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CAPITULO 6 Catabolismo de aminoácidos, formación de aminas biógenas, amonio y aromas María Fernández y Manuel Zúñiga
Instituto de Productos Lácteos, C.S.I.C.,Asturias, e Instituto de Agroquímica y Tecnología de
Alimentos, C.S.I.C., Valencia.
INTRODUCCIÓN
El metabolismo de los aminoácidos por las bacterias lácticas (BL) ha recibido una
considerable atención debido esencialmente a su impacto sobre la calidad y seguridad de los
productos fermentados. Esto se debe a que los aminoácidos son precursores de compuestos
que contribuyen significativamente al aroma característico de estos productos y además, son
precursores de compuestos tales como las aminas biógenas que pueden suponer un riesgo para
la salud. Este interés aplicado ha sesgado en cierta medida el estudio de las rutas metabólicas
hacia algunos grupos de aminoácidos. Diversos estudios han probado que las BL,
consideradas en conjunto, son capaces de metabolizar todos los aminoácidos, no obstante,
existen considerables variaciones entre diferentes cepas, incluso dentro de la misma especie
(Williams et al., 2001; Kieronczyk et al., 2001). Es de esperar no obstante, que los datos
obtenidos en los proyectos de secuenciación genómica de BL ya terminados o en curso,
contribuirán considerablemente a la elucidación de estas rutas metabólicas. En los modelos
celulares más conocidos, como las células animales o Saccharomyces cerevisiae entre los
eucariotas, y Escherichia coli y Bacillus subtilis entre los procariotas, las rutas de degradación
de los aminoácidos conducen en general a intermediarios del ciclo del ácido cítrico o a acetil-
CoA. Las BL no poseen un ciclo del ácido cítrico completo, por ello, las rutas de degradación
de aminoácidos en algunos casos son incompletas, divergentes, o totalmente distintas a las
descritas en los organismos modelo.
El metabolismo de aminoácidos en BL se canaliza por diversas rutas, dentro de éstas tienen
especial relevancia las catalizadas por amino-transferasas y descarboxilasas, puesto que
intervienen en la degradación de diversos aminoácidos. Otras enzimas implicadas en el
metabolismo de los aminoácidos por las BL incluyen liasas, deshidrogenasas y otras que serán
discutidas particularmente.
Aminotransferasas
Las amino-transferasas constituyen una gran familia de proteínas que catalizan la
transferencia del grupo amino entre pares aminoácido-oxoácido (Fig. 1). La mayoría utilizan
como oxoácido aceptor el ácido α-oxoglutárico, siendo por tanto específicas para el par α-
oxoglutarato-L-glutamato. La especificidad para el otro par es menos rígida, aunque en
general existe uno para el que muestran máxima actividad y confiere nombre a la enzima. No
obstante, es importante resaltar que existe un considerable solapamiento de actividades entre
distintas amino-transferasas, como veremos a lo largo de este capítulo. Las reacciones
catalizadas por las amino-transferasas son libremente reversibles y poseen una constante de
equilibrio de alrededor de 1. Todas las amino-transferasas utilizan el fosfato de piridoxal
como grupo prostético, un cofactor que interviene además en otras muchas transformaciones
de aminoácidos (véase por ejemplo Stryer, 1995, para más detalles sobre las reacciones donde
interviene el fosfato de piridoxal). Al ser reacciones reversibles, estas enzimas pueden
participar tanto en la degradación como en la síntesis de los aminoácidos. La participación en
una u otra reacción, está determinada por el mecanismo de regulación: la síntesis de enzimas
catabólicos es en general, inducida por el substrato de la reacción mientras que la síntesis de
los enzimas biosintéticos es constitutiva o está reprimida por el aminoácido.
Descarboxilasas
Las descarboxilasas catalizan la escisión del grupo carboxilo de un aminoácido y producción
de la amina correspondiente. La descarboxilación de aminoácidos constituye un sistema de
regulación del pH intracelular y generación de energía metabólica (Konings et al., 1995). La
descarboxilación del aminoácido resulta en el consumo neto de un protón, es decir una
alcalinización del medio intracelular. Pero además, el transporte del aminoácido y la amina
suelen estar acoplados por un antiporter. Este transporte es electrogénico, puesto que el
intercambio aminoácido/amina resulta en la expulsión de un protón y el establecimiento de
una fuerza protónmotriz (Fig. 1). Así, el sistema antiporter/descarboxilasa constituye una
bomba de protones indirecta similar a la descrita para otros sistemas análogos (Maloney 1990;
Poolman, 1993). Se ha propuesto además que la fuerza protónmotriz así generada puede ser
utilizada para la síntesis de ATP por transporte inverso de protones a través de la F0F1ATPasa
de membrana en condiciones de pH ácido. Las vías de degradación por descarboxilación
constituyen así una importante fuente de energía y un sistema de protección frente a un medio
ácido.
Este capítulo se ha dividido en dos secciones por facilidad de exposición. La primera sección
se centra en los aspectos bioquímicos y moleculares de las rutas metabólicas de degradación
de los aminoácidos caracterizadas en BL, y la segunda sección se centra específicamente en
dos temas de especial relevancia desde un punto de vista aplicado: la producción de
compuestos que afectan a las cualidades sensoriales de los productos fermentados, y la
producción de aminas biógenas que pueden afectar seriamente a la seguridad de los
productos.
Asparragina y glutamina
No se dispone de información detallada sobre el catabolismo de la asparragina y la glutamina
en BL, aunque existen evidencias de que numerosas cepas de este grupo son capaces de
metabolizar estos aminoácidos (Williams et al., 2001; Kieronczyk et al., 2001). No obstante,
en los genomas de Lactococcus lactis y Lactobacillus plantarum se encuentra un homólogo
del gen ansA de B. subtilis (llamado ansB y lp_2738 en L. lactis IL1403 y Lb plantarum
WCFS respectivamente; Bolotin et al., 2001; Kleerebezem et al., 2003), que codifica la
asparraginasa (EC 3.5.1.1), un enzima que cataliza la conversión de asparragina en ácido
aspártico con liberación de una molécula de amonio (Fig. 2; véase también el apartado
dedicado al metabolismo del ácido aspártico). La asparragina puede ser asimismo sustrato de
la glutaminasa-asparraginasa (EC 3.5.1.38; codificada por yccC en B. subtilis), que cataliza la
reacción análoga de conversión de glutamina en ácido glutámico y amonio. Los genes ansB
de L. lactis y ansA e yccC de B. subtilis son parálogos pertenecientes a la misma familia de
proteínas, por tanto, en función de la similitud de secuencia no se puede predecir si el enzima
codificado por ansB es una asparraginasa o una glutaminasa-asparraginasa.
De igual modo, no se conoce el catabolismo de la glutamina. Se han encontrado homólogos
de genes que codifican el enzima glutaminasa en L. lactis IL1403 (carA; Bolotin et al., 2001)
y Lb. plantarum WCFS (pyrAA; Elagoz et al., 1996). Sin embargo, en estos organismos los
genes se encuentran asociados con genes posiblemente implicados en la biosíntesis de
pirimidinas. En consecuencia, es probable que estos genes codifiquen las subunidades
glutaminasa del complejo carbamoil-fosfato sintetasa y por tanto, es dudoso que estos
enzimas tengan un papel relevante en el catabolismo de la glutamina.
En Streptococcus bovis se ha descrito una actividad glutamina ciclotransferasa que convierte
la glutamina en piroglutamato y amonio (Cook y Russell, 1993). Esta reacción está
aparentemente acoplada a la fosforilación de ADP. Sin embargo, se ignora si esta actividad
está presente en otras BL.
En E. coli, la aspartato amino-transferasa tiene también actividad glutamina transaminasa K
(EC 2.6.1.64) que cataliza la conversión de glutamina en oxoglutamato siendo el grupo
aceptor el fenilpiruvato que es convertido en fenilalanina (Han et al. 2001). Sin embargo, el
enzima caracterizado en L. lactis es altamente específico para el aspartato (Dudley y Steele,
2001). Finalmente, la glutamina amino-transferasa II o glutamina-piruvato amino-transferasa
no se ha descrito en bacterias.
Ácido aspártico
En BL se han identificado tres vías catabólicas del ácido aspártico, aunque no han sido
estudiadas detalladamente. Estas vías están catalizadas por aspartato amino-transferasa,
aspartato descarboxilasa y aspartasa respectivamente (Fig. 2). Además, en el genoma de Lb.
plantarum WCFS se ha localizado una aspartato 1-descarboxilasa (EC 4.1.1.11; codificada
por el gen panD; Kleerebezem et al. 2003) que convierte el aspartato en β-alalina, pero se
carece de datos sobre su posible implicación en el catabolismo del ácido aspártico.
La aspartato amino-transferasa (EC 2.6.1.1) cataliza el intercambio reversible del grupo
amino entre el aspartato y el α-oxoglutarato, rindiendo oxalacetato y glutamato (Fig. 2). La
aspartato amino-transferasa ha sido purificada de Lactobacillus murinus (Rollan et al., 1988).
En L. lactis LM0230 se ha clonado y caracterizado una aspartato amino-transferasa (aspC)
(Dudley y Steele, 2001). El enzima es específico para el aspártico y está implicado en la
biosíntesis de aspártico y asparragina, puesto que mutantes aspC- requieren al menos uno de
estos aminoácidos para crecer. Estos resultados indican que L. lactis puede producir aspártico
a partir de asparragina, posiblemente por acción del producto de asnB. De hecho, en L. lactis
el transporte de Asn es mucho más eficiente que el de Asp, y es probable que la Asn sea
preferentemente dirigida a la producción de aspártico. Sin embargo, se desconoce si este
enzima interviene en el catabolismo del aspártico.
La aspartasa o aspartato amonio-liasa (EC 4.3.1.1) es una liasa C-N y cataliza la conversión
reversible de aspártico en fumárico con eliminación de amonio (Fig. 2). Este enzima ha sido
aislado de diversas especies de bacterias, pero dentro del grupo de las BL sólo se ha descrito
en Lb. murinus y se desconoce su papel fisiológico (Rollan et al., 1985). En los genomas de L.
lactis y Lb. plantarum no se encuentran homólogos de aspartasas.
Finalmente, se ha descrito una aspartato descarboxilasa (EC 4.1.1.12) en Lactobacillus sp.
(Abe et al., 1996). El enzima cataliza la descarboxilación del carbono β del aspártico
rindiendo alanina y CO2 (Fig. 2). El intercambio de aspártico y alanina produce una fuerza
protónmotriz como se ha discutido anteriormente para las descarboxilasas en general. No
existen evidencias de este sistema en otras BL.
Ácido glutámico
Se han descrito tres posibles vías catabólicas para el glutamato en BL, iniciadas por una
amino-transferasa, una deshidrogenasa o una descarboxilasa (Fig. 3). Las dos primeras rutas
producen α-oxoglutarato, mientras que la última genera γ-aminobutirato. Sin embargo,
existen indicios de que el glutamato puede ser canalizado por otras rutas. En un notable
trabajo, Novák y Loubière (2000) demostraron que los productos principales del catabolismo
del glutamato en L. lactis cultivado en medios mínimos son el α-oxoglutarato y el
piroglutamato, si bien estaban presentes en bajas cantidades. No se ha descrito sin embargo
qué ruta puede conducir a la producción de piroglutamato, un compuesto intermediario del
metabolismo de la glutationa. Además, una parte significativa del glutamato no pudo ser
contabilizada en el balance de productos, lo que sugiere que puede haber sido degradado a
otros productos no identificados.
El glutamato es un importante intermediario en las vías metabólicas de los aminoácidos en BL
puesto que todas las amino-transferasas descritas hasta la fecha en este grupo utilizan el
glutamato como sustrato donador del grupo amino. El α-oxoglutarato resultante
aparentemente no es metabolizado (Christensen et al., 1999). Sin embargo, en las reacciones
catabólicas el glutamato es probablemente el producto de la transferencia del grupo amino de
otros aminoácidos al α-oxoglutarato. En L. lactis se ha descrito que la producción de
compuestos aromáticos a partir de la degradación de aminoácidos ramificados está limitada
por la disponibilidad de α-oxoglutarato (Rijnen et al., 2000).
Las glutamato deshidrogenasas (GDHs) se dividen en dos clases en función de su
especificidad metabólica (Smit et al., 1975). Las GDHs dependientes de NAD+ (EC 1.4.1.2)
tienen esencialmente función catabólica, mientras que las dependientes de NADP+ (EC
1.4.1.3) están implicadas en la asimilación de amonio, y por tanto, síntesis de glutamato. En
BL no se tienen evidencias directas de la presencia de GDH catabólica. L. lactis
aparentemente no puede producir α-oxoglutarato por deshidrogenación del glutamato
(Lapujade et al. 1998; Rijnen et al., 2000). Por otra parte se ha caracterizado la GDH
dependiente de NADP+ de Lactobacillus fermentum (Misono, 1985). Por tanto, la ruta de la
GDH en BL es aparentemente una ruta biosintética.
La glutamato descarboxilasa (GAD) ha sido purificada de Lactobacillus brevis, observándose
que presenta un óptimo de actividad a pH 4.2, y que la presencia de iones sulfato incrementa
su actividad (Ueno et al., 1997). Higuchi et al. (1997) demostraron además que células de
Lactobacillus sp. son capaces de sintetizar ATP vía la F1F0ATPasa en presencia de glutamato.
Asimismo, como consecuencia de la caracterización de un promotor inducible por cloruro
(Sanders et al., 1998b), se han clonado y caracterizado los genes implicados en la degradación
del glutamato por GAD en L. lactis (Sanders et al., 1998a). GAD es codificada por el gen
gadB, que forma un operón con un antiporter glutamato/γ-aminobutirato codificado por el gen
gadC. El operón gadCB se transcribe desde el promotor Pgad y está bajo control del
regulador transcripcional codificado por gadR (Fig. 4), como se puso de manifiesto por
inactivación de gadR. Por su parte gadR se transcribe constitutivamente a partir del promotor
PgadR. El estudio de la transcripción del operón gadCB puso de manifiesto que ésta es
máxima al comienzo de la fase estacionaria y en presencia de cloruro sódico y glutamato en
condiciones de pH ácido (Sanders et al., 1998a). En este trabajo se demostró que el sistema
constituye un mecanismo particularmente eficaz de resistencia a pH ácido, puesto que células
de L. lactis cultivadas en condiciones de inducción del sistema (0.3 M NaCl 1 mM Glu)
presentaban un incremento en viabilidad de 2500 a 5000 veces superior a células no inducidas
o deficientes en GAD frente a medio ácido. No se ha determinado claramente el papel del
cloruro en la inducción de un sistema de protección frente a condiciones ácidas, aunque se ha
propuesto que esto podría ser una respuesta adaptativa frente a ambientes donde se encuentra
un pH ácido y alta concentración de cloruro, como el estómago (Sanders et al., 1998a).
Asimismo, el sistema podría conferir una ventaja selectiva a L. lactis para el crecimiento en
queso, un ambiente con alta concentración de cloruro y glutamato.
Aminoácidos Aromáticos
En la degradación de aminoácidos aromáticos, fenilalanina, tirosina y triptófano, participan
tanto reacciones enzimáticas; catalizadas por amino-transferasas, descarboxilasas y
deshidrogenasas, como reacciones químicas; en este caso, el papel de los microorganismos es
proporcionar las condiciones adecuadas para que la reacción tenga lugar (concentración de
iones, condiciones de óxido-reducción, etc.).
En la mayoría de las cepas de BL estudiadas, la degradación de los aminoácidos aromáticos se
inicia con una reacción catalizada por una amino-transferasa. Por ello, antes de ver el
catabolismo de cada uno de los aminoácidos aromáticos por separado se describirá lo que se
conoce hasta el momento sobre las amino-tranferasas implicadas en la degradación de
aminoácidos aromáticos. Como ya se ha mencionado en la introducción de este capítulo, estas
amino-transferasas pueden utilizar varios aminoácidos como substrato de la reacción, y
aunque las aminotransferasas aromáticas utilizan preferentemente Trp, Tyr y Phe, otros
aminoácidos como Met y Leu son también degradados por estas enzimas.
Amino-transferasas aromáticas
La actividad amino-transferasa aromática ha sido determinada en distintos géneros de BL
pero hasta el momento, sólo han sido purificadas y caracterizadas tres enzimas responsables
de esta actividad a partir de dos cepas del género Lactococcus. A partir de la cepa L. lactis
NCDO763 Yvon et al. (1997) purificaron el enzima AraT y a partir de la cepa L. lactis S3
Gao et al. (1998 a), purificaron dos amino-transferasas aromáticas (AraT1 y AraT2). Las tres
enzimas son muy similares, tanto en el tamaño de sus subunidades (42-43.5 kDa), como en
sus secuencias N-terminales, que son idénticas. Existe una pequeña variación entre ellas en
cuanto a la especificidad para cada uno de los aminoácidos, siendo Phe el substrato preferido
para AraT frente a Trp para AraT1 y AraT2. Mientras que AraT y AraT1 forman
homodímeros, AraT2, se encuentra en forma tetramérica. Basándose en parámetros cinéticos,
Gao et al. (1998 a) establecieron que en la cepa L. lactis S3 donde se encuentran dos enzimas
(AraT1 y AraT2), la forma tetramérica (AraT2) tiene una mayor actividad catalítica que la
forma dimérica (AraT1), sugiriendo que la célula podría controlar su actividad amino-
transferasa regulando la relación entre la forma dimérica y la tretamérica del enzima en
respuesta a las condiciones de crecimiento. Las características de estas tres proteínas se
resumen en la Tabla 1.
Estas enzimas pertenecen a la familia I subfamilia γ de amino-transferasas, y dentro de esta
subfamilia es importante hacer una nueva subdivisión que permita separar a las aspartato
amino-transferasas de las amino-transferasas aromáticas.
En cuanto a los datos genéticos, hasta el momento sólo se ha clonado y secuenciado el gen
que codifica AraT en L. lactis NCDO763, araT. Este gen se encuentra en una sola copia en el
cromosoma de la bacteria y su expresión es constitutiva. Mediante análisis Southern, Rijnen
et al. (1999) comprobaron que el gen araT se encuentra ampliamente distribuido dentro de las
bacterias Gram +, incluyendo especies tales como B. subtilis, Streptococcus mutans,
Streptococcus pneumoniae, se encontró en todas las cepas de L. lactis subsp. cremoris y
subsp. lactis estudiadas, Enterococcus faecalis y con un grado de homología menor en
Streptococcus thermophilus. El análisis de los genomas de BL ha revelado que existe un gen
homólogo a araT en L. lactis IL1403 (Bolotin et al., 2001) mientras que en el genoma de Lb.
plantarum WCFS (Kleerebezem et al., 2003) hay dos genes que codifican dos proteínas que
tienen una elevada homología con la proteína AraT de L. lactis, y que podrían codificar la
enzima responsable de la actividad amino-transferasa aromática que había sido observada en
Lb. plantarum por Nierop et al. (1998).
La construcción de una cepa en la que el gen había sido interrumpido, y por lo tanto la
proteína resultante no era funcional, permitió evaluar el papel de esta amino-transferasa
aromática en la síntesis y en el catabolismo de aminoácidos. Los resultados obtenidos por
Rijnen et al. (1999) permiten concluir que esta enzima es esencial para el catabolismo de
aminoácidos aromáticos, especialmente fenilalanina, ya que en la cepa mutante se observa
una reducción de un 95% en la hidrólisis de Phe, Tyr y Trp. Se comprobó además, que en L.
lactis no existe otra ruta catabólica alternativa para estos aminoácidos ya que en ausencia de
α-oxoglutarato (el cofactor de esta reacción) no hay degradación de estos aminoácidos. AraT
participa también en el catabolismo de Met y Leu en este caso, se observa una reducción del
50% de la hidrólisis en la cepa mutante, indicando que al contrario de lo que ocurría en el
caso de los aminoácidos aromáticos otras amino-transferasas u otras rutas catabólicas
participan en la degradación de Met y Leu. AraT participa también en la síntesis de Phe y Tyr
pero no es esencial para la biosíntesis de Trp, para este aminoácido existe otra ruta
biosíntetica en BL. La inactivación de AraT ha permitido identificar otra amino-transferasa
que participaría en la biosíntesis de Phe y Tyr pero no en su degradación ya que está
reprimida en presencia de Phe y Tyr. Hasta el momento, no se tienen más datos sobre la
regulación de esta amino-transferasa biosintética. La presencia de dos o más amino-
transferasas aromáticas con funciones catabólicas y biosínteticas ha sido demostrada en otros
microorganismos como B. subtilis (Nester et al., 1976), Escherichia coli (Powell y Morrison,
1978) y Pseudomonas aeruginosa (Patel et al., 1978).
Los productos de la reacción de transaminación son posteriormente degradados mediante
reacciones químicas o enzimáticas a sus correspondientes aldehídos o ácidos carboxílicos. A
continuación, veremos con detalle estas rutas de degradación para los distintos aminoácidos
aromáticos.
Fenilalanina
El metabolismo de la fenilalanina ha sido estudiado en distintas cepas del género
Lactobacillus: Lb. plantarum URL-LcL1 (Nierop et al., 1998), Lactobacillus helveticus
LH212 y CNRZ32 (Klein et al., 2001), Lactobacillus casei LC301 y LC202 (Gummalla y
Broadbent, 2000) y en L. lactis NCDO763 (Yvon et al., 1997). En todas las cepas estudiadas,
el catabolismo de Phe se inicia con la reacción catalizada por una amino-transferasa (EC
2.6.1.57) cuyo producto de reacción es el ácido fenilpirúvico (PPA; Fig. 5). Éste es un
compuesto inestable que es química o enzimáticamente convertido en fenil-lactato, fenil-
acetato, benzaldehído, ácido mandélico o ácido fenil-glicósido. El porcentaje de cada uno de
estos productos varía de unas cepas a otras como veremos a continuación.
En Lb. plantarum el PPA formado por transaminación se convierte mediante una reacción
química en benzaldehído, ácido fenil-acético, ácido mandélico y ácido fenil-glicósido, siendo
el benzaldehído el producto mayoritario de la reacción (63%). Es interesante destacar que
aunque este último paso del catabolismo de Phe es una oxidación química, los componentes
celulares, posiblemente los iones Mn2+, son esenciales para la misma. El Mn2+, se encuentra
en concentraciones altas en el interior de la célula comparado con otros iones y Nierop et al.
(1998), observaron una relación lineal entre la cantidad de benzaldehído formado y la
concentración del extracto celular.
En Lb. casei y Lb. helveticus el producto mayoritario de la degradación de PPA es fenil-
lactato. En este caso, se trata de una reacción enzimática catalizada por una deshidrogenasa.
Mientras que los niveles de actividad amino-transferasa son muy similares entre las dos
especies, la actividad deshidrogenasa se expresa de forma constitutiva en Lb. casei y de forma
inducida en Lb. helveticus e incluso en esta última especie, hay variaciones importantes en los
niveles de actividad entre las distintas cepas (Gummalla y Broadbent, 2000). Al igual que
ocurría con la amino-transferasa, esta deshidrogenasa puede participar tanto en el catabolismo
como en la síntesis de Phe. Hasta el momento, no se dispone de otros datos sobre este enzima.
En L. lactis, la degradación de Phe da lugar a la formación de PPA, que se transforma
mediante una reacción química en fenil-lactato y fenil-acetato (Gao et al., 1997).
Triptófano
El triptófano (Trp) se transforma en la mayoría de las cepas estudiadas en ácido indol-pirúvico (IPA)
en una reacción catalizada por una amino-transferasa (EC 2.6.1.27; Fig. 6). El IPA formado es
posteriormente degradado química o enzimáticamente a indol-lactato (ILA), indol-acetato (IAA),
indol-aldehído (IALD) o benzaldehído. El tipo de compuesto derivado de la degradación de IPA varía
de unas cepas a otras. Algunos de los productos de degradación del IPA como el indol-acetato pueden
servir como substratos de nuevas reacciones para formar escatol. Este es un compuesto que confiere
un aroma muy desagradable al producto fermentado y es un ejemplo de cómo el conocimiento de las
rutas de degradación de los aminoácidos es una herramienta útil para la selección de las cepas que
formen parte de un cultivo iniciador para garantizar la calidad del producto.
En la mayoría de las cepas de lactobacilos el indol lactato es el producto mayoritario de la degradación
de triptófano y se forma por la acción sucesiva de una amino-transferasa que participa en la formación
de IPA y una segunda reacción de carácter enzimático o químico de la que no se conocen más datos
hasta el momento.
En lactococos, Gao et al. (1997) demostraron que el catabolismo de Trp comienza también con una
transaminación, pero en estos microorganismos el IPA formado se transforma en indol-aldehído o
indol acético mediante una reacción química o enzimática.
Algunas cepas de Lactobacillus y Leuconosotoc degradan Trp mediante una reacción de
descarboxilación, formándose triptamina como producto de la reacción. Gummalla y
Broadbent (1999) observaron en algunas cepas de lactobacilos actividad Trp descarboxilasa
pero no pudieron detectar en los sobrenadantes de los cultivos el producto de la reacción,
triptamina. González de Llano et al. (1998) observaron la formación de triptamina a partir de
Trp en algunas cepas de Leuconostoc, pero hasta el momento no se tiene ningún dato sobre el
enzima que catalizaría esta reacción, triptofano descarboxilasa.
Tirosina
En la mayoría de las cepas de BL estudiadas, el catabolismo de tirosina (Tyr) se inicia por una
amino-transferasa (EC 2.6.1.5) para formar p-hidroxi-fenil piruvato (HPPA; Fig. 7). Gao et al.
(1997) demostraron que en lactococos, este compuesto es espontáneamente transformado en
4-hidroxifenil-aldehído, p-hidroxifenil-acetato y p-hidroxifenil-lactato.
En Lb. casei y Lb. helveticus Gummalla y Broadbent (2000) comprobaron que el catabolismo
de Tyr comprende sucesivamente las reacciones de transaminación y deshidrogenación para
formar p-hidroxifenil acetato y p-hidroxifenil lactato y al igual que ocurría en el metabolismo
de Phe, mientras la expresión de la actividad amino-transferasa es similar entre las dos
especies, la actividad deshidrogenasa es inducible en Lb. helveticus y constitutiva en Lb.
casei, siendo la actividad especifica del enzima seis veces superior en los extractos celulares
de Lb. casei comparada con Lb. helveticus.
Algunas cepas de Lactobacillus, convierten el HPPA en p-cresol mediante una reacción de
descarboxilación en (Yokoyama y Carlson 1981); este compuesto confiere un aroma
desagradable al alimento y/o bebida. Por ello insistimos de nuevo en la importancia del
conocimiento de las rutas de degradación de los aminoácidos como un criterio de selección de
las cepas que forman el cultivo iniciador en alimentos fermentados.
Es importante destacar que en algunas cepas de BL la degradación de tirosina comienza con
una reacción de descarboxilación formándose tiramina y CO2 como productos de la misma.
La tiramina es una amina biógena, la ingestión de alimentos y/o bebidas con altos niveles de
tiramina, puede ser tóxica, por ello dedicaremos un apartado en este capítulo a las aminas
biógenas.
Aunque la actividad tirosina descarboxilasa había sido asociada inicialmente con
Lactobacillus ssp., trabajos posteriores han indicado que algunas cepas de Lactococcus y
muchas cepas del género Enterococcus tienen esta actividad descarboxilasa. Es interesante
destacar, que esta es una actividad dependiente de cepas y no de especies.
El enzima tirosina descarboxilasa (EC 4.1.1.25) ha sido purificado a partir de Lb. brevis IOEB
9809 (Moreno-Arribas y Lonvaud-Funel, 2001). Al igual que otras descarboxilasas su
actividad requiere la presencia del coenzima fosfato de piridoxal y es inducida por el substrato
de la reacción, tirosina. Recientemente, Connil et al., (2002) han clonado y secuenciado el
operón de la tirosina descarboxilasa a partir de una cepa de E. faecalis. Este operón está
formado por el gen estructural tirosina descarboxilasa, un gen que presenta homología con
proteínas transportadoras de membrana y que podría codificar para el antiporter encargado del
intercambio tirosina/tiramina entre el interior y el exterior de la célula y por una aminoacil t-
RNA sintetasa que estos autores sugieren que podría estar implicada en la regulación de la
expresión de la tirosina descarboxilasa.
AMINOÁCIDOS RAMIFICADOS
La degradación de leucina, valina e isoleucina, se inicia en todas las BL estudiadas con la
reacción catalizada por una amino-transferasa (EC 2.6.1.42) dando lugar a la formación del α-
oxoácido correspondiente (Fig. 8). La enzima responsable de esta actividad sólo ha sido
purificada a partir de la cepa de L. lactis NCDO763 (Yvon et al., 2000) y aunque utiliza
preferentemente aminoácidos ramificados, puede también degradar metionina.
Las amino-transferasas bacterianas son en general bastante diferentes de sus homólogas en
mamíferos y levaduras. La única amino-transferasa ramificada caracterizada de BL, BcaT
comparte algunas características con las amino-transferasas de mamíferos como su peso
molecular, pero sin embargo puede utilizar más de un aminoácido como substrato de la
reacción. Respecto a sus homólogas en otras bacterias, tiene mayor peso molecular y su
actividad específica con aminoácidos aromáticos es muy baja. De este modo, BcaT formaría
una nueva subclase de aminotransferasas tipo IV junto con los enzimas ILVE de Haemophilus
influenzae y ILVE de Helicobacter pylorii (Yvon et al., 2000).
El gen que codifica este enzima, ha sido clonado a partir de dos cepas del género
Lactococcus, L. lactis NCDO763, bcaT (Yvon et al. 2000) y LM0230 (Atiles et al., 2000)
donde se ha denominado a este gen ilvE por su homología con el gen de H. influenzae. Se
trata del mismo gen que se encuentra en copia única en el genoma de L. lactis, se transcribe
de forma monocistrónica y su expresión está reprimida por la presencia de aminoácidos
ramificados, especialmente isoleucina, en el medio de cultivo.
En Lactobacillus paracasei, Hansen et al. (2001) comprobaron que la degradación de los
aminoácidos ramificados se inicia también mediante una reacción de transaminación. A
diferencia de lo que había sido descrito en L. lactis esta enzima sólo hidroliza Ile, Leu y Val.
El análisis del genoma de Lb. plantarum WCFS (Kleerebezem et al., 2003) ha revelado la
presencia del gen bcaT en su genoma que podría codificar para el enzima responsable de la
actividad aminotransferasa en Lb. plantarum.
Al igual que ocurre con las amino-transferasas aromáticas, es difícil asignar un papel
fisiológico a estas transaminasas. Originalmente esta enzima catalizaría la última reacción de
biosíntesis de aminoácidos ramificados, lo que explicaría la represión del gen por Ile. Sin
embargo, en las cepas de BL que son auxótrofas para estos aminoácidos participan en la
degradación de aminoácidos, como se ha demostrado mediente la inactivación del gen bcaT
que conlleva una notable disminución en la hidrólisis de Ile y Val. En otros microorganismos,
estas enzimas catabólicas participan en la regulación de los niveles intracelulares de
NAD/NADH, síntesis de ácido pantoténico y formación de algunos de los ácidos grasos que
forman parte de la pared celular, si bien ninguna de estas posibles funciones ha sido
demostrada en BL. En BL trabajos recientes postulan que podrían participar el control de la
reserva intracelular de aminoácidos, ya que se ha visto que aquellas cepas de L. lactis en las
que este gen ha sido eliminado son incapaces de crecer en leche (Chambellon y Yvon., 2002).
Un aumento en la concentración intracelular de aminoácidos ramificados, especialmente de
Ile, provoca la represión del gen codY. La proteína CodY es a su vez un regulador
transcripcional que activa la expresión de algunas de las proteinasas esenciales para el
crecimiento en leche (Guédon et al., 2001).
Los oxoácidos formados como producto de la reacción catalizada por las transaminasas se
degradan posteriormente mediante reacciones enzimáticas, o químicas que en muchos casos
no han sido caracterizadas, para dar lugar a la formación de hidroxiácidos, aldehídos y ácidos
carboxílicos. Algunos de estos compuestos son los responsables de las características
organolépticas de los alimentos fermentados como se comentará con más detalle al final del
presente capítulo, en un apartado posterior se describirán las distintas reacciones de
degradación de estos α-oxoácidos.
AMINOÁCIDOS AZUFRADOS
El catabolismo de la metionina (Met) tiene especial interés ya que este aminoácido es el
precursor de los compuestos volátiles azufrados metanotiol, dimetildisulfuro y
trimetildisulfuro que son los responsables del aroma característico de algunos tipos de quesos,
como cheddar y gouda. En BL, se han propuesto dos posibles rutas de degradación de Met
(Fig.9), una en la que participaría una amino-transferasa y otra catalizada por una liasa.
La degradación de metionina mediante la reacción catalizada por una amino-transferasa da
lugar a la formación de 4-tiometil-2-cetobutirato (KMBA) siendo el α-oxoglutarato el
compuesto aceptor que se convierte en glutamato. Las amino-transferasas descritas en los
apartados anteriores tanto para los aminoácidos ramificados (BcaT) como las que degradan
los aminoácidos aromáticos (AraT) catalizan también la degradación de metionina. La
construcción de un doble mutante en L. lactis en el que ambos genes (araT y bcaT) habían
sido inactivados, ha permitido concluir que en esta especie no hay otras amino-transferasas
activas capaces de degradar Met, puesto que no se detectó actividad en el doble mutante
(Yvon y Rijnen, 2001).
En Lb. plantarum y Lb. casei la degradación de metionina comienza también con una
transaminación, dependiente de α-oxoglutarato; esta actividad transaminasa varía
notablemente de unas cepas a otras (Amarita et al., 2001).
El KMBA formado tras la transaminación, se transforma en metanotiol bien en una sola
reacción química o mediante dos pasos en los que participarían una reacción enzimática
(descarboxilasa) y una reacción química, pero hasta el momento no se tienen más datos sobre
estas reacciones.
El metanotiol formado es posteriormente oxidado a dimetil disulfuro y dimetil trisulfuro estos
dos compuestos junto con el metanotiol son los responsables del aroma característico de los
quesos tipo cheddar.
La segunda ruta de degradación de metionina, implica la transformación directa de Met en
metanotiol por la acción de una liasa (EC 4.4.1-). En la mayoría de los microorganismos, la
enzima responsable del catabolismo de metionina es una metionina γ-liasa (EC 4.4.1.11) que
cataliza de forma simultánea la desaminación y desmetilación de metionina para producir
metanotiol, α-oxobutirato y amonio. Se trata también de una enzima dependiente de fosfato
de piridoxal y su actividad es inducida por el substrato de la reacción (Dias y Weimer 1998a).
En BL no se ha encontrado ninguna cepa con actividad metionina γ-liasa; en estos
microorganismos la liasa responsable de la transformación de metionina en metanotiol puede
ser una cistationina β-liasa (CBL; EC 4.4.1.8) y/o cistationina γ-liasa (CGL; EC 4.4.1.1).
Ambas actividades han sido determinadas en varias cepas de BL como L. lactis (Alting et al.,
1995; Bruinenberg et al., 1997; Dobric et al., 2000), Lb. fermentum (Smacchi y Gobbetti,
1998) Lb. casei y Lb. helveticus (Dias y Weimer, 1998b), pero sólo las enzimas de L. lactis y
Lb. fermentun han sido purificadas. Al igual que ocurre con otras enzimas del catabolismo de
otros aminoácidos, la cistationina β-liasa y la cistationina γ-liasa pueden participar tanto en la
síntesis como en la degradación de metionina. Una vez más vemos que rutas de síntesis y de
degradación de aminoácidos comparten enzimas.
La mayoría de las BL son auxótrofas para muchos aminoácidos, entre ellos metionina, esto no
quiere decir que no dispongan de los genes necesarios para codificar las enzimas de la ruta
biosintética, sino que uno o varios de los enzimas de esta ruta no son funcionales (Chopin,
1993). Éste es el caso de las cistationina β/γ-liasas, que en BL en vez de participar en la
síntesis de metionina cataliza la degradación de metionina, pero se desconoce cuál puede ser
en este caso el papel fisiológico de estas enzimas.
Hasta el momento, sólo se disponen de datos genéticos sobre el gen que codifica para la
cistationina ß-liasa, metC, que ha sido clonado a partir de dos cepas de L. lactis, MG1363 y
B78 (Fernández et al., 2000). MetC presenta homología con cistationina β-liasas de otros
microorganismos (E. coli, B.subtilis) y se encuentra formando parte de un operón con el gen
cysK que codifica para la cisteína sintetasa, la enzima que cataliza el último paso de la síntesis
de cisteína.
Así pues, en L. lactis, se encuentran formando parte de un mismo operón, los genes
implicados en las ultimas etapas de la síntesis de metionina y cisteína. La expresión de este
operón está regulada a nivel transcripcional por la concentración de Met y Cys en el medio, y
está bajo el control de una proteína reguladora, CmbR, que pertenece a la familia de proteínas
reguladoras LysR. CmbR activa la transcripción del operon metCcysK cuando Met y Cys se
encuentran en bajas concentraciones en el medio de cultivo (Fernández et al. 2002).
En Lb. plantarum WCFS (Kleerebezem et al. 2003), existen dos genes que tienen homología
con las CBL (metC1 y metC2). Al igual que en L. lactis, metC1 se encuentra en el extremo 5’
del gen cysK.
Aunque CBL es activa en las condiciones de pH, temperatura y concentración de sal que se
encuentran en el queso durante el proceso de maduración y la sobreproducción de la enzima
va asociada a un aumento de los productos de degradación de la metionina (Fernández et al.,
2000), experimentos realizados por Gao et al., (1998 b) mediante resonancia magnética
nuclear sugieren que la transaminación es la ruta principal de conversión de metionina en
metanotiol en BL.
Se dispone de muy pocos datos sobre la degradación de la cisteína por BL. Cys puede ser
substrato tanto de la CBL como de la CGL. La CGL de Lb. fermentum puede descomponer la
cistina y cisteína en piruvato, sulfuro de hidrógeno y amonio, siendo la cistina el sustrato
preferente de esta enzima (Smacchi y Gobbetti, 1998). CBL puede utilizar también cistina,
que es convertida en tiocisteína, piruvato y amonio (Alting et al. 1995). Se desconoce en
cambio cuáles son los productos de la degradación de Cys por CBL, aunque sí se ha
observado que la CBL de L. lactis utiliza Cys (Alting et al. 1995).
Alanina y prolina
En Lactobacillus reuteri (Thompson et al., 2002) y Lb. plantarum (Hols et al., 1997) se ha
descrito actividad alanina racemasa. En E. coli, la D-alanina es degradada vía una D-alanina
deshidrogenasa, y posee una racemasa biosintética (para la síntesis de pared celular) y una
catabólica que provee el sustrato para la deshidrogenasa. En Lb. reuteri existe evidencia de la
presencia de dos racemasas (Thompson et al., 2002), aunque no existen datos que permitan
asignar un papel catabólico a alguna de estas actividades. L. lactis aparentemente sólo posee
una alanina racemasa (Hols et al., 1999). La alanina puede ser también convertida en piruvato
por transaminación, pero no se ha descrito actividad alanina amino-transferasa en BL.
De igual modo, se ignora si la prolina es utilizada por alguna ruta catabólica en BL. En
muchos organismos, la prolina es deshidrogenada a pirrolín-5-carboxilato que es a su vez
oxidado a glutamato. En L. lactis se encuentra un gen que codifica un producto similar a
pirrolín-5-carboxilato reductasas (EC 1.5.1.2), pero su función probablemente sea la
biosíntesis de prolina.
Serina, treonina y glicina
La serina puede ser convertida directamente a piruvato por acción de la serina desaminasa
(EC 4.3.1.17) y en algunos casos por la treonina desaminasa (EC 4.3.1.19) que puede utilizar
también serina (Fig. 10). La actividad serina desaminasa ha sido descrita en Lb. murinus
(Farias et al., 1985) y Lb. fermentum (Farias et al., 1991). Además, los genes que codifican la
enzima están presentes en el genoma de Lb. plantarum y L. lactis (sdaA y sdaB), y se ha
descrito que L. lactis convierte la serina predominantemente en lactato en medio mínimo
(Cocaign-Bousquet et al., 1996). Rijnen et al. (2000) confirmaron este resultado, y bajo sus
condiciones de ensayo el 10% del flujo de carbono hacia piruvato procedía de la serina. La
enzima es una liasa, utiliza fosfato de piridoxal como cofactor y está formada por
heterodímeros de dos subunidades, codificadas por los genes sdaA y sdaB respectivamente.
La enzima de Lb. fermentum es un tetrámero con un peso molecular de 150 KDa. En
Lactobacillus sakei se ha encontrado también un homólogo de sdaA (Nº acceso Q48838), por
lo que es probable que este organismo también posea esta actividad. En cuanto a la treonina
desaminasa, se han encontrado genes en L. lactis (codificada por el gen ilvA) y Leuconostoc
mesenteroides (Nº de acceso P97116), pero no se ha determinado si son activas también sobre
la serina. La treonina desaminasa convierte la treonina en 2-oxobutanoato y amonio. El 2-
oxobutanoato es el precursor en la biosíntesis de los aminoácidos leucina, valina e isoleucina,
pero se ignora si puede ser utilizado por otras rutas catabólicas en BL.
Sin embargo, se ha descrito como la principal vía de utilización de la treonina en BL es la
treonina aldolasa (Christensen et al., 1999). Esta enzima cataliza la conversión de treonina en
acetaldehído y glicina (Fig. 9) y ha sido parcialmente purificado de Lactobacillus delbrueckii
subsp. bulgaricus (Manca de Nadra et al., 1987). La actividad de la enzima está inducida por
treonina e inhibida por glicina y cisteína en Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus y S.
thermophilus (Manca de Nadra et al., 1987; Lees y Jago, 1976; Marranzini et al., 1989).
No obstante, no se ha determinado con claridad la importancia de la actividad treonina
aldolasa para el metabolismo de BL. En bacterias, la actividad treonina aldolasa puede
deberse a dos enzimas distintos: la serina hidroxi-metil transferasa (SHMT; EC 2.1.2.1) y la
allo-treonina aldolasa (EC 4.1.2.5). La reacción principal de la SHMT es la transferencia
reversible del grupo hidroximetil de la serina al tetrahidrofolato para producir glicina y 5,10-
metilén-tetrahidrofolato, un donador de grupos metilo utilizado en la biosíntesis de purinas,
timina, metionina y numerosos productos metilados (Mudd y Cantoni, 1964), siendo
secundaria la actividad treonina aldolasa (véase por ejemplo el trabajo de Simic et al., 2002,
sobre la SHMT de Corynebacterium glutamicum). En E. coli se ha identificado una SHMT,
codificada por el gen glyA, y una treonina aldolasa de baja afinidad, codificada por el gen ltaE
(Liu et al., 1998). El trabajo de estos autores puso de manifiesto que la treonina aldolasa es
una vía secundaria de producción de glicina en E. coli. Posteriormente, se ha demostrado que
la SHMT de E. coli carece de actividad treonina aldolasa (Contestabile et al., 2001). En
mamíferos, se ha descrito que la actividad SHMT y treonina aldolasa están catalizadas por el
mismo enzima (Schirch, 1982), sin embargo, recientemente se ha mostrado que las SHMT de
mamíferos o carecen de actividad treonina aldolasa o presentan una actividad muy débil
(Ogawa et al., 2000). Ni en L. lactis ni en Lb. plantarum se encuentran homólogos de ltaE.
No obstante, en L. lactis se encuentra un homólogo de la SHMT (glyA) próximo a un cluster
de genes biosintéticos de serina serCAB. La actividad treonina aldolasa descrita en este
organismo (Lees y Jago, 1976), probablemente se deba a una actividad secundaria treonina
aldolasa de la SHMT. En S. thermophilus se ha demostrado recientemente que la SHMT y la
treonina aldolasa están catalizadas por la misma enzima que es codificada por el gen glyA
(Chaves et al., 2002). La construcción de una cepa en la que este gen ha sido interrrumpido
demuestra que esta es la principal vía de síntesis de acetaldehído en este microorganismo y a
diferencia de lo que se había descrito para Lb. delbrueckii, esta cepa no se convierte en
auxótrofa para glicina.
La glicina puede ser metabolizada por múltiples vías en bacterias, sin embargo no se conoce
en detalle las rutas utilizadas por las BL. Las rutas principales en bacterias son la de la SHMT
y el sistema de corte de la glicina (glycine cleavage system) o glicina sintasa. La glicina puede
ser transaminada por la glicina amino-transferasa (EC 2.6.1.4) que cataliza la transferencia del
grupo amino al 2-oxoglutarato para producir glioxilato y glutamato. Esta actividad ha sido
descrita en Lb. plantarum (Galas y Florianowicz, 1975), y es la única referencia de esta
actividad en una bacteria. No se encuentra sin embargo ningún homólogo de glicina amino-
transferasas conocidas en el genoma de Lb. plantarum WCFS. La glicina puede ser también
sustrato de la SHMT para producir serina, como se ha discutido anteriormente.
El sistema de corte de la glicina es un complejo multienzimático que consta de cuatro
proteínas y está ampliamente distribuido entre organismos pertenecientes a los tres dominios
de los seres vivos. El complejo cataliza el corte oxidativo y reversible de la glicina en amonio,
dióxido de carbono y unidades metilén que son transferidas al tetrahidrofolato para formar
5,10-metilén-tetrahidrofolato. Los genes que codifican las distintas subunidades específicas
del complejo (proteínas H, P y T) están organizados en un operón (gcvTHP) en E. coli,
mientras que el cuarto componente, la proteína L (lipoamida deshidrogenasa, codificada por
el gen lpd), que forma parte también de los complejos piruvato deshidrogenasa y 2-
oxoglutarato deshidrogenasa, se encuentra en un locus distante (Steiert et al., 1990; Stephens
et al., 1983). Estos genes muestran una significativa conservación de secuencia, sin embargo,
no se encuentran homólogos en los genomas de L. lactis y Lb. plantarum, por lo que
aparentemente, estos organismos carecen de esta vía de degradación o biosíntesis de la
glicina. Se desconoce si otras BL poseen esta ruta, pero es significativo que en los genomas
disponibles de enterococos y estreptococos tampoco se encuentran homólogos de estos genes.
Arginina
La vía de principal de degradación de la arginina en BL es la ruta de la arginina deiminasa
(ADI). Además se ha descrito la producción de óxido nítrico por cepas de Lb. fermentum, y se
ha postulado que se debe a la acción de una óxido nítrico sintasa que produciría citrulina
(Morita et al., 1997). Sin embargo, los resultados de Xu y Verstraete (2001) han demostrado
que la producción de óxido nítrico no está asociada al metabolismo de la arginina.
La ruta ADI comprende tres reacciones (Fig. 11), catalizadas por la arginina deiminasa (ADI;
EC 3.5.3.6), ornitina carbamoil-transferasa(OTC; EC 2.1.3.3), y carbamato quinasa (CK; EC
2.7.2.2), y cataliza la conversión de arginina en ornitina, amonio y dióxido de carbono,
generando un mol de ATP por mol de arginina consumida. ADI cataliza el primer paso de la
reacción, la ruptura del grupo guanidino de la arginina para rendir amonio y citrulina. La
citrulina es a su vez sustrato de la OTC que cataliza la fosforólisis de la citrulina, produciendo
ornitina y carbamoil-fosfato. La OTC puede catalizar también la reacción reversa, la síntesis
de citrulina a partir de ornitina y carbamoil-fosfato, una de las etapas de la ruta biosintética de
la arginina y la primera etapa del ciclo de la urea. No obstante, las OTCs están especializadas
en un papel catabólico o anabólico. En organismos que poseen la ruta ADI y la ruta
biosintética de la arginina, las OTCs que intervienen en una u otra ruta están codificadas por
genes distintos. Finalmente, la carbamato quinasa cataliza la transferencia del grupo fosfato
del carbamoil-fosfato al ADP. El grupo carbamato restante se escinde espontáneamente en
amonio y dióxido de carbono.
El transporte de la arginina en las BL estudiadas hasta ahora está mediado por un
transportador que intercambia arginina y ornitina. El intercambio de arginina y ornitina es
electroneutro e independiente de la fuerza protonmotriz, siendo dirigido por la diferencia de
gradiente entre el interior y el exterior celular (Driessen et al., 1987).Este sistema es similar al
descrito en P. aeruginosa (Verhoogt et al., 1992), y ha sido caracterizado bioquímicamente en
L. lactis y algunas especies de enterococos y estreptococos (Poolman et al., 1987). La
secuenciación del genoma de L. lactis IL1403 ha confirmado la presencia de un gen
significativamente similar al que codifica el transportador de P. aeruginosa (arcD; Bolotin et
al., 2001). En Lb. sakei se ha descrito asimismo un homólogo de arcD, por lo que
probablemente el mecanismo de transporte sea similar en este organismo (Zúñiga et al.,
1998). Existen además indicios de que puede haber al menos un segundo sistema de
transporte de arginina en Lb. sakei, puesto que se ha observado que mutantes arcD- son
capaces de transportar arginina por un sistema no acoplado a la expulsión de ornitina
(Champomier-Vergés y Zúñiga, resultados no publicados). A continuación del operón arc se
encuentra un gen con similitud significativa a transportadores de aminoácidos, aunque se
carece de evidencias directas del papel del producto codificado por este gen (véase más
adelante).
Distribución, organización genómica y evolución de la ruta ADI
La ruta ADI está ampliamente distribuida entre las BL, habiendo sido descrita en cepas de los
géneros Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Weissella, así como en
Enterococcus y Streptococcus. Dentro del género Lactobacillus, la ruta ADI es común entre
las especies heterofermentativas estrictas, se ha detectado también en algunas cepas
homofermentativas estrictas, y dentro de las heterofermentativas facultativas, sólo se ha
descrito en Lb. sakei.
La organización de los genes que codifican las proteínas implicadas en la ruta ADI es
particularmente compleja en comparación con otros organismos (Fig. 12; Zúñiga et al.,
2002a) y sugiere que esta ruta puede tener un papel más importante que la provisión de
energía. El primer operón descrito en BL fue el de Lb. sakei (Zúñiga et al., 1998). Este operón
está compuesto por seis genes: arcA, que codifica la ADI, arcB, codifica la OTC, arcC, CK,
arcT, una amino-transferasa de la subfamilia I no caracterizada, arcD, el intercambiador
arginina-ornitina, y arcR, activador esencial para la activación de la ruta, perteneciente la
familia Crp/Fnr de reguladores transcripcionales (Zúñiga et al., 2002b). Además, tras arcR se
ha identificado otro gen, orf7, que codifica una proteína de membrana hipotética
significativamente similar a otras codificadas por genes localizados en grupos de genes ADI
de Borrelia afzelii, Borrelia burgdorferii, H. influenzae, Staphylococcus aureus y
Streptococcus pyogenes (Zúñiga et al., 2002b). En L. lactis IL1403 se encuentran dos grupos
de genes posiblemente asociados al catabolismo de la arginina: uno de ellos, contiene el
regulador transcripcional ArgR, homólogo al regulador del metabolismo de la arginina en E.
coli, la arginil-tRNA sintetasa, y los genes estructurales de la ruta, donde arcC y arcD
aparecen duplicados; además contiene también un homólogo de arcT. El segundo grupo
contiene dos parálogos más de arcB (otcA) y arcC (arcC3), separados por tres genes: yrfD, un
hipotético transportador de aminoácidos perteneciente a la misma familia que arcD, pero que
presenta una baja similitud con respecto a los homólogos de éste, tra983G, una hipotética
transposasa, parte de un elemento de inserción de la familia IS30, e yrfC, un gen de función
desconocida. En Oenococcus oeni se ha descrito parcialmente el operón ADI, compuesto por
los genes orf229, homólogo a arcR de Lb. sakei, y los genes estructurales arcA, arcB y arcC,
pero se ignora si hay genes adicionales tras arcC (Tonon et al., 2001). Recientemente se ha
caracterizado también un operón arc complejo en E. faecalis (Fig. 3; Barcelona-Andrés et al.,
2002).
La ruta ADI es una ruta metabólica muy antigua. El análisis filogenético de los genes
estructurales indica que probablemente ya estaba presente en el último ancestro común de
todos los seres vivos (Zúñiga et al., 2002a). La evolución del metabolismo aerobio permitió a
los organismos disponer de rutas de degradación de la arginina más eficientes, de manera que
se ha conservado sólo en organismos con metabolismo fermentativo. Así, bacterias anaerobias
facultativas tales como P. aeruginosa y Bacillus licheniformis poseen rutas de degradación
alternativas funcionales en aerobiosis, mientras que la ruta ADI se ha conservado como ruta
anaerobia. En BL, pese a su metabolismo fermentativo estricto, aparentemente se ha
conservado el mecanismo de inducción en condiciones anaerobias (véase más adelante), lo
que apoya la idea de que estas bacterias evolucionaron a partir de ancestros anaerobios
facultativos.
Regulación de la ruta ADI
La ruta ADI constituye una fuente de energía. Por ello, en muchas BL su regulación está
estrechamente asociada a la de otras rutas energéticas, como la glicólisis. En la mayoría de
bacterias, el agotamiento de energía metabólica es una señal esencial de inducción de la ruta
(Cunin et al., 1986).
La regulación de la ruta ADI ha sido estudiada con mayor detalle en Lb. sakei. El operón
arcABCTDR de Lb. sakei está bajo control del promotor ParcA y su expresión es inhibida por
glucosa e inducida por arginina (Montel y Champomier, 1987, Zúñiga et al., 1998, Zúñiga et
al., 2002b). Otros azúcares, tales como la galactosa y la ribosa, no ejercen un efecto represor
significativo. Además, se ha demostrado que la expresión de la ruta aumenta en anaerobiosis
(Champomier-Vèrges et al., 1999). La represión por glucosa está probablemente mediada por
el complejo CcpA/HPr, puesto que en el promotor ParcA se han localizado dos elementos
CRE (Fig. 13; Zúñiga et al., 1998). Además, se ha demostrado que el gen arcR es esencial
para la expresión de la ruta, si bien se desconoce si este gen media la inducción por arginina
(Zúñiga et al., 2002b).
En otras bacterias anaerobias facultativas como P. aeruginosa o B. licheniformis, la expresión
de la ruta está regulada por dos activadores, un homólogo de ArgR, el regulador del regulón
de la arginina de E. coli, media la inducción por arginina, mientras que una proteína de la
familia Crp/Fnr (como ArcR) media la activación por anaerobiosis (Gamper et al., 1991, Lu et
al., 1999, Maghnouj, 1998, 2000). La asociación de reguladores pertenecientes a estas dos
familias en los operones ADI de bacterias Gram positivas es muy frecuente (Zúñiga et al.,
2002a; véase Fig. 12), por lo que es posible que también en Lb. sakei y E. faecalis la
activación en anaerobiosis esté mediada por ArcR, mientras que la inducción por arginina
sería mediada por un homólogo de ArgR. La secuenciación en curso del genoma de Lb. sakei
permitirá probablemente elucidar esta cuestión.
La regulación de la ruta en los géneros Streptococcus y Enterococcus es probablemente
similar a la descrita para Lb. sakei. En Streptococcus gordonii, Streptococcus rattus y
Streptococcus sanguis se ha observado que la ruta ADI es inducida por arginina y reprimida
por glucosa y aireación (Curran et al., 1998). El mismo patrón de regulación se ha observado
en E. faecalis (Simon et al., 1982). Estos datos han sido confirmados posteriormente, pues se
ha demostrado que la transcripción del operón arcABCRD es inducida por arginina
probablemente mediada por ArgR; además la detección de sitios CRE en la regiones
promotoras tanto de argR como del operón arcABCRD sugiere que la expresión de estos
genes también está sujeta a represión mediada por el complejo CcpA/HPr (Barcelona-Andrés
et al. 2002). Además, se han localizado secuencias CRE en los promotores de los genes arc de
S. gordonii, Streptococcus pneumoniae y S. pyogenes (Caldelari et al., 2000). S. pyogenes
posee dos reguladores asociados al grupo de genes arc, spy1548, homólogo a arcR, y ahrC2,
homólogo a argR (Fig. 3), que posiblemente median la inducción por anaerobiosis y arginina
respectivamente.
En L. lactis, la regulación es aparentemente distinta a la descrita para Lb. sakei. La inspección
del genoma de L. lactis IL1403 revela que este organismo no posee ningún gen homólogo a
arcR, ni se localizan sitios CRE en las posibles regiones promotoras del grupo de genes arc.
Sin embargo, se ha descrito que la expresión de los enzimas ADI y OTC es reprimida por
glucosa, mientras que la actividad CK es constitutiva (Crow y Thomas, 1982). Este estudio se
basó en medidas de actividades enzimáticas, pero puesto que L. lactis posee tres genes que
codifican proteínas CK (Fig. 3) es posible que esta enzima intervenga en otros procesos
celulares no relacionados con el metabolismo de la arginina. De hecho, L. lactis subp.
cremoris no expresa actividad ADI u OTC pero mantiene la actividad CK (Cunin et al.,
1986), lo que sugiere que probablemente la expresión de alguno de estos parálogos está
regulada independientemente de los genes ADI.
La regulación de la ruta ADI en otras BL es menos conocida. En Lactobacillus buchneri se ha
descrito que la glucosa estimula el consumo de arginina (Manca de Nadra, 1981), sin
embargo, trabajos posteriores sugieren que la glucosa tiene un efecto represor (Mira de
Orduña et al., 2000). Estas discrepancias pueden explicarse probablemente por los distintos
sistemas experimentales empleados. En Lactobacillus leichmannii se ha observado inducción
por arginina y represión por glucosa (Manca de Nadra et al., 1986). En O. oeni se ha
demostrado que la ruta es inducida por arginina (Tonon et al., 2001).
Papel fisiológico de la ruta ADI
La arginina representa una importante fuente de energía para algunas BL. Se ha demostrado
que el consumo de arginina prolonga la viabilidad de Lb. sakei en fase estacionaria
(Champomier-Vergés et al., 1999). Asimismo, se ha observado que aumenta el crecimiento y
viabilidad de O. oeni (Tonon y Lonvaud-Funel, 2000) y L. lactis (Crow y Thomas, 1982).
En estreptococos orales, se ha propuesto que la degradación de arginina constituye un sistema
de defensa frente a un ambiente ácido (Marquis et al., 1987). Se ha observado que en S.
sanguis y S. rattus la ruta ADI es funcional a valores de pH inferiores al umbral de
funcionamiento de la ruta glicolítica (Casiano-Colón y Marquis, 1988). Sin embargo, no hay
evidencia de tal función en otras BL. En Lb. sakei, el aumento de viabilidad en fase
estacionaria debido al consumo de arginina no está asociado al aumento de pH del medio
(Champomier-Vergés et al., 1999).
En algunos organismos la ruta ADI puede estar asociada al sistema proteolítico, actuando éste
como fuente de arginina. Así, en Streptococcus mitis se ha observado la corregulación de la
expresión de la arginina aminopeptidasa I y los genes estructurales de la ruta ADI (Hiraoka et
al., 1986).
Finalmente, aunque no se tienen evidencias de que la ruta ADI tenga un papel relevante en el
metabolismo del nitrógeno, la presencia de amino-transferasas en los operones arc de Lb.
sakei y L. lactis, sugiere que este papel puede ser importante. Será necesaria una
caracterización bioquímica de los productos de estos genes para elucidar esta cuestión, puesto
que el análisis de la secuencia no permite predecir los posibles sustratos y productos de esta
reacción. Una posibilidad interesante es que la ornitina fuera utilizada por ArcT, sin embargo,
todas las ornitina amino-transferasas caracterizadas hasta ahora pertenecen a la subfamilia III,
mientras que ArcT pertenece a la subfamilia I.
Arginina y ornitina descarboxilasas
En algunas BL se han descrito rutas alternativas de degradación de la arginina y la ornitina
por descarboxilación (Fig. 14). En particular, se ha descrito actividad arginina y ornitina
descarboxilasa en Lactobacillus hilgardii X1B (Arena y Manca de Nadra, 2001). La actividad
ornitina descarboxilasa ha sido descrita además en varias especies de BL. Estas rutas son
particularmente importantes desde un punto de vista aplicado por su incidencia en la calidad y
seguridad de los alimentos ya que los productos finales son aminas biógenas. Por ello, la
mayoría de los trabajos se han centrado en la detección de la producción de aminas biógenas
pero las rutas metabólicas han recibido menos atención.
La ornitina descarboxilasa (EC 4.1.1.17) convierte la ornitina en putrescina. El enzima de la
cepa Lactobacillus 30a ha sido extensamente estudiado, se ha clonado (Hackert et al. 1994) y
se ha determinado su estructura tridimensional (Momany et al. 1995). Sin embargo, se
dispone de poca información sobre su relevancia fisiológica y regulación. Por su parte, la
arginina descarboxilasa (EC 4.1.1.19) transforma ésta en agmatina (Fig. 14). La agmatina
puede a su vez ser degradada a putrescina a través de una vía análoga a la ruta ADI por una
agmatina deiminasa (EC 3.5.3.12) que produce carbamoil-putrescina. Ésta es a su vez sustrato
de una putrescina carbamoil-transferasa. Esta vía se ha descrito en E. faecalis, que es capaz de
crecer con agmatina como única fuente de carbono (Simon y Stalon 1982). La ruta es inhibida
por glucosa y arginina. Además, se ha demostrado que este organismo posee un
intercambiador agmatina/putrescina análogo al intercambiador arginina/ornitina que
interviene en la ruta ADI (Driessen et al. 1988).
Lisina
Las rutas de degradación de la lisina en bacterias incluyen su descarboxilación directa a
cadaverina por el enzima lisina descarboxilasa (EC 4.1.1.18), que no ha sido descrita en BL
aunque un homólogo sí está presente en el genoma de S. pneumoniae, y la lisina
monooxigenasa (EC 1.13.12.2), descrita en Pseudomonas putida y Pseudomonas fluorescens.
En Clostridium subterminale, la ruta de degradación de la lisina comienza con la conversión
de ésta a β-lisina, catalizada por la lisina 2,3-aminomutasa (EC 5.4.3.2.) (Stadtman, 1973).
Sin embargo, no se encuentran homólogos de este gen en BL o especies próximas.
Histidina
La degradación de la histidina (His) está mediada por una histidina descarboxilasa (EC
4.1.1.22) que cataliza la conversión de His en histamina y CO2. (Fig. 16). Al igual que ocurría
en el caso de la tirosina descarboxilasa, la actividad histidina descarboxilasa está asociada a
cepas concretas y no a especies. Esta descarboxilasa, que también requiere fosfato de
piridoxal como coenzima, se sintetiza como un proenzima que tras un procesamiento
autocatalítico pasa a su forma activa. El gen que codifica la histidina descarboxilasa hdcA ha
sido clonado a partir de la cepa de Lb. plantarum 30A (Vanderslice et al., 1986) y de O. oeni
9204 (Coto et al., 1998), en ambas cepas se encuentra formando parte de un operón con un
segundo gen que codifica para una proteína de función desconocida. La actividad histidina
descarboxilasa podría estar inducida por el substrato de la reacción.
Al igual que otras descarboxilasas discutidas anteriormente, el papel fisiológico de esta
descarboxilasa podría ser participar en el control del pH intracelular y/o proporcionar energía
a la célula, como se ha descrito en la introducción.
Degradación de α-oxoácidos
Los α-oxoácidos formados tras la acción de las amino-transferasas pueden ser posteriormente
degradados a distintos compuestos mediante reacciones químicas o enzimáticas dando lugar a
la formación de hidroxiácidos, ácidos carboxílicos o aldehídos que han perdido uno o dos
carbonos. Todos estos compuestos con la excepción de los hidroxiácidos participan en las
características sensoriales de los productos fermentados pero a pesar de la importancia
biotecnológica de estos enzimas, estas reacciones y los enzimas que en ellas participan son
sólo parcialmente conocidas.
A continuación, veremos con un poco más de detalles lo que se conoce sobre las distintas
reacciones de degradación de α-oxoácidos (Fig.15).
1 Reducción
Los α-oxoácidos se pueden degradar mediante una reacción de reducción para formar
hidroxiácidos. Este tipo de reacción ha sido observada en muchas BL y está catalizada por
una 2-hidroxiácido deshidrogenasa. Esta enzima dependiente de NADH tiene un amplio rango
de substratos y cataliza la reducción reversible de varios α-oxoácidos especialmente
aromáticos y ramificados. Aunque la mayoría de autores ha nombrado a este tipo de enzima
como hidroxicaproato deshidrogenasa (HicDH), porque el α-cetoisocaproato es el mejor
substrato de la reacción, otros autores se refieren a él como mandelato deshidrogenasa. Estas
deshidrogenasas han sido divididas en dos grupos en función del tipo de esteroisómero
formado, D o L.
La actividad hidroxicaproato deshidrogenasa (HicDH) se encuentra ampliamente distribuida
entre las BL, siendo mucho más abundante la D-deshidrogensa frente a la L-deshidrogenasa.
La enzima ha sido aislada y purificada a partir de algunas especies de Lactobacillus (Lb.
casei, Lactobacillus curvatus y Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus), de Weissella confusa
(anteriormente Lactobacillus confusus) y de E. faecalis. D-HicDH o D-mandelatoDH es una
proteína homodimérica con un peso molecular comprendido entre 30 y 38 kDa. La L-HicDH
ha sido sólo purificada a partir de W. confusa, es muy similar a la D-HicDH en cuanto los
substratos, pH y temperatura óptima de actividad, pero el enzima está constituido por cuatro
subunidades de 33 kDa de peso molecular.
El gen correspondiente a D-HicDH ha sido clonado a partir de Lb. casei (Lerch et al., 1989), y
Lb. bulgaricus (Bernard et al., 1994) y el gen que codifica para L-HicDH ha sido clonado en
W. confusa (Lerch et al., 1989). La comparación de las secuencias aminoacídicas indica que
las L y D-deshidrogenasas están relacionadas las L-lactato y D-lactato deshidrogenasas
respectivamente. Sin embargo, entre las formas D y L no existe ninguna relación genética.
Finalmente, el análisis de los genomas secuenciados hasta el momento, ha revelado la
presencia de un gen equivalente a L-Hic en L. lactis IL1403 (Bolotin et al., 2001) y 3 genes
homólogos en Lb. plantarum WCFS (Kleerebezem et al., 2003).
El papel fisiológico de estas HicDH podría ser participar en la regeneración del poder
reductor del mismo modo que se ha descrito para otras deshidrogenasas como la lactato
deshidrogensa.
2 Descarboxilación
Otra ruta de degradación de los α-oxoácidos es la descarboxilación para formar aldehídos.
Aunque esta ruta ha sido descrita principalmente en levaduras, en BL ha sido sólo señalada en
algunas cepas de Lb. casei (Hickey et al., 1983) y en algunas cepas de Lactococcus con
diferentes niveles de actividad (Gao et al., 1997) si bien dentro de este género, Lactococcus
lactis var. maltigenes tiene las enzimas capaces de convertir Phe, Met, Ile, Val y Leu a sus
correspondientes aldehídos (MacLeod y Morgan, 1958). Las enzimas responsables de esta
actividad no han sido hasta al momento caracterizadas. Si bien, el análisis del genoma de L.
lactis IL1403 (Bolotin et al., 2001) reveló la presencia de un gen que presenta homología con
estas descarboxilasas y que podría por tanto codificar el enzima responsable de esta actividad
descarboxilasa (Gao et al., 1997).
Los aldehídos formados pueden ser posteriormente reducidos a alcoholes por la acción de una
alcohol deshidrogenasa o sufrir una reacción de oxidación para formar ácidos carboxílicos
mediante la reacción catalizada por una aldehído deshidrogenasa.
3. Descarboxilacion oxidativa
Otra de las posibles rutas de degradación de los α-oxoácidos es una descarboxilación oxidativa para
formar ácidos carboxílicos directamente sin el paso intermedio de la formación de un aldehído que se
ha descrito en el apartado anterior. En la degradación de α-oxoácidos a ácidos carboxílicos intervienen
distintas enzimas, la descarboxilación oxidativa se inicia con la reacción catalizada por el complejo
deshidrogenasa de α-cetoácidos de cadena ramificada (EC 1.2.4.4) que cataliza la conversión de α-
oxoácido a acil-CoA. Este acil-CoA es posteriormente hidrolizado liberándose el ácido carboxílico
correspondiente, bien en un sólo paso en una reacción catalizada por una acil-CoA hidrolasa como se
ha descrito en levaduras o por dos reacciones sucesivas catalizadas por una fosfatasa butirato-CoA
transferasa y una butirato quinasa como se ha descrito en E. faecalis (Ward et al., 1997).
Analizaremos con un poco mas de detalle la primera reacción, la conversión de los α-oxoácidos en
acil-CoA. Esta ruta ha sido descrita en levaduras y en algunas BL como E. faecalis (Ward et al.,
2000); en estos microorganismos, la deshidrogenasa de α-cetoácidos de cadena ramificada (BKDH),
es un complejo enzimático homólogo al de la piruvato deshidrogenasa, está formado por tres enzimas
catalíticos: α-cetoácido deshidrogenasa, dihidrolipoil transacilasa y lipoamida deshidrogenasa. Los
genes que codifican las enzimas que forman parte de este complejo multienzimático se encuentran
formando parte de un operón, que está sujeto a represión catabólica por glucosa y otras fuentes de
carbono como fructosa y lactosa. El papel fisiológico propuesto para esta ruta sería la formación de
ATP.
En el análisis del genoma de L. lactis IL1403 (Bolotin et al., 2000) no se ha encontrado ningún gen
con homología con bkdh, lo que sugiere que al igual que ocurre en B. subtilis esta actividad puede ser
llevada a cabo por la piruvato deshidrogenasa en este microorganismo (Lowe et al., 1983).
.
4 Degradación química
Como se ha comentado a lo largo de este capitulo la degradación de α-oxoácidos puede tener lugar
mediante reacciones químicas. Las dos principales reacciones químicas que han sido caracterizadas
hasta el momento son la conversión de los α-oxoácidos aromáticos a aldehidos con la eliminación de
dos atomos de carbono y la conversion de KMBA a metanotiol en la ruta de degradación de metionina.
En algunas de estas reacciones como la conversion de PPA a benzaledehido y la conversión de KMBA
a metanotiol se ha observado un aumento notable del producto de la reacción cuando esta tiene lugar
en presencia de las células por lo que se sugiere que los componentes celulares son esenciales para
estas reacciones ya que proporcionan las condiciones adecuadas para que la reaación tenga lugar.
AMINAS BIÓGENAS
Las aminas biógenas (AB), son bases orgánicas de bajo peso molecular que se sintetizan como
consecuencia de la actividad metabólica de animales, vegetales y microorganismos (ten Brink et al.,
1990) por descarboxilación de los aminoácidos precursores aunque podrían formarse también por
aminación o transaminación de aldehídos y cetonas.
Su estructura química puede ser: alifática (cadaverina, espemina y espermidina), aromática (tiramina y
feniletilamina) o heterocíclica (histamina, triptamina). Aminas como putrescina, espermina,
espermidina, y cadaverina, son componentes indispensables de las células, participan en la regulación
de los ácidos nucleicos, en la síntesis de proteínas y pueden jugar un papel importante en la
estabilización de las membranas.
Los aminoácidos precursores de las principales aminas biógenas se resumen en la Tabla 2. Los
alimentos que presentan una mayor posibilidad de contener aminas biógenas son aquellos que
presentan una elevada carga proteica y estén sujetos a condiciones que permitan el desarrollo de los
microorganismos con actividad descarboxilasa. La manipulación y la conservación son las dos etapas
más importantes de proliferación microbiana y, por tanto es durante estos procesos cuando los
alimentos pueden estar sometidos a la acción de enzimas descarboxilasas. Por otra parte, los alimentos
en los que en su preparación existe una etapa de maduración o fermentación y por tanto están sujetos a
la acción de microorganismos en su elaboración, también presentan una alta probabilidad de contener
aminas biógenas. La cantidad total y la variedad de las aminas formadas dependen de la naturaleza del
alimento y de los microorganismos presentes. Las AB están presentes en un amplio rango de
alimentos: pescados, carnes, lácteos, vino, cerveza, frutas y chocolate.
Normalmente, durante el proceso de digestión de los alimentos las AB son metabolizadas mediante un
sistema de detoxificación que incluye enzimas específicos como la diamino oxidasa y la monoamino
oxidasa. Sin embargo, la ingestión de cantidades elevadas de aminas biógenas hace que el sistema de
detoxificacion actúe de forma ineficaz. Este problema se acentúa en individuos con una actividad
amino oxidasa insuficiente debido a causas genéticas, a trastornos gastrointestinales o a que este
sistema esté inhibido por el efecto de algunos fármacos o por el alcohol. Si el sistema de
detoxificación es insuficiente, las AB son rápidamente absorbidas pasando a la circulación sistémica y
causando graves trastornos especialmente en el sistema nervioso y en el control de la presión
sanguínea, pudiendo llegar a comprometer en algunos casos la vida del consumidor.
Los niveles toxicológicos de las aminas son muy difíciles de establecer ya que la dosis tóxica depende
de las características de cada individuo y de la presencia de otras aminas debido al efecto sinérgico
que existe entre ellas. En el caso de la histamina que es la más ampliamente distribuida en los
alimentos, la Unión Europea ha propuesto que el contenido medio de histamina no debería de exceder
10-20 mg/100 gr alimento o 2mg/l en el caso de bebidas alcohólicas (Silla-Santos 1996). Es
importante mencionar que las aminas se van acumulando en el alimento, en aquellos alimentos con
largos tiempos de maduración como pueden ser algunos tipos de quesos y sobre todo en determinados
vinos pueden llegar a alcanzar niveles realmente peligrosos para el consumidor. Actualmente se
utilizan métodos cromatográficos para la detección de aminas en las muestras de alimentos, el
desarrollo de la biología molecular y técnicas como el PCR en combinación con el conocimiento de
las secuencias de los genes que codifican las descarboxilasas implicadas en la síntesis de aminas
biógenas permitirá el desarrollo de nuevos métodos que permitan identificar de forma rápida las cepas
potencialmente productoras de aminas biógenas, criterio que puede ser utilizado en la selección de las
cepas que forman los cultivos iniciadores.
PRODUCCIÓN DE COMPUESTOS IMPLICADOS EN EL AROMA Y SABOR DE LOS PRODUCTOS FERMENTADOS
Durante muchos años se ha trabajado en la identificación de los compuestos químicos responsables de
los aromas/sabores de los alimentos. Se han identificado más de 6500 compuestos en más de 300
alimentos y aunque no se puede hablar de una característica específica que sea válida para todos estos
compuestos, en general son compuestos volátiles, de naturaleza lipofílica y con distintos grupos
químicos, aldehídos, cetonas, ésteres, alcoholes, aminas, etc.
El desarrollo del aroma y sabor, “flavour”, en los productos fermentados es un proceso complejo que
implica numerosas reacciones químicas y bioquímicas. Aunque actividades como la glucólisis,
lipólisis y proteólisis están implicadas en la formación de algunos de los compuestos saborizantes, la
degradación de los aminoácidos rinde los alcoholes, aldehídos, ácidos carboxílicos, ésteres, etc. que
son esenciales para el desarrollo del flavour.
La combinación de las herramientas genéticas y bioquímicas junto al desarrollo de las técnicas
cromatográficas ha permitido conocer numerosas rutas de degradación de aminoácidos, y la naturaleza
de los productos formados, como se ha visto a lo largo del presente capítulo. En la Tabla 3, se resumen
algunos de los compuestos volátiles formados a partir de la degradación de aminoácidos y el aroma
que generan. Sin embargo, la conversión de algunos aminoácidos por determinadas rutas metabólicas,
puede dar lugar a la formación de compuestos como p-cresol, escatol, fenil-acetaldehído, fenil-etanol o
indol, que confieren al producto un sabor pútrido, no deseado. Como se ha descrito a lo largo del
capítulo, las actividades enzimáticas varían mucho de unas especies a otras e incluso en algunos casos
de unas cepas a otras, esto implica que una selección adecuada de los cultivos iniciadores puede evitar
la formación de estos compuestos desagradables y potenciar los sabores deseados.
Existen algunos trabajos recientes en los que se demuestra que la combinación de determinadas cepas,
basada en el conocimiento de las rutas de degradación de los aminoácidos, aumenta la formación de
determinados compuestos que confieren al producto un sabor más agradable. Por ejemplo, trabajos
previos habían indicado que aunque los lactococos tienen niveles altos de actividad amino-transferasa,
sólo un pequeño porcentaje de los aminoácidos presentes en la matriz del queso se degrada a sus
correspondientes aldehídos y cetonas. Estas amino-transfersas requieren la presencia de α-
oxoglutarato u otros α-oxoácidos como cosubstratos, por lo tanto, la concentración de este compuesto
podría ser el factor limitante en esta reacción y observaron, que la adición de α-oxoglutarato al queso
St. Paulin (1-4 gr por Kg de queso) permitía obtener un producto mas arómatico y mejor evaluado por
el panel de catadores (Yvon et al., 1998). Resultados similares fueron obtenidos para queso tipo
Cheddar (Banks et al., 2001). Pero la adición exógena de α-oxoglutarato resultaría poco práctica para
la industria quesera, por ello, se propuso incluir en el cultivo iniciador una cepa capaz de convertir
glutamato en α-oxoglutarato. Para ello se seleccionaron cepas de Lactobacillus con actividad
glutamato deshidrogenasa, que se combinaron con cepas de Lactococcus con actividad amino-
transferasa. Los quesos elaborados con estas cepas tenían un intenso aroma afrutado muy apreciado en
las pruebas hedónicas (Kieronczyk et al., 2003). Otra posibilidad explorada es la utilización de cepas
superproductoras del enzima gluatamato deshidrogenasa, lo que permitiría mantener niveles
intracelulares de α-oxoglutarato altos (Rijnen et al., 2000).
Podríamos concluir, que el conocimiento de las rutas del catabolismo de aminoácidos permitirá la
obtención de productos de mayor calidad tanto desde el punto de vista sanitario y organoléptico que
son cada vez más demandados por el consumidor.
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Tabla 1
Enzima Abreviatura Sustrato Cepa Peso Moleculara Tipo pH optimob Genc Referencia
L-aminotranferasa aromática AraT Tyr, Phe, Trp, Leu, Met L. lactis ssp. cremoris
NCDO763 43.5 X 2 PLP 6.5-8 araT Yvon et al., 1997; Rijnen et al., 2000
L-aminotranferasa aromática AraT1 Trp, Tyr, Phe, Leu, Met L. lactis ssp lactis S3 42 X 2 PLP 6.5-7.5 no Gao y Steele 1998a
L-aminotranferasa aromática AraT2 Trp, Tyr, Phe, Leu, Met L. lactis ssp lactis S3 42 X 4 PLP 6.5-8 no Gao y Steele 1998a
a PM en Daltons determinado por SDS-PAGE X nº de subunidades b Tipo de enzima: dependiente de piridoxal-5´-fosfato c Indica el nombre del gen o si no se dispone de datos genéticos
Tabla 2
Amina biógena Aminoácido precursor
Aminas Alifáticas Putrescina Ornitina Cadaverina Lisina
Aminas Aromáticas Tiramina Tirosina Feniletilamina Fenilalanina
Aminas Heterocíclicas Histamina Histidina Triptamina Triptófano
Tabla 3
Aminoácido Compuesto Aroma/sabor
Leucina 3-Metil-1-butanol Queso fresco, afrutado Isoleucina 2-Metilbutanal Malta Valina 2-Metilpropanal Malta Fenilalanina Fenilacetaldehido, benzaldehído Rosa, almendra Tirosina Fenilacetaldehido, Fenol, medicinal Treonina Acetaldehido Yogur Metionina Metanotiol, DMDS; DMTS Cebolla
FIGURAS
Fig. 1. Principales rutas de degradación de aminoácidos caracterizadas en bacterias lácticas.
Fig. 2. Esquema de las rutas de degradación del ácido aspártico en BL.
Fig. 3. Esquema de las rutas de degradación del ácido glutámico en BL.
Fig. 4. Organización de los genes implicados en la ruta de la glutamato descarboxilasa en L.
lactis. Los terminadores rho-independientes están indicados por horquillas; flechas
escuadradas, promotores. Los principales transcritos identificados están indicados por
flechas en la parte inferior.
Fig. 5. Esquema de la ruta de degradación de fenilalanina en BL. Las lineas de trazo
continuo indican reacciones de carácter enzimático, trazo discontinuo reaccion química y
trazo a puntos indica que el mecanismo de conversión es desconocido.
Fig. 6. Esquema de la ruta de degradación de triptófano en BL. Las lineas de trazo continuo
indican reacciones de carácter enzimático, trazo discontinuo reaccion química y trazo a
puntos indica que el mecanismo de conversión es desconocido.
Fig. 7. Esquema de la ruta de degradación de tirosina en BL. Las lineas de trazo continuo
indican reacciones de carácter enzimático, trazo discontinuo reaccion química y trazo a
puntos indica que el mecanismo de conversión es desconocido.
Fig. 8. Esquema de la ruta de degradación de aminoácidos ramificados (Isoleucina, Valina
y Leucina) en BL. Las lineas de trazo continuo indican reacciones de carácter enzimático,
trazo discontinuo reaccion química y trazo a puntos indica que el mecanismo de conversión
es desconocido.
Fig. 9. Esquema de la ruta de degradación de metionina en BL. Las lineas de trazo continuo
indican reacciones de carácter enzimático, trazo discontinuo reaccion química y trazo a
puntos indica que el mecanismo de conversión es desconocido.
Fig. 10. Rutas de degradación de la serina y treonina en BL. SDA, serina desaminasa;
SHMT, serina hidroxi-metil-transferasa; TDA, treonina desaminasa.
Fig. 11. Ruta de la arginina deiminasa. ADI, arginina deiminasa; OTC, ornitina carbamoil-
transferasa; CK, carbamato quinasa.
Fig. 12. Esquema de los grupos de genes implicados en la ruta ADI de distintas bacterias.
Los colores indican genes que comparten una similitud de secuencia significativa. Las
puntas de flecha indican genes que se transcriben en dirección opuesta.
Fig. 13. El promotor ParcA de Lb. sakei. TRM, terminador ρ-independiente; los posibles
sitios Cre están recuadrados. Las flechas indican los sitios de iniciación de la transcripción.
Las regiones -35, -10, el sitio de unión de ribosomas (RBS) y el codón de iniciación del gen
arcA están indicados.
Fig. 14. Rutas de la arginina descarboxilasa, ornitina descarboxilasa y agmatina deiminasa.
ADC, arginina descarboxilasa; ODC, ornitina descarboxilasa; AgDI, agmatina deiminasa;
PTC, putrescina carbamoil-transferasa; CK, carbamato quinasa.
Fig. 15. Esquema de las posibles rutas de degradación de los α-oxo-ácidos en BL.
Tabla 1. Características generales de las amino-transfersas arómaticas de BL caracterizadas
hasta el momento.
Tabla 2. Aminas biógenas más importantes en alimentos y sus aminoácidos precursores.
Tabla 3. Nombre de algunos de los compuestos sápidos derivados del catabolismo de
aminoácidos con su aroma asociado.
