PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO SENSU MESTRADO EM CIÊNCIAS ODONTOLÓGICAS INTEGRADAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO SENSU MESTRADO EM CIÊNCIAS ODONTOLÓGICAS INTEGRADAS
RENATA SANTOS DE SOUZA MASSONI
Cuiabá 2018
AVALIAÇÃO PERIODONTAL E MICROBIOLÓGICA, EM DIFERENTES TRIMESTRES DA GESTAÇÃO, CORRELACIONADA COM OS NÍVEIS
SÉRICOS DE ESTRADIOL E PROGESTERONA
RENATA SANTOS DE SOUZA MASSONI
AVALIAÇÃO PERIODONTAL E MICROBIOLÓGICA, EM DIFERENTES TRIMESTRES DA GESTAÇÃO, CORRELACIONADA COM OS NÍVEIS SÉRICOS DE ESTRADIOL E PROGESTERONA
Dissertação apresentada à UNIC, como requisito parcial
para a obtenção do título de Mestre em Ciências
Odontológicas Integradas.
Orientadora: Prof.ª Dr.ª Alessandra Nogueira Porto.
Cuiabá
2018
FICHA CATALOGRÁFICA Dados Internacionais para Catalogação na Publicação (CIP)
Bibliotecária Elizabete Luciano /CRB1-2103
M419a Massoni, Renata Santos de Souza.
Avaliação Periodontal e Microbiológica, em Diferentes Trimestres da Gestação,
correlacionada com os Níveis Séricos de Estradiol e Progesterona./ Renata Santos de Souza Massoni.
73p. Inclui Lista de Figuras e Tabelas
Dissertação de Mestrado apresentada à UNIC – Universidade de Cuiabá, como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Ciências Odontológicas Integradas. Área de concentração: Biociências.
Orientador: Profª. Drª.Alessandra Nogueira Porto
1.Doenças Periodontais. 2.Gravidez. 3.Estradiol. 4.Progesterona. CDU 616.314
FICHA CATALOGRÁFICA Dados Internacionais para Catalogação na Publicação (CIP)
Bibliotecária Elizabete Luciano /CRB1-2103
M419a Massoni, Renata Santos de Souza.
Avaliação Periodontal e Microbiológica, em Diferentes Trimestres da Gestação,
correlacionada com os Níveis Séricos de Estradiol e Progesterona./ Renata Santos de Souza Massoni.
73p. Inclui Lista de Figuras e Tabelas
Dissertação de Mestrado apresentada à UNIC – Universidade de Cuiabá, como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Ciências Odontológicas Integradas. Área de concentração: Biociências.
Orientador: Profª. Drª.Alessandra Nogueira Porto
1.Doenças Periodontais. 2.Gravidez. 3.Estradiol. 4.Progesterona. CDU 616.314
FICHA CATALOGRÁFICA Dados Internacionais para Catalogação na Publicação (CIP)
Bibliotecária Elizabete Luciano /CRB1-2103
M419a Massoni, Renata Santos de Souza.
Avaliação Periodontal e Microbiológica, em Diferentes Trimestres da Gestação,
correlacionada com os Níveis Séricos de Estradiol e Progesterona./ Renata Santos de Souza Massoni.
73p. Inclui Lista de Figuras e Tabelas
Dissertação de Mestrado apresentada à UNIC – Universidade de Cuiabá, como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Ciências Odontológicas Integradas. Área de concentração: Biociências.
Orientador: Profª. Drª.Alessandra Nogueira Porto
1.Doenças Periodontais. 2.Gravidez. 3.Estradiol. 4.Progesterona. CDU 616.314
RENATA SANTOS DE SOUZA MASSONI
AVALIAÇÃO PERIODONTAL E MICROBIOLÓGICA, EM DIFERENTES
TRIMESTRES DA GESTAÇÃO, CORRELACIONADA COM OS NÍVEIS
SÉRICOS DE ESTRADIOL E PROGESTERONA
Dissertação apresentada à UNIC, no Mestrado em Ciências Odontológicas
Integradas, área de concentração em Biociências, como requisito parcial para a
obtenção do Título de Mestre conferida pela Banca Examinadora formada pelos
professores:
_________________________________________
Profa. Dra. Alessandra Nogueira Porto
(Orientadora)
UNIC
_________________________________________
Profa. Dra. Andreza Maria Fábio Aranha
UNIC
_________________________________________
Prof. Dr. José Meirelles Filho
UNIC
Cuiabá, 08 de março de 2018
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho aos meus filhos João Lucca e Pedro, frutos do mais sincero
amor; ao meu esposo Adilson, perfeita resposta de Deus às minhas preces; aos
meus pais, perenes apoiadores e fonte de inspiração para os estudos e à tia Celuta,
com eterna gratidão por seu amor.
AGRADECIMENTOS
A Deus que em seu infinito amor me concedeu força de vontade para encarar os desafios e humildade para aprender com eles.
Ao meu esposo por sua (quase) infindável paciência ao longo deste percurso, pela compreensão e apoio durante as dificuldades, mas principalmente por me mostrar todos os dias o que realmente importa em nossas vidas.
Aos meus filhos por terem tolerado os momentos de ausência e a falta de férias, ao João Lucca agradeço a torcida e acompanhamento constante de cada etapa, ao Pedroca agradeço por cada abraço apertado que recebi quando retornava para casa.
Aos meus pais, Renato e Maria Celeste, por terem se tornado pai e mãe dos meus pequenos, por terem cultivado meu o amor pela ciência desde pequena e por nunca medirem esforços para que eu vá mais além.
Aos meus sogros, Ruy e Edy que, enquanto eu estudo, edificam com as próprias mãos nossa casa no Rancho, onde em breve iremos todos gozar do tesouro da convivência familiar e do ar puro da Chapada.
Aos amigos Alice Ludke, Ana Amélia Rosa, Candice Taques, Darlan Nascimento, Gisele Leite, Guilherme Bessa, Paulo Leite, Regina Von Kirchenheim e Renata Teixeira; pela certeza de poder contar com vocês não importa para que, nem o dia, nem a hora.
Aos amigos do Rancho da Chapada que acolheram nossa família e fizeram parte dos raros, mas valiosos momentos de lazer.
Às queridas Locinar Domingas e Josefina Gavazzoni, anjos que cuidam da minha casa, sempre atenciosas aos meus pedidos.
Aos colegas de trabalho, Profa. Denise Abech, Prof. José Meireles Filho, Prof. Arestides Nachi, Prof.a Cristina Pizarro, Prof. Pedro Crotti, Prof.a Gisley, Prof.a Rosa e a querida Beth, pelo imensurável apoio durante o curso, sem o qual este período dedicado aos estudos não seria viável.
Aos colegas de curso: Ana Carolina, Andrei, Cláudio, Deise, Keylla, Layssa, Lauro, Lya Carla, Simony e Rodrigo; por teremos embarcado juntos nesta jornada, partilhando bons e maus momentos, mas principalmente ensinando uns aos outros.
À minha Orientadora Prof.a Dr.a Alessandra Nogueira Porto, pelas inúmeras palavras tranquilizadoras e pelo empenho em tornar viável este projeto. Agradeço por ter encarado o desafio de orientar uma “não dentista” ampliando meus horizontes.
À Prof.a Ms.a Fernanda Zanol por sua contribuição fundamental, mas principalmente por termos construído laços de amizade que transcendem o ambiente acadêmico.
À Prof.a Dr.a Evanice pelo convite e incentivo inicial para a realização do curso de mestrado, resgatando meu amor e interesse pela odontologia.
À Andressa Ricci pela compreensão e dedicação ao projeto durante o momento mais difícil e ao Heitor pela prestação de auxílio mesmo abrindo mão de seus dias de folga.
Às pacientes que aceitaram participar desta empreitada, doando seu tempo e seu próprio “EU” em benefício da ciência, a elas os meus mais sinceros agradecimentos.
Aos Professores Doutores do Mestrado em Ciências Odontológicas Integradas da Universidade de Cuiabá – UNIC, Alex Semenoff Segundo, Alexandre Meireles Borba, Álvaro Henrique Borges, Andreza Maria Fábio Aranha, Cynthia Rodrigues de Araújo Estrela, Fábio Luís Miranda Pedro, Luiz Evaristo Ricci Volpato, Mateus Rodrigues Tonetto, Matheus Coelho Bandéca, Orlando Aguirre Guedes e Tereza A. Delle Vedove Semenoff.
Ao Coordenador do Mestrado em Ciências Odontológicas Integradas da Universidade de Cuiabá – UNIC, Prof. Dr. Álvaro Henrique Borges.
Ao Diretor da Faculdade de Odontologia da Universidade de Cuiabá – UNIC, Fábio Luís Miranda Pedro.
Ao Reitor da Universidade de Cuiabá – UNIC, Fernando Ciríaco Dias Neto.
Ao Pró Reitor Acadêmico da Universidade de Cuiabá – UNIC, José Cláudio Perecin.
Ao Diretor de Pós-Graduação Stricto Sensu da Kroton, Prof. Dr. Helio Suguimoto.
À Coordenadora de Pesquisa e Pós-Graduação - Stricto Sensu da Universidade de Cuiabá – UNIC, Lucélia de Oliveira Santos.
À secretaria do Programa de Mestrado/Doutorado da Universidade de Cuiabá nas pessoas de Jonielson Souza Dias e Ana Rita Borssari.
“Ainda que eu falasse as línguas dos
homens e dos anjos, e não tivesse amor, seria como o metal que soa ou como o
címbalo que retine. E ainda que tivesse o dom de profecia e conhecesse todos os
mistérios e toda a ciência, ainda que tivesse toda fé, de maneira tal que
transportasse os montes, e não tivesse amor, eu nada seria”
1 Coríntios 13:1-2
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Níveis de estradiol e progesterona nas diferentes fases do ciclo menstrual, durante a gestação e menopausa, adaptada a partir de Speroff, Glass e Kase, 1995.
31
Tabela 2 – Sequência de primers e sondas de DNA para cada um dos microrganismos estudados.
38
Tabela 3 – Descrição de dados epidemiológicos - frequência absoluta e relativa, média e desvio padrão (teste Qui-quadrado; p<0,05).
41
Tabela 4– Comparação do diagnóstico clínico periodontal nos grupos (teste Qui-quadrado; p<0,05).
42
Tabela 5– Comparação dos parâmetros clínicos de avaliação periodontal nos grupos (teste de ANOVA; p<0,05).
42
Tabela 6 – Quantificação de periodontopatógenos, total e por espécie, nos diferentes grupos (teste de Kruskal-Wallis; p<0,05).
43
Tabela 7 – Associação entre quantificação bacteriana total e diagnóstico clínico periodontal (teste ANOVA; p<0,05).
44
Tabela 8 – Associação entre a quantidade de Tf e o diagnóstico clínico periodontal (teste ANOVA; p<0,05).
45
Tabela 9 –
Associação entre diagnóstico clínico e os níveis séricos de estradiol e progesterona (teste de ANOVA; p<0,05).
46
Tabela 10 –
Correlação dos níveis séricos de estradiol e progesterona com a quantificação bacteriana por espécie, nos diferentes grupos (Correlação de Pearson; p<0,05).
47
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 – Figura demonstrativa dos complexos microbianos de Socransky et al., 1998.
22
LISTA DE ABREVIATURAS
SUS Sistema Único de Saúde 17
OMS Organização Mundial de Saúde 17
DAC Doenças ateroscleróticas cardiovasculares 18
qPCR Reação em cadeia da polimerase em tempo real 19
Fn Fusobacterium nucleatum 22
NIC Nível de inserção clínica 24
PS Profundidade de sondagem 24
IPV Índice de placa visível 25
ISG Índice de sangramento gengival 25
DNA Ácido desoxirribonucleico 26
TBRAS Thiobarbituric acid-reactive substances 27
FISH Fluorescence in situ hybridization 28
LDL Low density lipoprotein 29
LH Hormônio luteinizante 30
ng/mL Nanograma por mililitro 30
pg/mL Picograma por mililitro 31
MT Mato Grosso (estado) 34
NIH National Institute of Health 34
ABEP Associação Brasileira de Empresas de Pesquisa 34
Nº Número 34
Marca registrada 35
RJ Rio de Janeiro (estado) 35
Mfg Manufacturing 35
Co Company 35
Inc Incorporation 35
IL Illinois (estado) 35
EUA Estados Unidos da América 35
CA Califórnia (estado) 36
4PLC Curva logística de quatro parâmetros ponderada 36
nmol/mL Nanomol por mililitro 36
pmol/mL Picomol por mililitro 36
ºC Graus Celsius 36
mL Mililitro 37
L Microlitro 37
rpm Rotações por minuto 37
LTDA Limitada 38
SP São Paulo (estado) 38
NCBI National Center for Biotechnology Information 38
Aa Aggregatibacter actinomycetemcomitans 38
Pg Porphyromonas gingivalis 38
Tf Tannerella forsythia 38
So Streptococcus oralis 38
Un Universal 38
BLAST Basic Local Alignment Search Tool 38
nm Nanômetro 39
g/L Micrograma por microlitro 39
CT Cycle Treshold 39
SPSS Statistical package for the social sciences 39
EPM Erro padrão da média 40
K Kappa 40
ANOVA Análise de variância 40
RESUMO
Objetivo: identificar quantitativa e qualitativamente a flora subgengival de gestantes
em diferentes trimestres, comparadas com mulheres fora do ciclo grávido-puerperal;
avaliando as correlações entre características epidemiológicas, diagnóstico clínico,
achados microbiológicos e níveis de estradiol e progesterona. Metodologia: foram
avaliadas 52 gestantes, divididas em 3 grupos, conforme o trimestre gestacional e 15
pacientes não gestantes, sem uso de contraceptivos hormonais, representando o
grupo controle. A avaliação clínica periodontal registrou o índice de placa visível (IPV),
índice de sangramento gengival (ISG), profundidade de sondagem (PS) e o nível de
inserção clínica (NIC). Amostras do biofilme subgengival foram processadas pela
técnica de qPCR e os níveis séricos de estradiol e progesterona avaliados por
quimioluminescência. Resultados: O diagnóstico clínico durante a gestação se
correlacionou com a contagem bacteriana total, sendo identificada uma maior
prevalência de Tannerella forsythia (Tf) no primeiro trimestre da gravidez, havendo
correlação deste periodontopatógeno com diagnóstico de gengivite entre as
gestantes. Porphyromonas gingivalis (Pg) apresentou correlação positiva com os
níveis de progesterona no primeiro trimestre. O estudo apontou ainda alta prevalência
de periodontopatógenos nesta população. Conclusão: o diagnóstico clínico na
gestação se correlacionou positivamente com a quantidade de bactérias, não havendo
influência dos níveis hormonais ou dos fatores epidemiológicos avaliados. A presença
de Tf favoreceu a ocorrência de gengivite durante a gestação e os níveis de
progesterona no primeiro trimestre beneficiaram o crescimento de Pg. A alta
prevalência de bactérias agressivas ao periodonto indica a necessidade de
implementação de estratégias preventivas nesta população.
Palavras – chaves: doenças periodontais, estradiol, gravidez, progesterona,
qPCR.
ABSTRACT
Objective: to identify quantitatively and qualitatively the subgingival flora of pregnant
women in different trimesters, compared to women outside the pregnant-puerperal
cycle; evaluating the correlations between epidemiological characteristics, clinical
diagnosis, microbiological findings and levels of estradiol and progesterone.
Methodology: 52 pregnant women, divided into 3 groups, were evaluated according to
the gestational trimester and 15 non-pregnant patients, without hormonal
contraceptives, representing the control group. The periodontal clinical evaluation
recorded plaque index (PI), bleeding on probe (BOP), probing depth (PD) and clinical
attachment level (CAL). Subgingival biofilm samples were processed by the qPCR
technique and the serum levels of estradiol and progesterone were evaluated by
chemiluminescence. Results: The clinical diagnosis during gestation was correlated
with the total bacterial count. A higher prevalence of Tannerella forsythia (Tf) was
noticed in the first trimester of pregnancy and was correlated with gingivitis among
pregnant women. Porphyromonas gingivalis (Pg) showed a positive correlation with
progesterone levels in the first trimester. The study also pointed out a high prevalence
of periodontopathogens in this population. Conclusion: the clinical diagnosis in
gestation was positively correlated with the amount of bacteria, without influence of the
hormonal levels or the epidemiological factors evaluated. The presence of Tf favored
the occurrence of gingivitis during pregnancy and the progesterone levels in the first
trimester benefited the growth of Pg. The high prevalence of aggressive bacteria in the
periodontium indicates the need to implement preventive strategies in this population.
Key Words: estradiol, periodontal diseases, pregnancy, progesterone, qPCR
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 17
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Biofilme bacteriano
2.2 Doença periodontal
2.3 Doença periodontal X gestação
2.4 Estradiol & progesterona
2.5 Influência dos hormônios esteroides no periodonto
21
23
25
29
31
3 PROPOSIÇÃO
3.1 Geral
3.2 Específicas
33
33
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 População
4.2 Exame clínico periodontal
4.3 Avaliação dos níveis séricos de estradiol e progesterona
4.4 Coleta microbiológica
4.5 Extração e quantificação do DNA
4.6 Confecção dos primers, detecção e quantificação microbiana (qPCR)
4.7 Análise estatística
34
35
36
36
37
38
39
5 RESULTADOS
5.1 População estudada
5.2 Resultados clínicos
5.3 Resultados microbiológicos
5.4 Resultados hormonais
41
42
43
46
6 DISCUSSÃO 48
7 CONCLUSÕES 56
8 REFERÊNCIAS 57
ANEXOS 65
17
1 INTRODUÇÃO
O Sistema Único de Saúde (SUS), criado em 1988, apresenta como pilares
fundamentais os princípios da universalidade, integralidade e equidade da atenção
em saúde (1). Estes pilares incentivam a substituição da lógica curativa até então
vigente, por um modelo mais afeito aos princípios de promoção de saúde e qualidade
de vida; trazendo novos paradigmas para nortear as políticas de saúde e a conduta
dos profissionais envolvidos na assistência atualmente. Um dos focos de atenção
envolve o atendimento adequado e humanizado do período gestacional, rebatendo-
se o conceito de que saúde corresponda à ausência de doenças, mas valorizando a
qualidade de vida (1,2).
Sob esta mesma perspectiva, a Organização Mundial da Saúde (OMS),
através de seu Programa Global de Saúde Oral, destacou a importância da saúde
bucal como fator determinante para que os indivíduos tenham uma boa qualidade de
vida (3). A realização de avaliações e higienizações profissionais regulares são
componentes chave para esta conquista, já estando estabelecido que estes cuidados
são seguros, inclusive durante a gravidez, devendo ser recomendados para melhorar
a saúde bucal e geral da mulher como um todo (4).
O atendimento odontológico pré-natal além de melhorar a saúde bucal
materna, possui o benefício adicional de atuar sobre pacientes motivadas a adotar
comportamentos saudáveis que poderiam ser transmitidos à prole (4,5). Dentro deste
contexto, há a necessidade de um atendimento multidisciplinar para a manutenção
integral da saúde durante a gestação. Entretanto, mesmo em países desenvolvidos o
atendimento odontológico é um grande problema de saúde pública; nos Estados
Unidos um extenso levantamento, envolvendo 35.267 mulheres, demonstrou que 60%
delas não realizaram procedimentos de higienização profissional de seus dentes
durante a gravidez (4).
Apesar de ser infrequente o atendimento odontológico rotineiro no período
gestacional, percebe-se clinicamente que a gravidez, através de alterações
fisiológicas, afeta a saúde bucal. Um aumento gradual da gengivite foi observado em
diversos trabalhos, sendo interrogado o papel dos níveis ascendentes dos esteroides
sexuais frente a estas manifestações clínicas e ao biofilme bacteriano (6–10).
18
O controle inadequado do biofilme bucal, associado às características
evolutivas do mesmo, têm importância capital na progressão das doenças orais, mas
em sua complexidade, a doença periodontal influencia e sofre a influência de diversos
fatores sistêmicos. Evidências apontam para a contribuição da periodontite nas
doenças cardiovasculares ateroscleróticas (DAC), pois a translocação da microbiota
oral pode induzir, direta ou indiretamente, inflamação sistêmica relacionada ao
desenvolvimento da placa aterosclerótica, gerando aumento do risco para a doença.
O tratamento periodontal, por sua vez, promove redução da inflamação sistêmica, mas
seus efeitos na prevenção primária das DAC ainda são desconhecidos (11). Por outro
lado, o hábito do tabagismo é um grave fator de risco para a doença periodontal, sendo
responsável por 41,9% dos casos de periodontite em adultos, com efeitos persistentes
mesmo após a interrupção do hábito de fumar (12). Dentre as influências hormonais,
além das alterações relacionadas aos esteroides sexuais, podemos citar a relação
entre periodontite e diabetes, demonstrada na metanálise realizada por Papanou,
1996 (13), que evidenciou uma condição periodontal mais severa em indivíduos
portadores desta endocrinopatia.
O caráter transitório das alterações bucais encontradas no período
gestacional tem incentivado a realização de pesquisas com o objetivo de investigar a
relação entre estes achados e as variações hormonais fisiológicas da gravidez (6,8,14).
A produção de hormônios esteroidais pela placenta eleva progressivamente os níveis
de estrogênios e progesterona sendo que os estrogênios alcançam de forma
progressiva valores 1000 vezes acima dos níveis pré-gravídicos, enquanto a
progesterona atinge seu pico poucas semanas antes do parto (15). Ambos são
essenciais para a manutenção da gravidez e afetam os diversos sistemas orgânicos
promovendo alterações que viabilizem o desenvolvimento fetal (16).
São quatro os mecanismos relatados na literatura que possivelmente
contribuem com a exacerbação da inflamação gengival na presença de altos níveis
de estradiol e progesterona (8). O primeiro seria o efeito vasodilatador dos estrogênios
gerando aumento do aporte sanguíneo ao tecido gengival, com consequente
exacerbação da resposta inflamatória; também são apontadas: supressão do sistema
imune, alterações quantitativas e qualitativas da flora supra e subgengival, além de
alterações fenotípicas da gengiva. Estes relatos buscaram esclarecer a influência dos
19
esteroides sexuais na interação entre biofilme e hospedeiro, entretanto, ainda existe
um longo caminho a ser percorrido neste sentido (6,8,17,18).
Este é um assunto de abordagem multidisciplinar, pois o aparecimento de
resposta inflamatória exuberante, traduzida clinicamente como gengivite, pode
progredir para formas mais avançadas da doença, expressas pela periodontite; sendo
tal evolução relacionada com a ocorrência de partos prematuros e/ou nascimentos de
baixo peso por diversos pesquisadores (16,19,20). O levantamento realizado pela OMS
em 2010, afirma que a prematuridade de forma geral é responsabilizada por 35% das
mortes neonatais. Este mesmo estudo estima que aproximadamente 14,9 milhões de
bebês nascem prematuramente, o que corresponde há 11,1% de todos os partos no
mundo (21). Estes números instigam um pronto reconhecimento e a elaboração de
estratégias de combate contra todo e qualquer fator de risco modificável que possa
contribuir com tal ocorrência, o que inclui uma averiguação minuciosa do perfil bucal
das gestantes.
Esta é uma tarefa bastante difícil, pois, as amostras de biofilme bucal
contemplam uma diversidade de espécies bacteriana muito ampla, mais de 500 já
foram reconhecidas e com a evolução das técnicas de pesquisa este número
progrediu. A microscopia ótica, microscopia eletrônica e os métodos de cultura
bacteriana, tem perdido espaço para estudos que aplicam técnicas de biologia
molecular. Estes superam as dificuldades de cultivo de determinados microrganismos,
tendo por vantagens a especificidade, sensibilidade e capacidade de quantificar as
espécies do biofilme (22).
Levando-se em consideração que a doença periodontal tem sido
amplamente pesquisada, em virtude de sua capacidade de gerar ou interferir em
nascimentos prematuros e/ou de baixo peso, justifica-se a busca de dados que
possam aprimorar o conhecimento sobre estas interações. A proposta do presente
estudo consiste em investigar as condições periodontais clínicas e microbiológicas
nos diferentes trimestres da gestação, comparando estes dados com pacientes fora
do ciclo grávido puerperal.
Propusemos a combinação de rigorosos critérios clínicos para identificar a
presença da doença periodontal, avaliando sua gravidade e correlacionando estes
achados com a identificação e quantificação dos principais elementos patogênicos da
flora bacteriana subgengival, através de PCR em tempo real (qPCR), em paralelo com
20
a dosagem dos níveis séricos de estradiol e progesterona. A hipótese nula testada
verificou se ocorreram modificações clínicas e/ou microbiológicas relacionadas à
gestação e à elevação dos hormônios esteroides avaliados.
21
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 BIOFILME BACTERIANO
O termo biofilme caracteriza uma forma de aglomeração bacteriana com
características peculiares, contendo três componentes: as bactérias, uma superfície
para fixação e um fluido circulante. Este último tem o papel de carrear nutrientes e
produtos de excreção, realizando também o transporte de células inteiras para novos
locais de colonização. Desta forma o biofilme é um ecossistema que inclui
constituintes orgânicos e inorgânicos no qual uma matriz de substâncias poliméricas
extracelulares envolve as bactérias, fornecendo a elas um ambiente no qual múltiplas
espécies podem interagir de forma sinérgica ou competitiva, refletindo a mútua
interação entre as espécies hospedeiras e colonizadoras (22).
Durante o desenvolvimento do biofilme, inicialmente glicoproteínas e
anticorpos salivares criam uma película condicionante sobre a superfície dentária que
viabiliza a adesão das bactérias. A capacidade de adesão, entretanto, varia entre as
diferentes espécies sendo feita primariamente por cocos Gram positivos anaeróbios
facultativos, sendo o principal representante o Streptococcus sanguis. Na fase
seguinte estão envolvidos os bastonetes Gram positivos, como o Actinomyces spp.
Usufruindo dos receptores fornecidos por estes dois grupos de colonizadores iniciais,
a seguir, aderem-se ao biofilme microrganismos Gram negativos, sendo os mais
comumente associados à doença periodontal a Porphyromonas gingivalis, Prevotella
intermedia, Bacteroides forsythus, Campylobacter rectus e Aggregatibacter
actinomycetemcomitans, assim como os treponemas (23).
Socransky et al., 1998 (24) e Socransky e Haffajee, 2002 (25) descreveram
seis complexos microbianos que se instalam de forma evolutiva no biofilme
subgengival durante a história natural de evolução das doenças periodontais. Os
complexos amarelo, azul, verde e violeta são os colonizadores iniciais, capazes de
aderir a superfície dental, mas que não se relacionam com a doença periodontal.
Entretanto, estes agentes fornecem os receptores e condições ecológicas
necessárias para a implantação das bactérias do complexo laranja envolvidas na
patogênese das doenças periodontais.
22
FIGURA 1 – Complexos microbianos, Socransky et al. 1998 (24).
Zee et al.,1996 (26) realizaram estudo avaliando dois grupos de indivíduos,
classificados em grupo rápido ou lento, conforme a velocidade de acúmulo do biofilme.
Uma única amostra de placa foi retirada de cinco indivíduos do grupo rápido e em seis
do grupo lento nos dias 1, 3, 7 e 14. As bactérias Gram-positivas predominaram em
ambos os grupos, com aumento das espécies Gram-negativas ao longo do tempo,
sendo encontradas na proporção de 38% no grupo rápido, contra 17% no grupo lento,
no 14º dia. Houve diminuição da proporção de cocos gram-positivos de 50-60% no dia
1 para <15% no dia 14, acompanhada por um aumento na proporção de Actinomyces
sp. e bacilos Gram-negativos. Estas modificações refletiram a evolução de um
ambiente inicialmente aeróbio que progressivamente evoluiu para anaerobiose,
resultado do processo de amadurecimento do biofilme.
O Fusobacterium nucleatum (Fn) parece ser essencial durante este
processo de maturação, estando presente nas colonizações supragengivais e
23
subgengivais. Esta bactéria garante diversidade, pois, os colonizadores tardios em
geral não interagem com a flora inicial do biofilme e nem com outras bactérias de
ingresso tardio, mas agregam-se ao Fn (27). Após a instalação do quadro de gengivite,
foi documentado que as espécies dos complexos vermelho e laranja são mais
prevalentes e encontradas em maior número (22). Os trabalhos de Cortelli e Cortelli,
2003 (28), Mayanagi et al., 2004 (29) e posteriormente a revisão realizada por How et
al., 2016 (30) identificaram a Porphyromonas gingivalis como um dos principais agentes
etiológicos das periodontites crônicas, enquanto que nas periodontites agressivas a
presença do Aggregatibacter actinomycetemcomitans foi observada em 72% dos
casos (31).
Do ponto de vista estrutural, a região supragengival apresenta o dente
como única superfície para colonização pelo biofilme, enquanto que na área
subgengival estão presentes as superfícies dentárias e o epitélio do sulco gengival ou
bolsa periodontal. Outra diferença ocorre devido ao fluido que banha o biofilme, sendo
constituído pela saliva, na região supragengival, e pelo fluido crevicular na área
subgengival. A mudança de dois componentes do biofilme afeta a composição do
terceiro, constituído pelas bactérias em si. Em indivíduos saudáveis, a contagem
média da maioria das espécies é maior na região supragengival do que na
subgengival, havendo aumento do carga bacteriana em ambos os sítios nos
portadores de periodontite, nestes últimos notam-se taxas mais elevadas de
microrganismos dos complexos laranja e vermelho no biofilme subgengival (22).
2.2 DOENÇA PERIODONTAL
De acordo com Armitage, 2004 (32), o status de saúde periodontal pode se
alterar mediante a presença de gengivite ou de periodontite. Ambas estão mais
frequentemente relacionadas à presença do biofilme bacteriano, mas a etiologia
multifatorial da doença periodontal envolve determinantes relacionados ao
hospedeiro, tais como hereditariedade e tabagismo, podendo se manifestar em
consequência de diversas doenças sistêmicas, particularmente as que afetam o
sistema imunológico, ou que de alguma forma aumentam a sensibilidade local
mediante alterações inflamatórias com degradação tecidual concomitante.
24
Por outro lado, um pequeno grupo de bactérias predominantemente gram-
negativas, anaeróbias ou microaerófilas que colonizam a área subgengival, tem sido
regularmente associadas às patologias periodontais (33). O conceito de gengivite
induzida pelo biofilme reflete a presença de inflamação gengival sem perda do tecido
conjuntivo, enquanto que o quadro de periodontite, apresenta maior severidade. Nesta
segunda situação detecta-se a perda de tecido conectivo e do osso alveolar,
observando-se a migração apical da inserção epitelial nas superfícies radiculares (32).
Nas periodontites crônicas, a Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia e o
Treponema denticola, pertencentes ao complexo vermelho de Socransky, se
estabelecem levando a cronificação da doença (24,25).
Uma classificação sistematizada e de fácil entendimento por parte dos
profissionais é essencial para a correta identificação e manejo de qualquer afecção,
sendo assim, em 1999 foi criado um comitê, presidido por Gary Armitage, que revisou
e atualizou sistema de classificação das doenças periodontais. O escopo consistia em
viabilizar uma melhor identificação da etiologia e patogênese destas doenças, de
forma a garantir maior sucesso nas ações terapêuticas; baseando-se na identificação
do tipo de doença periodontal, gravidade das alterações detectadas e na extensão do
problema (34).
No caso das periodontites a classificação da gravidade da doença foi
diretamente relacionada com o nível de inserção clínica (NIC), sendo considerada
doença leve enquanto o NIC permanece entre 1±2mm, moderada para NIC variando
entre 3±4 mm e severa quando o NIC for maior ou igual a 5 mm. O quadro é
considerado localizado quando compromete menos de 30% dos dentes e
generalizado se afetar uma proporção superior a esta (32).
A profundidade de sondagem (PS) não foi elencada como critério primário
para categorizar a intensidade da doença, porque a altura da margem gengival pode
se alterar, por exemplo, durante os processos inflamatórios com edema gengival.
Nesta situação a margem encontrar-se-ia e posição mais coronal, o que afetaria o
resultado de sua aferição. Ainda assim, este parâmetro permanece útil na avaliação
das doenças periodontais, pois é capaz de discriminar a presença de sítios que
apresentem bolsas periodontais, habitat usual das bactérias subgengivais
patogênicas (32).
25
Outros critérios adotados durante a investigação das doenças periodontais
incluem o índice de placa visível (IPV) e o índice de sangramento gengival (ISG). O
IPV reflete o efeito dos procedimentos diários de higiene bucal, enquanto que o
sangramento durante a sondagem é um dos sinais mais precoces para o diagnóstico
de gengivite. Trata-se de um exame de fácil realização que produz resultado objetivo
e de fácil verificação. A ausência de sangramento tem sido correlacionada com baixo
risco para a perda de inserção clínica futura, enquanto que a sua ocorrência reflete
lesão inflamatória do epitélio e tecido conjuntivo, em geral antecedendo as alterações
de coloração nas gengivas. Sua detecção permite ao clínico indicar a instituição de
tratamentos em fase iniciais da doença evitando a progressão do quadro (35).
2.3 DOENÇA PERIODONTAL X GESTAÇÃO
Dados levantados pela pesquisa pós-parto do Sistema de Monitoramento
de Avaliação de Risco de Gravidez, realizada em dez estados americanos e
envolvendo 35.267 mulheres, retratam a carência de atendimento odontológico
durante o pré-natal. O levantamento evidenciou que, durante sua última gravidez, 56%
das gestantes não receberam cuidados dentários e 60% não realizaram profilaxia
profissional. Apenas 24% das mulheres negras e 25% das hispânicas foram
examinadas, enquanto que entre as pacientes brancas, 44% receberam atendimento
(36).
No Brasil, um estudo observacional realizado em 2012, entrevistou 200
pacientes com filhos de até 5 anos de idade. Não houve atendimento odontológico
durante a gestação em 57% delas e a maioria (88,84%) alegou não ter necessitado
de tratamento (37). Entretanto, mesmo na ausência de sintomas, a American Dental
Association recomenda que o intervalo de visitas para atendimento odontológico
ocorra a cada seis meses e que tais cuidados devem se manter durante o período
gestacional (4).
Embora a gestação seja um acontecimento fisiológico, ela envolve uma
série de modificações adaptativas no organismo materno. Tais alterações orgânicas
impõem aos profissionais de saúde a aquisição de conhecimentos que permitam uma
abordagem diferenciada. As alterações gengivais durante a gravidez foram descritas
pela primeira vez por volta de 1800 (17). A exacerbação da inflamação gengival,
26
observada em particular entre o 2º e 3º trimestres, já foi clínica e histologicamente
bem documentada (6–8,10,38) e diversos autores têm relatado a hipótese de que a
significativa elevação dos níveis de hormônios esteroides durante a gestação,
promoveria aumento da resposta inflamatória gengival (6,8,39).
No início da década de oitenta, Kornman e Loesche, 1980 (6) foram os
pioneiros na investigação microbiológica da flora subgengival em mulheres grávidas,
utilizando a caraterização de colônias em culturas anaeróbias cultivadas em meios
seletivos e não seletivos. Os autores dosaram a incorporação de esteroides,
marcados com Carbono-14, pelos microrganismos do biofilme bacteriano, com
objetivo de traçar um paralelo entre os níveis hormonais das gestantes e sua flora
periodontal. Foi observada, ao longo da gestação, alteração da flora subgengival, com
o desenvolvimento de um perfil mais anaeróbio. Os microrganismos anaeróbios
atingiram uma proporção de 39% no segundo trimestre, superando as taxas
previamente observadas nas gengivites crônicas, de aproximadamente 26-29% (40,41)
e os 20% observados na gengivite experimental (42). Concomitantemente, os níveis
séricos de estradiol e progesterona mostraram, até o final da gravidez, uma correlação
positiva com os níveis de B. melaninogenicus ss. Intermedius (posteriormente
denominado Prevotella nigrescens).
Mais recentemente, uma revisão de literatura listou as evidências que a
ciência havia encontrado até então a respeito da influência da variação dos hormônios
sexuais femininos sobre a placa bacteriana. Foram elencadas pesquisas que
avaliaram diferentes etapas da vida, incluindo a adolescência, gravidez e climatério.
O estudo considerou que a metodologia utilizada para a investigação destes tópicos
foi muito variada, o que poderia contribuir para a falta de homogeneidade das
conclusões. Com a evolução das técnicas de biologia molecular, a precisão na
quantificação e determinação dos agentes bacterianos determinou avanços em
relação aos estudos previamente realizados com a utilização de culturas. As bactérias
periodontais, caracteristicamente anaeróbias, são sensíveis e de difícil cultivo,
problema superado pelas técnicas que utilizam o estudo de DNA, mas que por outro
lado não são capazes de diferenciar os organismos viáveis daqueles já inviáveis. O
autor ainda interroga se os esteroides exercem influencia direta sobre os
microrganismos periodontais ou se a reação inflamatória, exacerbada em sua
presença, é que influencia o ecossistema (14).
27
Partindo da relação positiva entre níveis hormonais e inflamação, Gumus
et al., 2015 (43) conduziu pesquisa com o objetivo de avaliar a associação dos
parâmetros clínicos de inflamação periodontal e gravidade da doença com os níveis
salivares de marcadores de estresse oxidativo. O estudo envolveu 115 gestantes,
reavaliadas 6 meses após o parto e 72 mulheres não grávidas. O aumento do stress
oxidativo durante a gestação foi evidenciado pela elevação na concentração de
TBRAS (thiobarbituric acid-reactive substances). No período puerperal, de forma
contrária, elevaram-se as substâncias antioxidantes, mas não foi encontrada
associação da doença periodontal com estes marcadores.
Além de alterações na resposta inflamatória e no sistema imunológico,
outros mecanismos potenciais têm sido propostos na tentativa de esclarecer a relação
entre as bactérias patogênicas periodontais e seu papel durante a gravidez. A
contribuição dos esteroides sexuais femininos neste microbioma envolve teorias que
incluem alterações da permeabilidade vascular e das características do biofilme
subgengival (7). No entanto, existem poucos dados sobre a composição da microbiota
subgengival durante a gravidez e acredita-se que a variação hormonal possa
promover aumento da patogenicidade (6,9).
Com a persistência de lacunas a respeito da interação entre microbiota
periodontal e gestação, Carrillo-de-Albornoz et al., 2009 (8) desenvolveu um estudo
longitudinal incluindo avaliação clínica periodontal, cultura de amostra microbiológica
e dosagem dos níveis salivares de estradiol e progesterona. Os autores detectaram
que concomitantemente à piora clínica, o perfil bacteriano das gestantes tornava-se
realmente mais patogênico. O aumento nos níveis de progesterona e estradiol
influenciou positivamente a proporção de Porphyromonas gingivalis encontradas nas
amostras. Esta bactéria, assim como Prevotella intermedia foram associadas com
aumento do índice gengival (8).
Xie et al., 2013 (44), também descrevem alterações clínicas, reportando uma
redução do ISG de 6,5% durante a gestação, para 4,3% (± 5,3%) 22 meses após o
parto (p <0,05). Estes autores observaram redução da PS e do NIC no mesmo
intervalo, relatando ainda que a presença de periodontite diminuiu de 66,7% para
33,3% (p <0,01). Jensen, Liljemark e Bloomquist (45), por sua vez, observaram que
pacientes portadoras de gengivite e/ou periodontite apresentaram piora no período
28
gestacional e Tilakaratne et al., 2000 (46) relatou aumento das medidas clínicas de
inflamação durante a gravidez, sem perda de inserção.
Também no Brasil foram conduzidos, em gestantes, alguns trabalhos
avaliando as condições gengivais, perfil bacteriano e associação destas variáveis com
desfechos adversos na gravidez. Machado et al., 2012 (47) realizaram o primeiro
estudo utilizando a técnica de fluorescence in situ hybridization (FISH) para avaliação
da microbiologia periodontal durante a gravidez. Foram comparadas 20 gestantes no
segundo trimestre e 20 mulheres não grávidas com o objetivo de investigar diferenças
quantitativas e qualitativas de 8 periodontopatógenos. Não houve diferença entre os
grupos, sendo observado um nível mais elevado Prevotella intermedia entre as
gestantes, porém sem diferença estatística. A pesquisa apontou mínima influência das
variações hormonais na colonização e crescimento dos periodontopatógenos
estudados (47).
Lima et al., 2013 (48) identificou as bactérias pertencentes ao complexo
vermelho de Socransky em 33,3% das gestantes com periodontite, contra 3,7% no
grupo de gestantes com gengivite. Borgo et al.,2014 (9), por sua vez, observou piora
dos parâmetros clínicos entre o segundo e terceiro trimestre. Os autores identificaram
ISG de 52% e níveis mais elevados de Aggregatibacter actinomycetemcomitans neste
período, além de gengivite severa no terceiro trimestre. Esta informação é relevante
para a instituição de tratamentos dadas as características de maior resistência desta
bactéria, bem como devido ao seu envolvimento em casos de periodontite agressiva
(9,49).
Mais uma vez utilizando a técnica de fluorescence in situ hybridization
(FISH), Machado et al., 2016 (50) descreveram estudo longitudinal avaliando pacientes
entre 14-24 semanas de gravidez, no período puerperal com 48h e novamente 8
semanas após o parto. Não houve diferença estatística entre os parâmetros clínicos
nas três avaliações, assim como na contagem bacteriana total durante a gravidez e
após o parto. Observou-se, todavia, redução significativa na contagem de Prevotella
nigrescens comparando o segundo trimestre gestacional com as duas avaliações pós-
parto. O estudo faz ressalva ao pequeno tamanho da amostra.
Ao longo dos anos, além de investigar a piora clínica dos sinais indicativos
de gengivite durante a gravidez, os estudos começaram a apontar uma provável
correlação entre a doença periodontal com alguns desfechos adversos na gravidez.
29
Surgiram evidências de que a deterioração do status periodontal acarretava aumento
na incidência de trabalho de parto prematuro e de baixo peso ao nascer (51).
Em uma pesquisa realizada com 189 puérperas africanas, nas primeiras
24h após o parto, demonstrou correlação entre a presença de inflamação gengival e
a ocorrência de trabalho de parto prematuro e de baixo peso ao nascer. A associação
entre estes desfechos e a presença de doença periodontal ocorria quando eram
detectadas na mesma paciente espécies diferentes de bactérias
periodontopatogenicas, em associação de dois ou mais tipos, aparentemente sendo
necessária a presença do Aggregatibacter actinomycetemcomitans (49).
Estudos de intervenção clínica, por sua vez, demonstraram que a adoção
de raspagem e alisamento radicular durante a gestação se mostrava eficaz na
redução do número de bactérias periodontais patogênicas. Entretanto, a confirmação
da correlação entre esta infecção e os desfechos obstétricos encontrou resultados
conflitantes em relação à redução da incidência de trabalho de parto prematuro após
a realização de terapia periodontal (19,52).
Embora ainda não esteja clara a associação entre a doença periodontal e
os desfechos obstétrico, estudos inicialmente conduzidos em animais demonstraram
a capacidade de translocação das bactérias periodontais para a cavidade amniótica
(53). Este fato foi posteriormente confirmado em humanos, com o agravante de que
tais bactérias foram imputadas como responsáveis por casos de óbito fetal em pelo
menos dois episódios, sendo um em feto prematuro envolvendo a translocação de
Bergeyella sp e outro em feto a termo, com 39 semanas de gestação, envolvendo o
Fusobacterium nucleatum. Neste último a bactéria isolada do pulmão e do estômago
do natimorto não foi encontrada na placa supragengival, microflora vaginal ou retal,
correspondendo apenas ao tipo clonal identificado na placa subgengival da mãe (54,55).
Dados como estes justificam a necessidade de prosseguimento das investigações
sobre o tema.
2.4 ESTRADIOL & PROGESTERONA
Os esteroides sexuais são divididos em três grupos principais, de acordo
com o número de átomos de carbono. Na gestação, o precursor dos hormônios
esteroides é a lipoproteína LDL (low density lipoprotein), transferida a partir da
30
circulação materna para o compartimento placentário. A placenta, entretanto, não
possui todo o arsenal enzimático para a síntese estrogênica, de forma que feto e
placenta se unem nesta tarefa. O córtex adrenal fetal participa do processo
convertendo a pregnenolona materna em sulfato de pregnenolona e posteriormente
em sulfato de dehidroepiandrosterona, este precursor retorna à placenta
prosseguindo a sequencia de conversão até tornar-se estrona e estradiol, que serão
transferidos primordialmente para o organismo materno. Habitualmente são
quantificados no sangue periférico 3 tipos de estrogênios: estriol, estrona e estradiol;
sendo este último o que possui maior atividade biológica. O estriol possui um
centésimo, e a estrona um décimo, da potência do estradiol (15).
A progesterona, por sua vez, é produzida fora do período gestacional pela
glândula adrenal e pelo ovário, sendo mínima a sua secreção no início da fase folicular
do ciclo menstrual. Em torno do décimo dia do ciclo, o folículo dominante promove um
pequeno aumento na produção de progesterona que facilita a ação de feedback
positivo dos estrogênios, viabilizando o pico de hormônio luteinizante (LH)
responsável pelo processo de ovulação (15).
Durante a gestação, a progesterona é essencial para o processo de
nidação do ovo fecundado, possuindo um interessante efeito modulador do sistema
imunológico que permite a adaptação da mãe aos antígenos fetais. Sua produção
deriva inicialmente do corpo lúteo e, posteriormente, entre a sétima e a décima
semana gestacional, a placenta se torna sua principal fonte. Os níveis plasmáticos
deste hormônio ascendem progressivamente chegando a valores em torno de 100 –
200 ng/ml no final da gestação (16).
Na paciente não gestante, durante a fase folicular do ciclo menstrual, ocorre
produção de estradiol pelo folículo dominante que estimula a proliferação endometrial,
preparando o útero para a implantação do blastocisto. Durante a gravidez, os níveis
de estradiol se elevam em torno de 100 vezes. De forma conjunta os estrogênios
(estradiol, estrona e estriol) geram importante aumento do fluxo sanguíneo placentário
e atuam nos diversos sistemas orgânicos, modulando suas funções de forma a suprir
as necessidades do feto em desenvolvimento (16).
As concentrações plasmáticas habituais de estradiol e progesterona, de
acordo com a fase do ciclo menstrual e gravídico, são descritas por Speroff, Glass e
Kase, 1995, conforme ilustrado na Tabela 1.
31
TABELA 1 – Níveis de estradiol e progesterona nas diferentes fases do ciclo
menstrual, durante a gestação e menopausa, adaptada a partir de Speroff, Glass e
Kase, 1995 (15).
Fase avaliada Hormônios
Estradiol Progesterona
Fase folicular 25-75 pg/ml < 1 ng/ml Pico do meio do ciclo 200-600 pg/ml Fase lútea 100-300 pg/ml 5-20 ng/ml Primeiro trimestre de gravidez 1-5 ng/ml 20-30 ng/ml Segundo trimestre de gravidez 5-15 ng/ml 50-100 ng/ml Terceiro trimestre de gravidez 5-25 ng/ml 100-400 ng/ml Pós-menopausa 5-25 pg/ml < 1ng/ml
*1 ng = 1.000 pg
2.5 INFLUÊNCIA DOS HORMÔNIOS ESTERÓIDES NO PERIODONTO
É possível que os esteroides influenciem, direta e indiretamente, a
proliferação, diferenciação e o crescimento celular de forma sistêmica. Como
exemplo, Willershausen, citado por Mealey e Moritz, 2003 (17) relata que progesterona,
pode reduzir a síntese de glicosaminoglicanos, principal constituinte da matriz do
tecido conjuntivo da gengiva e aumentar a metabolização do folato reduzindo a
reparação tecidual. Já os estrogênios estimulam a proliferação e queratinização da
mucosa vaginal, oral e do epitélio gengival (56), também se relacionando com aumento
do fluxo sanguíneo para o útero e outros os tecidos (15).
A progesterona tem pouco efeito na vasculatura sistêmica, mas afeta a
gengiva e outros tecidos não periodontais intra-bucais, gerando aumento da
permeabilidade vascular e da proliferação vascular, além de possibilitar o acumulo de
células inflamatórias. Com níveis de placa bacteriana semelhantes, a reposta
imunológica gengival é exacerbada pelos hormônios esteroides sexuais permitindo
uma resposta tecidual exagerada durante a gestação (18).
No estudo pioneiro de Kornman e Loesche, 1980 (6), alterações hormonais
fisiológicas da gestação foram levadas em consideração para explicar os achados
clínicos da cavidade bucal. Utilizando estradiol e progesterona marcados pelo carbono
14, os autores perceberam que as bactérias previamente isoladas por meio de cultura
captavam estes hormônios de forma variável durante a evolução da gestação. Houve
aumento da captação de estradiol de 4,4% antes da 13ª semana gestacional para
18,1% entre a 21ª-24ª semanas (p<0,05), com retorno aos níveis basais entre 29ª-32ª
32
semanas. Para a progesterona a captação inicial era de 4,1%, passando para 18,4%
(p<0,05) na avaliação de segundo trimestre, acontecendo decréscimo no terceiro
trimestre semelhante ao ocorrido com o estradiol. Paralelamente foi observado
aumento da gengivite entre 18-23 semanas, com posterior redução dos casos, mesmo
sem variação no índice de placa.
Carrillo-de-Albornoz et al., 2009 (8) reportou correlação entre a variação dos
níveis de progesterona, do primeiro para o segundo trimestre, com um aumento na
contagem de P. gingivalis. Entre o segundo e o terceiro trimestre, a concentração de
estradiol também se correlacionou com a presença desta bactéria
periodontopatogenica. Todavia, esta pesquisa não detectou associação significativa
entre o aumento da inflamação gengival com a elevação dos hormônios salivares.
Kumar, 2013 (14) afirma que os esteroides sexuais exercem um efeito
predominantemente pró-inflamatório sobre a gengiva, dificultando a diferenciação
entre os efeitos hormonais diretos sobre os microrganismos daqueles relacionados ao
aumento da resposta inflamatória. O estudo conclui não haver evidências suficientes
que relacionem o aumento dos esteroides na gestação com a presença de bactérias
específicas na flora subgengival.
33
3 OBJETIVOS
3.1 GERAL
• Identificar e quantificar a presença de microbiota periodontopatogenica
em gestantes, de diferentes trimestres, comparadas com não gestantes.
3.2 ESPECÍFICAS
• Avaliar o perfil periodontal na gestação e fora dela.
• Avaliar a influência dos dados sócio demográficos no perfil periodontal.
• Avaliar os níveis séricos de estrogênio e progesterona, em diferentes
trimestres da gestação e em pacientes não gestantes.
• Correlacionar os achados clínicos periodontais aos microbiológicos.
• Correlacionar os níveis séricos de estrogênio e progesterona com as
manifestações clínicas e microbiológicas do periodonto.
34
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 POPULAÇÃO
Foram avaliadas 67 mulheres, provenientes de ambulatórios de
Ginecologia e Pré-Natal do SUS em Cuiabá – MT – Brasil, entre fevereiro e agosto de
2017, sendo o desenho do estudo transversal, do tipo caso controle, com amostra por
conveniência.
Foram definidos como critérios de inclusão: idade entre 18 e 35 anos, com
gestação única, confirmada por ultrassonografia. Para o grupo controle foram
selecionadas pacientes na mesma faixa etária com ciclos menstruais regulares e que
não fizeram uso de método contraceptivo hormonal nos últimos 3 meses.
Os critérios de exclusão elencaram: 1) gestações de alto risco conforme
critérios do Ministério da Saúde e National Institute Of Health (NIH) abrangendo
portadoras de comorbidades, obesas, gestações múltiplas e pacientes com idade
materna muito jovem (<15 anos) ou avançada (>35 anos) (57,58); 2) uso de antibióticos
sistêmicos nas últimas quatro semanas; 3) usuárias de corticoides e heparina; 4)
pacientes com limitação de abertura bucal. Pacientes com menos de 18 anos
completos também foram excluídas por necessitarem de autorização de terceiros para
o engajamento no projeto.
As pacientes foram alocadas conforme sua condição clínica em 4 grupos:
Grupo 1 (n = 16) – primeiro trimestre da gestação (até 98 dias);
Grupo 2 (n = 21) – segundo trimestre da gestação (entre 99 e 196 dias);
Grupo 3 (n = 15) – terceiro trimestre da gestação (a partir de 197 dias);
Grupo 4 (n = 15) – mulheres não gestantes (grupo controle);
Foi aplicado questionário próprio para a coleta de dados obstétricos e
ginecológicos (ANEXO 1), sendo realizada avaliação socioeconômica, utilizando a
classificação da Associação Brasileira de Empresas e Pesquisa - Critério de
Classificação Econômica Brasil 2014 (ABEP, 2014). Todas as pacientes avaliadas
assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido (ANEXO 2). Este estudo
recebeu parecer favorável nº 1.898.399 emitido pelo Comitê de Ética em Pesquisa na
35
Universidade de Cuiabá (ANEXO 3).
4.2 EXAME CLÍNICO PERIODONTAL
O exame clínico odontológico foi realizado imediatamente antes ou após o
atendimento obstétrico ou ginecológico, sem realização prévia de profilaxia e/ou
escovação supervisionada, com a paciente sentada, sob luz natural e com auxílio de
um espelho clínico (SSWhite Duflex®, Rio de Janeiro, RJ, Brasil) e sonda periodontal
milimetrada tipo Williams (Hu-Friedy® Mfg Co Inc. Chicago, IL, EUA). Foi realizado
exame periodontal, dente por dente, com registro dos dados (ANEXO 4).
As mensurações clínicas analisadas foram: índice de placa visível (IPV),
índice de sangramento gengival (ISG), profundidade de sondagem (PS) e nível de
inserção clínica (NIC). O índice de placa visível (IPV) é um parâmetro dicotômico que
considera a presença ou não de biofilme visível em todas as faces dos dentes,
avaliando a capacidade de controle de placa do paciente. A avaliação do ISG ocorreu
após a inserção de uma sonda periodontal milimetrada, cerca de 0,5 mm dentro do
sulco gengival, fazendo-a percorrer toda sua extensão delicadamente, aguardando 30
segundos para verificar a ocorrência de sangramento na gengiva marginal (59).
O diagnóstico periodontal foi estabelecido após a avaliação bucal, sendo
classificado como: saúde (quando < 30% dos sítios periodontais apresentavam
presença de sangramento gengival); gengivite (quando > 30% dos sítios periodontais
apresentavam sangramento gengival) e periodontite (na presença de quatro ou mais
dentes com um ou mais sítios apresentando PS ≥ 4mm e perda de inserção clínica ≥
3mm no mesmo sítio (32).
Entre os parâmetros subgengivais, a profundidade de sondagem (PS),
aferiu a distância compreendida entre a margem gengival até a porção mais apical do
epitélio juncional. O nível de inserção clínica (NIC), avaliou a distância entre a junção
amelocementária e a porção mais apical do epitélio juncional, sendo considerada
periodontite leve a perda de 1 a 2 mm de inserção, moderada variando entre 3±4 mm
e severas quando maior ou igual a 5 mm (32). As medições foram realizadas em seis
sítios por dente (mesio-vestibular, vestibular, disto-vestibular, mesio-lingual, lingual,
disto-lingual) para todos os dentes exceto os terceiros molares e anotadas nas fichas
clínicas periodontais (59).
Após avaliação clínica odontológica as pacientes com necessidade de
36
tratamento foram encaminhadas à Clínica de Odontologia da Universidade de Cuiabá.
4.3 AVALIAÇÃO DOS NÍVEIS SÉRICOS DE ESTRADIOL E
PROGESTERONA
As amostras de sangue foram coletadas por punção venosa periférica, pela
equipe do laboratório de análises clínicas do Hospital Geral Universitário, Cuiabá –
MT, sendo a dosagem hormonal efetuada pelo método de quimioluminescência
utilizando os testes Access Estradiol e Access Progesterone (Access Immunoassay
Systems, Beckman Coulter, Inc. 250 S. Kraemer Blvd. Brea, CA, EUA).
Entre as gestantes, a alíquota de sangue para dosagem de estradiol e
progesterona foi recolhida durante a realização dos exames da rotina pré-natal. Para
as pacientes não gestantes, a amostra foi coletada entre o 7°-13º dias da fase folicular
do ciclo.
Os resultados dos testes foram determinados automaticamente pelo
software do sistema utilizando um modelo matemático de curva logística de quatro
parâmetros ponderada (4PLC). O nível mínimo detectável de progesterona
distinguível de zero para o teste Access Progesterone (calibrador Access
Progesterone Calibrator S0) foi 0,10 ng/mL (0,32 nmol/L) e para o teste Access
Estradiol (calibrador Access Estradiol Calibrator S0) foi 20 pg/mL (73 pmol/L), com
95% de confiança.
4.4 COLETA MICROBIOLÓGICA
As coletas microbiológicas subgengivais foram realizadas após a avaliação
clínica, com o auxílio de um cone de papel n° 30 autoclavado (Dentsply, Maillefer,
Ballaigues, Suíça). Foram coletadas amostras microbianas intrasulculares dos sítios
mesio-vestibulares dos dentes 11, 16, 26, 31, 36 e 46. Na ausência desses elementos,
foram obtidas amostras dos dentes adjacentes. Para a coleta, cada dente foi isolado
com roletes de algodão esterilizados e o biofilme dental supragengival removido com
rolete de algodão esterilizado (59).
O cone de papel foi inserido na porção mais apical do sulco periodontal e
mantido em posição por 60 segundos (31). Em seguida, os cones de papel de cada
indivíduo foram colocados em minitubos tipo Eppendorf (Bio-Rad®, Hercules, CA,
37
EUA) e mantidas a temperatura de - 80°C até seu processamento.
4.5 EXTRAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DO DNA
Para a avaliação microbiológica, a extração do DNA genômico foi realizada
com auxílio do kit PureLinkTM Genomic DNA Purification Kit (Invitrogen, Carlsbad,
CA, EUA) seguindo as instruções do fabricante.
As amostras de cada paciente foram combinadas em pool, o tubo A
contendo os cones de papel e o tubo B contendo o swab e a alça coletora. Foi
adicionado 1,0 ml de água ultrapura aos minitubos e o material foi homogeneizado em
agitador mecânico (Vórtex, QL 901, Biomixer) por 30 segundos e 500 μL da amostra
foram centrifugados (3 min x 10.000 rpm, 27ºC).
Após a remoção do sobrenadante, foi adicionado 180 μL de Lisozima,
sendo realizada ressuspensão no Vórtex por 30 segundos e incubação a 37ºC por 30
minutos. A seguir, 20 μL de Proteinase K foram adicionados aos tubos contendo a
suspensão de células bacterianas (pellet) e em seguida novamente colocados no
Vórtex por 30 segundos. Foi adicionado 200 μL de PureLinkTM Genomic
Lysis/Binding Buffer sendo realizada nova homogeneização com o agitador mecânico,
por 30 segundos.
Cada minitubo foi incubado à 55ºC por 120 min, sendo retirados e
recolocados no agitador mecânico por 30 segundos em intervalos de 20 minutos. Após
esses procedimentos, foi adicionado 200 μL de etanol (100%) ao lisado e o minitubo
foi agitado por 5 segundos até a formação de uma solução homogênea.
Ao término desse processo, todo o lisado (aproximadamente 600 μL) foi
transferido para uma coluna (contendo membrana de sílica - “PureLinkTM Spin
Column”) acoplado a um tubo de coleção. Esse conjunto foi centrifugado por 1 min x
10.000 rpm, 27ºC. Em seguida, foram realizadas dois enxagues da membrana com
500 μL de Wash Buffer 1 (10.000 rpm por 1 min) e Wash Buffer 2 (10.000 rpm por 3
min), o tudo coletor foi desprezado e a coluna foi acondicionada em um novo minitubo.
Finalmente, 30 μL de PureLinkTM Genomic Elution Buffer foi utilizado na eluição do
DNA fixado na membrana de sílica, com posterior centrifugação por 1 min x 10.000
rpm, 27ºC. A coluna foi removida e descartada, o minitubo foi incubado a -20ºC.
As cepas bacterianas foram provenientes da Fundação Oswaldo Cruz,
Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde, cultivadas no laboratório de
38
microbiologia da Universidade de Cuiabá.
4.6 CONFECÇÃO DOS PRIMERS, DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO
MICROBIANA (qPCR)
Os primers empregados foram desenhados de acordo com a sequência
específica altamente conservada do gene 16S do DNA ribossomal bacteriano de cada
microrganismo envolvido e sintetizados pela Life Technologies do Brasil LTDA, São
Paulo-SP (Invitrogen Tech-LineSM). A busca das sequências alvo desejadas foi
realizada por consulta ao NCBI Nucleotide Search (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). O
software Primer 3 (http://frodo.wi.mit.edu/) foi utilizado para a confecção dos primers
(Tabela 2).
TABELA 2 – Sequência de primers e sondas de DNA para cada um dos
microrganismos estudados.
Cepas Primers e Sondas Sequência
ATCC 25922 (E. coli)
Universal (F) Universal (R) Universal (Probe)
TGGAGCATGTGGTTTAATTCGA TGCGGGACTTAACCAACA CACGAGGTGACGACAAGCCATGCA
ATCC 29522 (Aggregatibacter actinomycetemcomitans)
A. Actinomyc (F) A. Actinomyc (R) A. Actinomyc (Probe)
CAAGTGTGATTAGGTAGTTGGTGGG TTCATTCACGCGGCATGGC ATCGCTAGCTGGTCTGAGAGGATGGCC
ATCC 43037 (Tannerella forsythia)
T. forsythia (F) T. forsythia (R) T. forsythia (Probe)
AGCGATGGTAGCAATACCTGTC TTCGCCGGGTTATCCCTC CACGGGTGAGTAACG
W83 (Porphyromonas gingivalis)
P. gingivalis (F) P. gingivalis (R) P. gingivalis (Probe)
ACCTTACCCGGGATTGAAATG CAACCATGCAGCACCTACATAGAA ATGACTGATGGTGAAAACCGTCTTCCCTTC
ATCC 10557 (Streptococcus oralis)
S. oralis (F) S. oralis (R) S. oralis (Probe)
TTGGGTCAATTGCCCTTTGAC GTCCAAACAAGCCACCACTT ACAACATATCAACAGGCGCA
A identificação e quantificação absoluta das bactérias de Aggregatibacter
actinomycetemcomitans (Aa), Porphyromonas gingivalis (Pg), Tannerella forsythia
(Tf), Streptococcus oralis (So) e Universal (Un) nas amostras clínicas foi realizada
através da qPCR pelo equipamento StepOne™ (Applied Biosystems, Foster City, CA,
EUA), utilizando pares de primers específicos por sistema de amplificação com
sondas TAQMAN® (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). Em seguida, os
mesmos foram testados, em relação à especificidade, empregando o programa NCBI
39
BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
A concentração dos primers, bem como, as condições ideais para o
processo de amplificação (concentrações dos reagentes/determinação das
temperaturas envolvidas) foram previamente estabelecidas para cada conjunto de
primers Foward e Reverse incluídos no estudo.
A qPCR foi realizada utilizando uma solução de 25 µL contendo 0,5 µL de
200 nmol de cada primer, 0,5 µL de 200 nmol de sonda Taqman, 12,5 µL de Taqman
Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) 9 µL de água
estéril e 2 µL de solução de DNA.
Inicialmente, para a realização da curva padrão, foi utilizado o DNA extraído
a partir da bactéria pura, onde foi feita a leitura em espectrofotômetro (NanoDrop® ND-
1000 UV-vis, NanoDrop Technologies, Wilmington, EUA) por meio da avaliação das
absorbâncias a 260 nm e da relação entre as absorbâncias a 260/280 nm. Obteve-se
uma concentração inicial entre 0,5-0,6 ug/µL de cada DNA bacteriano, em seguida
realizou-se 8 diluições seriadas (101-108) para confecção da curva padrão. A curva
padrão (a qual possuía concentração conhecida) foi utilizada para converter os scores
de Ct (Cycle treshold) obtidos com as amostras de fluido em números exatos de
concentração de DNA.
Uma vez determinados os limites de quantificação, as amostras clínicas
foram processadas juntamente com a curva padrão (controle positivo) respectivas de
cada espécie bacteriana, em triplicatas, e os valores médios foram utilizados para o
cálculo dos níveis bacterianos. As reações foram realizadas respeitando-se uma
eficiência de amplificação para a curva padrão entre 110% a 93% (slope = -3,10 a -
3,50) e um coeficiente de correlação (R2) ≥ 0,98%. Para o ensaio da qPCR ter alta
eficiência, a inclinação da curva padrão (slope) deve ser próxima de -3,30 (60).
O controle negativo foi realizado substituindo o DNA pela mesma
quantidade de água estéril, a fim de checar possíveis contaminações.
4.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados clínicos e microbiológicos foram submetidos a tratamento
estatístico específico, utilizando o programa Statistical Package for the Social
40
Sciences (SPSS) versão 20.
Cada parâmetro clínico foi obtido por dois examinadores, cegos e
previamente calibrados conforme metodologia descrita por Araujo et al. (2003) (61).
Para as variáveis contínuas (profundidade de sondagem) foi utilizado o EPM (erro
padrão da medida) e para as variáveis categóricas, (índices de placa e gengival) foi
utilizado o teste Kappa. Assim 10 exames foram repetidos num intervalo de 30 dias e
submetidos à análise. As examinadoras foram consideradas calibradas mediante
EPM ≤ 0,8 e K > 0,8 e < 0,95.
Para responder aos objetivos do estudo foram utilizadas, além de técnicas
básicas de análise exploratória como média, mediana, desvio padrão, frequência
absoluta e relativa, o teste Qui-quadrado para analisar a relação entre variáveis
qualitativa e para comparar os grupos aos pares empregamos a comparação múltipla
de Tukey. Já na relação entre variáveis quantitativas, foi utilizado a Correlação de
Pearson. Por fim, nas análises de comparação de médias entre co-variáveis
qualitativas, utilizamos o teste de ANOVA.
Os testes de hipóteses desenvolvidos nesse trabalho consideraram uma
significância de 5%, e a hipótese nula foi rejeitada quando p-valor foi menor ou igual
a 0,05.
41
5 RESULTADOS
5.1 POPULAÇÃO ESTUDADA
Entre as 67 pacientes que completaram o estudo, a idade média foi de
24,67 ± 1,26 anos, não havendo diferença entre os grupos (p = 0,704); entre as
gestantes a média foi de 24,71 anos e no grupo controle de 24,53 anos (p = 0,909). A
idade gestacional evidenciou pequena variabilidade dentro de cada grupo.
Em relação aos dados epidemiológicos, incluindo raça, paridade e classe
socioeconômica os grupos se apresentaram homogêneos (Tabela 3). A única
diferença ocorreu em relação ao estado civil, sendo encontrada maior prevalência de
pacientes com companheiro nos grupos 2 e 3 (p= 0,047).
TABELA 3 – Descrição de dados epidemiológicos - frequência absoluta e relativa,
média e desvio padrão (teste Qui-quadrado; p<0,05).
Dados epidemiológicos
Grupos
Total p-valor
1 2 3 4
Estado Civil
Com Companheiro
% (N)
50 (8)
86 (8)
80 (8)
53 (8)
69 (8)
0,047 Sem Companheiro
% (N)
50 (8)
14 (8)
20 (8)
47 (8)
31 (8)
Raça Caucasiana
% (N)
38 (6)
19 (8)
40 (8)
27 (8)
30 (8)
0,502 Não Caucasiana
% (N)
63 (10)
81 (8)
60 (8)
73 (8)
70 (8)
Paridade Com Filhos
% (N)
63 (10)
67 (8)
67 (8)
53 (8)
63 (8)
0,970 Sem Filhos
% (N)
38 (6)
33 (8)
33 (8)
47 (8)
37 (8)
Classe SE*
Classe E % (N)
19 (3)
24 (8)
27 (8)
7 (8)
19 (8)
0,527 Classe D
% (N)
81 (13)
67 (8)
60 (8)
80 (8)
72 (8)
Classe C2 % (N)
0 (0)
10 (8)
13 (8)
7 (8)
7 (8)
Classe B2 % (N)
0 (0)
0 (8)
0 (8)
7 (8)
1 (8)
Média de idade (anos) Desvio padrão
23,50 +/-5,6
24,90 +/-5,0
25,73 +/-4,9
24,53 +/-6,0
24,67 +/-5,3
0,704
Média da idade gestacional (dias) Desvio padrão
77
+/-14,24 157,48
+/-28,46 236,13
+/-26,77 - - -
*SE = classe socioeconômica
42
5.2 RESULTADOS CLÍNICOS
Em relação ao diagnóstico clínico periodontal, no grupo 1 houve uma maior
proporção de indivíduos com gengivite, nos grupos 2 e 3 as maiores proporções de
indivíduos com periodontite e no grupo 4 a maior proporção de indivíduos com saúde
(Tabela 4), entretanto não houve diferença estatística entre os grupos (p = 0,1035).
TABELA 4 – Comparação do diagnóstico clínico periodontal nos grupos (teste Qui-
quadrado; p<0,05).
Grupos Diagnóstico Clínico Periodontal
Total p-valor Saúde Gengivite Periodontite
1 % 38 63 0 100
0,1035
(N) (6) (10) (0) (16)
2 % 33 33 33 100
(N) (7) (7) (7) (21)
3 % 40 33 27 100
(N) (6) (5) (4) (15)
4 % 53 40 7 100
(N) (8) (6) (1) (15)
Corroborando a não variabilidade do diagnóstico clínico periodontal,
verificou-se que nas avaliações de PS, NIC, IPV e ISG não houve diferença estatística
entre os grupos (Tabela 5).
TABELA 5 – Comparação dos parâmetros clínicos de avaliação periodontal nos
grupos (teste de ANOVA; p<0,05).
Grupos Parâmetros Avaliados PS NIC IPV ISG
1 Media 2,46 0,94 0,67 0,39 Mediana 2.40 1,00 0,82 0,26 Desvio padrão 0,46 0,58 0,36 0,36
2 Media 2,28 1,36 0,65 0,41 Mediana 2,30 1,00 0,60 0,25 Desvio padrão 0,70 0,81 0,32 0,35
3 Media 2,55 1,48 0,41 0,26 Mediana 2.30 1,00 0,30 0,15 Desvio padrão 0,61 0,71 0,33 0,32
4 Media 2,33 1,00 0,49 0,22 Mediana 2,30 1,00 0,50 0,26 Desvio padrão 0,58 0,74 0,31 0,17
p-valor 0,546 0,099 0,074 0,217 PS: profundidade de sondagem; NIC: nível clínico de inserção; IPV: índice de placa visível; ISG: índice de sangramento gengival.
43
O teste Qui-quadrado não evidenciou associação entre o diagnóstico
clínico periodontal e os dados epidemiológicos (idade da paciente, paridade, raça,
estado civil e nível socioeconômico) nos diferentes grupos. O mesmo ocorreu entre
as gestantes quando fizemos o ajuste de acordo com a idade gestacional.
5.3 RESULTADOS MICROBIOLÓGICOS
Para avaliar a diferença entre os grupos, em relação à quantidade total de
bactérias, foi utilizado o teste de Kruskal-Wallis (Tabela 6). Observou-se que o grupo
controle (grupo 4) foi o que apresentou a menor quantidade média de bactérias e que
a carga bacteriana foi mais elevada no grupo 1, seguido pelos grupos 2 e 3. Porém,
não houve diferença estatística entre os grupos (p = 0,4336).
TABELA 6 – Quantificação de periodontopatógenos, total e por espécie, nos diferentes
grupos (teste de Kruskal-Wallis; p<0,05).
Grupos Microorganismos
Total Pg Aa Tf So Un
1 Media 12.658.073 561.991 89.805 202.344 36.623 3.953.290 Mediana 9.612.764 0 46.013 23.945 0 3.281.499 Desvio Padrão 9.221.776 1.320.099 156.964 329.860 102.610 3.830.708
2 Media 11.809.621 410.656 72.545 67.940 35.554 2.999.282 Mediana 8.673.809 40 18.709 1.147 0 1.429.628 Desvio Padrão 11.519.511 1.244.766 138.342 133.984 79.832 3.661.119
3 Media 10.449.415 134.774 59.857 31.498 18.508 2.386.648 Mediana 9.048.468 0 35.481 5.264 0 1.414.154 Desvio Padrão 8.267.627 372.516 78.484 47.464 35.241 3.458.882
4 Media 9.262.006 114.705 25.573 380 10.763 1.407.833 Mediana 4.273.116 0 24.561 0 0 917.895 Desvio Padrão 9.975.699 422.722 22.010 483 19.993 1.261.805
p-valor 0,4336 0,3198 0,3056 0,0061 0,9911 0,0651 Total: contagem bacteriana total; Pg: Porphyromonas gingivalis; Aa: Aggregatibacter actinomycetemcomitans; Tf: Tannerella forsythia; So: Streptococcus oralis; Un: Universal.
Por outro lado, quando os periodontopatógenos de interesse foram
quantificados individualmente, a detecção de Tf revelou diferenças significativas, com
p igual a 0,0061 (Tabela 6). Foi identificado que no grupo controle a média para esta
bactéria é bem mais baixa que nos demais e, partindo deste dado, optou-se pela
realização da comparação múltipla de Tukey buscando identificar quais grupos
apresentavam diferenças entre si.
Este segundo teste confirma que, ao comparar o grupo 1 com os grupos 3
44
(p = 0,048) e 4 (p = 0,014), existem diferenças na quantificação de Tf. Já entre os
grupos 1 (média 202.344) e o grupo 2 (média de 67.940) não foi observada
significância estatística (p = 0,119).
A frequência relativa das bactérias periodontopatogenicas estudadas foi
comumente superior a 50% nesta população. Aa foi encontrado em todas as pacientes
avaliadas (100%) e Pg esteve presente em mais da metade das gestantes no grupo
2 (52%). Para Tf, as taxas de detecção entre as gestantes, foram superiores a 80%,
atingindo 88% no grupo 1, 81% no grupo 2 e 87% no grupo 3.
Nota-se que ao agruparmos todas as gestantes (grupo gestante =
G1+G2+G3), a quantidade total de bactérias subgengivais exerceu influencia sobre o
diagnóstico clínico (p = 0,006), conforme Tabela 7. Ao comparamos pacientes com
diagnóstico de saúde periodontal, com aquelas que clinicamente apresentavam
doença (gengivite ou periodontite), verificou-se que nestas últimas as médias foram
progressivamente maiores. Na comparação múltipla de Tukey, as diferenças entre
saúde x gengivite, e saúde x periodontite, determinaram um valor de p = 0,041 e 0,008
respectivamente.
TABELA 7 – Associação entre quantificação bacteriana total e diagnóstico clínico
periodontal (teste ANOVA; p<0,05).
Grupos Quantificação
Bacteriana Diagnóstico Clínico Periodontal
Saúde Gengivite Periodontite p-valor
1 Media 2.475.898 6.264.945 - x -
0,119 Mediana 1.911.377 4.210.644 - x - Desvio padrão 1.874.674 5.335.504 - x -
2 Media 902.626 3.640.720 6.214.584
0,146 Mediana 526.191 2.753.431 3.935.374 Desvio padrão 845.962 2.373.493 7.915.453
3 Media 459.090 2.312.813 6.287.668
0,024 Mediana 216.069 2.316.411 3.936.126 Desvio padrão 566.618 924.803 5.511.489
Gestantes* (G1+G2+G3)
Media 1.259.385 4.531.753 6.241.160 0,006 Mediana 648.389 3.353.085 3.935.374
Desvio padrão 1.435.355 4.103.691 6.834.248
4 Media 1.402.892 1.903.534 744.473
0,736 Mediana 889.354 1.142.871 744.473 Desvio padrão 1.255.824 1.947.505 - x -
*Gestantes = agrupamento de todas as gestantes (G1 + G2 + G3)
Quando analisadas separadamente, de acordo com o trimestre
45
gestacional, observou-se que a associação entre quantificação bacteriana e
diagnóstico clínico se perpetua apenas para o grupo 3 (p = 0,024). Com o teste da
comparação múltipla de Tukey, nota-se que neste grupo, a quantidade média de
bactérias em gestantes com saúde foi significativamente menor do que naquelas com
periodontite (p = 0,020). Não houve diferença nas comparações entre saúde x
gengivite e gengivite x periodontite.
Na quantificação específica dos periodontopatógenos, foi observado que
Aa, Pg e So não demostraram associação com o diagnóstico clínico em nenhum dos
grupos, porém a quantidade de Tf se correlacionou positivamente com o diagnóstico
de gengivite entre as gestantes (Tabela 8).
TABELA 8 – Associação entre a quantidade de Tf e o diagnóstico clínico periodontal
(teste ANOVA; p<0,05).
Grupos Quantificação
de Tf Diagnóstico Clínico Periodontal
Saúde Gengivite Periodontite p-valor
1 Media 16.094 314.093 - x -
0,079 Mediana 124 117.005 - x - Desvio padrão 39.094 378.808 - x -
2 Media 14.468 91.976 97.375
0,454 Mediana 1.175 1.027 1.024
Desvio padrão 26.630 145.232 181.705
3 Media 27 41.870 65.738
0,073 Mediana 30 61.592 37.468
Desvio padrão 25 36.642 70.709
Gestantes* (G1+G2+G3)
Media 10.421 181.551 85.871
0,031 Mediana 94 55.519 17.936
Desvio padrão 26.721 288.904 146.850
4 Media 246 456 986
0,334 Mediana 0 405 986 Desvio padrão 456 503 - x -
*Gestantes = agrupamento de todas as gestantes (G1 + G2 + G3)
Ao avaliar a influência dos dados epidemiológicos nos resultados
microbiológicos, foi encontrada correlação positiva entre idade e a presença Aa no
grupo 1 (p 0,023). No grupo 1 a presença de Aa e So mostraram correlação inversa
com o nível socioeconômico, com valores de p = 0,019 e 0,031 respectivamente;
sendo que Aa manteve o mesmo padrão no grupo 3, com p = 0,030. Não foram
encontradas correlações entre a quantificação bacteriana e a raça, paridade, estado
civil e idade gestacional.
46
5.4 RESULTADOS HORMONAIS
Os níveis de estradiol e progesterona foram consideravelmente mais
baixos no grupo controle e, refletiram a evolução da idade gestacional, aumentando
progressivamente entre os grupos de 1 a 3. Para estradiol, foram detectadas
diferenças entre os níveis séricos do grupo 4 em relação aos demais, com p igual a
0,002; 0,005 e < 0,001 na comparação com os grupos 1, 2 e 3 respectivamente. Entre
as gestantes, não houve diferença estatística entre os grupos. Os níveis séricos de
progesterona variaram significativamente, exceto entre os grupos 1 e 4; porém,
mesmo nesta comparação observa-se um valor de p = 0,071 demonstrando tendência
a diferença entre os dois grupos.
5.4.1 Correlação entre os níveis hormonais e diagnóstico clínico
Neste trabalho não foi observada associação entre os níveis séricos de
estradiol e/ou progesterona com diagnóstico periodontal clínico (Tabela 9).
TABELA 9 – Associação entre diagnóstico clínico e os níveis séricos de estradiol e
progesterona (teste de ANOVA; p<0,05).
Hormônio Grupos Nível sérico Diagnóstico Clínico Periodontal
Saúde Gengivite Periodontite p-valor
Estr
ad
iol
1 Media 985,8 1.400,8 - x -
0,434 Mediana 1.000 1.000 - x - Desvio padrão 102,6 1.243,2 - x -
2 Media 1.000 1.120,0 1.452,6
0,492 Mediana 1.000 1.000 1.000 Desvio padrão 0 268,3 1.012,0
3 Media 2.266,7 1.000 1.000
0,207 Mediana 1.000 1.000 1.000 Desvio padrão 1.962,3 0 0
4 Media 42,6 70,5 32,0
0,412 Mediana 39,0 58,0 32,0 Desvio padrão 13,1 60,8 - x -
Pro
ge
ste
ron
a
1 Media 26,0 28,0 - x -
0,700 Mediana 27,6 27,6 - x - Desvio padrão 6,4 11,7 - x -
2 Media 53,5 51,7 60,8
0,846 Mediana 47,6 40,0 40,0 Desvio padrão 24,2 29,4 38,3
3 Media 99,2 88,7 97,6
0,947 Mediana 95,1 97,9 105,7 Desvio padrão 71,1 36,9 41,6
4 Media 0,480 0,943 0,600
0,309 Mediana 0,300 0,620 0,600 Desvio padrão 0,334 0,728 - x -
47
5.4.2 Correlação entre os níveis hormonais e avaliação microbiológica
No primeiro trimestre Pg se correlacionou com os níveis de progesterona
(p 0,041), conforme Tabela 10. Não foi encontrada correlação entre a quantidade total
de bactérias e os níveis de estradiol e/ou progesterona.
TABELA 10 - Correlação dos níveis séricos de estradiol e progesterona com a
quantificação bacteriana por espécie, nos diferentes grupos (Correlação de Pearson;
p<0,05).
Hormônio Grupos Correlação
p-valor Espécie Bacteriana
Un Pg Aa Tf So
Estr
ad
iol
1 Corr (r)* -0,247 -0,113 -0,126 -0,162 0,002 p-valor 0,357 0,677 0,642 0,548 0,995
2 Corr (r) -0,184 -0,128 -0,189 -0,215 -0,163 p-valor 0,512 0,649 0,501 0,441 0,563
3 Corr (r) -0,255 -0,147 -0,299 -0,269 -0,205 p-valor 0,359 0,601 0,279 0,332 0,464
4 Corr (r) -0,056 -0,223 -0,060 0,193 -0,212 p-valor 0,842 0,423 0,832 0,490 0,449
Pro
ge
ste
ron
a 1
Corr (r) 0,333 0,516 -0,124 0,391 -0,169 p-valor 0,208 0,041 0,646 0,134 0,532
2 Corr (r) 0,197 0,102 0,070 0,009 -0,137 p-valor 0,392 0,659 0,762 0,969 0,553
3 Corr (r) 0,075 -0,248 -0,082 0,064 -0,014 p-valor 0,791 0,372 0,772 0,821 0,959
4 Corr (r) 0,049 -0,010 0,010 0,363 -0,201 p-valor 0,863 0,970 0,971 0,184 0,472
*Corr (r) = correlação
48
6 DISCUSSÃO
O presente estudo realizou uma investigação transversal, avaliando a
ocorrência de alterações quantitativas e/ou qualitativas da flora subgengival de
gestantes, em diferentes trimestres, comparadas com mulheres não gestantes.
Em relação à idade, a média encontrada foi de 24,67 anos (± 1,26),
compatível com a de outros autores (6,8,47,60,62); exceto Bieri et al., 2012 (63) que
trabalharam com gestantes argentinas com idade média em torno dos 32 anos. Foram
excluídas pacientes identificadas como “gestantes de alto risco”, pois, diversos
trabalhos tem relacionado a doença periodontal com desfechos obstétricos adversos
(19,20,49,64,65). Desta forma, evitou-se um viés de seleção, excluindo pacientes que
apresentassem previamente condições passíveis de influenciar negativamente a
gestação ou que já pudessem ser portadoras de alterações da flora subgengival, tais
como diabéticas, hipertensas, tabagistas e pacientes com mau passado obstétrico.
Embora o termo “gestação de alto risco” inclua critérios variáveis, passíveis de
influências regionais, ele reflete condições nas quais a vida ou a saúde da mãe e/ou
do feto e/ou do recém-nascido têm maiores chances de serem atingidas que as da
média. Optou-se então pela adoção dos parâmetros definidos pelo Ministério da
Saúde em concordância com National Institute of Health (57,58).
De uma forma geral nossa população demonstrou homogeneidade para a
idade, paridade, raça e nível sócio econômico, o que tornou válida as comparações
entre os 4 grupos. Apenas para o critério estado civil, foi observada uma maior
proporção de pacientes com companheiro nos grupos 2 e 3 (p = 0,047). O tamanho
da amostra foi comparável à de outros estudos sobre o mesmo tema (6,8,47,63,66–68).
O nível socioeconômico não apresentou correlação com a contagem
bacteriana total, possivelmente por termos trabalhado com uma população usuária do
SUS, com nível sócio econômico bastante homogêneo, no qual 72% das pacientes
pertenciam à classe D e 19% à classe E, perfazendo 91% da amostra. Apenas
associações pontuais com esta variável foram observadas, como por exemplo a
correlação inversa com Aa nos grupos 1 e 3. Raça, estado civil e paridade também
não demonstraram associação com o diagnóstico clínico periodontal e contagem
bacteriana.
Como não possuíamos o conhecimento prévio do status periodontal da
49
paciente, foi possível avaliar a flora de mulheres apresentando saúde, gengivite e
periodontite, em concordância com os trabalhos de Kornman e Loesche, 1980 (6) e de
Carrillo-de-Albornoz et al., 2009 (8); mas diferindo de Usin et al., 2013 (62) que optaram
por selecionar pacientes que apresentassem sinais clínicos de inflamação periodontal.
Este aspecto nos permitiu uma avaliação geral, não influenciada pela presença
majoritária de indivíduos portadores de alterações periodontais, nos quais se
pressupõe a presença de microbiota mais patogênica.
Em relação à técnica adotada para quantificação bacteriana, nosso
trabalho tem por vantagem a utilização de qPCR, o que viabiliza a identificação e
quantificação dos periodontopatógenos com maior sensibilidade, diferenciando-o de
publicações prévias que utilizaram a avaliação microbiológica por meio de cultura (6,8)
e PCR convencional (62).
Quanto à avaliação hormonal, verificamos serem escassos os trabalhos
que efetivamente quantificaram os níveis de estradiol e progesterona na gestação,
correlacionando-os com achados do biofilme subgengival (6,8,69,70). Todavia,
considerando o caráter sistêmico das alterações fisiológicas relativas à gravidez,
julgamos relevante a avaliação dos níveis séricos destes hormônios, assim como
Kornman e Loesche, 1980 (6). Os demais autores realizaram a dosagem hormonal
salivar, mas esta não foi nossa opção visto que o foco da pesquisa foi a avaliação
subgengival. Neste sentido, o fluido crevicular que banha as estruturas periodontais,
por se tratar essencialmente de um transudato do plasma, apresenta níveis hormonais
muito semelhantes a este (71).
Os níveis séricos de progesterona, em todos os grupos, foram semelhantes
aos descritos por Speroff, Glass e Kase, 1995 (15) (tabela 1). Para este hormônio, os
valores encontrados durante a pesquisa foram cerca de 50x, 100x e 200x mais
elevados nos grupos 1, 2 e 3, respectivamente, quando comparados com o grupo 4.
Para o estradiol, é descrito aumento em torno de 100x durante a gestação, em relação
aos níveis pré-gravídicos, mas as variações entre os diferentes trimestres apresentam
superposição de seus valores (15). Este fato foi confirmado neste trabalho, sendo
detectada média estatisticamente semelhante entre as gestantes dos diferentes
grupos. Os valores observados na gravidez foram em torno de 20-50 vezes superiores
ao do grupo 4, e, possivelmente, valores mais elevados não foram revelados devido
a utilização de metodologia semi-quantitativa para a dosagem hormonal. Apesar disto
50
os níveis de estradiol foram efetivamente diferentes entre as gestantes e o grupo
controle.
Nesta pesquisa que a progesterona foi o esteroide que mais
adequadamente ilustrou as modificações hormonais entre os trimestres gestacionais,
revelando diferenças significativas entre todos os grupos de gestantes (grupos 1, 2 e
3). Apenas a comparação entre o grupo 1 e o grupo controle não alcançou
significância (p = 0,071), embora já demostre tendência à diferença. O mesmo não
ocorreu para os níveis de estradiol, mas acreditamos que a menor variação dos títulos
hormonais entre as gestantes tenha decorrido em virtude da ascensão progressiva de
seus títulos com evolução da idade gestacional dentro de um mesmo grupo.
A utilização de quatro critérios objetivamente mensuráveis para avaliação
clínica periodontal – NIC, PS, IPV e ISG – também diferencia e agrega valor a este
trabalho. Anteriormente, nos trabalhos de Kornman e Loesche, 1980 (6); Jonson,
Howland e Bowden, 1988 (69), Yokoyama et al., 2008 (70), Carrillo-de-Albornoz et al.,
2009 (8) e Bieri et al., 2012 (63) não foi incluída a avaliação do NIC, mas de acordo com
Armitage (2000) os casos de periodontite necessitam ser avaliados e estratificados
com base na perda de inserção clínica, pois este parâmetro possui maior
especificidade do que a profundidade de sondagem, sendo então de fundamental
importância.
A respeito do diagnóstico clínico periodontal, nossa investigação não
detectou variação entre os grupos. A condição clínica se distribuiu de forma
especialmente equitativa nos grupos 2 e 3; no grupo 1 a frequência relativa de
gengivite foi de 63% e no grupo 4 observou-se saúde periodontal em 53% das
mulheres; todavia esta variação não alcançou diferença estatística. A avaliação
individual dos parâmetros clínicos, ISG, IPV, PS e NIC apontou uma tendência para
aumento do ISG no grupo 3 e do IPV no grupo 1 sem, contudo, apresentar valor de p
significativo. Nota-se que apesar de não ter sido detectada associação entre gestação
e alterações periodontais, o p-valor de 0,1035 reforça que eventualmente esta relação
poderá ser detectada em novos estudos com uma amostra maior.
Em relação aos parâmetros clínicos de avaliação periodontal, Kornman e
Loesche, 1980 (6) descrevem ascensão significativa do ISG entre o primeiro e segundo
trimestres; enquanto que no grupo não grávido não houve alteração dos parâmetros
clínicos durante o período do estudo. Estes autores evidenciaram que o IPV se
51
manteve inalterado ao longo da gravidez e pós-parto, sendo a mesma estabilidade
observada nos diferentes grupos do presente trabalho. Entretanto, em relação ao ISG,
nossos achados são discordantes, pois, não foi observada diferença quando
comparamos os grupos 1 e 2 (p = 0,999) e mesmo quando agrupamos as pacientes,
classificando-as como gestantes e não gestantes, não foi observada variação (p =
0,124).
Sobre este ponto nossos dados concordam com o trabalho de Jonson et
al., 1988 (69) que também não observaram alterações para ISG e PS, comparando
grávidas e não grávidas. Estes autores também não identificaram variação
significativa durante a progressão da gravidez, assim como em nossa pesquisa.
Em relação à caracterização quantitativa da flora subgengival durante o
período gestacional observamos que a literatura reforça a ausência de alterações
significativas durante a gestação, demostrada neste trabalho pela ausência de
diferenças entre os grupos em relação à quantificação bacteriana total, em
concordância com os estudos prévios de Löe e Silness, 1963 (72); Cohen et al., 1971
(73); Kornman e Loesche, 1980 (6); Tilakaratne et al., 2000 (46) e Novak et al., 2008 (52).
Todavia, mesmo com uma carga bacteriana semelhante, muitos autores relataram
aumento da gengivite no período gestacional (6,8–10,17,47,63,67,74) o que não foi
confirmado em nosso estudo. Esta discordância pode ter sido ocasionada por
diferenças metodológicas e nos critérios de avaliação clínica.
Adriaens et al., 2009 (75) investigaram longitudinalmente alterações
microbiológicas subgengivais durante a gravidez e 4 a 6 semanas pós-parto, utilizando
hibridização DNA-DNA. Os autores relatam que os níveis subgengivais de bactérias
associadas à periodontite não mudaram, havendo redução quantitativa de 17 das 37
espécies analisadas apenas na comparação entre o primeiro trimestre e o período
pós-parto. Nenhuma alteração ocorreu entre a 12ª e 28ª semanas da gravidez e a
quantificação de Aa, Pg, Tf e de T denticola não variou.
Entre gestantes portadoras de periodontite, Novak et al., 2008 (52), não
observou diferenças qualitativas para os sete microrganismos
peridodontopatogenicos por eles estudados. A literatura aponta, entretanto,
alterações qualitativas pontuais, tais como o aumento de B. melaninogenicus
intermedius no segundo trimestre (6), maior proporção de Prevotella intermedia no
primeiro trimestre e de Pg e Aa no terceiro trimestre (8).
52
Nosso estudo está de acordo com o exposto, pois não foram observadas
variações em relação ao número total de bactérias encontradas nos diferentes grupos
(p = 0,4336), contudo, detectou-se variação espécie especifica. A quantificação de Tf
revelou diferença estatisticamente significativa no biofilme subgengival com p =
0,0061. O grupo 1 apresentou média muito mais alta do que a encontrada no grupo 3,
havendo decréscimo numérico desta bactéria com a evolução da gestação. É possível
que alterações relativas à Tf no decorrer da gravidez não tenham sido detectadas em
estudos que utilizaram cultura microbiana por se tratar de uma bactéria anaeróbia, de
difícil cultivo (76) o que foi superado nesta metodologia com a utilização qPCR. A
respeito da diferença observada entre o grupo 1 e grupo 4, nossos dados confirmam
os achados de Carrillo-de-Albornoz et al., 2009 (8), que já haviam demostrado queda
abrupta na detecção de Tf avaliando mulheres 3 meses após o parto.
Esta pesquisa observou divergência com o exposto na literatura ao termos
identificado altas prevalências de Tf e Aa em uma população sem comorbidades. De
acordo com Aas et al., 2005 (77), mais de 700 espécies bacterianas já foram detectadas
na cavidade oral, distribuindo-se de forma não homogênea entre os indivíduos, sendo
altamente diversificada e específica em relação ao sítio e indivíduo analisado. Em
média, para cada sítio específico, encontra-se 20 a 30 espécies predominantes
diferentes, mas de forma geral não se detecta espécies geralmente associadas a
periodontite e cárie, o que não foi confirmado em nossa amostra. Pg esteve presente
em mais da metade das gestantes do segundo trimestre (52%), Tf demonstrou
prevalência superior a 80% em todos os grupos de gestantes e Aa foi encontrado
virtualmente em todas as pacientes avaliadas (em apenas 1 indivíduo não foi
detectada).
Acreditamos que o uso de qPCR tenha promovido um aumento da nossa
capacidade de identificar tais bactérias, mas também é possível que ao termos
abordado uma população de baixo nível socioeconômico, haja um real
comprometimento, ainda que subclínico, de sua saúde periodontal. Por se tratarem
de pacientes jovens, é possível que manifestações periodontais mais exuberantes
ainda não tenham tido tempo suficiente para se apresentarem.
A influência de fatores socioeconômicos no agravamento das condições
periodontais é confirmada pela Pesquisa Nacional de Saúde Bucal, quando
comparamos as regiões com maior renda per capta, com as mais pobres, havendo
53
decréscimo do número de indivíduos hígidos nestas últimas (78). Neste âmbito,
observamos no trabalho atual correlação inversa entre nível sócio econômico e a
presença de uma espécie altamente patogênica (Aa), ainda que esta associação não
tenha se manifestado em todos os grupos.
Fazendo jus ao conceito de que a presença de biofilme bacteriano é o
principal fator determinante para o desenvolvimento de gengivite e doença periodontal
(32), observamos em nossa pesquisa que a quantidade total de bactérias subgengivais
se correlacionou positivamente com um agravamento do diagnóstico clínico nas
gestantes de forma geral (p = 0,006). Notamos também uma associação entre a
contagem de Tf e a ocorrência de gengivite entre as gestantes, quando consideradas
em conjunto (p = 0,031).
Conforme a classificação de Socransky et al., 1998 (24), esta bactéria possui
forte característica periodontopatogenica, pertencendo ao complexo vermelho, no
qual estão agrupados os microrganismos responsáveis pela cronificação e
agressividade da doença. É provável que tenhamos encontrado associação entre Tf
e gengivite, e não com periodontite, em função de termos avaliado uma população
jovem, ainda sem manifestações clínicas mais avançadas, tal como foi comentado
anteriormente em relação a alta prevalência de bactérias periodontopatogenicas
nestas pacientes.
Quanto à avaliação dos níveis hormonais, justifica-se sua dosagem devido
à presença de receptores para os esteroides sexuais nos tecidos gengivais. Durante
a gestação, os efeitos da elevação dos estrogênios e progesterona na vasculatura
gengival poderiam explicar o edema, eritema, aumento do fluido crevicular e
sangramento. Altos níveis de esteroides estão associados a uma maior
permeabilidade vascular no sulco gengival e possivelmente justificam a exacerbação
da secreção de fluido crevicular nesta situação (17,18).
É importante frisar que as variações nos níveis dos esteroides sexuais
ocorrem no período gestacional e também fora dele, sendo importante que pacientes
não gestantes sejam avaliadas sempre na mesma fase do ciclo menstrual. Este
cuidado foi observado durante nosso estudo e a investigação de pacientes do grupo
controle ocorreu sempre na fase folicular tardia, entre o 7º-13º dias do ciclo.
54
A fase lútea já havia sido estudada por Carrillo-de-Albornoz et al., 2009 (8),
enquanto Kornman e Loesche, 1980 (6) avaliaram as pacientes não grávidas sempre
na mesma fase do ciclo menstrual, porém sem descrever especificamente em qual
período. Optamos por avaliar as pacientes do grupo controle durante a fase folicular
do ciclo menstrual, pois esta exibe maior contraste em relação ao período gestacional,
em especial, devido à mínima influência da progesterona nesta fase do ciclo.
Após a avaliação estatística dos dados, não detectamos associação entre
os níveis séricos de estradiol e/ou progesterona com diagnóstico periodontal clínico,
nem com a quantidade total de bactérias entre os grupos. Entretanto, observamos que
a frequência relativa de gengivite entre a gestantes foi 33% nos grupos 2 e 3, e 63%
no grupo 1. Estes achados clínicos concordam com Mealey e Moritz, 2003 (17), que
relataram ocorrência de gengivite em torno de 30-100% das gestantes.
Para Hugoson, 1971 (18) a alteração gengival tende a se iniciar no 2º mês
de gestação, piorando no 8º e regredindo após o parto, sendo assim correlacionada
com os níveis hormonais. Nós não observamos este padrão de comportamento, não
havendo aumento do número de pacientes acometidas por gengivite quando
comparamos os grupos 2 e 3 e, portanto, não confirmamos a correlação com a
elevação dos níveis de estradiol e progesterona. Interrogamos a possibilidade de que
em nosso estudo, parte das pacientes foi adequadamente reclassificada como
portadora de periodontite, e não de gengivite exclusivamente, ao adotarmos também
o critério de NIC como parâmetro de avaliação periodontal, o que pode ter provocado
a discordância assinalada.
No grupo 1, Pg se correlacionou com os níveis de progesterona (r = 0,516;
p = 0,041), assim como no trabalho de Carrillo-de-Albornoz et al., 2009 (8). Acredita-
se que Pg tenha se favorecido da elevação súbita dos níveis de progesterona no
primeiro trimestre da gestação (15), utilizando-a com fator de crescimento em
substituição à vitamina K. A não persistência desta correlação ao longo do segundo e
terceiro trimestre sugerem uma saturação das vias metabólicas envolvidas.
Comportamento semelhante já foi descrito para outro bacilo periodontopatogenico por
Carrillo-de-Albornoz et al., 2009 (8) e Kornman e Loesche, 1980 (6) que observaram
correlação positiva entre os níveis dos esteroides sexuais e presença de Prevotella
intermedia, Bacteróides melaninogenicus ss. e Fusobacterium nucleatum, porém
estes periodontopatógenos não foram avaliados em nossa pesquisa. Identificamos
55
uma tendência para correlação positiva entre quantificação bacteriana e nível de
estradiol no grupo 2 (p 0,093), porém sem atingir a significância estatística.
Este trabalho demonstrou diferenças quantitativas de Tf durante a
gestação, comparando os grupos 1 e 3, mas a maior prevalência de Tf entre as
gestantes do grupo 1 não demonstrou correlação positiva ou negativa com os níveis
hormonais, sugerindo que sua variação, não foi influenciada pelos esteroides
estudados. Todavia, o estudo de Laine et al., 1988 (79) evidenciou um aumento
significativo da peroxidase salivar durante o terceiro trimestre, e é possível que o papel
antibacteriano desta enzima tenha favorecido o decréscimo deste periodontopatógeno
durante a gestação. O efeito estrogênico sobre o comportamento desta enzima
também foi observado por Leimola-Virtanen et al., 2000 (80) avaliando mulheres antes
e após a menopausa.
56
7 CONCLUSÕES
Neste trabalho o diagnóstico clínico periodontal se correlacionou
positivamente com a quantificação da microbiota subgengival durante a gestação. Na
avaliação qualitativa dos periodontopatógenos, observamos que Tanerella forsithya
foi mais frequente entre gestantes de 1º trimestre quando comparadas com gestantes
do 3º trimestre e não gestantes, havendo decréscimo na sua quantificação durante a
gravidez. Este periodontopatógeno, por sua vez, se associou a um aumento dos casos
de gengivite entre as gestantes.
Observou-se correlação positiva entre os níveis séricos de progesterona
com a presença de Pg, mas não foi identificada influencia hormonal ou das variáveis
epidemiológicas sobre o diagnóstico clínico e contagem bacteriana total. Alta
prevalência de bactérias reconhecidamente patogênicas foi encontrada nesta
população de mulheres jovens, sem grande comprometimento atual de suas
condições clínicas, sugerindo que ações preventivas poderiam evitar uma futura
deterioração do seu status periodontal.
57
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65
ANEXOS
ANEXO 1
FICHA PARA COLETA DE DADOS
Identificação da Paciente
Data da entrevista:
Data da coleta microbiológica:
Nº na Pesquisa
Nome:
Endereço:
Local em que está sendo realizado o PN:
Nº do Prontuário:
Idade:
Data de nascimento: Raça: ( ) Branca ( ) Não Branca
Estado Civil:
Você tem Companheiro? ( ) Sim ( ) Não
Mora com você? ( ) Sim ( ) Não
Telefones para contato:
Outros telefones para contato:
66
Levantamento Socioeconômico
1 - Nível Educacional da Paciente (1), Chefe da Família(2):
Nunca estudou
1 a 4 série do 1 grau
5 a 8 série do 1 grau
2 grau incompleto
2 grau completo
universitário incompleto
universitário completo
2 - Renda mensal em salários mínimos:
1 – ( ) Até 1 2 – ( ) 2 3 – ( ) 3 4 – ( )
entre 3 e 5
5 – ( )
entre 5 e 10
6 – ( )
entre 10 e 20
7 – ( ) +20 8 – ( )
não recebe salário
9 – ( ) Não respondeu
3 - Anote na coluna correspondente a quantidade de bens que possui:
Televisão em cores 0 1 2 3 4 ou mais
Radio 0 1 2 3 4 ou mais
Banheiro da sua residência 0 1 2 3 4 ou mais
Automóvel 0 1 2 3 4 ou mais
Empregada mensalista 0 1 2 3 4 ou mais
Maquina de lavar 0 1 2 3 4 ou mais
Videocassete ou DVD 0 1 2 3 4 ou mais
Geladeira 0 1 2 3 4 ou mais
Freezer 0 1 2 3 4 ou mais
4 - Como você mora atualmente?
1 ( ) Casa própria 2 ( ) Casa alugada 3 ( ) Quarto alugado
4 ( ) Apartamento próprio 5 ( ) Apartamento alugado
6 ( ) Habitação coletiva (hotel, pensionato, república) 7 ( ) Outra situação
5 - Quem mora com você?
1 ( ) Moro sozinho(a) 2 ( ) Pai e/ou mãe 3 ( ) Esposo(a) / companheiro(a) 4 ( ) Filhos(as) 5 ( ) Irmãos(ãs)
6 ( ) Outros parentes, amigos(as) ou colegas 7 ( ) Outra situação
6 - Quantas pessoas moram em sua casa?
(Contando com seus pais, irmãos ou outras pessoas que moram na mesma casa)
1 ( ) Moro sozinho (a) 2 ( ) Duas pessoas 3 ( ) Três pessoas
4 ( ) Quatro pessoas 5 ( ) Cinco pessoas 6 ( ) Mais de seis pessoas
67
Dados Obstétricos
1- Esta foi a primeira vez que você ficou grávida? ( ) Sim ( ) Não
2- Você teve algum aborto?
Não
Sim
Quantidade – Provocado
Quantidade – Espontâneo
3- Número de gestações prévias? _____________
4- Possui quantos filhos? ______________
5- Semana de Gestação na data de hoje: __________
6- Quantos de seus filhos nasceram de parto normal? __________ e de cesariana? _________
7- Todos os seus filhos nasceram vivos? ( ) Sim ( ) Não
8- Quantos nasceram mortos? _____________
9- Desta vez você queria ficar grávida? ( ) Sim ( ) Não
10- Data de início dos cuidados pré-natal: ___________________
11- Data da última menstruação: __________________________
12- Peso anterior/atual: _________/________
13- Estatura: ____________
14- Hospitalização na gravidez: _______
Número de dias:________________
Motivo:_______________________
15-
Antecedentes Familiares
Sim Não
Diabetes
Hipert. Art.
Gemelares
Câncer
Outros
16-
Antecedentes Pessoais
Sim Não
Infecção Urinária
Infertilidade
Diabetes
Hipert. Crônica
Cirurg Pélv. Uterina
Câncer
Outros
68
Dados Ginecológicos
1- Você ficou grávida alguma vez ? ( ) Sim ( ) Não
2- Você teve algum aborto?
Não
Sim
Quantidade – Provocado
Quantidade – Espontâneo
3- Número de gestações prévias? _____________
4- Possui quantos filhos? ______________
5- Quantos de seus filhos nasceram de parto normal? __________ e de cesariana? _________
6- Todos os seus filhos nasceram vivos? ( ) Sim ( ) Não
7- Quantos nasceram mortos? _____________
8- Data da última menstruação: __________________________
9- Você usa anticoncepcional? ( ) Sim ( ) Não
10- Você já usou anticoncepcional alguma vez? ( ) Sim ( ) Não
11- Há quanto tempo você não usa anticoncepcional ? __________________________
12- Seus ciclos menstruais são regulares? ? ( ) Sim ( ) Não
13- Peso anterior/atual: _________/________
14- Estatura: ____________
15- Hospitalização anterior: _______
Número de dias:________________
Motivo:_______________________
16-
Antecedentes Familiares
Sim Não
Diabetes
Hipert. Art.
Gemelares
Câncer
Outros
17-
Antecedentes Pessoais
Sim Não
Infecção Urinária
Infertilidade
Diabetes
Hipert. Crônica
Cirurg Pélv. Uterina
Câncer
Outros
69
ANEXO 2
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Título do Projeto: Avaliação periodontal clínica e microbiológica, nos diferentes
trimestres da gestação, correlacionada com os níveis sanguíneos de estradiol e
progesterona.
Pesquisador (a) responsável: Profa. Renata Santos de Souza Massoni
Telefone para contato: (65) 99978-9447 e (65) 8112-2528 (inclusive ligações a cobrar)
Pesquisadores participantes: Profa. Dra. Alessandra Nogueira Porto
Profa. Ms. Fernanda Zanol
Você está sendo convidada para participar, como voluntária, em uma pesquisa. Após
ser esclarecida sobre as informações a seguir, no caso de aceitar fazer parte do estudo, assine
ao final deste documento, que está em duas vias. Uma delas é sua e a outra é do pesquisador
responsável. Em caso de recusa você não será penalizada de forma alguma. Desde logo fica
garantido o sigilo das informações. Caso tenha dúvidas você pode procurar a Universidade de
Cuiabá (UNIC) Unidade Beira Rio pelo telefone (65) 3363-1271. Queremos também lhe
informar que este estudo foi avaliado pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da Universidade
de Cuiabá, localizado na Avenida Manoel José de Arruda, 3100, Bloco de Saúde I, sala 328 -
Jardim Europa – Cuiabá –MT, CEP: 78.065-900, Fone: (65)3363-1271 e E-mail:
[email protected]. O horário de funcionamento do CEP é de segunda a sexta-feira das
14:00 as 17:30 horas.
O presente projeto pretende avaliar a saúde bucal de mulheres dentro e fora do período
gestacional, contribuindo com a disseminação de bons hábitos para o processo de saúde bucal
e geral; estimulando também o processo da amamentação e fornecendo orientações que se
estendam após o parto, no cuidado pessoal e com o bebê. As pacientes serão divididas em
grupos de acordo com o tempo de gravidez: no primeiro grupo ficarão as gestantes com até 98
dias de gravidez, no segundo grupo gestantes com 99 a 196 dias de gravidez e no terceiro grupo
gestantes com 197 ou mais dias de gravidez. Um quarto grupo será formado pelas pacientes
que não estão gestantes.
Você será convidada a responder um questionário informando dados socioeconômicos,
obstétricos ou ginecológicos. Também lhe será perguntado sobre seus hábitos e higiene, sobre
o impacto da saúde bucal em sua vida e também sobre o seu nível de ansiedade. Caso se sinta
constrangida, ou desconfortável de qualquer forma, você pode se recusar a responder qualquer
destas perguntas, não implicando em prejuízo algum ao seu atendimento.
Nessa investigação científica, serão examinados a presença de doença cárie, doença
periodontal, dentes perdidos, dentes restaurados e exame microbiológico. O exame é uma
observação da boca, com toda técnica, segurança e higiene. Será realizado por um examinador
Doutor em Periodontia, em uma sala pré-definida do ambulatório de pré-natal, sob luz natural,
com auxílio de espelho clínico e sonda periodontal milimetrada. O exame em geral não gera
desconforto para quem será examinado, serão utilizadas máscara, gorro e luvas descartáveis,
assim como de material previamente esterilizado para garantir a higiene e sua segurança. Os
benefícios que você terá na participação serão indiretos e relacionados a um melhor
conhecimento a respeito das doenças bucais e, no caso das gestantes, quais as possíveis
complicações para a grávida e seu bebê.
70
Será realizada uma coleta única de sangue por punção venosa no antebraço para dosar
os hormônios estradiol e progesterona. A coleta vai ocorrer na mesma oportunidade em que
serão realizados os seus exames de rotina de pré-natal ou ginecológica, evitando-se punção
exclusivamente para este fim. A data e horário para a realização destes exames serão agendados
pela secretária do ambulatório de medicina e a coleta será executada por um técnico de
enfermagem nas dependências do laboratório de análises clínicas do Hospital Geral
Universitário ou no posto de coleta do ambulatório de medicina da UNIC Beira Rio.
As informações obtidas serão sigilosas e seu nome não será identificado em nenhum
momento. Não haverá qualquer tipo de constrangimento ou coação para o preenchimento deste
termo de consentimento, sendo dada total liberdade de recusar a participar em qualquer tempo.
Os dados serão guardados em local seguro e a divulgação dos resultados será feita de forma a
não identificar os voluntários. Ainda essa coleta não trará nenhuma alteração ou prejuízo na
paciente ou no bebê, visto que não haverá procedimento invasivo.
Caso seja detectado algum problema de saúde bucal que exija atendimento
odontológico, você será devidamente orientado(a) procurar tratamento na Faculdade de
Odontologia da UNIC, sendo as gestantes encaminhadas à Clínica de Pacientes Especiais e as
não gestantes para a Clínica de Atenção Básica.
Nome e assinatura do pesquisador (a)
_______________________________________________
CONSENTIMENTO DE PARTICIPAÇÃO DA PESSOA COMO SUJEITO
Eu,__________________________________________________________RG:_____
____________CPF _________________________, número do prontuário:
____________________, abaixo assinado, concordo em participar do estudo “Pré-Natal
Odontológico: Integração da Odontologia e Medicina”, como sujeito. Fui devidamente
informado (a) e esclarecido (a) pelo(a) pesquisador (a) _____________________ sobre a
pesquisa, os procedimentos nela envolvidos, assim como os possíveis riscos e benefícios
decorrentes de minha participação. Foi me garantido que posso retirar meu consentimento a
qualquer momento, sem que isso leve á qualquer penalidade ou interrupção de meu
acompanhamento, assistência ou tratamento. Local:___________________________ Data:_____________________
Nome e assinatura do sujeito ou responsável: _________________________________________
Presenciamos a solicitação do consentimento e esclarecimento sobrea pesquisa e a aceitação do sujeito
em participar.
Nome:__________________________________________________Assinatura_________________
Nome: _________________________________________________ Assinatura_________________
71
ANEXO 3
72
73
74
ANEXO 4