1. 1. Protocolos e recomendaes da ENSCONET para a conservao de sementes Editor: Royal Botanic Gardens, Kew Verso: 15 de Junho de 2009 ISBN: 978-84-692-6456-0 Citao: ENSCONET (2009) Protocolos e recomendaes da ENSCONET para a conservao de sementes
2. 2. O contedo deste documento baseia-se no Workshop da ENSCONET A critical review of key curation procedures que teve lugar no Departamento de Ecologia do Territrio, Universidade de Pavia, Via S. Epifanio 14 - 27100 Pavia, Itlia 22 - 26 de Outubro 2007 A ENSCONET foi financiada pelo Sexto Programa-Quadro da Comisso Europeia, como Aco Integrada implementada como Aco de Coordenao. O documento reflecte as opinies dos membros do projecto; a Comisso Europeia no responsvel por qualquer utilizao da informao nele contida. Tambm disponvel em Ingls, Francs, Alemo, Grego, Hngaro, Italiano, Polaco e Espanhol Traduo da verso inglesa: Adelaide Clemente & Maria Amlia Martins-Louo Banco de Sementes A.L. Belo Correia, Jardim Botnico, Museu Nacional de Histria Natural, Universidade de Lisboa Rua da Escola Politcnica 58, 1250-102 Lisboa, Portugal
3. 3. Agradecimentos e membros da ENSCONET Acrnimos usados neste documento, seguidos do nome da instituio e endereo RBGK - Seed Conservation Department, Royal Botanic Gardens, Kew, Wakehurst Place, Ardingly, West Sussex RH17 6TN, UK NKUA - Department of Botany, Faculty of Biology, National and Kapodistrian University of Athens, Panepistimiopolis, Athens 15784, GREECE IB SAS - Institute of Botany, Slovak Academy of Sciences, Dbravsk cesta 14, 845 23 Bratislava, SLOVAKIA BZBG - Budapest Zoo & Botanical Garden, P.O. Box 469, llatkerti krt 6-12, H-1146 Budapest, HUNGARY MAICh - Mediterranean Agronomic Institute of Chania, Alsyllion Agrokepion, P.O. Box 85, 73100 Chania (Crete), GREECE JB Cordoba - IMGEMA - Jardn Botnico de Crdoba, Avda. de Linneo s/n, 14004 Crdoba, SPAIN TCD - Trinity College Botanic Garden, Palmerston Park, Dartry, Dublin 6, IRELAND Jardin Canario - Jardin Botanico Viera y Clavijo del Cabildo de Gran Canaria, Apdo 14, 35017 Tafira Alta, Las Palmas de Gran Canaria, SPAIN CYARI - Agricultural Research Institute, P.O.Box 22016, 1516 Nicosia, CYPRUS UPM - Departamento de Biologa Vegetal, Escuela Tcnica Superior de Ingenieros Agrnomos, Universidad Politcnica de Madrid, Ciudad Universitaria s/n, 28040 Madrid, SPAIN NBGB - National Botanic Garden of Belgium, Domein van Bouchout, 1860 Meise, BELGIUM MNHN - Musum National dHistoire Naturelle, Dpartement des Jardins Botaniques et Zoologiques, Case postale 45, 57, rue Cuvier, 75231 Paris Cedex 05, FRANCE UNI-PAV-CFA - Universit degli Studi di Pavia, Dipartimento di Ecologia del Territorio e degli Ambienti Terrestri, Via S. Epifanio, 14, 27100 Pavia, ITALY Pisa Botanic Garden - Department of Biology, Pisa University, Via Luca Ghini 5, 56126 Pisa, ITALY JB Soller - Jard Botnic de Sller, Ctra. Palma-Port de Sller Km 30,5, Apartat de Correus 44, 07100 Sller, SPAIN MTSN - Museo Tridentino di Scienze Naturali Trento, Via Calepina 14, 38100 Trento, ITALY UVEG - Jard Botnic de la Universitat de Valncia, C/ Quart, 80, 46008 Valencia, SPAIN HBV - Department of Biogeography and Botanical Garden, University of Vienna, Rennweg 14, 1030 Vienna, AUSTRIA BG-CBDC PAS - Botanical Garden, Center for Biological Diversity Conservation of the Polish Academy of Sciences, Prawdziwka 2, 02-973 Warszawa 76, POLAND FUB-BGBM - Botanischer Garten und Botanisches Museum Berlin-Dahlem, Freie Universitt Berlin, Knigin- Luise-Str. 6-8, 14191 Berlin, GERMANY HUBG - Botanic Garden, P.O.Box 44 (Jyrngntie 2), 00014 University of Helsinki, FINLAND FUL - Jardim Botnico / Botanical Garden, Museus da Politcnica, R. Escola Politcnica 58, 1269-102 Lisboa, PORTUGAL NHMOSLO - Botanical Garden, Natural History Museum, University of Oslo, P.O. Box 1172, Blindern, 0318 Oslo, NORWAY IB-BAS - Department of Applied Botany, Institute of Botany, Bulgarian Academy of Sciences, 23, Acad. G. Bonchev Str., 1113 Sofia, BULGARIA AS-BOKU - Institute of Botany and Botanical Garden, Department of Integrative Biology, University of Natural Resources and Applied Sciences, Gregor-Mendel-Str. 33, 1180 Wien, AUSTRIA Luxembourg - Living plant collections, Muse national dhistoire naturelle, 25 rue Munster, 2160 Luxembourg, LUXEMBOURG Geneva - Conservatoire et Jardin botaniques de la ville de Genve, 1 chemin de lImperatrice, Case postale 60, 1292 Chambsy/GE, SWITZERLAND FIT Nicosa - Frederick University Cyprus, Nature Conservation Unit, P.O.Box 24729, 1303 Nicosia, CYPRUS Outras instituies participantes: Hungarian Academy of Sciences, Research Institute of Soil Science and Agricultural Chemistry Department of Soil Biology, Herman Ott t 15, H-1022 Budapest, HUNGARY Global Crop Diversity Trust, c/o FAO, Viale delle Terme di Caracalla, 00153 Rome, ITALY
4. 4. NDICE Recomendaes da ENSCONET para a conservao de sementes.............. i Introduo........................................................................................................ 1 Tema 1. Limpeza das sementes....................................................................... 4 Tema 1a. Equipamento e procedimentos comuns.......................... 5 Tema 2. Secagem das sementes...................................................................... 10 Tema 2a. Heterogeneidade das amostras e velocidade de secagem 10 Tema 2b. Circulao de ar.............................................................. 11 Tema 2c. Monitorizao da secagem............................................. 11 Tema 2d. Temperatura e humidade durante a secagem................. 12 Tema 2e. Equipamento de secagem.............................................. 13 Tema 3. Monitorizao do contedo em gua................................................. 15 Tema 3a. Medio da humidade relativa em equilibrio................... 15 Tema 3b. Uso de higrmetros para monitorizar o contedo das sementes em gua......................................................................... 17 Tema 4. Acondicionamento.............................................................................. 19 Tema 5. Armazenamento a longo prazo: Temperatura..................................... 22 Tema 5a. Temperatura de armazenamento.................................... 22 Tema 5b. Instalaes e equipamento.............................................. 23 Tema 6. Testes de germinao......................................................................... 26 Tema 7. Vouchers e verificao........................................................................ 31 Tema 8. Gesto de datos.................................................................................. 32 Tema 9. Regenerao das coleces de sementes......................................... 33 Anexo 1. Sumrio de palavras-chave dos sistemas de reproduo 38 Anexo 2. Possvel formulrio para as coleces provenientes de regenerao 40 Tema 10. Distribuio das sementes................................................................ 42 Bibliografia........................................................................................................ 44
5. 5. RECOMENDAES DA ENSCONET PARA A CONSERVAO DE SEMENTES LIMPEZA DAS SEMENTES Para mais detalhes ver Temas 1. Idealmente, todos os lotes de sementes deveriam ser cuidadosamente limpos at que todo o material vegetal fosse removido. Contudo, nalguns casos, pode ser necessrio armazenar as coleces com algum grau de impureza e registar essa informao na base de dados. Amaioria das sementes de espcies silvestres deve ser limpa manualmente, com o auxlio de algum equipamento. O equipamento deve ser limpo entre cada utilizao com amostras diferentes. Os operadores devem ter conhecimento da morfologia de sementes e frutos ao nvel da famlia, e devem ter capacidade para interpretar as estruturas lupa. As operaes de limpeza de sementes devem ser realizadas numa bancada com ar forado e filtro de poeira, ou numa rea restrita, tendo os operadores o cuidado de usar ms caras anti- poeira de tipo adequado. Durante a limpeza, as sementes devem ser inspeccionadas numa lupa, para detectar sementes danificadas. Os resduos produzidos durante a limpeza devem ser destrudos, preferencialmente por incin- erao controlada. O nmero de sementes vazias deve ser avaliado na amostra limpa com um teste de corte ou anlise de raio-X. SECAGEM E MONITORIZAO DO CONTEDO EM GUA Para mais detalhes ver Temas 2 e 3. At que existam novos dados disponveis, recomenda-se a secagem das sementes em equil- brio com o ar a cerca de 15% HR (cerca de 3,5-6,5% de contedo em gua, dependendo do teor de leo das sementes) e 10-20 C nos casos em que a conservao feita a temperaturas inferiores a 0 C. A ultra-secagem (inferior a 15% HR) recomendada nos casos em que a conservao feita a temperaturas superiores a 0 C. A secagem a temperaturas elevadas ou em estufas de secagem no recomendada. As sementes ou frutos em diferentes estdios de maturao devem, se possvel, ser separados em sub-amostras e cada uma delas deve secar independentemente, depois de atingir a maturao. Para maximizar a velocidade de secagem, as sementes devem ser distribudas em camadas finas num ambiente com circulao de ar. Os frutos ou sementes imaturos devem amadurecer durante 2-3 semanas em condies semelhantes s condies naturais do local de colheita. As sementes extradas de frutos carnudos maduros devem secar gradualmente nas condies ambientais (60-70% HR, 20-25 C, durante 1-2 semanas) antes de serem transferidas para a sala de secagem. Usar a humidade relativa em equilbrio (HRe) para monitorizar a secagem, tendo em conta as potenciais fontes de erro. Este parmetro pode ser medido usando higrmetros, data loggers
6. 6. ii ou slica-gel. Para os bancos de sementes mdios a grandes (ca. 100 - 1000 amostras por ano), recomenda- se uma sala de secagem com possibilidade de ajustar a HR para o valor desejado. Para o processamento em pequena escala, de um nmero de amostras reduzido (ca. menos de 100 por ano), aconselha-se o uso de desidratantes, como slica-gel, ou uma cmara / incubadora com HR regulvel. As sementes com elevado contedo em gua devem secar em condies ambientais durante 2-3 dias, antes de iniciar a secagem com desidratante. No caso de se usar slica-gel, uma proporo 1:1 dever secar as sementes de forma adequada (30 % HRe). ACONDICIONAMENTO Para mais detalhes ver Tema 4. Para a conservao a longo prazo usar recipientes de vidro transparentes, com tampa reutilizvel, para coleces com acesso frequente; recipientes de vidro selados chama ou embalagem dupla em recipientes de vidro, com tampa reutilizvel, para coleces com acesso pouco frequente. Os sacos de folha de alumnio podero ser igualmente eficazes, desde que devidamente selados e, de preferncia, em embalagem dupla. As sementes devem ser embaladas preferencialmente num ambiente com humidade controlada. Colocar um indicador de humidade (pequeno saco de slica-gel) no recipiente para monitorizar a hermeticidade e para proteco contra catabolitos. A slica-gel deve serequilibrada nas condies de secagem usadas no banco de sementes (normalmente 15 % HR). Verificar e substituir periodicamente a selagem (se aplicvel). Testar a hermeticidade dos lotes de recipientes usando um procedimento padronizado. ARMAZENAMENTO Para mais detalhes ver Tema 5. As temperaturas abaixo de 0 C (normalmente entre -18 e -20 C) so recomendadas para a conservao a longo prazo da maioria das sementes ortodoxas. Para o armazenamento convencional a temperaturas no-criognicas, temperaturas abaixo de -35 C no parecem trazer benefcios longevidade das sementes que justifiquem os custos adicionais. A criopreservao em azoto lquido recomendada para espcies com sementes ortodoxas com longevidade baixa. Todas as amostras devem ser duplicadas noutro banco de sementes. Este banco deve estar situado a uma distncia considervel, de modo a que no esteja sujeito aos mesmos fenmenos catastrficos que possam destruir a coleco principal. TESTES DE GERMINAO Para mais detalhes ver Tema 6. Recomenda-se a realizao dos testes de germinao no maior nmero possvel de coleces aps a secagem das sementes e, se possvel, aps o armazenamento. Seria desejvel que os testes de germinao fossem realizados antes e aps a secagem, para identificar possveis efeitos da secagem e congelamento na capacidade de germinao. Se os recursos forem
7. 7. iii limitados e s for possvel realizar um teste, recomenda-se que este seja realizado no primeiro ms depois do armazenamento. A percentagem de germinao deve ser expressa em termos do nmero de sementes com capacidade fsica para germinar (nmero total de sementes - nmero de sementes sem embrio ou danificadas). Uma amostra de 200 sementes ideal, mas duas rplicas de 50 ou 25 sementes so aceitveis. Para evitar as leses por embebio, as sementes de espcies susceptveis devem ser humedecidas antes do teste de germinao. A germinao das sementes uma caracterstica extremamente plstica e os requisitos podem variar consideravelmente com a espcie, populao, ano de colheita e at mesmo o tempo de conservao. A bibliografia ou as bases de dados, como a Seed Information Database, RBGK (Liu et al., 2008: http://data.kew.org/sid/sidsearch.html) e LEDA traitbase (http://www. leda-traitbase.org/tomcat/LEDAportal/index.jsp) podem orientar na definio das condies de germinao. Caso essa informao no exista, pode usar-se o clima da regio de origem, a ecologia e a estrutura das sementes como orientao. As sementes de muitas espcies silvestres apresentam dormncia. Nestes casos, tero de ser aplicados os tratamentos adequados para quebrar a dormncia. O substrato para a germinao pode ser agar, papel de filtro ou areia. O agar (geralmente 1%) tem as seguintes vantagens: manuteno baixa; baixo risco de leses por embebio; concentrao dos produtos qumicos aplicados constante; fcil identificao das radculas brancas num fundo escuro; fcil remoo das plntulas para transplante. Em todos os casos, deve usar-se gua destilada ou desionizada. As sementes no devem tocar-se no substrato de germinao. As temperaturas constantes devem ser evitadas, se possvel, excepto nos tratamentos de estratificao.Aluz contnua tambm deve ser evitada, devido ao risco de inibio da germinao. Considera-se que uma semente germinou quando se d a emergncia de uma radcula com cerca 1 a 2 mm de comprimento ou com pelo menos o mesmo comprimento que a semente. VOUCHERS E VERIFICAO Para mais detalhes ver Tema 7. Excepto nos poucos casos em que as populaes so bem conhecidas, deve ser recolhido um espcime de herbrio representativo da populao na qual as sementes foram colhidas. Este procedimento deve ter em conta a raridade ou grau de ameaa das populaes. GESTO DE DADOS Para mais detalhes ver Tema 8. Quando se regista os dados de cada colheita de sementes fundamental ter em conta que os dados so importantes para os utilizadores, no presente e durante o tempo de vida das se- mentes (provavelmente por um perodo de 200 anos). Portanto, os dados devem ser objectivos e devem ser registados de acordo com normas de referncia. REGENERAO Para mais detalhes ver Tema 9. A regenerao um processo caro e, sempre que possvel, deve ser evitado pela colheita, no campo, de um grande nmero de sementes de elevada qualidade. Nalguns casos, prefervel optar por fazer nova colheita no campo (se ainda for possvel).
8. 8. iv Deve reduzir-se, tanto quanto possvel, os riscos de seleco, deriva gentica ou hibridao entre entidades aparentadas, tendo simultaneamente em conta que a eliminao total desses riscos praticamente impossvel. Deve usar-se o conhecimento disponvel sobre os mecanis- mos de reproduo para seleccionar o mtodo de polinizao (e.g. evitar a autopolinizao nas espcies alogmicas e assegurar o isolamento gentico). Os procedimentos de cultivo so essenciais para minimizar a perda de plantas (condies semelhantes s naturais) e maximizar a produo de semente (reduo da competio e opti- mizao da produo de flores e sementes). O mtodo ideal para assegurar a manuteno da variabilidade gentica consiste em cruza- mentos recprocos mas, em muitos casos, uma prtica demorada e complicada; importante garantir que a contribuio de plen semelhante em todas as plantas. A polinizao assistida em vrias datas assegura a contribuio das plantas com florao pre- coce e tardia. Se possvel, as sementes produzidas por cada progenitor devem ser mantidas em separado, e usadas de forma equitativa na produo da prxima gerao. Se isso no for possvel, pode agrupar-se as sementes de forma equitativa, em que cada progenitor contribui com a mesma proporo de sementes para a amostra; as sementes para produzir a prxima gerao devem ser seleccionadas ao acaso e no devem ser em nmero inferior gerao anterior, para evitar o efeito de gargalo. As condies de crescimento e os resultados da regenerao devem ser devidamente docu- mentados. DISTRIBUIO DAS SEMENTES Para mais detalhes ver Tema 10. As listas de sementes devem incluir coleces com a quantidade de sementes adequada, nvel de germinao aceitvel e identidade verificada; no devem incluir coleces para as quaisexistam restries definidas em acordos prvios ou espcies com caractersticas invasoras reconhecidas. importante que os bancos de sementes mantenham um stock de sementes que no distribudo. Isso consegue-se, quer separando fisicamente uma parte para conservao (amostra base) e outra para utilizao (amostra activa), quer mantendo um sistema de controlo na base de dados que assinala o momento em que a coleco atinge valores limite. Tendo em conta a soberania nacional e os direitos de propriedade que regulamentam o uso dos recursos genticos, as sementes so normalmente distribudas ao abrigo dos termos de um acordo legal de transferncia de material, que determina as utilizaes possveis das sementes, a passagem a terceiros e partilha de benefcios. As autoridades fitossanitrias, CITES e a Directiva Habitats devem ser consideradas quando o material enviado para o estrangeiro. As amostras devem ser enviadas em sacos de folha de alumnio, acompanhadas de informao relevante (passaporte e germinao). O banco de sementes deve manter um registo dos requisitantes e usos das sementes distribudas. Esta informao essencial para demonstrar o valor das coleces de sementes. Sempre que possvel, os curadores devem discutir os tipos de coleco requisitados pelos utilizadores, pois isso permite maximizar a utilizao das coleces.
9. 9. INTRODUO Objectivo deste documento O objectivo deste documento fornecer o melhor aconselhamento disponvel s instituies envolvidas na conservao de sementes de espcies silvestres a longo prazo (ou que pretendem inici-la), na Europa, mas tambm mais amplamente. Pretende-se que este documento seja um guia e no um manual prescritivo. Para manuais mais detalhados, os curadores devero referir- se a (sementes de cultivares - Rao et al., 2006; sementes de rvores - Schmidt, 2000; espcies silvestres CPC, 1986; Bacchetta et al., 2008; OffordMeagher, 2009); para obter informao de base mais detalhada ver Smith et al., (2003), especialmente o captulo de Terry et al. (2003). Para cada tema abordado, so dadas recomendaes para os bancos de sementes dedicados conservao de espcies silvestres. Essas recomendaes baseiam-se nas normas para os bancos de germoplasma, elaboradas pela FAO / IPGRI (1994). So igualmente enumeradas reas para investigao futura. Temas abordados Limpeza, secagem, monitorizao do contedo em gua, acondicionamento, armazenamento, germinao, verificao taxonmica, gesto de dados, regenerao e distribuio de amostras de sementes (as Figuras 2 e 3 mostram a sequncia destes processos nas instalaes de um banco de sementes de espcies silvestres). Figura 1 Sementes conservadas a longo-prazo. ( RBGK)
10. 10. Figura 2 Elementos principais nos processos de conservao de um banco de sementes (adaptado de Smith et al., 2003) Planeamento e autorizaes Colheita de sementes e vouchers etiquetados e registo de dados de campo Expedio rpida para o banco de sementes Inspeco de problemas, secagem e montagem de vouchers Criao de registos de dados para cada coleco Avaliao da tolerncia desidratao (se desconhecida) Limpeza das sementes1 Anlise de raio-X ou teste de corte Determinao da quantidade de sementes Secagem Determinao do contedo em gua Teste de germinao inicial2 Acondicionamento e duplicao3 Armazenamento no frio Caracterizao e avaliao4 Distribuio de sub-amostras caracterizadas aos utilizadores (ao longo do tempo) Testes de germinao (ao longo do tempo) Regenerao / multiplicao das coleces (quando necessrio)5 A limpeza por vezes antecedida de um perodo de secagem. As amostras pequenas podem ser multiplicadas neste estdio. Procedimento aps a colheita igual ao do material colhido no campo. Este passo por vezes adiado para a fase ps-armazenamento, se for necessrio confirmar a tolerncia desidratao e s temperaturas baixas. Requer um recipiente reutilizvel. Os duplicados devem ser depositados num local bem afastado. Apropriadas a cada caso. Procedimento aps a colheita igual ao do material colhido no campo. Planeamento Colheita Processamento Testes Armazenamento Utilizao
11. 11. Figura 3 Diagrama dos principais processos e instalaes num banco de sementes Plantas Sementes Limpeza e teste de pureza Secagem Laboratrio de limpeza Estufa Herbrio Expedio Sala fria Amostraretirada Herbrio verificao de espcimes Chegada Germinao Estufa Exterior Sala de secagem Sala fria Laboratrio de germinao Acondicionamento
12. 12. TEMA 1. LIMPEZA DAS SEMENTES Resumo redigido por Gianni Bedini (Jardim Botnico de Pisa), com base nas experincias de UVEG, MNHN, RBGK e Jardim Botnico de Pisa, e na sesso de discusso. Aspectos gerais A limpeza de sementes o acto de retirar todas as partes e tecidos que envolvem as sementes, bem como qualquer material no vegetal (e.g. insectos ou partculas de solo) e sementes de outras espcies (ver MSBP Technical Information Sheet 14 http://www.kew.org/msbp/scitech/ publications/14-Seed%20cleaning.pdf). Embora seja uma tarefa demorada, exija conhecimentos tcnicos, espao considervel e equipamento especfico, o processo de limpeza apresenta vrios benefcios: Economiza espao durante o armazenamento no frio. Se a limpeza for feita antes da secagem, tambm economiza espao e tempo na sala / equipamento de secagem. Permite a inspeco visual do lote de sementes para identificao de sementes vazias, imaturas, danificadas ou infestadas (inteis para a conservao) e sua posterior eliminao. Elimina agentes patgenicos (fungos, bactrias e vrus), que normalmente esto presentes nas estruturas eliminadas. Isto tambm facilita o cumprimento das regulamentaes fitossanitrias quando as sementes so enviadas para os utilizadores. A quantidade de sementes pode ser determinada com maior rigor nas sementes limpas. Idealmente, todos os lotes de sementes deveriam ser cuidadosamente limpos at que todo o material vegetal indesejado fosse removido. Na prtica, isto no possvel para todas as espcies, especialmente para alguns tipos de fruto e para sementes pequenas. Os frutos deiscentes e as sementes grandes so relativamente fceis de limpar. A extraco de sementes diminutas de fragmentos do pericarpo de tamanho, forma e densidade comparveis pode revelar-se uma tarefa demasiado difcil e morosa. A extraco de sementes de frutos indeiscentes (smaras, aqunios e glandes) tambm pode ser demasiado demorada ou pode danificar as sementes. Nestes casos, pode ser necessrio armazenar as coleces com algum grau de impureza, mas essa informao deve ser registada na base de dados. A maioria das sementes de espcies silvestres deve ser limpa manualmente, embora por vezes se possa recorrer a algum equipamento automtico. Os processos automatizados, comuns no processamento de sementes agrcolas, hortcolas e florestais, no so adequados para a limpeza de um grande nmero de coleces de espcies silvestres, com sementes pequenas e variadas (p. ex. no tamanho e na morfologia). O tempo necessrio para limpar o equipamento entre amostras diferentes, para evitar a contaminao, no rentvel para um grande nmero de pequenas amostras. Algumas amostras, especialmente as de espcies ameaadas, podem ser constitudas por um nmero muito reduzido de sementes. Alm disso, o equipamento pode necessitar de calibrao para cada espcie, o que no se coaduna com a grande variabilidade de forma, tamanho e peso das sementes / frutos em cada amostra. Estudos realizados em sementes de algumas cultivares, mostraram que alguns tipos de equipamento podem causar danos mecnicos nas sementes, suficientes para reduzir a longevidade. A limpeza de sementes de espcies silvestres requer mais Figura 4 Laboratrio para limpeza de sementes. ( RBGK)
13. 13. conhecimentos do que seria de esperar. Os operadores devem ter conhecimento da morfologia de sementes e frutos ao nvel da famlia, e devem ter capacidade para interpretar as estruturas lupa, de forma a aplicar tcnicas de limpeza que removam estruturas desnecessrias sem danificar as sementes. Adaptar as tcnicas para diferentes tipos de frutos / sementes , portanto, a chave para uma boa limpeza de sementes. Na maioria dos casos, a limpeza facilitada pela secagem. Os frutos carnudos so uma excepo, pois neste caso, aconselhvel a extraco das sementes antes da secagem. Embora possam ser aplicados procedimentos de limpeza simples no campo, imediatamente aps a colheita, a maioria dos procedimentos de limpeza so realizados de forma mais eficaz num laboratrio, com espao adequado, proteco contra poeira e o seguinte equipamento: Crivos, rolhas e escovas Sistema de extraco de poeira e / ou mscaras Luvas de borracha Tnel de vento Lupas e material de disseco Equipamento para lavagem Eliminao de resduos TEMA 1A. EQUIPAMENTO E PROCEDIMENTOS COMUNS Aspectos gerais Crivos, rolhasescovas De um modo geral, os bancos de sementes utilizam crivos de ao inoxidvel, com malha metlica de diferentes tamanhos. Os crivos permitem a separao das sementes e resduos em duas ou mais fraces. Os objectos de dimenses maiores do que a malha permanecem no crivo, enquanto os restantes passam atravs dela. Se os resduos forem maiores do que as sementes, pode usar-se uma malha ligeiramente maior do que as sementes, para reter os resduos na malha e as sementes limpas numa bandeja colocada sob o crivo. Se, pelo contrrio, os resduos forem menores do que as sementes, pode usar-se uma malha ligeiramente menor do que as sementes, para reter as sementes limpas na malha e os resduos abaixo desta. Pode usar-se uma combinao de crivos com malhas de diferentes tamanhos para separar as sementes de resduos com vrias dimenses. Este mtodo no apropriado se os resduos e as sementes forem do mesmo tamanho. Neste caso, usa-se outro mtodo de separao, p. ex., rolar a amostra numa superfcie inclinada ou usar um tnel de vento (ver abaixo). Se os mtodos alternativos no forem eficazes, as sementes so armazenadas com resduos. As sementes podem ser ligeiramente pressionadas ou friccionadas contra a malha, com uma rolha de borracha. A frico permite partir os resduos e separ-los mas, se for vigorosa, pode esmagar ou quebrar as sementes. As sementes frgeis podem ser friccionadas com a mo: neste caso, o operador deve usar luvas de ltex ou PVC para proteger os dedos e manter simultaneamente a sensibilidade. Figura 5 Limpeza de sementes com crivo e rolha de borracha. ( RBGK)
14. 14. As sementes devem ser observadas lupa: se forem detectadas sementes danificadas, p. ex. abraso do tegumento ou ruptura das cariopses de Poaceae ou aqunios de Asteraceae, em seguida, deve aplicar-se uma presso menor. Tambm importante observar as vrias fraces da crivagem: se for detectada uma mistura de resduos e sementes intactas, esta deve ser crivada novamente, at que se obtenham sementes limpas. Os crivos, as bandejas e as bancadas devem ser devidamente limpos aps a sua utilizao com um lote sementes, para evitar contaminao. Uma escova de ao a melhor opo para limpar os crivos. Sistema de extraco de poeiras ou mscaras Durante a crivagem de sementes ou frutos secos, produzida uma grande quantidade de poeira, composta por partculas finas que podem ser inaladas pelos operadores e depositadas no equipamento do laboratrio. Parte desta poeira pode causar irritao pulmonar ou alergia. Portanto, as operaes de limpeza das sementes devem ser realizadas numa bancada com ar forado e um filtro de poeira, ou numa rea restrita, tendo os operadores o cuidado de usar mscaras anti-poeira de tipo adequado (p. ex. EN149: 2001 FFP3). Os filtros e as mscaras devem ser substitudos regularmente. Tnel de vento Este equipamento permite separar as sementes dos resduos com base na densidade. Gera um fluxo de ar regulvel que passa pela amostra de sementes, colocada sobre uma malha fina ajustada a um cilindro oco. O fluxo de ar captura materiais leves, que so transportados ao longo do cilindro e recolhidos num colector situado na parte superior, enquanto os materiais pesados permanecem em baixo. importante garantir que a separao to eficaz quanto possvel, deixando as sementes sobre a malha e todos os resduos (ou seja, fraco destituda de sementes potencialmente viveis) no colector. Para isso, necessrio o ajuste preciso do fluxo de ar, definido por tentativa e erro. Com uma pequena amostra, fixa-se inicialmente o fluxo de ar numa velocidade reduzida, apenas a suficiente para transportar alguns resduos para o colector. Os resduos recolhidos no colector so ento verificadas lupa, procurando sementes viveis. Se no existirem sementes, ento a intensidade do fluxo de ar pode ser aumentada progressivamente, repetindo o procedimento. Quando o colector contiver sementes, o fluxo de ar deve ser ajustado para o valor anterior. O uso deste equipamento pode ser muito eficaz quando aplicado depois da crivagem. Tal como acontece com outras tcnicas, o equipamento deve ser limpo cuidadosamente entre diferentes amostras, para evitar a contaminao. Recomenda-se o uso de panos anti-estticos / sprays, pois a electricidade esttica frequente no cilindro, devido ao atrito gerado pelo fluxo de ar. Figura 6 Bancada com ar forado e filtro de poeira para limpeza de sementes. ( RBGK)
15. 15. Lupasmaterial de dissecao A lupa um equipamento til em muitas tarefas associadas limpeza de sementes, incluindo a verificao da pureza de uma amostra de sementes, a deteco de sementes intactas na fraco de resduos e o teste de corte. Os testes de corte so usados para avaliar o nmero de sementes vazias (ou seja, sem endosperma e / ou embrio ou com estes danificados). Uma vez que este teste destrutivo, deve ser realizado em sub- amostras (p. ex. 50 sementes) (ver tambm a anlise de raio-X). As sementes so cortadas com um bisturi, ou outra ferramenta de dissecao, e verifica-se se o endosperma est intacto e o embrio totalmente formado. O resultado do teste expresso em sementes preenchidas / sementes vazias. Se a proporo de sementes vazias for muito elevada (p.ex. 50%), ento a amostra deve ser limpa novamente, embora, por vezes, as limitaes de tempo e recursos humanos no o permitam. Equipamento de lavagem As sementes extradas de frutos carnudos podem necessitar de uma lavagem para remover os resduos do pericarpo (ver abaixo). As sementes tambm podem ser separadas por flutuao: as sementes vazias flutuam enquanto sementes preenchidas se depositam no fundo do recipiente. Geralmente, este mtodo no recomendado nos bancos de sementes, pois as sementes secas podem ser afectadas pela embebio rpida. Eliminao de resduos Os resduos podem conter agentes patognicos e sementes viveis de espcies invasoras. Ambos podem constituir uma grave ameaa para os ecossistemas autctones se sarem do banco de sementes (sobretudo se o banco de sementes processar sementes de plantas exticas). Portanto, todos os resduos devem ser rigorosamente controlados no banco de sementes: uma boa opo coloc-los em sacos de plstico, em caixotes do lixo devidamente etiquetados. Os sacos devero ser fechados e enviados para um depsito especializado no tratamento deste tipo de resduos. A incinerao hospitalar o tratamento mais seguro e dever ser aplicada sempre que possvel. Limpeza de frutos carnudos Os frutos imaturos devem amadurecer em condies de humidade elevada antes da extraco e secagem das sementes. Estas podem ser extradas por corte, separao, espremendo os frutos, ou esmagando-os num crivo. As sementes podem ser lavadas com gua, se for necessrio remover resduos do pericarpo. De seguida, as sementes devem ser distribudas num recipiente, numa camada fina, e colocadas na sala de secagem. No caso de se formar uma mucilagem sobre as sementes, a secagem permite remov-la, por frico ligeira. Figura 8 Caixote do lixo para resduos destinados incinerao. ( RBGK) Figura 7 Lupa. ( RBGK)
16. 16. Caso especial 1: frutos com polpa pegajosa Daphne alpina subsp. alpina produz pequenas drupas com polpa pegajosa. Quando as drupas so comprimidas no crivo, as sementes extradas esto revestidas de resduos de pericarpo pegajoso, formando agregados. A polpa pegajosa no se dissolve nem removida com gua. A soluo mais prtica, neste caso, consiste em rolar as sementes sobre cinzas, at estarem totalmente revestidas. Assim, a polpa torna-se menos pegajosa e pode ser removida rolando suavemente num crivo com malha menor do que as sementes. Caso especial 2: frutos muito maduros Para evitar a fermentao, pode ser necessrio limpar parcial ou totalmente os frutos carnudos (p. ex., bagas de Solanaceae) quando estes esto muito maduros, ou foram danificados ou esmagados durante a colheita. A polpa deve ser eliminada, usando um crivo e gua corrente. As sementes devero ento ser retiradas do crivo e colocadas na sala de secagem. No campo, as sementes podero secar ao ar, sobre uma malha metlica ou papel absorvente espesso, sendo posteriormente embaladas em sacos de pano. Caso especial 3: frutos imaturos na disperso Algumas plantas herbceas (p. ex. Anemone nemorosa) e aquticas (p. ex. Caltha palustris) podem dispersar frutos com sementes imaturas. Nestes casos, as sementes no devem ser extradas imediatamente aps a colheita; os frutos devem amadurecer em condies de humidade relativa relativamente elevada antes da extraco das sementes. Limpeza de frutos secos Os frutos secos so geralmente limpos usando crivos e rolha de borracha. Os frutos so colocados num crivo com malha de tamanho adequado, de modo a reter as sementes, e em seguida, so ligeiramente pressionados com a rolha, exercendo simultaneamente um movimento de rotao, at que as sementes sejam libertadas. Os resduos so assim quebrados em pequenos pedaos, que passam atravs da malha do crivo. A rolha pode danificar as sementes, se for pressionada vigorosamente. Por isso, importante observar as sementes lupa durante o processo de limpeza; se forem encontradas sementes danificadas a presso aplicada deve ser reduzida. Esta regra fundamental no caso de sementes frgeis, que podem ser facilmente partidas quando pressionadas contra a malha do crivo. Nestes casos, o material pode ser pressionado com a mo, usando luvas de PVC ou ltex para proteger os dedos. Se este mtodo de limpeza danificar as sementes ou for demasiado demorado, deve aplicar- se outro mtodo, ou considera-se que no possvel aumentar a pureza da amostra e esta armazenada com resduos, tendo o cuidado de registar essa informao na base de dados. Nalguns casos, pode conseguir-se um maior grau de pureza numa fase posterior, limpando sub- amostras retiradas para germinao ou distribuio. Caso especial 1: frutos secos deiscentes As sementes de frutos secos deiscentes, quando maduras, limpam-se abrindo cuidadosamente os frutos e separando as sementes manualmente. As cpsulas, silquas e vagens abrem-se facilmente pelas suas linhas de deiscncia e podem ser agitadas suavemente numa bandeja para libertar as sementes. Esta tarefa pode ser executada de forma eficaz no campo, com alguma precauo. Os frutos com deiscncia explosiva devem ser mantidos numa bandeja ou caixa coberta com papel ou carto, para evitar perdas de sementes. Caso especial 2: frutos secos indeiscentes Frutos como as glandes, aqunios e smaras so dispersos como disporos e devem ser armazenados como tal. A remoo de qualquer estrutura da unidade natural de disperso (tais como asas, pleas e lemas, etc), especialmente quando ela parte integrante do disporo ou se apresenta fortemente ligada a ele, deve ser feita com cautela e, de preferncia, deve ser evitada, uma vez que essa aco pode danificar a semente.
17. 17. Anlise de raio-X Esta tcnica permite identificar sementes vazias, mal formadas ou danificadas. Permite ainda determinar o nmero de sementes presentes num fruto quando no possvel extra-las. uma alternativa tecnolgica ao teste de corte, que exige equipamento especfico (aparelho de raio-X e, para aparelhos no digitais, material fotogrfico e cmara escura) e operadores com formao especfica. Permite obter resultados mais rpidos, mais rigorosos e uma avaliao melhor documentada do que no teste de corte. Embora seja um teste no-destrutivo, deve ser usada apenas uma sub-amostra do lote de sementes, como precauo contra eventuais efeitos genticos. Esta sub-amostra no deve ser reintegrada no lote inicial, podendo ser usada nos testes de germinao (os resultados do teste devero ser iguais ou piores do que os obtidos para as restantes sementes, mas importante ter em conta potenciais efeitos genticos). Componentes possveis de um lote de sementes numa anlise de raio-X: Componente do teste de viabilidade Imagem no raio-X Sementes no dormentes* Sim Preenchida Sementes dormentes* Sim usar o teste do tetrazlio ou distinguir das sementes mortas pela aparncia Preenchida Sementes mortas Sim Preenchida Sementes vazias No - excluir Vazia Sementes danificadas (por insectos) No - excluir excepto se o dano for superficial Danificada Resduos No - excluir Resduos * ver Tema 6 para as definies % de viabilidade = (Sementes no dormentes + sementes dormentes) / (Nmero total de sementes sementes vazias sementes danificadas) x 100 Estimativa da quantidade de sementes Estimar a quantidade de sementes essencial para planear o uso das coleces (testes de germinao, duplicados, conservao, regenerao, etc.). O procedimento sugerido o seguinte: Pesar todo o lote de sementes Pesar cinco amostras de 50 sementes Calcular o peso mdio de 50 sementes Calcular o limite superior do intervalo de confiana a 95 % (LSIC) Estimar o nmero total de sementes: (peso total do lote de sementes / LSIC) x 50 Note-se que o procedimento proposto subestima o nmero de sementes do lote, o que prefervel ao valor sobrestimado que resultaria do clculo simples, envolvendo apenas o peso de uma nica amostra de 50 sementes, ou seja, (peso total do lote de sementes / peso de 50 sementes) x 50. Se o peso da amostra nica fosse significativamente menor do que a mdia, o resultado final sobrestimaria o nmero de sementes. A pesagem pode constituir um mtodo alternativo para monitorizar a quantidade de sementes da coleco. Figura 9 Raio-X de sementes de Albizia bernieri evidenciando sementes vazias (sem embrio), danificadas por insectos e viveis. ( RBGK)
18. 18. 10 TEMA 2. SECAGEM DAS SEMENTES Resumo redigido por Costantino Bonomi (MTSN) com base na comunicao de Robin Probert (RBGK), nas apresentaes de UPM e NBGB e na sesso de discusso. Aspectos gerais A secagem adequada a chave para maximizar a longevidade das sementes da maioria das espcies . frequentemente assumido que a temperatura baixa o factor que determina a longevidade das sementes. Contudo, os modelos empricos demonstram a importncia da secagem na conservao das sementes a longo prazo. TEMA 2A. HETEROGENEIDADE DAS AMOSTRAS E VELOCIDADE DE SECAGEM Aspectos gerais Os frutos e sementes devem ser colhidos quando esto completamente maduros e, geralmente, durante a fase natural de disperso (Figura 10). Nalguns casos excepcionais (necessidade de estmulos para libertar as sementes, como o caso do fogo nos frutos serotinos), a colheita realizada vrios anos antes da disperso natural. No extremo oposto, algumas espcies apresentam uma disperso abrupta ou, como o caso de algumas orqudeas, as sementes so dispersas antes de a cpsula atingir a deiscncia completa. Nestes casos, pode ser necessrio colher os frutos antes do incio da disperso. Os frutos e sementes da maioria das espcies silvestres apresentam variabilidade temporal na maturao, que pode dificultar o manuseamento das coleces aps a colheita, incluindo a secagem. A secagem demasiado rpida pode reduzir drasticamente a longevidade de sementes imaturas, assim como a longevidade de sementes extradas de frutos carnudos. Uma srie de estudos recentes (Probert et al., 2007 e as revises de HayProbert, 1995 e ProbertHay, 2000) mostram que a qualidade das sementes superior quando as sementes e os frutos imaturos so submetidos a secagem lenta. Alm disso, um estudo recente de RBGK (Butler, et al., 2009) demonstrou que as sementes imaturas so bastante resilientes a flutuaes na humidade relativa, podendo no s recuperar aps perodos de exposio a nveis intermdios de humidade relativa, como tambm continuar a maturao quando re-hidratadas. A maioria das espcies produz sementes tolerantes desidratao. Estas espcies so designadas ortodoxas. Para mais informaes sobre a classificao das espcies quanto tolerncia desidratao - ver MSBP Technical Information Sheet 10 http://www.kew.org/msbp/scitech/publications/10-Desiccation%20tolerance.pdf; para mais informaes sobre o efeito da secagem na longevidade das sementes - ver PritchardDickie, 2003; para encontrar informao sobre uma espcie ver Seed Information Database (Liu et al., 2008: http://kew.org/data/sid/). Figura 10 Sequncia temporal de maturao dos frutos de Fritillaria tubaeformis evidenciando o incio da disperso. ( MTSN) 8 Julho 16 Julho 29 Julho
19. 19. 11 Recomendaes Os frutos imaturos (e, portanto, as sementes) devem amadurecer durante 2-3 semanas, em condies semelhantes s condies naturais do local de colheita. Geralmente, a maturao ser facilmente identificada por uma mudana de cor, muitas vezes de verde para vermelho. A cor das sementes no interior dos frutos tambm se altera, normalmente de uma cor clara para uma cor mais escura. Para as sementes extradas de frutos carnudos maduros, recomenda-se inicialmente uma secagem gradual nas condies ambientais (60-70% HR, 20-25 C, durante 1-2 semanas); todas as outras sementes maduras podem secar nas condies recomendadas abaixo. Os frutos ou sementes que apresentem diferentes estdios de maturao devem, sempre que possvel, ser separados em sub-amostras, amadurecer e secar conforme descrito acima. As sementes maduras e as sementes extradas de frutos secos maduros devem ser submetidas a secagem de imediato (nas condies recomendadas abaixo), para minimizar a perda de viabilidade. Deve ser dada alguma ateno taxa de secagem de diferentes sementes nas condies da sala de secagem. Os operadores do banco de sementes devem verificar se as sementes esto devidamente secas antes de serem armazenadas, especialmente no caso das sementes grandes com tegumento espesso. reas de investigao prioritrias Seria til recolher mais informao sobre a velocidade de secagem de sementes de espcies diferentes. TEMA 2B. CIRCULAO DE AR Aspectos gerais excepo das sementes extradas de frutos carnudos e sementes imaturas (ver acima), a secagem deve ser relativamente rpida, a fim de reduzir o perodo durante o qual as sementes apresentam um contedo hdrico elevado. A velocidade de secagem afectada pela circulao do ar acima das sementes: uma maior circulao de ar extrai a gua das sementes mais rapidamente e aumenta o gradiente de humidade entre o ar exterior e a semente. Uma grande quantidade de sementes, muito prximas entre si, num recipiente fechado e com pouca circulao de ar, pode criar um ambiente hmido, que poder comprometer a longevidade das sementes, mesmo nas condies de secagem recomendadas. Recomendaes Para maximizar a velocidade de secagem, as sementes devem ser distribudas em camadas finas num ambiente com circulao de ar. A circulao de ar forado pode ser usada para este efeito. TEMA 2C. MONITORIZAO DA SECAGEM Aspectos gerais A humidade relativa das sementes em equilbrio (HRe) com o ar num espao fechado um parmetro mais adequado para medir o grau de secagem do que o contedo em gua. A HRe um parmetro independente do teor da semente em leos. Se o teor em leos for conhecido, o teor em gua pode ser estimado a partir do valor de HRe (ver: http://data.kew.org/sid/viability/mc1. jsp), evitando assim a utilizao de mtodos destrutivos. Ver Probert et al. (2003) para aspectos gerais da determinao da HRe e Cromarty et al. (1990) para a converso de HRe em contedo em gua e vice-versa. Recomendao Usar HRe para monitorizar a secagem das sementes (ver abaixo).
20. 20. 12 TEMA 2D. TEMPERATURA E HUMIDADE DURANTE A SECAGEM Aspectos gerais A secagem a temperaturas elevadas ( 40 C) no recomendada, especialmente durante longos perodos. Existem algumas evidncias de que a secagem a temperaturas altas, como a secagem ao sol, no prejudicial, desde que devidamente monitorizada. No entanto, uma vez atingido o contedo em gua desejado, existe o risco de sobre-exposio das sementes a temperaturas elevadas. Alm disso, as sementes grandes podem abrir fendas durante a secagem a temperaturas altas. As temperaturas de secagem mais utilizadas nos bancos de sementes situam-se entre 10 e 20 C. H divergncia de opinio acerca do contedo das sementes em gua que deve ser atingido no final da secagem e, consequentemente, sobre as condies de humidade relativa do ar adequadas para a secagem. Muitos bancos de sementes conservam sementes que foram secas at atingir o equilbrio num ambiente com cerca de 15% HR (cerca de 3,5-6,5% de contedo em gua, dependendo do teor de leo das sementes). Outros bancos de sementes utilizam condies de secagem a uma HR inferior (Prez-Garca et al., 20072008). Outros ainda usam valores ligeiramente mais elevados de HR (20-25%), alegando que o potencial hdrico (equivalente a HRe) das sementes secas a 15% HR pode, teoricamente, descer para nveis sub-ptimos nas sementes armazenadas a temperaturas inferiores a 0 C (Vertucci et al., 1994). No entanto, h indicaes de que o ltimo fenmeno no universal ou no tem efeitos acentuados na longevidade das sementes. Alguns dos actuais conflitos de evidncias devem-se a diferenas nas espcies e metodologias usadas por cada banco de sementes. No entanto, esta continua a ser umas das questes que permanece sem resposta na rea da conservao de sementes. Recomendaes Os curadores dos bancos de sementes no podem aguardar o consenso da comunidade cientfica relativamente ao contedo em gua recomendado para conservao das sementes a longo prazo. Actualmente, no possvel recomendar um valor universal, para utilizao em todas as circunstncias. Portanto, e at que estejam disponveis novos dados, recomenda-se a secagem das sementes em equilbrio com o ar a cerca de 15% HR (cerca de 3,5-6,5% de contedo em gua, dependendo do teor de leo das sementes) e 10-20 C nos casos em que a conservao feita a temperaturas inferiores a 0 C. A ultra-secagem (inferior a 15% HR) recomendada nos casos em que a conservao feita a temperaturas superiores a 0 C. reas de investigao prioritrias A investigao cientfica fundamental para determinar o contedo em gua mais adequado conservao das sementes. Obviamente, de esperar que diferentes espcies apresentem diferentes valores ptimos de HRe. O planeamento de experincias conjuntas importante para fornecer dados comparativos sobre a conservao de sementes a vrios contedos em gua (sobretudo nos valores mais baixos da escala). Esses dados permitiriam avaliar a possibilidade de recomendar um valor de contedo em gua para diferentes grupos taxonmicos ou regies biogeogrficas. Este estudo dever incidir sobretudo em espcies para as quais existem indicaes de longevidade baixa em condies de conservao, pois sero as mais sensveis ao efeito das diferentes condies de secagem na longevidade. A publicao de dados dos bancos de sementes sobre conservao de sementes desejvel (incluindo as condies de conservao utilizadas), quer em revistas com reviso cientfica, quer em relatrios tcnicos ou on-line, p. ex., em Seed Information Database (Liu et al., 2008: http://kew. org/data/sid/). Sugesto de experincia Cada banco de sementes deve seleccionar pelo menos uma (se possvel, mais) espcie com sementes ortodoxas e longevidade baixa, com requisitos de germinao conhecidos e grande quantidade de sementes. As sementes devem ser submetidas a diferentes regimes de secagem, seguidos de envelhecimento controlado e testes de germinao. Por exemplo, as sementes sero
21. 21. 13 secas a trs nveis de HR (25, 15 e 5%), a uma temperatura comum (15 C). Esses nveis de HR correspondem aproximadamente aos recomendados por trs bancos de sementes: i) National Center for Genetic Resources Preservation, em Fort Collins, E.U.A.; ii) as normas da FAO / IPGRI (1994), amplamente utilizadas e iii) a ultra-secagem, usada pela UPM, p. ex., respectivamente. As sementes podem ser conservadas posteriormente a trs temperaturas diferentes: 30, 5 e -20 C. A viabilidade ser monitorizada em intervalos de 6 meses, durante 10 anos, usando 4 rplicas de 25 sementes por teste. O nmero total de sementes necessrio por espcie ser: 3 x 3 x 21 x 4 x 25 = 18.900 sementes. Os valores de P50 podem ser posteriormente comparados entre as diferentes espcies estudadas. TEMA 2E. EQUIPAMENTO DE SECAGEM Aspectos gerais Os mtodos de secagem incluem o uso de: (a) Recipientes fechados contendo agentes desidratantes. Estes agentes so substncias higroscpicas, como a slica-gel, utilizadas para remover o vapor de gua do ar. Este mtodo barato, mas o contedo em gua no final da secagem s pode ser controlado dentro de um intervalo de valores relativamente grande (excepto se forem aplicadas metodologias adicionais demoradas), dependente da razo (semente:desidratante), do contedo em gua do desidratante e do tempo. Este mtodo pode ser usado para um nmero de sementes relativamente reduzido. (b) Cmaras / incubadoras de secagem. Uma forma eficaz de secar as sementes consiste no uso de alguns tipos de cmaras ou incubadoras, como as utilizadas no crescimento de plantas, que podem ser arrefecidas, e nas quais a humidade do ar pode ser ajustada para valores baixos. A temperatura e humidade so medidas numa sonda e registadas num datalogger. Desta forma, criada uma pequena sala de secagem (ver abaixo). A circulao de ar dentro da cmara feita por um ventilador. Este mtodo permite o controlo do contedo em gua dentro de limites razoavelmente definidos e permite secar um nmero de sementes superior ao mtodo anterior (a). (c) Sala de secagem. Esta a opo mais dispendiosa, mas aconselhvel para os bancos de sementes com elevado nmero anual de coleces. A HR e temperatura da sala podem ser ajustadas para os valores desejados usando equipamento de secagem e refrigerao. A slica-gel e o cloreto de ltio (LiCl) so os desidratantes normalmente utilizados. O equipamento de secagem est ligado ao equipamento de refrigerao e ambos esto ligados sala, devidamente isolada, atravs de um sistema de tubagem (fluxo de ar). A separao dos sistemas de tubagem permite a eliminao, no exterior da sala, da humidade gerada durante a fase de regenerao automtica do desidratante. A regenerao do desidratante determinada pela ligao a um higrmetro situado no interior da sala de secagem. As coleces de sementes podem permanecer na sala de secagem at que os operadores do banco de sementes tenham disponibilidade para o seu processamento. Aconselha-se Linington (2003) para projectar e equipar uma sala de secagem (http://www.kew.org/msbp/scitech/publications/SCTSIP_digital_book/pdfs/Chapter_33.pdf). Figura 12 Sala de secagem. ( MAICh)Figura 11 Cmara de secagem. ( UPM)
22. 22. 14 (d) Recipientes fechados com uma soluo de sal saturada. As solues de sais saturadas, como a de LiCl, geram HR especficas num ambiente fechado e mantm-no activamente, absorvendo e libertando vapor de gua. O LiCl til para este fim por ser relativamente independente da temperatura. As sementes colocadas no recipiente, acima da soluo (numa plataforma), secam at atingir o equilbrio com o ar. Este mtodo pode ser utilizado para pequenas quantidades de sementes, sendo necessrio algum cuidado para evitar o derramamento da soluo. Alguns produtos qumicos podem ser perigosos, por exemplo, o cloreto de amnio e o nitrito de sdio. Recomendaes No aconselhada a secagem a temperaturas elevadas ou numa estufa de secagem. Recomenda-se uma sala de secagem na qual seja possvel ajustar a HR para o valor desejado. Este tipo de instalao fundamental para um banco de sementes moderno, com uma entrada anual de sementes relativamente grande (100 - 1000 amostras por ano). Esta soluo flexvel e pode ser adaptada para a maioria das instalaes. As tcnicas de liofilizao foram brevemente discutidas no Workshop, tendo-se concludo que os dados existentes sobre o efeito desta tcnica so insuficientes e h o risco de congelamento das amostras com humidade, que iria comprometer a conservao a longo prazo. Por precauo, este mtodo no recomendado. Para o processamento em pequena escala, de um nmero de amostras reduzido (ca. menos de 100 por ano), aconselha-se o uso de desidratantes, como slica-gel, carvo ou mesmo sementes torradas. Em todos os casos, os desidratantes tero de ser previamente secos numa estufa de secagem e, posteriormente, controlados durante o processo de secagem para garantir que esto activos. Existem no mercado diversos tipos de cmaras e incubadoras, nalguns casos projectadas especificamente para a secagem de sementes, como o caso do mini seed bank de RBGK (ver: http://shop.kew.org/kew-mini-seed-bank.html). Consultar tambm os dispositivos usados por UPM em http://www.etsia.upm.es/banco_germoplasma/inicio_bgv_archivos/Page497.htm. A proporo (desidratante:semente) que garante a secagem adequada (e evita a secagem excessiva) depende muito do contedo em gua das sementes no incio. As sementes colhidas recentemente, com elevado contedo em gua, exigem uma grande quantidade de desidratante e este pode necessitar de ser renovado antes de a secagem estar completa. Por isso, as sementes devem secar em condies ambientais durante 2-3 dias para remover a gua livre (isto , a que facilmente perdida) antes de iniciar a secagem com desidratante. As sementes devem ser ento colocadas num recipiente fechado, acima da camada de desidratante. A capacidade de reteno de gua dos desidratantes varia. No caso de se usar slica-gel, uma proporo 1:1 (volume de desidratante:sementes) dever secar sementes a 30% HRe (Probert, 2003), o que permitir a conservao segura a mdio prazo para a maioria das espcies. No caso de se usar carvo, a proporo necessria para atingir o mesmo valor de HRe ser 3:1. Figura 13 Recipiente com slica-gel para secagem de sementes. ( RBGK)
23. 23. 15 Figura 14 Srie de hidratao de slica-gel. Hidratao total a parcial (da esquerda para a direita). ( MTSN) TEMA 3. MONITORIZAO DO CONTEDO EM GUA Resumo redigido por Robin Probert (RBGK), com base na comunicao de Costantino Bonomi (MTSN), uma comunicao adicional da UNI-PAV, e na sesso de discusso. TEMA 3A. MEDIO DA HUMIDADE RELATIVA EM EQUILIBRIO Aspectos gerais O desenvolvimento de sensores de humidade relativa fiveis ao longo da ltima dcada veio alterar a capacidade de monitorizar com rigor o contedo de gua em vrias fases do processo de conservao de sementes. Os sensores de humidade relativa so fulcrais nos sistemas de controlo das salas de secagem, alertando no caso de falhas do equipamento ou de desvios das condies em relao ao intervalo estabelecido. Mas, sem dvida, o avano tecnolgico mais importante na de conservao de sementes nos ltimos anos foi o uso de sensores de humidade relativa do ar como instrumento para monitorizar o contedo das sementes em gua (ver MSBP Technical Information Sheet 5. http://www.kew.org/msbp/scitech/publications/05-eRH%20moisture%20meas urement.pdf). Estes sensores medem a humidade relativa do ar que est em equilbrio com uma amostra de sementes. Se necessrio, a humidade relativa em equilbrio (HRe) pode ser relacionada com o contedo em gua das sementes, recorrendo a isotrmicas de adsoro de gua. A maior vantagem destes mtodos em relao ao mtodo convencional de determinao do contedo em gua consiste no carcter geralmente no-destrutivo da medida e, portanto, na salvaguarda das sementes. Outra vantagem o facto de o valor medido no estar dependente do teor da semente em leo, uma vez que as sementes com diferentes teores em leo, quando atingem o equilbrio nas mesmas condies de HR e temperatura, tm diferentes contedos em gua mas o mesmo estado de hidratao (potencial hdrico). No entanto, o desenvolvimento dos instrumentos para medir o contedo em gua de forma no- destrutiva no significa que o mtodo convencional se tornou redundante. A determinao gravimtrica do contedo em gua (para informao geral ver ISTA, 2008) ainda desempenha um papel importante na maioria dos bancos de sementes. Alm disso, constitui a base para a construo de isotrmicas de adsoro de gua, quando os valores de HRe so determinados num intervalo de contedos em gua, a uma mesma temperatura. Os bancos de sementes usam actualmente um conjunto de instrumentos relativamente baratos e portteis para a monitorizao de rotina do estado de hidratao das sementes, durante e aps a secagem, e para a investigao cientfica. Contudo, os higrmetros com medida de ponto de orvalho so os nicos a fornecer uma medida directa do parmetro psicromtrico do ar no estado de equilbrio, a temperatura do ponto de orvalho (para uma discusso mais aprofundada das propriedades psicromtricas do ar, ver Probert, 2003). Os outros higrmetros baseiam-se na alterao fsica ou qumica de uma substncia relativamente a um padro calibrado, que est directamente relacionada com uma mudana na humidade. Os higrmetros digitais mais recentes apresentam software que calcula os parmetros requeridos com base nos princpios psicromtricos. Assim, os resultados so expressos em humidade relativa, actividade da gua, potencial hdrico e temperatura do ponto de orvalho. Os instrumentos com cmara de medio desenvolvida para sementes ou outros materiais higroscpicos expressam normalmente os resultados em HRe ou actividade da gua (idntica HRe mas expressa numa escala de 0 a 1).
24. 24. 16 Recomendaes Higrmetros com sonda Os higrmetros meteorolgicos (com sonda) podem ser usados para medir a HRe das sementes, desde que o sensor tenha um dispositivo de isolamento na extremidade da sonda e que possa ser introduzido numa cmara de medio adequada, tambm devidamente selada. Dataloggers Os pequenos dataloggers de HR / temperatura podem ser utilizados para registar a HRe de amostras de sementes dentro de recipientes fechados. Tais instrumentos podem ser usados, por exemplo, para monitorizar o comportamento das coleces de sementes quando os recipientes so deslocados da temperatura ambiente para temperaturas abaixo de zero e novamente para a temperatura ambiente. Tambm podem ser usados para monitorizar o estado de hidratao das coleces de sementes em trnsito, localizados entre as sementes, dentro de um saco de pano, ou entre um conjunto de coleces empacotadas para expedio. Deste modo, estes instrumentos podem fornecer dados importantes para explicar a qualidade final das coleces que chegam a um banco de sementes. Higrmetros mecnicos e electrnicos de baixo custo Os higrmetros mecnicos e electrnicos, de pequenas dimenses, podem ser comprados por menos de 50 Euros. Embora, geralmente, sejam menos precisos, podem dar uma indicao aproximada do estado de hidratao das sementes. Podem ser colocados entre as coleces de sementes durante uma expedio de colheita, indicando assim a eventual necessidade de secagem adicional. Tambm permitem avaliar a adequabilidade das condies ambientais para a secagem e, posteriormente, confirmar se esta realmente ocorreu. Indicador de slica-gel Uma forma engenhosa e muito barata de acompanhar a secagem das sementes a utilizao de slica-gel hidratada como substituto das sementes. Este mtodo consiste em colocar os grnulos de slica-gel hidratada dentro de um pacote poroso, que por sua vez colocado entre as sementes, durante a secagem. medida que as sementes secam, a slica-gel tambm perde gua e muda de cor. reas de investigao prioritrias Durante e aps o Workshop surgiram duas questes que devem ser consideradas em trabalhos futuros: Base de dados do contedo das sementes em gua Uma vez que a maioria dos bancos de sementes mede o contedo em gua rotineiramente, e um nmero crescente tambm mede a HRe, seria til compilar estas informaes numa base de dados comum (e.g. a base de dados da ENSCONET). Dado que o contedo em gua, para um valor de HRe, um bom indicador do teor em leo, esta base de dados iria contribuir significativamente para o conhecimento da relao entre o teor em leo das sementes e a taxonomia. Figura 16 Datalogger para registo da HRe num re- cipiente fechado com uma amostra de sementes. ( RBGK) Figura 17 Exemplos de higrmetros mecnicos e electrnicos. ( RBGK) Figura 15 Higrmetro da Rotronic para medir a HRe de amostras de sementes. ( Rotronic Instruments (UK) Ltd)
25. 25. 17 Problemas de secagem nalgumas espcies Os dados recolhidos em RBGK indicam que as espcies de algumas famlias, como a Fabaceae, especialmente as espcies com sementes relativamente grandes, podem apresentar uma secagem lenta. O risco potencial o de conservar estas coleces sem que as sementes estejam completamente secas. Este problema agravado pelas dificuldades descritas abaixo na obteno de medies precisas de HRe para essas sementes, excepto se forem esmagadas. Assim, nestas famlias, seria til recolher mais dados de contedo em gua e HRe durante todo o processo de secagem. TEMA 3B. USO DE HIGRMETROS PARA MONITORIZAR O CONTEDO DAS SEMENTES EM GUA Aspectos gerais Quando se utiliza higrmetros para monitorizar o estado de hidratao das sementes importante considerar possveis fontes de erro. Sementes com tegumento impermevel Como precauo, recomenda-se que as sementes com dormncia fsica (i.e. tegumento impermevel gua, ver Tabela 1) sejam cortadas ou esmagadas imediatamente antes do teste. Para evitar o possvel ganho ou perda rpida de gua nas sementes aps a exposio dos tecidos internos, extremamente importante que as sementes sejam transferidas para a cmara de medio do higrmetro o mais rapidamente possvel. A desvantagem bvia deste procedimento a destruio das sementes. Tabela 1. Famlias com gneros com dormncia fsica descrita. Para mais detalhes ver Baskin (2003) Anacardiaceae Bixaceae (incluindo Cochlospermaceae) Cannaceae Cistaceae Convolvulaceae incluindo Cuscutaceae Cucurbitaceae Dipterocarpaceae (subfamlias: Montoideae e Pakaraimoideae mas no Dipterocarpoideae) Fabaceae (subfamlias: Caesalpinioideae, Mimosoideae e Papilionoideae) Geraniaceae Malvaceae (incluindo Bombacaceae, Sterculiaceae e Tiliaceae) Nelumbonaceae Rhamnaceae Sapindaceae Sarcolaenaceae Seleco da cmara de medio e tamanho de amostra Idealmente, deve ser seleccionada a maior cmara de medio que possa ser completamente preenchida com a amostra de sementes. Quando o tamanho da amostra limitante, recomendada a seguinte regra: a cmara deve ser seleccionada de forma que o peso das sementes a testar, em gramas, deve representar pelo menos 10% do espao total em cm3 . Por exemplo, para uma cmara de 70 cm3 o peso das sementes deve ser de pelo menos 7 g (ver Probert et al., 2003 para mais detalhes). Medio de amostras no-equilibradas Ao medir a HRe ou a actividade da gua de sementes no-equilibradas (sementes ainda em secagem), extremamente importante que seja dado tempo suficiente para que as sementes atinjam o equilbrio dentro da cmara de medio do higrmetro. Depois desse perodo, altamente recomendvel que as medies sejam registadas num datalogger ou, se no for possvel, que os valores sejam anotados periodicamente, de modo a traar um grfico para determinar o tempo de equilbrio.
26. 26. 18 Importncia da temperatura Com base nas isotrmicas de adsoro de gua, sabe-se que os valores em equilbrio dependem da temperatura (ISTA, 2008). Por conseguinte, se houver uma discrepncia entre a temperatura das sementes e a temperatura da cmara de medio do higrmetro, o valor registado pode ser incorrecto. Tal situao poder ocorrer, por exemplo, se um higrmetro de actividade da gua for usado para verificar o estado de hidratao das sementes conservadas a uma temperatura baixa. Normalmente, estas medidas so realizadas temperatura ambiente (sala de secagem). Se a amostra de sementes estiver a uma temperatura significativamente mais baixa do que a temperatura da sala, o valor medido pode ser incorrecto. Esta medida pode situar-se abaixo ou acima do valor correcto, dependendo da rapidez com que as sementes foram transferidas para a cmara de medio, e da HR do ambiente. Por exemplo, quando se expe sementes muito frias ao ar ambiente, mesmo que por alguns minutos, h um risco elevado de adsoro das molculas de gua na superfcie das sementes, por condensao. Essa gua (adicional) pode ser rapidamente libertada para a atmosfera da cmara durante a medio, contribuindo assim para o registo de um valor incorrecto. Assim, e caso a HRe seja medida a uma temperatura diferente daquela qual a amostra de sementes se encontra, recomenda-se vivamente que seja aguardado tempo suficiente para que a amostra atinja a temperatura de medio, antes de ser retirada do recipiente e transferida para a cmara de medio do higrmetro. Recomendaes So recomendadas as seguintes regras para monitorizao de rotina do estado de hidratao das sementes (adaptado de Probert et al., 2003): Deve escolher-se uma cmara de medio com o tamanho adequado para minimizar o espao acima das sementes. O peso da amostra de sementes, em gramas, no deve ser inferior a 10% do volume total da cmara em cm3 . Se for conhecida a presena de tegumento impermevel (dormncia fsica), as sementes de- vem ser cortadas, trituradas grosseiramente ou esmagadas imediatamente antes de serem colocadas na cmara de medio. Note-se que necessrio limpar e secar o pilo e almofariz aps cada utilizao. A temperatura da amostra de sementes deve ser totalmente equilibrada com a temperatura da cmara de medio antes de registar os valores de HRe. O corpo humano est constantemente a libertar vapor de gua atravs da pele e da respirao, pelo que se deve evitar a manipulao directa das sementes, tocar a superfcie interna da c- mara de medio e respirar para um sensor exposto. As normas do fabricante para o tempo de equilbrio devem ser consideradas com cautela. Recomenda-se um perodo de pelo menos 30 minutos antes de iniciar as medies em amos- tras de sementes que esto num estado de hidratao estvel, e um perodo substancialmente maior caso os tecidos internos e externos das sementes possam no estar em equilbrio. Sempre que possvel, os valores devem ser registados num datalogger e o tempo de equilbrio final deve ser estimado a partir de grficos. Os sensores devem ser regularmente calibrados, de acordo com as recomendaes do fabricante. Muitos higrmetros funcionam simultaneamente a bateria e electricidade e, portanto, podem ser utilizados no campo. O sensor pode ser exposto ao ar para medir a HR e a temperatura ambiente e, na altura da colheita, pode ser feita a mediao de HRe das coleces de sementes.
27. 27. 19 TEMA 4. ACONDICIONAMENTO Resumo redigido por Costantino Bonomi (MTSN), com base na comunicao de Cesar Gomez Campo (UPM), comunicaes adicionais de RBGK e MAICh e na sesso de discusso. Aspectos gerais Uma embalagem adequada essencial para manter as sementes secas e, portanto, garantir a sua longevidade durante o armazenamento (ver Gomez-Campo, 2002). O ambiente de temperatura baixa utilizado na conservao das sementes frequentemente caracterizado por humidade relativa elevada, o que aumenta o risco de entrada de humidade nos recipientes. Embora este processo seja muito lento, devido s baixas temperaturas, acabar por ser prejudicial para as sementes ao longo do tempo. Assim, um recipiente estanque a chave para a conservao a longo prazo. Menosprezar este facto pode comprometer a viabilidade das sementes. Portanto, essencial seleccionar criteriosamente os recipientes e implementar formas de monitorizar a sua eficcia. Figura 18 Exemplos de recipientes. ( NBGB, MAICh, UPMRBGK).
28. 28. 20 A primeira questo a abordar , portanto, a seleco de recipientes hermticos (ver, nomeadamente, Gomez-Campo (2002) para uma descrio de diferentes recipientes). H muito poucos materiais totalmente prova de humidade. O plstico PET no recomendado. O plstico rgido, tipo PVC, poder ter melhor desempenho, mas requer uma investigao mais aprofundada e, actualmente, no recomendado. Actualmente, e de acordo com as informaes disponveis, o vidro o material mais aconselhvel. A eficcia dos sacos de alumnio tri-laminado (camadas de polister, polietileno e alumnio) a longo prazo foi questionada (ver Gomez-Campo, 2006), mas estes ainda so muito utilizados em diversas instituies (ver tambm Walters, 2007 e Gomez- Campo, 2009). Uma das desvantagens da embalagem de alumnio a impossibilidade de monitorizao por inspeco visual, uma vez que opaca. A fim de monitorizar a eficcia dos recipientes durante a conservao a longo prazo, recomenda- se a introduo de pequenos sacos de slica-gel no seu interior. A slica-gel tem a vantagem adicional de absorver o etileno e outros gases potencialmente nocivos, produzidos pelas sementes como catabolitos durante o processo de envelhecimento. importante que os sacos de slica-gel sejam equilibrados nas condies de secagem usadas no banco de sementes, para evitar o risco de secagem excessiva das sementes. Outras questes crticas so o tipo de tampa e selagem do recipiente e a acessibilidade do contedo, no caso de recipientes com selagem reutilizvel. A selagem pode necessitar de verificao e substituio peridicas. Recomenda-se o uso de materiais de borracha natural, pois tm dado bons resultados (RBGK). Alguns bancos de sementes tm realizado testes hermeticidade dos recipientes (ver mtodo abaixo). Recomenda-se que todos os bancos de sementes realizem este tipo de teste, para que seja possvel comparar a eficcia dos diversos tipos e lotes de recipientes. Existem algumas indicaes de que as sementes com elevado teor em leo beneficiam da embalagem em vcuo, pois o oxignio no ar poderia promover a peroxidao lipdica (ver tambm EllisHong, 2007). No entanto, a embalagem em vcuo tambm aumenta o risco de entrada de humidade, devido presso negativa e, no caso de frutos com forma irregular, existe a possibilidade de perfurao da embalagem. Alm disso, os sulcos podem aumentar a tenso. Note-se que o fecho em vcuo pode ser usado noutro tipo de recipientes, alm das embalagens de alumnio (p. ex., de metal). Teste para deteco de fugas nos recipientes Colocar 1 g de esferas de slica-gel por 1 l de volume do recipiente vazio (0,1%, peso:volume). A slica-gel dever ser previamente seca numa estufa de secagem e o recipiente equilibrado nas condies da sala de secagem. Colocam-se os recipientes em teste num ambiente hmido (caixa selada contendo gua), temperatura ambiente, por um perodo mnimo de quatro semanas. Posteriormente, transfere-se a experincia para -20 C durante pelo menos um ano e, de preferncia, por um perodo superior. Devem ser testados pelo menos 10 recipientes por lote e recomenda-se que o nvel de resposta para o resultado positivo seja fixado em 100%. Uma simples fuga indica que todo o lote deve ser rejeitado.
29. 29. 21 Recomendaes Escolher o recipiente utilizando a rvore de deciso abaixo. As sementes devem ser embaladas preferencialmente na sala de secagem ou noutro ambiente com humidade controlada. Deve usar-se recipientes de vidro transparente (os frascos com tampa de enroscar e os frascos com fecho metlico foram os que mostraram o melhor desempenho at data) e evitar sacos de plstico. Colocar um indicador de humidade (pequeno saco de slica-gel) no recipiente para monitorizar a hermeticidade e para proteco contra catabolitos. A slica-gel deve ser equilibrada nas condies de secagem usadas no banco de sementes (normalmente 15% HR). Inspeccionar anualmente os recipientes para deteco de fugas. Verificar e substituir periodicamente a selagem (se aplicvel). Usar embalagem dupla ou tripla para aumentar a proteco contra a entrada de vapor de gua, especialmente nas coleces base, que no iro ser utilizadas por longos perodos. Testar a hermeticidade dos lotes de recipientes usando um procedimento padronizado. rvore de deciso para seleco de embalagens 1 As coleces so enviadas para outras instituies ou transportadas a longa distncia usar sacos de folha de alumnio (peso e risco de quebra baixos) 1 As coleces so armazenadas sem necessidade de transporte a longa distncia 2 conservao a curto prazo usar sacos de folha de alumnio ou recipientes de vidro 2 conservao a longo prazo 3 acesso frequente coleco usar recipientes de vidro transparente com selagem reutilizvel, com indicador de humidade no interior; ou distribuir a coleco por vrios recipientes de vidro selados chama 3 acesso pouco frequente / sem acesso coleco usar recipientes de vidro selados chama (para coleces pequenas); embalagem dupla em recipientes de vidro transparente, com selagem reutilizvel e indicador de humidade no interior, inspeccionados regularmente; ou embalagem dupla de folha de alumnio, com selagem de eficcia garantida reas de investigao prioritrias Colaborar com universidades na investigao das propriedades fsicas dos diferentes mate- riais (incluindo plsticos rgidos) e sistemas de selagem dos recipientes, de modo a conceber um recipiente para armazenamento de sementes a longo prazo que combine hermeticidade e acessibilidade. Obter mais dados sobre os efeitos da embalagem em vcuo nas sementes com elevado teor de lpidos.
30. 30. 22 TEMA 5. ARMAZENAMENTO A LONGO PRAZO: TEMPERATURA Resumo redigido por M. Elena Gonzlez-Benito (UPM), com base na comunicao de Hugh Pritchard (RBGK), na comunicao adicional de MAICh e na sesso de discusso. Aspectos gerais reconhecido que a reduo do contedo em gua (ver Tema 2D) e / ou a temperatura de armazenamento prolongam a longevidade das sementes ortodoxas (cf. RobertsEllis, 1989; PritchardDickie, 2003). Portanto, a utilizao de uma temperatura abaixo de 0 C (normalmente entre -18 e -20 C) recomendada para o armazenamento a longo prazo da maioria das sementes ortodoxas (FAO Gene Bank Standards, 1994; Rao et al., 2006). Tendo por base esta recomendao geral, sero discutidos os seguintes tpicos, que devero ser teis ao projectar um banco de sementes de espcies silvestres, especialmente no caso de no existir informao publicada: (1) temperatura de armazenamento; (2) identificao de sementes com baixo desempenho a -20 C e procedimentos que podero minimizar este problema, e (3) potencialidades e riscos da criopreservao de sementes. TEMA 5A. TEMPERATURA DE ARMAZENAMENTO Aspectos gerais A vantagem de utilizar temperaturas baixas para conservar as sementes foi quantificada nas equaes de viabilidade das sementes (EllisRoberts, 1980). A longevidade das sementes aumenta medida que a temperatura de armazenamento decresce. Contudo, o efeito benfico do decrscimo de temperatura na longevidade reduzido a temperaturas muito baixas(Tompsett, 1986; Dickie et al., 1990; Walters et al., 2004). Para seleccionar a temperatura de armazenamento das sementes, necessrio encontrar um compromisso entre os custos e o esforo tcnico, e a longevidade. A maioria dos congeladores convencionais opera de -18 C a -20 C, pelo que esta gama de temperaturas frequentemente utilizada. Para esta gama de temperaturas, so recomendados contedo em gua de 3,5 - 6,5% (ver Tema 2D). No entanto, salienta-se que no existem dados empricos que validem as temperaturas de armazenamento convencionais como o compromisso ptimo entre custo e longevidade. Apesar disso, o uso de temperaturas abaixo de - 35 C no parece trazer um acrscimo significativo na longevidade das sementes, no justificando assim os custos acrescidos. As temperaturas muito baixas, como -196 C usada na criopreservao com azoto lquido, podem ser recomendadas para as espcies com sementes tolerantes desidratao e com longevidade baixa (Stanwood, 1985). Hipoteticamente, h um aumento de 175x na longevidade comparado com o armazenamento convencional a -20 C (Dickie et al., 1990; PritchardDickie, 2003). Mais recentemente, os trabalhos em sementes de alface secas sugeriram uma meia-vida de 500 e 3400 anos em fase de vapor e em azoto lquido, respectivamente. Estes resultados indicam uma longevidade pelo menos 50 vezes superior esperada para as temperaturas convencionais dos bancos de sementes (Walters et al., 2004). A criopreservao tambm pode ser recomendada para a conservao de sementes de espcies ameaadas ou endmicas, para as quais existem apenas pequenas quantidades de sementes e, naturalmente, para os tecidos (embries, eixos embrionrios) de sementes recalcitrantes. H evidncias de que algumas sementes ortodoxas toleram a secagem nas condies dos bancos de sementes, mas perdem a capacidade de germinao ou apresentam uma longevidade inferior esperada aps o armazenamento a cerca de -20 C ou a outras temperaturas abaixo de zero (Ellis et al., 1990; Pritchard et al., 1999). Por exemplo, as sementes secas de Cattleya aurantiaca
31. 31. 23 (Orchidaceae; Pritchard e Seaton, 1993) e Cuphea carthagenensis (Lythraceae; Crane et al., 2003) apresentam germinao baixa aps armazenamento a -18 C, possivelmente devido transformao de lpidos / cristalizao. Em C. carthagenensis, a germinao foi parcialmente recuperada com um pr-tratamento de aquecimento antes da embebio (Crane et al., 2003). Os tratamentos necessrios para recuperar a capacidade de germinao (se as sementes no foram danificadas) podem ser especficos da espcie e podem incluir: embebio lenta, embebio a temperatura superior e pr-aquecimento antes da embebio (ver PritchardNadarajan, 2008). Recomendaes As temperaturas abaixo de 0 C (normalmente entre -18 e -20 C) so recomendadas para a conservao a longo prazo da maioria das sementes ortodoxas. Para o armazenamento convencional a temperaturas no-criognicas, temperaturas abaixo de -35 C no parecem trazer benefcios longevidade de sementes que justifiquem os custos adicionais. reas de investigao prioritrias De acordo com o exposto acima, quando uma espcie apresenta germinao baixa aps armazenamento a uma temperatura abaixo de zero, isso no significa necessariamente que as sementes esto mortas ou que as condies de conservao so inadequadas; so necessrios mais estudos para identificar eventuais respostas especficas de cada espcie. Poder ser necessrio testar tratamentos especficos para quebra de dormncia e / ou tratamentos de embebio. Alm disso, seria importante comparar os efeitos do armazenamento a diferentes temperaturas. A anlise da relao custo-benefcio das diferentes temperaturas (gama convencional abaixo de zero) usadas no armazenamento das sementes seria til. TEMA 5B. INSTALAES E EQUIPAMENTO Aspectos gerais Sala fria e arcas frigorficas A escolha entre uma sala e uma arca frigorfica depende do nmero de coleces de sementes e do respectivo volume (tamanho das sementes). Quando ambos os valores so baixos, uma arca frigorfica pode ser suficiente. As arcas frigorficas verticais tm melhor acessibilidade do que as horizontais e armazenam um maior nmero de coleces por unidade de rea de laboratrio. No caso de se optar por esta soluo, conveniente ter uma arca suplementar para uma eventual falha do equipamento. Figure 19 Organizao das coleces de sementes no Banco de Sementes UVEG. ( UVEG)
32. 32. 24 Se a capacidade das coleces for superior a 10-15 m3 , uma sala fria a soluo mais eficiente (Cromarty et al., 1990). Nesse caso, prefervel ter duas pequenas salas com sistemas de arrefecimento independentes a uma nica sala grande, especialmente se no h inteno de utilizar todo o espao de armazenamento no futuro prximo (ver tambm Linington de 2003 para a discusso sobre o planeamento de um banco de sementes). Independentemente do equipamento escolhido, a rotulagem adequada (p. ex. cdigo de barras) essencial para garantir o acesso fcil e rpido coleco. A rapidez particularmente importante se as portas permanecerem abertas. O nmero de acesso, o nmero de localizao (por exemplo, na UVEG, Prateleira / Estante / Recipiente aparecem como AB/04/10B - ver Figura 19) e o cdigo de barras indicados na etiqueta devem ser obrigatoriamente registados na base de dados do banco de sementes. Coleces base e activa e duplicados Tradicionalmente, os bancos de sementes separam cada coleco numa amostra base, que mantida intacta para a conservao a longo prazo, e uma amostra activa, que est mais facilmente acessvel, para que possa ser retirada para utilizao. As amostras base so geralmente mantidas em embalagens menos acessveis (vidro selado ou embalagem dupla) e armazenadas em condies de conservao a longo prazo. Em contrapartida, as amostras activas, so armazenadas em recipientes de fcil abertura (ou mesmo abertas, quando em ambiente seco) e a temperaturas mais adequadas ao acesso dos funcionrios. Existem problemas potenciais de divergncia gentica entre as duas amostras (ver Tema 9, Regenerao). Alm disso, pode ser difcil decidir qual a proporo da coleco que se deve destinar para distribuio e conservao a longo prazo. RBGK (Millenium Seed Bank) mantm ambas as amostras (base e activa) em condies de conservao a longo prazo. A maioria da coleco mantida na amostra base. Uma grande vantagem dos bancos de sementes a conservao de uma enorme diversidade gentica num mesmo local. Esta concentrao da diversidade num mesmo espao constitui igualmente uma fraqueza elementar em caso de acidente, que pode destruir material extremamente valioso (e nalguns casos, insubstituvel). Por isso, essencial que, alm de tomar todas as medidas necessrias salvaguarda das instalaes e das coleces do banco de sementes, as amostras sejam duplicadas (criando outra amostra base separada) noutro banco de sementes, com uma localizao geogrfica distante. Criopreservao Embora a conservao em azoto lquido (-196 C) ou em sua fase de vapor (cerca de -150 C) possa prolongar a vida til das sementes, geralmente no a primeira escolha para armazenamento, devido a dificuldades tcnicas / motivos de ordem prtica (ver abaixo). H cerca de 30 anos que no feita uma anlise custo-benefcio da criopreservao relativamente ao armazenamento convencional. Este tipo de anlise seria til. A criopreservao obviamente mais adequada conservao de sementes ortodoxas com uma longevidade baixa, ou conservao de amostras com um nmero de sementes baixo (p. ex., espcies em perigo ou endemismos raros e com distribuio restrita). Figura 20 Criopreservao em azoto lquido. ( RBGK)
33. 33. 25 Embora a tolerncia ao azoto lquido tenha sido demonstrada em sementes de centenas de espcies, existem ainda desafios prticos no uso desta tcnica: O azoto lquido um produto perigoso, devido ao risco de queimadura e asfixia. essencial a formao de pessoal especializado e o uso de roupas e procedimentos de segurana adequados. O derramamento de azoto lquido evapora rapidamente e elimina o oxignio, pelo que indispensvel a instalao de alarmes de oxignio nos locais de armazenamento e uso deste produto. necessrio um fornecedor de azoto lquido nas proximidades do banco de sementes. Os grandes recipientes de azoto lquido (p. ex. 600 l, com capacidade para 12.000 cryovials) so caros. Os recipientes devem ser regularmente preenchidos at ao nvel necessrio para manter as amostras temperatura adequada (cerca de -150 C). Os tanques criognicos de menor dimenso (p. ex., 30 l, com capacidade mxima de 855 recipientes de 2 ml) podem ser enchidos manualmente, enquanto os grandes requerem um recipiente prprio. Embora o custo inicial dos recipientes grandes seja elevado, o preo de fornecimento de azoto lquido menor quando comparado com o recipientes pequenos, pois o transporte de azoto lquido aumenta os custos. O mtodo s apropriado para amostras com quantidades relativamente pequenas de se- mentes. Para optimizar o processamento das sementes, devem ser considerados trs aspectos princi- pais (PritchardNadarajan, 2008): 1) o contedo das sementes em gua deve ser inferior ao teor de humidade limite para congelao (Stanwood, 1985); 2) o arrefecimento rpido ou re-aquecimento podem danificar mecanicamente as sementes muito secas, o que pode, no en- tanto, ser evitado; 3) a embebio lenta, sobretudo evitando a imerso em gua a temperaturas inadequadas, recomendada antes ou como parte do teste de germinao. de salientar que, alm da vantagem da maior longevidade na criopreservao, os criotanques tm uma vida til cerca de cinco vezes superior das arcas frigorficas (J. Puchalski, com. pss.) e no requerem o fornecimento permanente de energia elctrica. Recomendaes A criopreservao em azoto lquido recomendada para espcies com sementes ortodoxas com longevidade baixa. Todas as amostras devem ser duplicadas noutro banco de sementes. Este banco deve estar situado a uma distncia considervel, de modo a que no esteja sujeito aos mesmos fenmenos catastrficos que possam destruir a coleco principal. reas de investigao prioritrias Seria til uma anlise de custo-benefcio da criopreservao relativamente conservao convencional.
34. 34. 26 TEMA 6. TESTES DE GERMINAO Resumo redigido por David Draper e M. Elena Gonzlez-Benito (UPM), com base na comunicao de Costas Thanos (NKUA), comunicaes adicionais de UNI-PAV e RBGK e na sesso de discusso. Aspectos gerais Num banco de sementes, importante conhecer a viabilidade das sementes que se conserva. A viabilidade das sementes de uma amostra definida como o nmero de sementes vivas e com potencial para dar origem a uma plntula (Gosling, 2003; Rao et al., 2006). Uma vez que a longevidade de uma amostra de sementes depende da qualidade destas, importante que as sementes tenham viabilidade elevada quando so armazenadas, ou pelo menos, que a viabilidade seja conhecida. O mtodo mais fivel para avaliar a viabilidade um teste de germinao, i.e. germinar as sementes nas condies ptimas, depois da aplicao de um tratamento para quebra de dormncia, se necessrio. As dificuldades surgem quando, como acontece com muitas espcies silvestres, as condies ptimas de germinao e o mtodo para quebrar a dormncia so desconhecidos. Podem ainda ser utilizados testes bioqumicos (p. ex. tetrazlio, TTC) para identificar sementes viveis, sem necessidade de realizar testes de germinao. Esses testes podem ser teis para distinguir entre sementes mortas e dormentes. No entanto, tm a desvantagem de ser menos rigorosos do que os testes de germinao e os resultados so, por vezes, difceis de interpretar. Obviamente, importante saber como germinar as sementes, para que estas possam ser utilizadas no futuro. Assim, a seco seguinte centra-se nos testes de germinao e nos procedimentos necessrios para a produo de plntulas normais. Recomendaes Quando testar? Seria desejvel que os testes de germinao fossem realizados antes e aps a secagem e depois do armazenamento. Deste modo, seria possvel verificar se a capacidade de germinao afectada pela secagem e pelas temperaturas baixas. No entanto, na maioria dos bancos de sementes, este procedimento pode no ser vivel. Se os recursos permitirem, recomenda-se a realizao dos testes de germinao no maior nmero possvel de coleces aps a secagem das sementes (antes do armazenamento) e pouco tempo depois do armazenamento. Se os recursos forem limitados e s for possvel realizar um teste, recomenda-se que este seja realizado no primeiro ms depois do armazenamento. O resultado deste teste constituir a referncia, com a qual os futuros testes sero comparados. Quantas sementes? Antes de realizar os testes de germinao, deve fazer-se uma estimativa do nmero de sementes vazias / danificadas. A percentagem de germinao deve ser expressa em termos do nmero de sementes com capacidade fsica para germinar (nmero total de sementes - nmero de sementes vazias ou danificadas). O tamanho da amostra recomendado para as espcies agrcolas (FAO / IPGRI, 1994; ISTA 2008), 200 sementes (duas Figura 21 Resultado de um teste de germinao.( RBGK)
35. 35. 27 rplicas de 100), pode ser demasiado elevado para as coleces de espcies silvestres, nas quais o nmero de sementes pode ser limitado, sobretudo nas espcies com populaes pequenas ou com sementes grandes. Nestes casos, um teste de germinao com 100 ou mesmo 50 sementes considerado aceitvel, com a amostra dividida em duas rplicas de 50 ou 25 sementes, respectivamente (note-se que no existem regras obrigatrias, p. ex., algumas instituies, como MAICh, utilizam trs rplicas de 30 sementes). Esta recomendao tambm til para bancos de sementes com um grande nmero de coleces e com disponibilidade limitada de recursos e / ou pessoal. Humedecimento das sementes secas Os recipientes que estiveram armazenados a temperaturas abaixo de zero devem ser aquecidos antes de retirar as sementes (ver Tema 10). Nas espcies susceptveis a leses por embebio, por exemplo, Leguminosae (Fabaceae) com sementes grandes, as sementes devem ser humedecidas. Este procedimento evita as leses causadas por embebio. A recuperao da capacidade de reparao das membranas celulares lenta nas sementes muito secas ou envelhecidas, pelo que a rpida absoro de gua pode conduzir perda de contedo celular. As sementes podem ser colocadas dentro de um recipiente de plstico com tampa hermtica (semelhante aos usados na conservao de alimentos) ou num excicador, que por sua vez, contm um recipiente com gua; esta gua ir criar um ambiente hmido. As sementes devem permanecer no recipiente durante 24 h antes, antes de iniciar o teste de germinao, mas no devem estar em contacto fsico com a gua lquida. Seleco das condies de germ