIÓN ASISTIDA POR

ULTRASONIDO

•Extracción por punto nube (CPE)

•Solventes ecológicos

•Retroextracción asistida por ultrasonido (UABE)

•Análisis de agua y suelo

GC?

Análisis instrumental

Extracción cloud point

vs.

Extracción L-L

Miniaturización del

sistema de extracción/

preconcentración

Capacidad de

preconcentración

Eficiencia de

extracción Tiempos de

extracción

Consumo de

solventes

LC CE

Metodología

CPE, 5 min

80 °C

Muestra

filtrada 10 mL de muestra + 400 µL NaCl 6,15

mol L-1 + 500 µL solución citrato 0,1

mol L-1 + 40 µL Tritón X-114 100 g L-1 Agitación, 2 seg

Centrifugación,

3500 rpm 2 min.

0°C 3 min

Remoción

sobrenadante

50 µL

Isooctano

UABE, 5 min

Inyección

Análisis

GC-qMS

Analitos tR’ (min) IP (m/z) IC (m/z)

BDE-47 0,64 486 484; 326

BDE-100 0,80 404 564; 406

BDE-99 0,84 404 564; 406

BDE-153 1,09 484 644; 486

IP: ión cuantificación; IC: ión de confirmación

CPE: extracción por cloud point

UABE: Retroextracción asistida por ultrasonido

Estudio de variables

Tipo de tensoactivo y concentración

10 mL solución patrón 1 ng mL-1 PBDEs, 100 µL

tensoactivo, CPE 10 min 80 °C

0,25 0,50 0,75 1,00 1,25 1,50 1,75 2,0050

60

70

80

90

100

Re

sp

ue

sta

re

lati

va

(%

)

BDE47

BDE100

BDE99

BDE153

Tritón X-114 (g L-1

)

[Tritón X-114]:

0,4 g L-1

Factor de

preconcentración

Tritón X-100 Tritón X-114 PONPE 7.5

Sistema bifásico Emulsión

60 µL 30 µL

Volumen de

solvente UABE

Naturaleza de la solución reguladora

sin buffer Citrato pH 5.6 Acetato pH 4 Fosfato pH 7 Borato pH 9.20

20

40

60

80

100

Re

sp

ue

sta

re

lati

va

(%

)

Solución reguladora

BDE47

BDE100

BDE99

BDE153

Modificación de propiedades micelares

Efectos en la solubilización

micelar de los analitos

OH

O

OH

O OH

OH

O

Interacciones puente H

estabilizantes con

grupos de Tritón X-114

Estudio del pH: pH 2 – 12, no se observaron cambios significativos

Estudio de la concentración de citrato: 2,5 x 10-3 a 0,5 mol L-1. Resultados óptimos para [ ] > 4 x

10-3 mol L-1. Condición seleccionada: 500 µL solución citrato 0,1 mol L-1

10 mL solución patrón 1 ng mL-1 PBDEs, 100 µL Tritón X-114, CPE 10 min 80 °C

Temperatura y tiempo de equilibración

Temperatura Tiempo

Deshidratación micelar Volumen de fase

tensoactivo

40 50 60 70 80 9020

30

40

50

60

70

80

90

100

Re

sp

ue

sta

re

lati

va

(%

)

Temperatura (°C)

BDE47

BDE100

BDE99

BDE153

Tiempos de extracción: 3 – 20 min.

Tiempo seleccionado: 5 min. Para

tiempos ↑ no se observaron cambios

significativos

Estudio del efecto de la concentración

salina del medio: 0 – 3,4 mol L-1.

Concentración salina seleccionada:

0,4 mol L-1

10 mL solución patrón 1 ng mL-1 PBDEs,

500 µL buffer citrato 0,1 mol L-1,40 µL

Tritón X-114, CPE 10 min 80 °C

Tipo de solvente y volumen UABE

Isooctano Hexano Eter0

20

40

60

80

100

Re

sp

ue

sta

re

lati

va

(%

)

Solvente UABE

BDE47

BDE100

BDE99

BDE153

Efecto del tiempo UABE: 1 – 15 min

Resultados óptimos: 4 min Respuestas relativas máximas

10 mL solución patrón 1 ng mL-1 PBDEs, 400 µL 6,15 mol L-1 NaCl, 500 µL

solución citrato 0,1 mol L-1 pH 5,6 y 40 µL Tritón X-114 100 g L-1, CPE 7 min 80 °C

0

20

40

60

80

100

50 100 150 200 250 300 350 4000

50

100

150

200

250

Fa

cto

r d

e p

reco

nce

ntr

ació

n

Volumen de isooctano adicionado (L)

BDE47

BDE100

BDE99

BDE153

Re

sp

ue

sta

re

lati

va

(%

)

Cifras de mérito analítico

PBDE RSD

(%) FP

Rango lineal

(pg mL-1) r2

LOD

(pg mL-1)

BDE-47 4,2 250 5 - 150 0,9989 1,2

BDE-100 6,2 250 4 - 150 0,9987 1,0

BDE-99 6,9 250 6 - 150 0,9992 1,5

BDE-153 8,3 250 7 - 150 0,9994 2,0

Intervalo de confianza 95 %; n=5.

Eficiencia de extracción: > 99 % para todos los analitos 0C

CFP ext

R% satisfactorias→Cuantificación por calibración externa

utilizando soluciones patrones de PBDEs preparadas en isooctano

Estudio de recuperación y análisis de muestras

BDE

Agua corriente Agua de lago Agua de río

Nivel

Base

10 pg mL-1 50 pg mL-1 Nivel

Base

10 pg mL-1 50 pg mL-1 Nivel

Base

10 pg mL-1 50 pg mL-1

Ea R%b Ea R%b Ea R%b Ea R%b Ea R%b Ea R%

b

47 nd 9,9 ± 1,2 99 49,0 ± 5,1 98 nd 10,6 ± 1,3 106 52,5 ± 5,5 105 nd 10,8 ± 1,3 108 53,0 ± 5,5 106

100 nd 10,9 ± 1,7 109 52,0 ± 8,0 104 nd 9,8 ± 1,5 98 51,0 ± 7,8 102 nd 10,3 ± 1,6 103 52,0 ± 8,0 104

99 nd 10,2 ± 1,7 102 49,5 ± 8,5 99 nd 9,7 ± 1,7 97 53,5 ± 9,2 107 nd 9,7 ± 1,7 97 51,0 ± 8,7 102

153 nd 9,7 ± 2,0 97 48,0 ± 9,9 96 nd 9,9 ± 2,0 99 48,5 ± 9,9 97 nd 10,4 ± 2,1 104 48,5 ± 9,9 97

a E: Encontrado. Resultados expresados como n=3; Intervalo de confianza, 95 %; pg mL-1.

nd: inferior al límite de detección

b R%: Recuperación=[(Encontrado - Nivel base)/Agregado]x100

;n

SDtx

Conclusiones parciales

La metodología desarrollada es eficiente, robusta, rápida y simple para la extracción y preconcentración de vestigios de

PBDEs en muestras de agua

La reducción del consumo de solventes y reactivos, mediante la utilización de solventes alternativos, sumado a la

miniaturización, brindó una metodología de bajo costo y ambientalmente sustentable

La introducción de la UABE permitió retroextraer los PBDEs y realizar su determinación satisfactoria en el GC-qMS, sin evidencias de deterioro en la eficiencia de la cromatografía

LIXIVIACIÓN ASISTIDA POR ULTRASONIDO,

EXTRACCIÓN EN FASE SÓLIDA DISPERSIVA Y

MICROEXTRACCIÓN LÍQUIDO-LÍQUIDO PARA

LA EXTRACCIÓN, LIMPIEZA Y

PRECONCENTRACIÓN DE PBDEs EN

SEDIMENTOS

•Lixiviación asistida por ultrasonido (USAL)

•Extracción en fase sólida dispersiva (DSPE)

•Microextracción líquido-líquido dispersiva (DLLME)

•Análisis de sedimentos

USAL Presión y

temperatura Penetración del

solvente en la matriz

Transporte de los

componentes solubilizados

DSPE QuEChERS

Extracción exhaustiva

(no selectiva)

Rápida

Simple

Económica

Eficiente

Robusta Segura

DLLME Selectividad en

muestras complejas

Sin separación

de fases

Sistema ternario

Solvente de extracción

Solvente dispersante

Fase acuosa

“Qu”

“E”

“Ch”

“E”

“R” “S”

Metodología

0,25 g sedimento

+ 1,5 mL acetona

Análisis

GC-MS/MS

USAL, 6 ciclos de 5

min, 35 °C

Agitación,

30 seg

Centrifugación,

3500 rpm 2 min

1,2 mL

extracto

0,1 g sílica

activada

DSPE

DLLME, 5

min 35 °C

5 mL agua + 1 mL

de extracto acetona

+ 60 µL CCl4

Agitación, 5 seg

Inyección

USAL: Lixiviación asistida por ultrasonido

DSPE: Extracción en fase sólida dispersiva

DLLME: Microextracción líquido-líquido dispersiva

Estudio de variables USAL-DSPE

Solvente USAL Volumen de solvente USAL

0,25 g de sedimento 50 ng g-1, USAL

radiación continua, 40 min. DSPE: 0,15 g C18

Solvente dispersante

DLLME

Afinidad por

los PBDEs

Miscible y polar

Acetonitrilo

Acetona

Metanol

0 20 40 60 80 100

Respuesta relativa (%)

So

lve

nte

US

AL

BDE47

BDE100

BDE99

BDE153

Eficiencia de

extracción Efecto de dilución

3,2

3,6

4,0

4,4

4,8

0

20

40

60

80

100

6,05,04,03,02,0

Re

sp

ue

sta

re

lati

va

(%

)

Volumen de solvente USAL (mL)

BDE47

BDE100

BDE99

BDE153

1,51,0

ng BDE47

ng BDE100

ng BDE99

ng BDE153

Ma

sa

PB

DE

s (

ng

)

Extracción en fase sólida dispersiva

0 20 40 60 80 100

Respuesta relativa (%)

Ad

so

rbe

nte

DS

PE

BDE47

BDE100

BDE99

BDE153

Sílica activada

C18

PSA

Sin limpieza

Selectividad y

sensibilidad

0,25 g de sedimento 50 ng g-1, USAL 1,5 mL acetona, radiación

continua 40 min. DSPE: 0,1 g de cada adsorbente.

Tiempo y modo

de extracción USAL

6 ciclos de 5 min

3 ciclos de 10 min

2 ciclos de 15 min

30 min continuo

0 20 40 60 80 100

Respuesta relativa (%)

Mo

do

US

AL

BDE47

BDE100

BDE99

BDE153

Eficiencias de extracción

Transferencia de masa

0,25 g de sedimento 50 ng g-1, USAL 1,5

mL acetona. DSPE: 0,1 g sílica activada

Temperatura USAL

10 20 30 40 500

20

40

60

80

100

Re

sp

ue

sta

re

lati

va

(%

)

Temperatura USAL (°C)

BDE47

BDE100

BDE99

BDE153

Estudio de variables DLLME

Solvente y volumen de extracción

0 20 40 60 80 100

CCl4

CHCl3

Respuesta relativa (%)

So

lve

nte

de

ex

tra

cció

n

BDE47

BDE100

BDE99

BDE153

C2HCl

3

-Dispersión satisfactoria

-Sistema bifásico

Apolaridad

Inmiscibilidad en agua

Afinidad por los analitos

Compatibilidad con GC

30 60 90 120 150 180 2100

20

40

60

80

100

Re

sp

ue

sta

re

lati

va

(%

)Volumen de solvente de extracción (L)

BDE47

BDE100

BDE99

BDE153

EE% Dilución

Efecto del volumen adicional de solvente

dispersante: 0 – 1 mL acetona.

0 a 0,5 mL resultados óptimos. Volúmenes

mayores generaban < Respuestas relativas →

↑ Solubilidad de PBDEs en la fase acuosa

Temperatura DLLME

Efecto del tiempo DLLME: 0 – 15 min

Resultados óptimos: 5 min, equilibrio térmico y dispersión satisfactoria del solvente de

extracción

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

40

60

80

100

Re

sp

ue

sta

re

lati

va

(%

)

Temperatura DLLME (°C)

BDE47

BDE100

BDE99

BDE153

Viscosidad

CCl4

Dispersión

Solubilidad de

PBDEs

Transferencia de masa

Cifras de mérito analítico

PBDE RSD

(%) r2

Rango lineal

(ng g-1)

LOD

(ng g-1)

LOD Soxhlet

(ng g-1)

BDE-47 4,7 0,9992 0,07-1000 0,02 0,04

BDE-100 7,3 0,9996 0,09-1000 0,03 0,05

BDE-99 5,5 0,9996 0,10-1000 0,03 0,07

BDE-153 9,8 0,9991 0,19-1000 0,06 0,08

Intervalo de confianza 95 %; n=5

test-t para dos muestras con un 95 % de nivel de

confianza

Curva en matriz Comparación con una

metodología de Referencia

LODs estadísticamente

comparables

Estudio de recuperación y análisis de muestras Muestras de diferente naturaleza y composición:

Muestra 1: corriente arriba Río Mendoza, %TOC: 0,19

Muestra 2: corriente abajo Canal Pescara, % TOC: 4,61

Muestra 3: lago de la ciudad de Mendoza, % TOC: 2,16

BDE

Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3

Nivel

Base

0,25 ng g-1 1 ng g-1

Nivel

Base

0,25 ng g-1 1 ng g-1

Nivel

Base

0,25 ng g-1 1 ng g-1

Ea R%b Ea R%b Ea R%b Ea R%b Ea R%b Ea R%b

47 nd 0,21±0,03 84 1,12±0,13 112 0,32±0,04 0,20±0,04 80 0,80±0,09 80 nd 0,23±0,03 92 1,03±0,12 103

100 nd 0,22±0,03 88 1,04±0,19 104 0,22±0,04 0,21±0,04 84 0,91±0,16 91 nd 0,27±0,05 108 0,89±0,16 89

99 nd 0,27±0,04 108 1,08±0,15 108 0,26±0,05 0,20±0,03 80 0,83±0,11 83 nd 0,25±0,03 100 0,91±0,12 91

153 nd 0,24±0,06 96 0,98±0,24 98 0,26±0,06 0,22±0,07 88 0,92±0,22 92 nd 0,26±0,06 104 1,11±0,27 111

a E: Encontrado. Resultados expresados como n=3; Intervalo de confianza, 95 %; pg mL-1.

nd: inferior al límite de detección

b R%: Recuperación=[(Encontrado - Nivel base)/Agregado]x100

;n

SDtx

Soxhlet-SPE-GC-MS/MS

0,40±0,05

0,25±0,05

0,31±0,04

0,29±0,06

test-t para dos muestras con un 95 %

de nivel de confianza

4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

0

100

200

300

400

500

600

Muestra 2 (5 ng g-1 IS) analizada

con Soxhlet-SPE-GC-MS/MS

BDE153

IS

BDE99

BDE100

BDE47

Tiempo (min)

Cuentas

0

100

200

300

400

500

600

BDE47

BDE100

BDE99

IS

BDE153

Muestra 2 (5 ng g-1 IS) analizada

con USAL-DSPE-DLLME-GC-MS/MS

EIC para 324, 326, 328, 402, 404, 406, 426, 428, 430, 482, 484, 486 y 496 m/z

Conclusiones parciales

La metodología desarrollada es eficiente y rápida para la extracción y preconcentración de vestigios de PBDEs en

muestras de sedimentos

La validación satisfactoria mediante la comparación con una técnica de extracción de referencia (Soxhlet), demostró la

aplicabilidad de la metodología propuesta

El acoplamiento USAL-DSPE permitió incrementar la selectividad y sensibilidad de la metodología; posibilitando la aplicación de DLLME en matrices complejas de sedimentos

DETERMINACIÓN DE PBDEs EN MUESTRAS

BIOLÓGICAS Y ALIMENTICIAS UTILIZANDO

EXTRACCIÓN EN FASE SÓLIDA DISPERSIVA

COMO NOVEDOSA TÉCNICA DE LIMPIEZA DE

EXTRACTOS

•Limpieza de extractos

•Extracción en fase sólida dispersiva (DSPE)

•Análisis de muestras biológicas y alimenticias

Muestras biológicas

Sensibilidad

instrumental Extracción exhaustiva

Lípidos y

proteínas

DSPE

vs.

SPE

Limpieza y

recuperaciones comparables

Sustentabilidad

ambiental

Capacidad de

adsorción/g adsorbente

Metodología

Análisis

GC-MS/MS

Centrifugación,

3500 rpm 2 min

500 µL Hex +

0,20 g C18

Agitación,

10 seg

Inyección

1 g de muestra + 4 g

sulfato de sodio anhidro Muestra homogeneizada

+ 8 mL Hex:DCM (8:2)

USAL, 30 min

5 mL

sobrenadante

Evaporación

a sequedad

Agitación,

30 seg

DSPE

Estudio de variables

Modo de extracción

PBDEs → interacción con

lípidos no polares

Solvente de extracción

Hex

Hex-DCM (8:2)

Hex-DCM-ace (4.5:4.5:1)

Hex-ace (8:2)

0 20 40 60 80 100

Respuesta relativa (%)

BDE47

BDE100

BDE99

BDE153

Efecto del volumen de solvente de extracción: 5 –

16 mL Hex-DCM (8:2). Volumen seleccionado: 8 mL

Efecto del tiempo USAL: 0 – 60 min. Valores

máximos de Respuesta relativa→30 min, después

de lo cual permanecían invariantes.

1 g de muestra 20 ng g-1 de PBDEs. DSPE: 0,25 g C18

USAL Vórtex Manual0

20

40

60

80

100

Re

sp

ue

sta

re

lati

va

(%

)

Modo de extracción

BDE47

BDE100

BDE99

BDE153

Eficiencia US en la

destrucción de la matriz

Limpieza

Tipo de adsorbente DSPE

Efecto de la cantidad de adsorbente: 0,05 –

0,50 g C18. Valores máximos de Respuesta

relativa → 0,20 g

•Comparación con el formato SPE usando

el mismo adsorbente DSPE

•Comparación con método destructivo de

lípidos utilizando ácido sulfúrico 40 %

10 11 12

0

800

1600

2400 Acido sulfúrico 40 % p/v

Acido sulfúrico 40 % p/v y DSPE

DSPE sin ácido sulfúrico 40 % p/v

SPE con 0,2 g C18

BDE-153

BDE-99BDE-100

BDE-47

Cu

en

tas

Tiempo (min)

IS

TIC (Corriente total de iones)

1 g de muestra 20 ng g-1 de PBDEs.

USAL: 8 mL Hex-DCM (8:2), 30 min

Adsorción de interferentes (ácidos grasos,

triglicéridos, fosfolípidos y colesterol)

Florisil

Sílica neutra

C18

PSA

Alúmina neutra

Sin limpieza

0 20 40 60 80 100

Respuesta relativa (%)

Ad

so

rbe

nte

DS

PE

BDE47

BDE100

BDE99

BDE153

Cifras de mérito analítico

PBDE RSD

(%)

Rango lineal

(pg g-1)

LOD

(pg g-1)

BDE-47 8,7 53-500000 9

BDE-100 10,5 66-500000 17

BDE-99 9,3 89-500000 24

BDE-153 10,9 151-500000 44

Intervalo de confianza 95 %; n=5

Curva en matriz

Exactitud de la metodología

Material de referencia certificado, matriz de salmón (WELL-WMF-01)

BDE 47 BDE 100 BDE 99 BDE 1530

20

40

60

80

100

120

140

160

Co

nce

ntr

ació

n (

ng

g-1

)

Analito

Certificado

Medido

95 % de nivel de confianza

Validación de la metodología

•Comparación con técnica de limpieza SPE previamente reportada

BDE

USAL-DSPE-GC-MS/MS USAL-SPE-GC-MS/MS

Nivel base a

(pg g-1) R% b Nivel base a

(pg g-1) R% b

47 98 ± 12 85 ± 9 95 ± 19 81 ± 11

100 nq 79 ± 6 nq 76 ± 8

99 93 ± 16 84 ± 8 91 ± 22 83 ± 10

153 nd 77 ± 8 nd 74 ± 11

a Resultados expresados como n=3; Intervalo de confianza, 95 %;

pg g-1. Concentraciones adicionadas: 200, 250, 400 y 750 pg g-1 para

BDE-47, BDE-100, BDE-99 y BDE-153, respectivamente

nq: inferior al límite de cuantificación

nd: inferior al límite de detección

b R%: Recuperación= [(Encontrado-Nivel base)/Agregado]x100

Muestra de salmón rosado

;n

SDtx

test-t para dos muestras con un 95 % de nivel de confianza

Estadísticamente comparables

•Estudio de recuperación y análisis de muestras

Boga Patí Surubí Moncholo Salmón Pechuga

de pollo Huevo

% Lípidosc 7,8 6,7 3,9 9,2 8,7 2,5 11,8

BDE Ea Ra,b

(%) Ea

Ra,b

(%) Ea

Ra,b

(%) Ea

Ra,b

(%) Ea

Ra,b

(%) Ea

Ra,b

(%) Ea

Ra,b

(%)

47 nq 84 127±21 107 140±25 106 nd 89 98±12 85 nd 97 nd 79

100 nd 89 102±20 111 123±24 104 nd 83 nq 79 nd 104 nd 77

99 nd 81 118±23 114 nd 95 nd 79 93±16 84 nd 94 nd 76

153 nd 78 nd 98 nd 89 nd 78 nd 77 nd 91 nd 75

Concentraciones adicionadas: 200, 250, 400 y 750 pg g-1 para BDE-47, BDE-100, BDE-99 y BDE-153, respectivamente. a E: Encontrado. Resultados

expresados como n=3; Intervalo de confianza, 95 %; pg g-1 peso húmedo.

nq: inferior al límite de cuantificación

nd: inferior al límite de detección b R%: Recuperación= [(Encontrado-Nivel base)/Agregado]x100 C Determinado por gravimetría

;n

SDtx

Concentraciones inferiores a las reportadas

10 11 12

0

100

200

300

400

500 Muestra de patí adicionada

con 2 ng g-1

IS y 0,2 ng g-1

de BDEs

BDE-153

IS

BDE-99BDE-100

BDE-47

Tiempo (min)

Cu

en

tas

0

100

200

300

400

500

600

BDE-99

118 pg g-1

BDE-100

102 pg g-1

BDE-47

127 pg g-1

ISMuestra de patí adicionada

con 2 ng g-1

IS

EIC para 324, 326, 328, 402, 404, 406, 426, 428, 430, 482, 484, 486 y 496 m/z

Conclusiones parciales

La metodología propuesta es una alternativa conveniente para la preparación de muestras complejas debido a su

eficiencia analítica, escaso costo, simplicidad, robustez y exactitud

El reporte de contaminación con PBDEs en peces de nuestro país constituye un dato valioso en el establecimiento de

probables rutas de exposición a estas sustancias en países en desarrollo

La novedosa limpieza mediante DSPE brindó resultados satisfactorios, reduciendo los tiempos y costos inherentes a

las técnicas convencionales

CONCLUSIONES

GENERALES

Las metodologías desarrolladas brindan una solución concreta y eficiente a muchos de los inconvenientes que

surgen en el análisis de PBDEs

Se obtuvieron metodologías analíticas eficientes utilizando instrumentación y materiales de bajo costo, disponibles en laboratorios, sumado al reducido impacto ambiental de las

mismas

La utilización de novedosas técnicas de microextracción como USAEME, DLLME y CPE así como la limpieza DSPE posibilitó eficientes desarrollos analíticos ambientalmente

sustentables

PUBLICACIONES CIENTÍFICAS (CON REFERATO INTERNACIONAL)

PRESENTACIONES A REUNIONES CIENTÍFICAS

XXVII Congreso Argentino de Química Septiembre de 2008, Tucumán - Argentina

Microextracción en fase líquida emulsificada por

ultrasonido para preconcentración de éteres difenilos

polibromados y posterior análisis por GC-MS Ariel R. Fontanaa; Rodolfo G. Wuillouda,b, Luis D.

Martínezb,c; Jorgelina C. Altamiranoa,b

Aplicación de sistemas micelares organizados como

técnica de extracción y preconcentración para GC-

MS: análisis de PBDEs en muestras de agua Ariel R. Fontanaa; María F. Silvab,c; Rodolfo G.

Wuillouda,b, Luis D. Martínezd,b; Jorgelina C.

Altamiranoa,b

aLaboratorio de Investigaciones y Servicios Ambientales Mendoza

(LISAMEN), (CCT-CONICET-Mendoza), Av. Ruiz Leal S/N Parque General

San Martín, CC. 131, M 5502 IRA Mendoza, Argentina, bConsejo Nacional

de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), cArea de Química

Analítica, Facultad de Química, Bioquímica y Farmacia, Universidad

Nacional de San Luis

aLaboratorio de Investigaciones y Servicios Ambientales Mendoza

(LISAMEN), (CCT-CONICET-Mendoza), Av. Ruiz Leal S/N Parque General

San Martín, CC. 131, M 5502 IRA Mendoza, Argentina, bConsejo Nacional

de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), cDepartamento de

Química Orgánica y Biológica de la Facultad de Ciencias Agrarias,

Universidad Nacional de Cuyo, dArea de Química Analítica, Facultad de

Química, Bioquímica y Farmacia, Universidad Nacional de San Luis

COLACRO XII, Latin American Congress of Chromatography and Related Techniques

Octubre del 2008, Florianópolis(SC) - Brazil

Micellar organized medium as extraction and

preconcentration technique for GC-MS: determination

of brominated flame retardants in water samples

Ariel R. Fontanaa; María F. Silvab,d; Fabio De Souza

Diasc; Rodolfo G. Wuillouda,d; Jorgelina C.

Altamiranoa,d

aLaboratorio de Investigaciones y Servicios Ambientales Mendoza, CCT - CONICET

- Mendoza- Argentina, bDepartamento de Química Orgánica y Biológica, Facultad de

Ciencias Agrarias, Universidad Nacional de Cuyo, Mendoza, Argentina, cUniversidade Federal da Bahia, Instituto de Química, Salvador, Bahia, Brazil, dConsejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET)

2nd Latin American Pesticide Residue

Workshop. Food and Environment Junio del 2009, Santa Fe - Argentina

Simple approach based on dispersive liquid-liquid

microextraction technique for determination of

polibrominated flame retardants in water samples by

GC-MS/MS

Ariel R. Fontanaa; Rodolfo G. Wuillouda,b; Jorgelina C.

Altamiranoa,b

aLaboratorio de Investigaciones y Servicios Ambientales Mendoza (LISAMEN), CCT-

CONICET-Mendoza. P.O. Box 131, 5500 Mendoza, Argentina, bInstituto de Ciencias

Básicas, Universidad Nacional de Cuyo

V Congreso Argentino de Química Analítica Noviembre de 2009, Bahía Blanca - Argentina

Sensible determinación de éteres difenilos polibromados

en sedimentos mediante combinación de lixiviación

asistida por ultrasonido y microextracción líquido-líquido

dispersiva previo al análisis por GC-MS/MS

Ariel R. Fontanaa; Rodolfo G. Wuillouda,b; Jorgelina C.

Altamiranoa,b

aGrupo de Investigación y Desarrollo en Química Analítica (QUIANID), (LISAMEN,

CCT CONICET–Mendoza), bInstituto de Ciencias Básicas, Universidad Nacional de

Cuyo

5th International Symposium on Brominated

Flame Retardants Abril de 2010, Kioto - Japón

Dispersive solid-phase extraction followed by liquid-

liquid microextraction for extraction and

preconcentration of PBDEs from sediment samples

prior gas chromatography-mass spectrometry

Jorgelina C. Altamiranoa,b; Ariel R. Fontanaa; Rodolfo

G. Wuillouda,b

aGrupo de Investigación y Desarrollo en Química Analítica (QUIANID) (LISAMEN,

CCT CONICET – Mendoza), Av. Ruiz Leal S/N, Parque General San Martín, 5500

Mendoza, Argentina, bInstituto de Ciencias Básicas, Universidad Nacional de Cuyo.

Mendoza, Argentina

31st International Symposium on Halogenated Persistent Organic Pollutants – Dioxin 2011

Agosto de 2011, Bruselas - Bélgica

Novel clean-up technique based on dispersive solid-

phase extraction for the determination of

polybrominated diphenyl ethers in biological samples

Ariel R. Fontanaa; Luis D. Martinezb,c; Jorgelina C.

Altamiranoa,d

aGrupo de Investigación y Desarrollo en Química Analítica (QUIANID) (LISAMEN,

CCT CONICET – Mendoza), Av. Ruiz Leal S/N, 5500 Mendoza, Argentina, bFacultad

de Química, Bioquímica y Farmacia, Universidad Nacional de San Luis, Argentina, cINQUISAL-CONICET, Departamento de Química Analítica, Facultad de Química,

Bioquímica y Farmacia, Universidad Nacional de San Luis, Argentina, dInstituto de

Ciencias Básicas, Universidad Nacional de Cuyo, Argentina

Presentación oral

Agradecimientos

Gracias por su atención!!