Download pdf - TESIS- S NTESIS Y CARACTERIZACI N DE GLIC SIDOS …

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA

TÍTULO DE TESIS: SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN ESTRUCTURAL DE GLICÓSIDOS

FENILAZONAFTÓLICOS DE POTENCIAL USO COMO PROFÁRMACOS GLICOSÍDICOS.

QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE INGENIERO FARMACÉUTICO

PRESENTA: CRUZ SALAZAR DIANA GUADALUPE

DIRECTOR: Dr. MARCO AUGUSTO BRITO ARIAS

México, D.F, Septiembre 2008

Síntesis y Caracterización Estructural de Glicósidos Fenilazonaftólicos de Potencial uso como Profármacos Glicosídicos

AGRADECIMIENTOS

A mi Ángel de Amor... Mi padre Jorge Cruz González.

Al mirar esa estrella brillar reluciente el resplandor de su luz

momentos bellos comencé a recordar y entre ellos estabas tú.

Tan presente como siempre en mi mente ángel de amor conmigo siempre estás

vuelvo a soñar, una vez más, que estás conmigo

te abrazo y siento tu respiro más luego despierto...

El vértigo enorme de tu aliento tus palabras llenas de consuelo

¡Cuanto te extraño!

No conforme mi tristeza llega hasta donde estás

habla con fuerza a tu alma para que puedas regresar.

Padre mío, regrésame la vida que contigo te llevaste

inyecta sabiduría en tus palabras enclaustra en mi ser tu hermoso ejemplo

mitiga el silencio con tu sonrisa no te vayas mas

quédate aquí, abrázame así quita el hielo de la soledad.

Dios, si no me lo regresaras dame la fuerza de aceptar

y el valor para luchar contra el dolor de que ya no estará.

Yo pienso siempre en ti, mi ángel inolvidable, y hoy te digo te amo

¡gracias por ser mi padre!

En tu memoria y con todo mi amor, gracias por todo.


A mi amiga incondicional….Mi Madre Leonor Salazar Rodríguez

Quiero que sepas que eres ese rayito de luz que alumbra mi vida, y a quien quiero mucho…Tu amistad, tus abrazos, tú sonrisa, tú cariño, tú paciencia, tus consejos, tú amor y todo lo bello que esta vida tiene tú me lo das.

Tu amor no tiene medida, siempre me lo das todo solo para ser feliz, eres la madre que se desvela por sus hijos, que se mantiene despierta a nuestras necesidades, tu amor es de siempre y para siempre; lo bueno es que no tiene horario, pues me lo brindas a todas horas, como sea y donde sea.

Es más profundo que un océano, más real que la vida, más preciso que cualquier cantidad, más enorme que el universo; tu amor es infinito. Acepto tus regaños, pues aunque muchos no lo crean solo son por cariño, que después de darlos se vuelven consejos.

Tus brazos siempre se abren cuando quiero un abrazo. Tu corazón comprende cuando necesito una amiga. Tus ojos tiernos se endurecen cuando me hace falta una lección. Tu fuerza y tu amor me guían, y hasta ahora me dan alas para volar.

Mamá, eres la única persona del mundo que siempre está, de forma incondicional. Si te rechazo, me perdonas. Si me equivoco, me acoges. Si los demás no pueden conmigo, me abres una puerta. Si estoy feliz, celebras conmigo. Si estoy triste, no sonríes hasta que me hagas reír.

Eres mi amiga incondicional. Eres quien necesito, eres la persona a quien quiero más que a mi vida, esta vida cual tengo gracias al amor que nació entre tu y ese ser especial a quien ahora llamo papá. Eres la persona capaz de dar todo sin recibir nada. De querer con todo tu corazón sin esperar nada a cambio. De invertir todo en un proyecto sin medir la rentabilidad que le aportes a tu inversión.

Una madre sigue teniendo confianza en sus hijos cuando todos los demás lo han perdido. Gracias por todo lo bueno que haces por mi. Me he dado cuenta de que tus pasos son cansados pero llenos de sabiduría, tus manos alegres tocadoras del alma y se que todo lo tuyo es bello.

Tu hambre es contenida con una sonrisa, tu, solo tu eres capaz de elevar mi seguridad al cielo. Como explicarte madre todo lo que tú eres, y todo lo que siento por ti; como explicarte si me quedan cortas las palabras para decirte cuanto te quiero y como explicarte, si para mí solamente eres mi madre.

Quiero que sepas por qué hasta hoy, desde que nací yo soy feliz porque soy parte de ti y tú eres parte de mí. Porque tu amor por mí fue más grande que el sufrimiento. Porque tu ternura pudo más que la amargura. Porque tú supiste siempre amar con sentimiento.

Quiero también que sepas que si un día alguien me preguntase si alguna vez fui feliz y añade a su pregunta: ¿Cómo? Diría que con cada beso, con cada sonrisa hasta con cada regaño que tu hasta este preciso instante me has brindado. Soy feliz, aun cuando sé que la vida nunca es eterna y que para mi no estarás la vida entera. Aun cuando la ausencia traiga melancolía al corazón. Tú siempre llenarás el vacío que pueda tener en mi alma por alguna razón.

Eres grande, magnifica, especial e inigualable.

Grande, porque haces de mis errores tu comprensión. Magnifica, porque tú haces de mi tristeza una alegría. Especial, porque se que tu mano estará siempre ahí para acogerme. Inigualable, porque aun en esta etapa de mi vida me enseñas a vivir sin temer al fracaso, a ser feliz después de una tristeza, a levantarme de una caída.

Mamá antes de concluir este presente quiero que sepas que por más humildes que sean las palabras son para ti. Madre para ti un gracias y todo mi amor.

No me despido sin antes decirte y agradecerte cada uno de los esfuerzos compartidos para lograr el éxito: ¡Gracias por ser mi madre!


A mi Asesor de Tesis… Marco A. Brito Arias

CONVENCETE:

-De ser tan fuerte, que nada ni nadie pueda perturbar la paz de tu espíritu.

-De hablar de salud, progreso y felicidad a todos los que te encuentres.

-De hacer sentir a tus amigos que hay algo grande en ellos.

-De ver todo por el lado noble y hermoso, haciendo que tu optimismo sea sincero.

-De pensar sólo en lo mejor y esperar sólo lo mejor.

-De tener tanto entusiasmo por el éxito de los demás como por el tuyo propio.

-De olvidar los errores del pasado y luchar por las grandes realizaciones del porvenir.

-De llevar todo el tiempo un semblante alegre y tener siempre una sonrisa para todos.

-De ser tan grande para la pena, tan noble para la cólera, tan fuerte para el miedo, que tu felicidad no

tema la presencia del dolor.

Porque ha sido un gran ejemplo, amigo y una persona incondicional, agradezco de todo corazón, el

tiempo compartido y los esfuerzos para el desarrollo de este trabajo.

¡Gracias, por todo el apoyo brindado!


2

ÍNDICE

1. INTRODUCCIÓN. ..................................................................................................... 4

1.1 CONCEPTO DE PROFÁRMACO .................................................................. 4 1.2 PROFÁRMACOS GLICOSÍDICOS..................................................................5 1.3 GLICOSIDASAS…………………………………………………………………….6 1.4 MONOSACÁRIDOS SIMPLES DE INTERÉS BIOLÓGICO............................ 6 1.5 FORMACIÓN DEL ENLACE O- GLICOSÍDICO. ............................................ 7

1.5.1 MÉTODO DE MICHAEL. ........................................................................... 8 1.5.2 MÉTODO DE FISCHER..............................................................................................8 1.5.3 METODO DE KOENIGS-KNORR.............................................................. 9

1.5.4 MÉTODO DE HELFERICH……………………………………………10 1.6 PROFÁRMACOS AZOICOS ……………………………………………………10

2. JUSTIFICACIÓN................................................................................................. 14

3. OBJETIVOS. ...................................................................................................... 15

3.1 OBJETIVO GENERAL............................................................................. 15 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS.................................................................... 15

4. METODOLOGÍA................................................................................................. 16

5. MATERIALES Y MÉTODOS. ................................................................................. 18

5.1 DESARROLLO EXPERIMENTAL. ....................................................................... 18

5.1.1 1,2,3,4,6-PENTA-O-ACETIL-α,β-D-GLUCOPIRANOSA.............................. 18 5.1.2 2,3,4,6-TETRA-O-ACETIL-α-BROMO GLUCOPIRANOSA. ........................ 19 5.1.3 4-NITROFENIL 2,3,4,6 TETRA-O-ACETYL- β-D- GLUCOPIRANOSA......... 19 5.1.4 4-AMINOFENIL 2,3,4,6 TETRA-O-ACETYL- β-D- GLUCOPIRANOSA. ....... 20 5.1.5 1-[(2,3,6-TETRA-O-ACETIL-β-D-GLUCOPIRANOSIL-OXI-FENIL)AZO]-2 NAFTOL. .................................................................................................... 21 5.1.6 1-[(4-β-D-GLUCOPIRANOSIL-OXI-FENIL)AZO]-2 NAFTOL........................ 22

6. DISCUSIÓN Y ANÁLISIS DE RESULTADOS. ................................................... 23

7. CONCLUSIONES. .................................................................................................. 38

8. REFERENCIAS………………………..…………………………………………………..40 9. ANEXOS……………………………………………………………………………………41


3

ÍNDICE DE FIGURAS.

Figura 1 Ventajas del uso de un profármaco…………………………………………….....4 Figura 2. Método de Michael......................................................................................... 8 Figura 3. Método de Fischer. ....................................................................................... 8 Figura 4. Isómeros obtenidos en la reacción de Fischer …………………………………9 Figura 5. Método De Koenigs-Knorr.............................................................................. 9 Figura 6. Método de Helferich..................................................................................... 10 Figura 7. Metabolismo de grupos azoicos................................................................... 10 Figura 8. Aminación reductiva de grupos azoicos. ...................................................... 11 Figura 9. Colorantes autorizados para el uso farmacéutico......................................... 12 Figura 10. Agentes cromogénicos para detección de actividad enzimática................. 13 Figura 11. Ruta de síntesis para el glicósido fenilazonaftólico 7. ................................ 17 Figura 12. Espectro de RMN 1H para el intermediario 2 en CDCl3.............................. 23 Figura 13. Espectro de RMN 13C para intermediario 2 en CDCl3................................. 24 Figura 14. Espectro de RMN 1H para intermediario 3 en CDCl3. ................................. 25 Figura 15. Espectro de RMN 13 C para intermediario 3 en CDCl3. ............................... 26 Figura 16. Espectro de RMN 1H para intermediario 4 en CDCl3. ................................. 26 Figura 17. Espectro de RMN 13C para intermediario 4 en CDCl3................................. 27 Figura 18. Difracción de Rayos X para intermediario 4. .............................................. 28 Figura 19. Espectro de RMN 1H para intermediario 5 en CDCl3. ................................. 30 Figura 20. Espectro de RMN 13C para intermediario 5 en CDCl3. ................................ 30 Figura 21. Ion característico de piranósidos………………………………………………31 Figura 22. Espectroscopia de masas para el intermediario 5…………………………...32 Figura 23. Espectro de RMN 1H para el intermediario 6 en CDCl3.............................. 32 Figura 24. Espectro de RMN 13C para el intermediario 6 en CDCl3. ............................ 33 Figura 25. Espectroscopia de masas para el intermediario 6. ..................................... 34 Figura 26. Espectro de RMN 1H para el glicósido fenilazonaftólico desprotegido 7 en DMSO-d-6. ......................................................................................... 35 Figura 27. Análisis de colorimetría para el glicósido fenilazonaftólico desprotegido 7. .......................................................................................... 37 Figura 28. Muestras correspondientes a los viales en actividad enzimática................ 37


4

1. INTRODUCCIÓN

1.1 CONCEPTO DE PROFÁRMACOS

El término profármaco (“pro-drug”) fue empleado por primera vez por Albert en 1958,

para describir compuestos que sufrían biotransformaciones antes de ejercer su efecto

farmacológico. El mismo autor, sugirió la utilización de los profármacos con el fin de

alterar las propiedades de ciertos fármacos para incrementar su efecto y disminuir su

toxicidad.

Si bien, la búsqueda de profármacos data desde no más de 20 años atrás, su empleo

es tan antiguo como los primeros fármacos sintetizados, tales como la aspirina o el

prontosil.

Por lo tanto, podemos definir a un profármaco como una sustancia con actividad

farmacológica que es administrada en su forma inactiva o significativamente menos

activa, y una vez administrada el profármaco es metabolizado en el organismo para

generar la forma activa.1,2

Pueden presentar, como ventajas un incremento en la solubilidad, en la absorción y en

su distribución, mayor especificidad, estabilidad, liberación prolongada, baja toxicidad,

aceptación del paciente y puede emplearse como recurso para resolver problemas de

formulación (figura 1). Los profármacos clásicos representan una aproximación

química no específica para evitar propiedades indeseables del fármaco.

Figura 1. Ventajas del uso de un profármaco.

Problemas de Formulación

Metabolismo en el lugar de absorción PPPRRROOOFFFÁÁÁRRRMMMAAACCCOOO

Escasa especificidad Inestabilidad

Dificultad de aceptación por el paciente

Insolubilidad en agua

Toxicidad

No se absorbe


5

Por otra parte, los profármacos dirigidos representan una nueva estrategia para llevar

a cabo una liberación más eficiente, particularmente hacia enzimas y transportadores

de membrana específicos involucrados en células cancerígenas. Como ejemplo de

esta última estrategia, se han sintetizado profármacos de Doxorubicina y Epirubicina a

partir de el fármaco Daunorubicina, este procedimiento fue fundamentado

principalmente en la investigación para la obtención de una nueva técnica relacionada

a un nuevo método, este, con la finalidad de disminuir la toxicidad e incrementar la

concentración del fármaco en el tumor.3,4

Otros profármacos (sulfasalazina, ipsalazina, balsalazina y olsalazina) han sido

desarrollados y dirigidos para liberar acido 5-aminosalicílico (5-AAS) para quimoterapia

localizada en enfermedades inflamatorias.5

1.2 PROFÁRMACOS GLICOSÍDICOS

Se consideran profármacos glicosídicos, a aquellos fármacos que se conjugan con una

fracción de carbohidrato a través de un enlace O-glicosídico y que ejercen su efecto

terapéutico una vez que se lleva a cabo la ruptura del enlace por vía química o

enzimática.

Debido a su tamaño y naturaleza hidrofílica de los glicósidos, estos no pueden

penetrar las membranas biológicas después de su ingestión. Algunos glicósidos de

origen natural como los senósidos han sido empleados como laxantes y se ha

observado que cuando se administran por vía oral son más eficientes que los

senósidos hidrolizados.

Otras sustancias consideradas profármacos glicosídicos incluyen el agente

cardiotónico Pentaacetato de digitoxina, el cual presenta mejor biodisponibilidad

debido a una mejor absorción entérica y una rápida desacetilación en el organismo

después de su absorción.6 El pentaacetato de digitoxina, es un profármaco obtenido a

partir de digitoxina y es un glucósido cardíaco indicado para el tratamiento de

insuficiencia cardíaca congestiva y arritmias cardíacas, cuya finalidad de síntesis es

inhibir la Na,K-ATPasa unida a membrana, lo que da lugar a una mayor disponibilidad

del calcio y produce una mejoría de las contracciones musculares cardíacas; además,

otro de las mejoras que se refieren a su síntesis, es que, la digitoxina como tal, posee

un intervalo terapéutico limitado que frecuentemente es tóxico, siendo la mayoría de

los síntomas de toxicidad similares a los síntomas de la enfermedad subyacente.7,8

Otros profármacos glicosídicos de interés son la dexametasona- -D-glucurónido y

budesónido- -D-glucurónido los cuales se emplean en síntomas intestinales crónicos

como la colitis ulcerativa y la colitis de Crohn observándose una disminución de la

dosis requerida de los antiinflamatorios, así como una mejoría en la liberación del


6

fármaco en la región del intestino grueso como resultado de la actividad de la flora

bacteriana.9

Mas recientemente compuestos Inmuno-conjugados obtenidos al unir enzimas con

anticuerpos monoclonales que se unen a antígenos asociados a tumores están siendo

empleados en la terapia llamada profármaco dirigido contra anticuerpo asociado a

tumores (ADEPT). En esta estrategia los glicósidos son preparados como profármacos

de CI-TMI el cual es un análogo más simplificado que el potente agente antitumoral

duocarmicina SA. La exposición de los glicósidos a células de carcinoma muestra baja

toxicidad, sin embargo al momento de la adición de la glicosidasa se observa que la

proliferación de las células de carcinoma se inhiben casi completamente.10

1.3 GLICOSIDASAS

La función bioquímica de estas enzimas no esta del todo esclarecida, sin embargo

existen evidencias que señalan su participación en una serie de procesos entre los

que podemos mencionar los de degradación de sustratos naturales como mecanismos

de detoxificación, en plantas como mecanismos de defensa contra patógenos

herbívoros mediante la liberación de tiocianatos, cianuro y fitohormonas, y en

humanos, catalizan la degradación de glucosilceramidas en el lisosoma.11

La glicosidasas principales son β-D-galactosidasa, β-D-glucosidasa, β-D-glucuronidasa

β-L-arabinofuranosidasa, β-D-xilopiranosidasa, e hidrolizan el enlace glicosídico de

manera específica en función del carbohidrato que forme parte del glicósido.

Bacterias de la flora intestinal secretan β-glucuronidasa en el intestino grueso y puede

hidrolizar conjugados de profármacos unidos a ácido glucurónico en el intestino lo cual

se emplea como estrategia para liberar fármacos a nivel de cólon. 12

1.4 MONOSACÁRIDOS SIMPLES DE INTERÉS BIOLÓGICO

La D-glucosa es el monosacárido más abundante en la naturaleza. Se encuentra como

tal en el jumo de uva, en el suero sanguíneo y en el medio extracelular. Forma parte

de los polisacáridos, tanto de reserva como estructurales, y constituye la base del

metabolismo energético, ya que todos los seres vivos son capaces de metabolizar la

glucosa, la importancia esencial del consumo de azúcares, para el ser humano radica,

en el aprovechamiento de energía, siendo la glucosa, el principal combustible para la

mayoría de los seres vivos, además de ser un precursor versátil capaz de producir


7

una gran cantidad de intermediarios metabólicos que son materiales de partida

necesarios para reacciones biosintéticas.11,12

La D-galactosa es un constituyente del disacárido lactosa, carbohidrato principal de la

leche. La D-fructosa está presente en casi todas las frutas, a las que confiere su sabor

dulce.

Gracias a que los monosacáridos tienen un gran empleo en la mejora de fármacos, se

pueden sintetizar drogas con mayor capacidad de generar un efecto en el organismo,

mejorando propiedades indeseables originalmente presentadas en el fármaco que

permiten mayor biodisponibilidad en el organismo y por consiguiente una mejor

aceptación por el paciente.13

Por otro lado, es importante señalar que los glicósidos son un conjunto de moléculas

que en su estructura se encuentra un azúcar unido a un compuesto diferente a ella.

Los glicósidos desempeñan numerosos papeles importantes en organismos.

Formalmente, un glicósido según la IUPAC, es cualquier molécula en la cual un azúcar

se enlaza a través de su carbón anomérico a otro compuesto de diferente naturaleza

química, mediante un enlace O-glicosídico. El azúcar del glicósido se conoce como

glicona y el grupo ajeno al azúcar, aglicona o genina del glucósido.

1.5 FORMACIÓN DEL ENLACE O- GLICOSÍDICO.

El enlace O-glicosídico es uno de los enlaces más estables existentes en los

biopolímeros, se forma cuando un monosacárido se condensa con un grupo R’OH

para generar una unión R’-O-R, donde R es la fracción del Carbohidrato y R’ es la

fracción del aglicón que puede ser alifática, aromática o bien tratarse de otro

carbohidrato. 14

Existen métodos sintéticos diversos, para la formación de este tipo de enlaces, los

principales son los siguientes:

• Método de Michael

• Método de Fischer

• Método de Koenigs Knorr

• Método de Helferich

• Método de Imidato


8

1.5.1 MÉTODO DE MICHAEL

Este método consiste en condensar el cloruro de 2,3,4,6-tetra-O-acetil-α-D-

glucopiranósido (a) con fenóxido de potasio (b), para generar el derivado acetilado (c)

que, mediante hidrólisis formara el fenil-β-D-glucopiranosa (d). (Figura 2)

O

OAc

OAc

OAc

OAc

OAc

+

O-K+

R

O

OAc

OAc

OAc

OAc

O

R

(a) (b) (c)

O

OH

OH

OH

OH

O

R

(d)

R=o-OMe,p-MeO

Figura 2. Método de Michael.

Una aplicación importante de esta metodología es la preparación de algunos sustratos

que poseen como aglicón un cromóforo, y que son empleados para la detección de

actividad enzimática de glicosidasas.

1.5.2 MÉTODO DE FISCHER

El método consiste en la condensación catalizada por ácido de D-glucopiranosa con

metanol para producir principalmente metil-α-glucopiranosa. (Figura 3). Los

catalizadores empleados pueden ser ácidos de Lewis, resinas de intercambio iónico y

más recientemente el ácido tríflico, que proporcionan rendimientos óptimos.15

O

OH

OH

OH

OH

OH

O

OH

OH

OH

OH OMe

+ ISOMERO

i) MeOH/0.7% HCL 20ºC

i

Figura 3. Método de Fischer.


9

O

OH

OH

OH

OH

OH

OHO

OH

OH

OH

OMe

OHO

OH

OH

OH

OMei

O

OH

OH

OH

OMe

OH

O

OH

OH

OH

OH

OMe

ii

i) MeOH/0.7% HCl20C ii)MeOH/4% HCl,reflujo Figura 4. Isómeros obtenidos en la reacción de Fischer

1.5.2 METODO DE KOENIGS-KNORR

Este método se basa en la reacción entre un 1,2-cis-acetilglucosilhaluro (a) y un

alcohol (alifático, aromático o monosacárido), en presencia de sales de plata (óxido o

carbonato). La reacción se lleva a cabo manteniendo agitación vigorosa a temperatura

ambiente y en ausencia de luz. (Figura 5)

O

OAc

OAc

OAc

O

OH

OH

OH

OH

i) AgO2 o Ag2CO3/ benceno ii) MeONa/MeOH

OAc Br

+

OH

i, ii O

Figura 5. Método De Koenigs-Knorr.


10

1.5.4 MÉTODO DE HELFERICH

Este método es considerado como una modificación del de Koenigs Knorr y consiste

en condensar 2,3,4,6-tetra-O-acetilpiranosilhaluro con alcoholes alquílicos, arílicos o

monosacáridos en presencia de sales de mercurio (cianuro de mercurio) en lugar de

sales de plata, además de usar disolventes de mayor polaridad como acetonitrilo y

nitrometanol (Figura 6). Cabe mencionar que esta reacción no es estereoespecífica y

en la mayoría de los casos se obtienen mezclas de anómeros.

O

OAc

OAc

OAc

O

OH

OH

OH

OH

i) Hg(II)(CN)2/CH3CN ii) MeONa/MeOH

OAc Br

i, ii OR+ ROH

Figura 6. Método de Helferich

1.6 PROFÁRMACOS AZÓICOS

Los compuestos azóicos se consideran profármacos debido a que el grupo azo (-N=N)

es metabolizado en el organismo por el citocromo P-450 y por NADPH-citocromo P450

reductasa y por bacterias en el tracto gastrointestinal. La reducción procede vía un

radical anión azo, posterior conversión al compuesto hidrazo y ruptura para generar

las dos aminas correspondientes (Figura 7).1

N NAr Ar'e-

O2 O2

N NAr Are-

2H+

HN

HNAr Ar'

e-2H+

NH2 H2NAr Ar'+

Figura 7. Metabolismo de grupos azoicos.


11

Existen sustancias farmacológicamente activas que presentan un grupo azóico y se

han empleado como profármacos. Un ejemplo lo constituyen los profármacos

Sulfasalazina que es inactivo en la forma administrada y que sufre una ruptura por las

bacterias de colon para generar los productos ácido 5-amino salicílico y sulfapiridina

responsables del efecto farmacológico cuya función es generar efectos

antiinflamatorios en el tratamiento de la inflamación intestinal y de la artritis reumatoide

(Figura 8).16

PhHN S

NN N

COONa

OH

O

O

NH2

COONa

OH

5-ASA

PhHN S

N

O

O

+NH2

Bacteria del colon

Sulfapiridina

Sulfasalazina

Figura 8. Animación reductiva de grupos azoicos.

Recientes estudios han demostrado que la sulfasalazina revierte el proceso de

cicatrización hepática asociado a la cirrosis. Aparentemente, unas células llamadas

miofibroblastos, que causan tejido de cicatrización en un hígado enfermo, también

segregan proteínas que previenen la rotura del tejido de cicatrización. La sulfasalazina

parece retardar la secreción de esas proteínas.17

Los compuestos azóicos presentan un enlace N N , y en algunos casos

se puede presentar en su forma tautomérica HN N estos compuestos

constituyen la clase más amplia e importante de colorantes, que representan

aproximadamente a un tercio de la producción total.

Son preparados a partir de aminas aromáticas primarias por una secuencia de

procesos conocidos como diazoación y copulación y bajo las condiciones establecidas

para cada cromóforo se genera la sal de diazonio que puede copularse con


12

componentes adecuados, típicamente fenoles, naftoles, aminas aromáticas y sus

derivados acetoacetarilaminas y pirazol-5-onas sustituidas.18

Dentro de la industria farmacéutica, existe una serie de colorantes que son mezclados

con medicamentos, estos principalmente son empleados para recubrimientos

exteriores, algunos colorantes autorizados se muestran a continuación (Figura 9).19

N

NaO3S

NN

NHO

SO3Na

CO2Na

Amarillo No. 5 Sal trisódica del ácido 4,5-dihidroxi-5-oxo-1-(4-sulfofenil))-4

-[4-sulfofenil-azo]-1H-pirazol-3-carboxílico

NNaO3S

N

HO

Anaranjado No. 4 Sal sódica del ácido

4-[(2-hidroxi-1-naftalenil)azo]bencensulfónico

NO2N

Cl

N

HO

Rojo No. 36 1[(2-cloro-4-nitrofenil)azo]-2-naftol

NH3C

N

SO3Na

HO CO2Na

Rojo No. 6 Sal disódica del ácido 3-hidroxi-4-[(4-metil-2-sulfofenil)-azo]-2-naftalenocarboxílico

NN N

N

HO

Rojo No. 17 1-[[4-(fenilazo)fenil]azo]-2-naftol

Figura 9. Colorantes autorizados para el uso farmacéutico.

Otros agenetes cromogénicos que se emplean para la detección de actividad

enzimática son: p-nitrofenol, 7-hidroxi-4-metilcumarina, resorufina y 5-bromo-4-cloro-

indoxil acetato (X-gluc), que pueden ser detectados por absorción uv, fluorescencia o


13

histoquímicamente. Dichos cromóforos han sido conjugados con los monosacáridos

mas abundantes (glucosa, galactosa, ácido glucurónico) generando los

correspondientes O-glicósidos los cuales se emplean de manera extensiva en la

detección de actividad enzimática de las glicosidasas representativas. (Figura 10).

RO

NO2

R = glucosa, galactosa, ácido glucurónico, xilosa,

N-acetilglucosamina, arabinosa.

NAc

ORCl

Br

O ORO N

OO OR

Figura 10. Agentes cromogénicos para detección de actividad enzimática.

La característica principal de estos cromóforos es que, como O-glicósidos, son

hidrosolubles y al ser liberados por la acción de la glicosidasa correspondiente,

precipitan en el medio y así permite la detección enzimática a nivel histológico.1


14

2. JUSTIFICACIÓN. El desarrollo de nuevos fármacos empleando metodologías que se basan en la

síntesis, diseño y desarrollo de profármacos de naturaleza glicosídica constituye una

opción de relevancia para el tratamiento de ciertos padecimientos que requieren de un

mayor grado de especificidad hacia los sitios de acción, así como de mejores

características de biodisponibilidad. Bajo este razonamiento se propone el diseño de

un profármaco formado por un compuesto azóico unido a glucopiranosa a través de un

enlace beta glicósidico el cual será hidrolizado por beta glucosidasas presentes en la

flora intestinal.

El desarrollo de esta metodología permitirá la obtención de otros profármacos azóicos

de naturaleza glicosídica de potencial actividad farmacológica.

Asimismo, el desarrollo de métodos que permitan el acoplamiento de sustancias

activas a unidades de carbohidratos a través de uniones glicosídicas continúa siendo

un área de interés relacionada a la modificación molecular en el diseño de fármacos.


15

3. OBJETIVOS.

3.1 Objetivo General.

- Síntesis y caracterización estructural por RMN 1H y 13C de un glicósido

fenilazonaftólico de potencial actividad como profármaco.

3.2 Objetivos Específicos.

- Síntesis de los intermediarios glicosídicos

- Purificación de los intermediarios y producto glicosídico por cromatografía en columna.

- Caracterización estructural por medio de Resonancia Magnética Nuclear de 1H y 13C.

- Reconocimiento enzimática.


16

4. METODOLOGÍA La síntesis de los glicósidos feniazonaftólicos se llevó a cabo de acuerdo al esquema

propuesto (Figura 11) que consistió en la preparación del intermediario 2 a partir de

glucosa para proteger los grupos oxhidrilo del azúcar. Siguiendo con la síntesis de

acetobromoglucosa 3 a partir de 2. La secuencia indica una reacción a partir de 3 con

paranitrofenol en condiciones básicas para síntesis del intermediario 4. El siguiente

paso consistió en la reducción del grupo nitro para lo cual se emplearon condiciones

de reducción catalítica para generar el intermediario 5. El siguiente paso fué critico en

la obtención del glicósido fenilazonaftólico y consistió en someter el intermediario 5 a

condiciones de formación de sal de diazonio bajo condiciones débilmente ácidas, con

la finalidad de evitar la hidrólisis del enlace glicosídico, para generar el intermediario

protegido 6. El paso final consistió en la desprotección de los grupos acetato para lo

cual se emplean las condiciones de Zémplen, dando lugar a la obtención del glicósido

fenilazonaftólicos 7.

La obtención de sustancias de potencial actividad farmacológica mediante síntesis

química requiere de una serie de pasos que involucran la reacción y tratamiento

posterior, así como la purificación y caracterización estructural de los intermediarios

obtenidos.

Se realizará una evaluación enzimática del profármnaco glicosídico 7 con β-

glicosidasa, para identificación del grupo O- glicosídico y el aglicón.


17

O

OR1

R1OR1O

OR1

O

NO2

O

OR1

R1OR1O

OR1

O

NH2

iii

ONa

1; R1, R2 = H

O

OR1

R1OR1O

OR1 OR2

O

OR1

R1OR1O

OR1

O

N

N

OH

2; R1, R2 = Aci

ii3; R1 = Ac, R2 = Br

iv

v

6; R1= Ac

4; R1= Ac

5; R1= Ac 7; R1= Hvi

i) Ac2O, Et3N, CH2Cl2, DMAP (cat). ii) HBr-AcOH 33%. iii) NaOC6H44-NO2, acetona-agua.iv) H2, Pd-C 10%, EtOH. v) NaNO2,AcOH-H20-THF. vi) NaOMe-MeOH.

Figura 11. Ruta de síntesis para el glicósido fenilazonaftólico 7.


18

5. MATERIALES Y MÉTODOS.

Los disolventes orgánicos empleados son grado técnico y fueron purificados por

destilación fraccionada previamente a su uso. Los reactivos químicos son grado

analítico (Aldrich Co.) y fueron empleados sin purificar. Los intermediarios fueron

purificados, mediante cromatografía en columna, empleando Sílica gel 60 Merck Co.

como fase estacionaria, como fase móvil se empleo un sistema de elución Hexano-

Acetato de Etilo y Metanol. Cada reacción fue monitoreada por cromatografía en capa

fina (c.c.f), utilizando como sistema revelador luz ultravioleta y solución de sulfato

cérico amoniacal (CAN) seguido por calentamiento, aproximadamente 90° C.

5.1 DESARROLLO EXPERIMENTAL.

5.1.1 1,2,3,4,6-penta-O-acetil-α,β-D-glucopiranosa.

O

OH

HOHO

OHOH

i O

OAc

AcOAcO

OAcOAc

21

i) Ac2O, Et3N, CH2Cl2, DMAP

En un matraz bola de 100 mL se hace reaccionar Glucosa (5g, 27.75 mmol) en

diclorometano (20 mL), la mezcla se enfría a 0ºC, se adiciona trietilamina (19.3 mL,

138.4 mmol), anhídrido acético (13mL, 137.4 mmol), y una cantidad catalítica de

dimetilaminopiridina (20 mg), la reacción se mantiene con agitación constante durante

24 horas a temperatura ambiente. La reacción se diluye en diclorometano (100 mL) y

se lava con una solución 1N de HCl (3 x 30 mL), se neutraliza con una solución

saturada de bicarbonato de sodio fría (2 x 40 mL), se lava con una solución salina fría

(1 x 35 mL).

La fase orgánica se seca sobre sulfato de sodio anhidro, se decanta y se evapora en

rotavapor para obtener 10.44 g de un sólido blanco (rendimiento 96%).


19

5.1.2 2,3,4,6-tetra-O-acetil-αααα-bromo glucopiranosa.

O

OAc

AcOAcO

OAcOAc

i O

OAc

AcOAcO

OAcBr

32

i) HBr/ CH3COOH 33%

En una matraz bola de 100 mL se hace reaccionar el intermediario 2 (5 g, 12.8 mmol)

adicionando una solución de ácido bromhídrico-ácido acético 33% (5mL), la reacción

se deja en agitación constante durante 6 horas a temperatura ambiente. El producto se

diluye con diclorometano frío (10 mL), y se neutraliza con una solución saturada fría de

bicarbonato de sodio (3 x 15 mL), y se lava con solución salina (1 x 10 mL). El

producto se seca sobre sulfato de sodio anhídro, se decanta y evapora en rotavapor,

para obtener 16 g de una sustancia de consistencia aceitosa de color rojiza (rend.

76%). El intermediario de Acetobromoglucosa 3 es susceptible a descomposición por

lo que no se purificó y es utilizó como tal para la siguiente reacción.

5.1.3 4-Nitrofenil 2,3,4,6 tetra-O-acetyl- β-D- glucopiranosa.

O

OAc

AcOAcO

OAc

O

NO2

O

OAc

AcOAcO

OAcBr

i

43

i) 4 NO2C6H4OH, NaOH, H2O En un vial de 10 mL se disuelve hidróxido de sodio (115 mg, 12.1 mmol) en agua

destilada (5 mL), y se adicionan 4-nitrofenol (1.69 g, 12.1 mmol) manteniendo la

agitación durante 20 min a temperatura ambiente. La sal del 4-nitrofenol obtenida se

adiciona a un matraz bola de 100 mL que contiene el intermediario 3 (5 g. 12.1 mmol)

diluido previamente en acetona (15 mL). La reacción se mantiene con agitación

constante durante 24 horas a temperatura ambiente en ausencia de luz.

La reacción se diluye con diclorometano (10 mL), y se lava con una solución 1N

NaOH fría (3 x 15 mL) y con una solución salina fría (1 x 15 mL). La fase orgánica se


20

seca sobre sulfato de sodio anhídro, se decanta y evapora en rotavapor para obtener

2.85 g de un sólido amarillento correspondiente a intermediario 4 en rendimiento de

50%. El intermediario 4 es cristalizado por adición de metanol obteniendo un sólido

cristalino con punto de fusión de 172ºC. [α]D -54o (c 0.95, CHCl3).; 1H NMR (CDCl3) δ

2.01-2.10 (4 s, 12 H), 3.95 (m, 1H), 4.20 (dd, 1H), 4.26 (dd, 1H), 5.15-5.34 (m, 4H),

7.07 (d, 2H, J = 9.3 Hz), 8.20 (d, 2H, J = 9.3 Hz). 13C NMR (CDCl3) δ 20.78, 61.99,

68.15, 71.08, 72.57, 77.68, 98.19, 116.80, 126.02, 143.42, 161.36, 170.71.

5.1.4 4-Aminofenil 2,3,4,6 tetra-O-acetyl- β-D- glucopiranosa.

O

OAc

AcOAcO

OAc

O

NO2

O

OAc

AcOAcO

OAc

O

NH2

i

4 5

i)H2, Pd-C, EtOH

En un matraz bola de 50 mL, se disuelve el intermediario 4 (2g, 4.2 mmol) en una

mezcla de acetato de etilo- metanol 1:1 (2.5 mL-2.5 mL) y se adiciona paladio en

carbono al 10% (150mg). La reacción se agita vigorosamente durante 10 hrs. a

temperatura ambiente bajo atmósfera de hidrógeno para lo cual se usa un globo

cargado con este gas.

La reacción se filtra en una pequeña columna empacada con celita usando metanol

como sistema de elución. El producto se concentra y evapora en rotavapor y el

producto oleoso se purifica por cromatografía en columna, empleando sílica gel 60

como fase estacionaria y como sistema de elución hexano- acetato de etilo-metanol

(1:1:0.5) obteniendo 1.4 g del intermediario 5 como aceite rojizo (78 % rendimiento).

[α]D -16o (c 1.1, CHCl3).; 1H NMR (CDCl3) δ 2.01-2.10 (4 s, 12 H), 3.95 (m, 1H), 4.20

(dd, 1H), 4.26 (dd, 1H), 5.15-5.34 (m, 4H), 6.62 (d, 2H, J = 7.5 Hz), 6.81 (d, 2H, J = 7.5

Hz). 13C NMR (CDCl3) δ 20.78, 61.99, 68.15, 71.08, 72.57, 77.68, 98.19, 116.13,

119.16, 142.76, 150.02, 170.71


21

5.1.5 1-[(2,3,6-tetra-O-acetil-ββββ-D-glucopiranosil-oxi-fenil)azo]-2 naftol.

O

OAc

AcOAcO

OAc

O

NH2

O

OAc

AcOAcO

OAc

O

N

N

OH

i) C10H7NaO, THF, NaNO2, CH3COOH- 0ºC

i

En un matraz bola de 50 mL se disolvió el intermediario 5 (0.543g, 1.23mmol) en una

mezcla de tetrahidrofurano (3mL)- ácido acético (0.5 mL), y una vez disuelto se enfría

a 0ºC en baño de hielo con sal. Una vez que se alcanza esta temperatura se adiciona

una solución de nitrito de sodio (85 mg, 1.23 mmol) en agua (0.5 mL) y la reacción se

mantiene a 0oC durante 30 minutos. La sal de diazonio resultante se adiciona a un vial

de 10 mL que contiene 2-Naftol (1.69g, 1.23mmol) e hidróxido de sodio (49mg,

1.23mmol) en agua destilada agitados previamente durante 20 minutos y la mezcla de

reacción se agita durante 30 minutos a temperatura ambiente en ausencia de luz. La

solución color naranja se diluye en diclorometano (10mL), se lava con solución 1N de

NaOH (2 x 15 mL), solución salina (1 x 15 mL), se seca sobre sulfato de sodio anhídro,

se decanta y evapora en rotavapor. El producto se purifica por cromatografía en

columna empleando sílica gel 60 como fase estacionaria y como eluyentes hexano-

acetato de etilo (1:3) obteniendo 325 mg de un sólido naranja correspondiente al

intermediario 6 (rend. 30 %) con un punto de fusión de 81-83ºC. [α]D -13.1o (c 0.6,

CHCl3), IR (película fina) 1738 cm-1, 1H NMR (CDCl3) δ 2.09-2.12 ( 4s, 12 H), 3.85 (m,

1H-5), 4.08 (dd, 1H-6), 4.32 (dd, 1H-6’), 5.10 (t, 1H-2), 5.31 (t, 1H-4), 5.41 (t, 1H-3),

5.70 (d, 1H-1, J = 8.4 Hz), 6.97 (d, 1H, J = 9.6 Hz), 7.10 (d, 2H), 7.41 (t, 1H), 7.57 (t,

1H), 7.66 (d, 1H), 7.78 (d, 1H), 7.79 (d, 2H), 8.62 (d, 1H). 13C NMR (CDCl3) δ 20.93

(CH3-CO), 61.66 (C-5),67.90 (C-4), 68.38 (C-6), 70.39 (C-3), 72.99 (C-2), 91.90 (C-1),

118.3 (C-2’), 121.4 (C-8), 124.5 (C-3), 125.4 (C-6), 127.7 (C-4), 128.3 (C-5), 128.5 (C-

7), 129.2 (C-3’), 129.7 (C-1 naftol), 133.3 (C-8), 139.6 (C-4), 144.4 (C-1’ fenol), 157.8

(C-4’), 171.0 (C=O), 171.6 (C-2). MS (EI) m/z 594.18 [M+], 169 (100), 264 (62).


22

5.1.6 1-[(4-ββββ-D-glucopiranosil-oxi-fenil)azo]-2 naftol

O

OH

HOHO

OH

O

N

N

OH

i) MeONa / MeOH

O

OAc

AcOAcO

OAc

O

N

N

OH

i

En una matraz bola de 50 mL se disuelve el intermediario 6 (0.3 g, 0.504 mmol) en

metanol (5 mL) y se adiciona una solución de metóxido de sodio (10 mg de Na en 1

mL de metanol), y la reacción se agita a temperatura ambiente durante 4 hrs. La

solución se neutraliza con resina de intercambio iónico Dowex (H+), se decanta y se

concentra en rotavapor, obteniendo 0.193 g de un sólido rojo (rend. 90%) con punto de

fusión de 177-178o. [α]D -23.4o (c 0.9, MeOH), 1H NMR (DMSO d-6) δ 2.94 (dd, 1H-2),

3.14 (t, 1H-4), 3.17 (t, 1H-3), 3.27 (m, 1H-5), 3.45 (dd, 1H-6), 3.64 (dd, 1H-6’), 4.99 (d,

1H-1, J = 7.5 Hz), 6.97 (d, 1H, J = 9.6 Hz), 7.10 (d, 2H), 7.41 (t, 1H), 7.57 (t, 1H), 7.66

(d, 1H), 7.78 (d, 2H), 8.62 (d, 1H) 13C NMR (CDCl3) δ 20.93 (CH3-CO), 61.66 (C-

5),67.90 (C-4), 68.38 (C-6), 70.39 (C-3), 72.99 (C-2), 91.90 (C-1), 118.3 (C-2’), 121.4

(C-8), 124.5 (C-3), 125.4 (C-6), 127.7 (C-4ª), 128.3 (C-5), 128.5 (C-7), 129.2 (C-3’),

129.7 (C-1 naftol), 133.3 (C-8ª), 139.6 (C-4), 144.4 (C-1’ fenol), 157.8 (C-4’) 171.6 (C-

2). Análisis elemental de masas C22H22N2O7 : C, 30.98; H, 2.60; N, 3.28. Found: C,

31.74, H, 3.40; N, 2.41.


23

6. DISCUSIÓN Y ANÁLISIS DE RESULTADOS.

El glicósido fenilazonaftólico 7 fue preparado de acuerdo al esquema general el cual

inicio con la reacción de peracetilación de glucosa generando el intermediario 2 en

rendimiento cuantitativo (96%). El espectro de Resonancia Magnética Nuclear para 1H

en CDCl3 para este intermediario ( figura 12) muestra a frecuencia baja en δ 2.0 ppm

cinco señales simples que integran para 15 H, correspondientes a cinco grupos

acetilo, en 4.12 ppm se observa una señal múltiple que integra para 2 hidrógenos

correspondiente a los hidrógenos H5 y H6. En 4.28 ppm una señal doble de doble que

se asigna a los hidrógenos H6’. En 5.12 ppm se observa una señal múltiple que

integra para 2 hidrógenos asignables a H-2 y H-4, en 5.47 ppm se observa una señal

triple para H-3, y en 6.33 ppm se observa una señal doble asignable a H-1 con una

constante de acoplamiento J1-2 = 4.5 característico de una interacción axial-ecuatorial

entre H-1 y H-2 lo cual demuestra que el anómero es de tipo α.

Figura 12. Espectro de RMN 1H para el intermediario 2 en CDCl3..

O

OAc

AcOAcO

OAcOAc

1''

4''

3''

5'' 2''

6''


24

El espectro de de RMN 13C en CDCl3 del intermediario 2 (figura 13), muestra en 20.0

ppm señales para los carbonos metílicos, en 62, 68, 70 y 88 ppm señales

correspondientes a los carbonos intracíclicos y en 170 ppm señales que corresponden

a los grupos carbonilo.

Figura 13. Espectro de RMN 13C para intermediario 2 en CDCl3.

El siguiente paso consistió en la reacción de la glucosa peracetilada 2 con una

solución de ácido bromhídrico en ácido acético generando acetobromoglucosa 3, con

un rendimiento del 76%, el cual es un producto inestable y debe ser usado de

inmediato sin purificar. El espectro de Resonancia Magnética Nuclear para 1H en

CDCl3 para este intermediario (figura 14), muestra a frecuencia baja en 2.0 ppm

cuatro señales simples que integran para 12 H, correspondientes a cuatro grupos

acetilo, en 4.32 ppm se observa una señal múltiple correspondiente al hidrógeno H5.

En 4.3 ppm una señal múltiple que integra para los hidrógenos H6 y H6’. En 4.8 ppm

se observa una señal doble de doble para H-2 y en 5.2 ppm se tiene una señal triple

para H-4, en 5.6 ppm una señal triple para H-3 y en 6.6 ppm se tiene una señal

doble para H-1.

O

OAc

AcOAcO

OAcOAc

1''

4''

3''

5'' 2''

6''


25

Figura14. Espectro de RMN 1H para intermediario 3 en CDCl3.

El espectro de Resonancia Magnética Nuclear de 13C en CDCl3 para el intermediario 3

(figura 15), muestra señales en la región alifática en 20 ppm correspondiente a los

carbonos de los metilos de los acetatos. En 62 ppm se muestran señales

correspondientes al C6 de la glucopiranosa, 68 ppm a 74 ppm se muestran señales

correspondientes a los carbonos C3, C4 y C5 del azúcar. En 78 ppm se muestra una

señal correspondiente al carbono anomérico del glucósido, en 170 ppm se muestran

señales correspondientes a los carbonos de los grupos carbonilo.

O

OAc

AcOAcO

OAcBr

1''2''

3''

4''

5''

6''

O

OAc

AcOAcO

OAcBr

1''2''

3''

4''

5''

6''


26

Figura15. Espectro de RMN 13 C para intermediario 3 en CDCl3.

La acetobromoglucosa 3 se hizo reaccionar con la sal sódica del p-nitrofenol en

acetona-agua generando el correspondiente β-glucósido en 50% de rendimiento. El

espectro de Resonancia Magnética Nuclear de 1H en CDCl3 para el intermediario 4

(figura 16), indica señales a frecuencia baja en 2.01-2.10 ppm correspondientes a

cuatro grupos acetilo que se observan como cuatro señales simples e integran para 12

H. En 3.95 ppm se observa una señal múltiple que integra para 1 hidrógeno y

corresponde a H-5. Entre 4.2 ppm y 4.3 ppm se observan dos señales doble de doble

asignables a los hidrógenos H6 y H6’. En 5.15 ppm a 5.4 ppm se observan cuatro

señales para los hidrógenos H-1, H-2, H-3, y H-4 de la glucopiranosa. A frecuencia

alta en 7.0 ppm y δ 8.2 ppm se observan dos señales dobles que integran para dos

hidrógenos cada uno correspondientes a un sistema aromático para sustituido (A2X2).

Figura 16. Espectro de RMN 1H para intermediario 4 en CDCl3.

El espectro de de RMN 13C en CDCl3 para el intermediario 4 (figura 17) muestra

señales en la región alifática en 20 ppm para los carbonos de los metilos de los

grupos acetato, entre 60 y 72 ppm se observa señales correspondientes a los

O

OAc

AcOAcO

OAc

O

NO2

1''

2''

3''

4''

5''

6''

1'2'

3'

4'5'


27

carbonos de la glucopiranosa C3, C4, C5 y C6, en 74 ppm se muestra una señal

correspondiente al carbono C2 de la glucopiranosa en 100 ppm se observa el carbono

anomérico del monosacárido, en aproximadamente 118 ppm se muestran señales

correspondientes a los carbonos del anillo aromático C2 y C6 ambos cercanos al

enlace O - glicosídico, en 128 ppm se observa los carbonos del anillo aromático C3

y C5 ambos cercanos al grupo nitro, en 142 ppm se muestra la señal correspondiente

al carbono C4 unido al grupo nitro, en δ 162 ppm se observa el carbono C1 del anillo

aromático formador del enlace O - glicosídico, y alrededor de 170 ppm se observa la

señal correspondiente a los carbonos del los grupos carbonilos.

Figura 17. Espectro de RMN 13C para intermediario 4 en CDCl3.

El intermediario 4 fue purificado por cromatografía en columna y la evaporación lenta

del sistema de elusión dio como resultado la formación de cristales de alta pureza que

permitieron realizar la caracterización espectroscópica por difracción de rayos X.20

O

OAc

AcOAcO

OAc

O

NO2

1''

2''

3''

4''

5''

6''

1'2'

3'

4'5'


28

El análisis de difracción de rayos X del intermediario 4 (figura 18) demuestra que el

glucósido adopta una conformación de silla 4C1 con todos los sustituyentes orientados

en posición ecuatorial. El ángulo endocíclico C-O-C corresponde al valor característico

de la conformación β-D-4C1 de piranosido. Los parámetros de puckering (Cremer y

Pople) son Q = 0.583 (4) Ǻ, θ = 5.4 (4)o y ψ = 352 (4)o.

Figura 18. Difracción de Rayos X para intermediario 4.

El intermediario glicosídico 4 fue sometido a condiciones de hidrogenación catalítica

con la finalidad de transformar el grupo nitro al amino, generando el intermediario 5

con rendimiento del 78%. El espectro de Resonancia Magnética Nuclear de 1H con

CDCl3 (figura 19), indica señales a frecuencia baja en 2.0 ppm correspondientes a

cuatro grupos acetilo que se observan como cuatro señales simples e integran para 12

H. En 3.9 ppm se observa una señal múltiple que integra para un hidrógeno y

corresponde a H5. Entre 4.2 ppm se observan 1 señal múltiple asignables a los

hidrógenos H6 y H6’. En 4.8, 5.0 y 5.4 ppm se observan tres señales que integran

para los hidrógenos restantes H-1, H-2, H-3, y H-4 de la glucopiranosa. A frecuencia

alta en 6.6 ppm y 6.8 ppm se observan dos señales dobles que integran para dos

hidrógenos cada uno correspondientes a un sistema aromático para sustituido (A2X2).

Se observa que las dos señales dobles del sistema A2X2 se desplazan a 6.6 y 6.8 ppm

debido a que el grupo amino ejerce un efecto de escudo (shielding). El desplazamiento


29

químico a frecuencia baja muestra un acercamiento de las señales para dicho sistema,

la razón, es que el grupo amino presenta características de electrodonador, lo que

genera un desplazamiento de señales y el acercamiento entre ellas.

En comparación con el espectro del intermediario 4, este presenta un desplazamiento l

de señales para el sistema A2X2 por la presencia del grupo nitro que presenta

características de electroatractor, por lo que las señales se ven desplazadas a

frecuencia alta y se observa una separación considerable entre ellas.

Figura 19. Espectro de RMN 1H para intermediario 5 en CDCl3.

El espectro de de RMN 13C en CDCl3 para el intermediario 5 (figura 20), muestra

señales en la región alifática en 20 ppm para los metilos de los grupos acetato, entre

60 y 80 ppm se observa señales correspondientes a los carbonos de la glucopiranosa,

en 100 ppm se observa el carbono anomérico, en 118 y 120 ppm se observa los

carbonos 2 y 3 del anillo aromático, en 142 ppm se observa el carbono unido al grupo

nitro, en 150 ppm el carbono 1 del anillo bencénico, y a frecuencia alta en 170 ppm las

señales correspondientes al carbono de carbonilo.

O

OAc

AcOAcO

OAc

O

NH2

1''

2''

3''

4''

5''

6''

1'2'

3'

4'5'


30

Figura20. Espectro de RMN 13C para intermediario 5 en CDCl3.

El espectro de masas de alta ionización por impacto electrónico del intermediario 5

(figura 21), muestra un ion molecular [M].+ de 439 el cual coincide con el peso

molecular, y un pico base de 169 (100%) correspondiente al fragmento de la figura 20

el cual es un ión característico presente en la fragmentación de piranósidos.

OAc

AcO

Figura 21. Ion característico de piranósidos

O

OAc

AcOAcO

OAc

O

NH2

1''

2''

3''

4''

5''

6''

1'2'

3'

4'5'


31

Figura 22. Espectroscopia de masas para el intermediario 5.

La siguiente reacción consistió en la generación del glicósido fenilaazonaftólico 5 para

lo cual se ensayo la reacción de Sandmeyer para la formación de colorantes azóicos

empleando en nuestra estrategia condiciones débilmente ácidas con la finalidad de

conservar el enlace glicósidico el cual es susceptible a condiciones de hidrólisis con

ácido clorhídrico siendo las condiciones standard en la formación de sales de diazonio.

El espectro de Resonancia Magnética Nuclear de 1H en CDCl3 (figura 23), presenta

señales a frecuencia baja en 2.0 ppm correspondientes a cuatro grupos acetilo que

se observan como cuatro señales simples e integran para 12H, en 3.85 ppm se

observa una señal múltiple correspondiente a un hidrógeno y corresponde a H5, entre

4.2-4.4 ppm se observan dos señales doble de doble correspondientes a los

O

OAc

AcOAcO

OAc

O

NH2


32

hidrógenos H6 y H6’, en 5.10 ppm una señal triple asignable a H-2, en 5.31 ppm una

señal triple que corresponde a H-4, en 5.41 ppm una señal triple para H-3 y una doble

para H-1, entre 6.97-7.87 ppm se observan 5 señales dobles y 2 señales triples para

los hidrógenos de tipo aromático y en 8.60 ppm se observa una señal doble asignable

al hidrogeno adyacente a la fusión de anillo (H-8), la cual es característica de los

colorantes azoicos.21

Figura 23. Espectro de RMN 1H para el intermediario 6 en CDCl3.

El espectro de de RMN 13C en CDCl3 para el intermediario 6 (figura 24), muestra

señales en la región alifática en 20 ppm para los carbonos de los metilos de los

grupos acetato, entre 60 y 72 ppm se observa señales correspondientes a los

carbonos de la glucopiranosa, en 100 ppm se observa el carbono anomérico del

monosacárido. A frecuencia alta se observan los carbonos aromáticos en 118 (C2’),

121.4 (C8), 124.4 (C3), 125.4 (C6), 127.0 (C4’), 127.7 (C4a), 128.3 (C5), 128.5 (C7),

129.2 (C3’), 129.7 (C1), 133.3 (C8a), 139.6 (C4), 144.4 (C1’), 171.6 (C2), y finalmente

en 172 los carbonos del los grupos carbonilos.

O

OAc

AcOAcO

OAc

O

N

N

OH

1''

2''

3''

4''

5''

6''

1'2'

3'

4'5'

6'

1

2

3

44a

8a

5

6

7

8


33

Figura 24. Espectro de RMN 13C para el intermediario 6 en CDCl3.

El espectro de masas de alta ionización por impacto electrónico del intermediario 6

(figura 25), muestra un ion molecular [M].+ de 594 el cual coincide con el peso

molecular, y un pico base de 169 (100%) correspondiente al fragmento de la figura 20

el cual es un ión característico presente en la fragmentación de piranósidos.

O

OAc

AcOAcO

OAc

O

N

N

OH

1''

2''

3''

4''

5''

6''

1'2'

3'

4'5'

6'

1

2

3

44a

8a

5

6

7

8


34

Figura 25. Espectroscopia de masas para el intermediario 6.

El intermediario 6 fue sometido a las condiciones de Zemplen para la remoción de los

grupos acetato generando el glicósido fenilazonaftólico 7 que se ha propuesto como

profármaco.

El espectro de Resonancia Magnética Nuclear de 1H en DMSO-d6 del glicósido

desprotegido parcialmente puro (figura 26) presenta señales a frecuencia baja en 3.4

ppm correspondientes a disolvente deuterado la cual se sobrepone con algunas

señales del carbohidrato. (H-6, H-6’ y H-5), entre 4.4 y 5.4 ppm se observan señales

para los H-1, H-2, H-3 y H-5). Entre 6.97-7.87 ppm se observan 5 señales dobles y 2

señales triples para los hidrógenos de tipo aromático y en 8.60 ppm se observa una

O

OAc

AcOAcO

OAc

O

N

N

OH


35

señal doble asignable al hidrogeno adyacente a la fusión de anillo (H-8), la cual es

característica de los colorantes azoicos.

Figura 26. Espectro de RMN 1H para el glicósido fenilazonaftólico desprotegido 7 en DMSO-d-6.

O

OAc

AcOAcO

OAc

O

N

N

OH

1''

2''

3''

4''

5''

6''

1'2'

3'

4'5'

6'

1

2

3

44a

8a

5

6

7

8


36

Finalmente se llevo a cabo un ensayo de actividad enzimática empleando beta

glucosidasa comercial (from almonds, Sigma 2.1 units/mg de solido).

Con la finalidad de comprobar la unión del colorante fenilazonaftólico con la unidad de

glucopiranosa, considerando que la actividad hidrolítica de la enzima liberaría el

compuesto azoico de la glucopiranosa lo cual podrá ser detectado colorimétricamente

en un espectro uv-visible marca Beckman. Esta prueba consistió en agregar el

glicósido fenilazonaftólico (3 mg) disuelto en metanol en ausencia de la enzima vial (1)

y otro vial conteniendo el glicósido fenilazonaftólico (3mg) disuelto de igual forma en

metanol pero con presencia de β- glicosidasa vial (2). Se colocaron en un baño a

temperatura de 60º C para activación de la enzima, y se analizaron por

espectrofotometría obteniendo los siguientes resultados:

En un espectro de absorbancia para cuantificación de colorimetría (figura 27), se

observan dos curvas, la curva (1) indica la absorbancia para el vial (1), este es en

ausencia de enzima y presenta una absorbancia menor, ya que el color observado era

tenue. Sin embargo, para el vial (2) se muestra una curva con mayor absorbancia

(curva 2), esta muestra una intensificación de color en el vial después del

calentamiento, indicando la actividad enzimática por la aparición de un color naranja

(figura 28), dicha colorimetría se ve incrementada debido a que el profármaco obtenido

7 presenta un enlace N N , el cual da una característica cromofórica al

producto, evidenciando así, la acción de la enzima en el enlace O-glicósidico.


37

Figura 27. Análisis de colorimetría para el glicósido fenilazonaftólico desprotegido 7.

Figura 28. Muestras correspondientes a los viales en actividad enzimática.


38

7. CONCLUSIONES

• Se llevó a cabo la síntesis de acuerdo al esquema propuesto y la

caracterización estructural por RMN de 1H, 13C y espectrometría de masas de

los intermediarios 5 y 6 de los intermediarios y glicósido.

• Se caracterizó el intermediario 4 por difracción de rayos X.

• Se realizó el ensayo enzimático del glicósido fenilazonaftólico para detección

de enlace O - glicosídico por beta glicosidasa, obteniendo resultados

contundentes que afirman la acción de la enzima sobre el enlace O-glicosidico.

• La metodología empleada permitirá el diseño de profármacos glicosídicos de

naturaleza azoica.


39

8. REFERENCIAS. 1. Silverman R.B. The Organic Chemistry of Drug Design and Drug Action. Academic Press. 1992, pp 352 2. Penco S. Chim. In. Millan, 1993, pp 369-373 3. Arcamone F et al. Cancer Chemother. Rep. 1975, 6, pp123-129 4. De Graaf M; Pinedo H.M; Quadir R; Haisma H.J; Boven E; Biochemystri Pharmacol. 2003, 65, pp 1875. 5. Chourasia MK, Jain SK. J Pharm Pharm Sci. (2003) 6, pp 33-66. 6. Barnhart ER. Physicians’ Desk Reference and Oradell, NJ: Medical Economics Co., Inc., 1991, pp 1222-1223. 7. Hoffman BF, Bigger JT Jr. The pharmacological basis of therapeutics, Goodman Gilman A, et. al., eds. Pergamon Press Inc.,1990, pp 814-839. 8. Megges R., Portius H.J., Repke K.R. Pharmazie. 1977 ,32, pp 665. 9. Esen, A. β-glucuronidasa. Biochemistry and Molecular Biology, Am Chem, Soc, 1993. 10. Tietze LF, Lieb, M, Herzig, T, Haunert F and Schuberth I Bioorganic & Medicinal Chemistry (2001) 9, pp 1929-1939. 11. Brito Arias, Marco A. Química de los glicósidos. Instituto Politécnico Nacional, 1999. pp 18-26. 12. Hyo-Kyung Han, and Gordon L. Amidon AAPS PharmSci. 2000; 2 (1). 13. Nolen III H. W, Fedorak R. N, Friend D. R. Biopharmaceutics & Drug Disposition, 1998, 18, pp 681. 14. Brito-Arias M, Synthesis and Characterization of Glycosides Ed Springer 2007, pp 68. 15. Wessel, H. P., Carbohydrate Chemical, 1998,7, pp 263. 16. Azad Khan, A.K., Truelove, S.C. and Aronseq J.K., Br J Clin Pharmacol, 1982, 13, pp 523-528. 17. Brodie BB & Axelrod J. Journal of . Pharmacology, 1948 94, pp 29-38. 18. Wittcoff, Harold A. Reuben G, Bryan. Productos químicos orgânicos industriales. Limusa Noriega editores, 2, pp 458-462. 19. Farmacopea de los Estado Unidos Mexicanos, Edición 7, pp 458-464 20. M. Brito-Arias, D. Cruz- Salazar, E. Molins Acta Cryst. (2207), E63, o539-o360. 21. Webb G.A. Annual Reports on NMR Spectroscopy. Academic Press A.P. 1993,26, pp 247-278


40

9. ANEXOS.


41


42


43


44


45