Replikacija DNA
Vjeran prijenos genetičke informacije s roditelja na potomstvo Semikonzervativna replikacija – dva lanca DNA mogu se razdvojiti i
služiti kao kalup za sintezu novog lanca – svaka nova molekula DNA sadrži jedan roditeljski lanac
Točna replikacija ključna za život svih stanica i organizma Kad se stanica dijeli cjelokupan genom mora biti udvostručen Potrebna prisutnost cijelog niza enzima Glavni enzim – DNA polimeraza – katalizira spajanje deoksiribonukleozid-
5’-trifosfata (dNTP) Nužna prisutnost korigirajućih mehanizama kako bi učestalost pogrešaka
bila što manja
DNA polimeraze – eukarioti
polimeraze: α,γ,δ i ε. Polimeraza γ – u mitohondrijima Preostala četiri enzima u jezgri
Sve polimeraze sintetiziraju DNA samo u 5’ prema 3’ kraju dodajući dNTP na 3’ hidroksilnu skupinu rastućeg lanca
DNA polimeraze mogu dodati nove dNTP samo na prethodno formirani lanac početnice koje su vodikovim vezama spojene s kalupom
DNA polimeraze ne mogu de novo započeti sintezu novog lanca, za razliku od RNA polimeraza
Sinteza u smjeru 5’→3’
Autoradiografijom s H3 timidinom obilježena je DNA i vizualizirana fotografskim filmom. Ovaj shematski prikaz ilustrira dvije replikacijske rašlje
Replikacijske rašlje
Lanci DNA su antiparalelni, teku u suprotnim smjerovima. Ne mogu se oba kontinuirano sintetizirati u 5’ prema 3’
smjeru. Samo se jedan lanac sintetizira kontinuirano (vodeći lanac), a
drugi u kratkim diskontinuiranim Okazakijevim fragmentima (zaostali, tromi lanac)
RNA polimeraza može započeti sintezu de novo, a enzim nazvan primaza sintetizira kratke fragmente RNA (3-10 nukleotida). Okazakijevi fragmenti sintetiziraju se produljenjem ovih RNA početnica.
DNA ligaza spaja kratke fragmente
Replikacijske rašlje
Sinteza vodećeg i tromog lanca
Inicijacija Okazakijevih fragmenata RNA-početnicama
Uklanjanje RNA početnica i spajanje Okazakijevih fragmenata
Glavna replikacijska polimeraza je polimeraza III koja obavlja sintezu vodećeg lanca i Okazakijevih fragmenata produljenjem RNA početnice
Polimeraza I uklanja RNA početnicu i popunjava pukotine između Okazakijevih fragmenata
Polimeraza I posjeduje 3’→5’ i 5’ → 3’ egzonukleaznu aktivnost
5’ → 3’ egzonukleaznom aktivnošću se uklanjaju ribonukleotidi s 5’ krajeva Okazakijevih fragmenata
Prokarioti – E. coli
Polimeraza α u kompleksu s primazom sudjeluje u sintezi RNA početnica
Polimeraza δ sintetizira vodeći lanac. Polimeraza ε sintetizira tromi lanac. Polimeraza δ također
popunjava pukotine nakon uklanjanja početnice kombiniranim djelovanjem RNaze H i 5’ → 3’ egzonukleazom.
Eukarioti
Uloga DNA polimeraza u E. coli i stanicama sisavaca
Polimeraza III E. coli i eukariotske polimeraze δ i ε združene su s dvije vrste pomoćnih proteina:
Proteini za stavljanje stezaljke (RFC), clamp loading proteins specifično prepoznaju i vežu se na mjesto spajanja početnice i kalupa
Proteini kližuće stezaljke (PCNA), sliding-clamp proteins vežu se na protein za stavljanje stezaljke (RFC) i stvaraju prsten oko DNA kalupa nakon čega se DNA polimeraza veže za PCNA odnosno na mjesto spajanja početnice i kalupa
Prsten stvoren PCNA proteinima održava združenost polimeraze s njenim kalupom
Pomoćni proteini DNA polimeraze
Helikaze su enzimi koji kataliziraju razmotavanje roditeljske DNA ispred replikacijskih rašlji
Proteini koji vežu jednolančanu DNA, single stranded DNA-binding proteins, nakon toga stabiliziraju razmotani DNA kalup održavajući ga ispruženim.
Topoizomeraza katalizira reverzibilno kidanje i ponovno spajanje lanaca DNA. Topoizomeraza I kida samo jedan lanac, a topoizomeraza II oba lanca.
Prekidi nastali djelovanjem topoizomeraze služe za slobodno odmatanje (rotiranje) lanaca DNA oko kalupa da se spriječi uvijanje DNA ispred replikacijskih rašlji
Ostali pomoćni enzimi
Djelovanje helikaze i proteina koji veže jednolančanu DNA
Djelovanje topoizomeraze za vrijeme replikacije DNA
Sinteza tromog i vodećeg lanca se odvija istovremeno Stvaraju se dimeri replikativnih DNA polimeraza s pratećim
proteinima Jedna molekula DNA polimeraze sintetizira vodeći, a druga
tromi lanac Tromi lanac stvara petlju ispod replikacijskih rašlji tako da se
podjedinica DNA polimeraze koja ga sintetizira kreće u istom smjeru kao i podjedinica koja sintetizira vodeći lanac
Model replikacijskih rašlji E. coli
http://sites.sinauer.com/cooper6e/animation0601.html
Učestalost pogrešaka u replikaciji – jedna pogrešno ugrađena baza na svakih 109 do 1010 ugrađenih nukleotida.
na osnovi komplementarnosti sparivanja baza – 1 pogreška na 103 nukleotida.
Polimeraza aktivno diskriminira ugradnju pogrešne baze. Sparivanje komplementarnih nukleotida inducira konformacijske promjene DNA polimeraze koje dovode do ugradnje ispravnog nukleotida u DNA – smanjenje greške pri replikaciji na 10-6
Vjernost replikacije
Korektivna aktivnost DNA polimeraze
Mehanizam odgovoran za daljnju preciznost replikacije Polimeraza I E. coli ima 3’→5’ kao i 5’→3’
egzonukleaznu aktivnost. 5’→3’ aktivnost djeluje u smjeru DNA sinteze i pomaže
uklanjanju RNA-početnice iz Okazakijevih fragmenata. 3’→5’ aktivnost djeluje u suprotnom smjeru od sinteze
DNA i provjerava točnost novog lanca. Smanjivanje pogrešaka na 10-9
Korektivna aktivnost DNA polimeraze
Ishodište replikacije – specifično vezno mjesto za proteine koji iniciraju proces replikacije.
Bakterije – ishodište replikacije je građeno od 245 parova baza. Za to mjesto prvo se veže inicijacijski protein – započinje razmatanje dvostruke uzvojnice.
Veže se helikaza i proteini koji vežu jednolančanu DNA Primaza započinje sintezu vodećeg lanca Formiraju se dvije replikacijske rašlje i sinteza teče u
suprotnim smjerovima.
Ishodište i inicijacija replikacije
Ishodište replikacije E. coli
E. coli (4x106 parova baza) – jedno ishodište replikacije Vrijeme replikacije – 30 min Sisavci (3x109 parova baza) – kada bi bilo jedno ishodište
replikacije trebala bi 3 tjedna za replikaciju cijele DNA Brzina replikacije u stanicama sisavaca 10 puta sporija od
bakterija zbog pakiranja kromatina. Više tisuća replikacijskih mjesta – replikacija unutar nekoliko
sati Ishodišta replikacije udaljena 50-300 kb, humani genom ima
oko 30 000 ishodišta replikacije.
Ishodišta replikacije u eukariotskim kromosomima
Telomere i telomeraza
DNA polimeraze nisu u stanju produljiti krajnje 5’ dijelove linearnih molekula (replikacija ide u 5’→3’) – posebni mehanizmi replikacije
Telomere – terminalni dijelovi kromosoma. Uzastopna ponavljanja jednostavnih sljedova DNA
Enzim telomeraza – sposoban replicirati krajnje dijelove DNA u odsutnosti DNA – kalupa.
Telomeraza je reverzna transkriptaza – sintetizira DNA na osnovu RNA kalupa.
Telomerazni enzimski kompleks sadrži svoj vlastiti RNA-kalup komplementaran s ponavljajućim telomernim sljedovima.
Djelovanje telomeraze
Za bolje razumijevanje pogledati:http://www.youtube.com/watch?v=AJNoTmWsE0s