REPLIKACIJA, ODRAVANJE I REARANIRANJE GENOMSKE DNA

REPLIKACIJA, ODRAVANJE I PRESLAGIVANJE GENOMSKE DNA

Osnovni bioloki proces razmnoavanja zahtijeva vjerni prijenos genske informacije s roditelja na potomstvo. Zbog toga je tona replikacija genomske DNA kljuna za ivot svih stanica i organizama. Svaki puta kada se stanica dijeli, njen cjelokupni genom mora biti udvostruen, pri emu je za kopiranje velikih DNA molekula koje izgrauju prokariotske i eukariotske kromosome potrebno prisutsvo cijelog niza enzima. Uz to, stanice su razvile mehanizme za popravljanje pogreaka koje se ponekad dogaaju za vrijeme umnaanja DNA te za popravak oteenja koja nastaju kao rezultat djelovanja imbenika okolia kao to je zraenje. Nepravilnosti u ovim procesima rezultiraju nemogunou tone replikacije i odravanja genomske DNA grekom koja moe imati katastrofalne poslijedice kao to je razvoj karcinoma.

Unato vanosti precizne replikacije i odravanja DNA, stanini genomi su ipak podloni promjenama. Da bi se vrste evolucijski razvijale, potrebno je prisutstvo mutacija i preslagivanja gena kako bi se odrala genetika varijabilnost izmeu jedinki. Rekombinacija homolognih kromosoma za vrijeme mejoze igra vanu ulogu u ovom procesu dozvoljavajui roditeljskim genima da preslagivanjem (rearanmanom) stvaraju nove kombinacije u narednim generacijama. Smatra se da preslagivanjesljedova DNA unutar genoma stvaranjem novih kombinacija genetikih informacija takoer doprinosi evolucijskom razvoju. Uz to su neki oblici preslagivanja DNA programirani za regulaciju ekspresije gena tijekom diferencijacije i razvoja individualnih stanica i organizama. Karakteristian primjer tog procesa kod ljudi predstavlja preslagivanje imunoglobulinskih gena tijekom razvoja imunolokog sustava. Stoga je za razvoj pojedinanih organizama kao i za evoluciju vrsta potrebna suptilna ravnotea izmeu odravanja i varijabilnosti naslijednih informacija.

5.1 Replikacija DNA

Kao to je navedeno u treem poglavlju, replikacija DNA predstavlja semikonzervativni proces u kojem svaki roditeljski lanac slui kao kalup za sintezu novih, komplementarnih lanaca keri. Glavni enzim ukljuen u ovaj proces je DNA-polimeraza koja katalizira spajanje deoksiribonukleozid 5'-trifosfata (dNTP-a) rastueg DNA lanca. Ipak, DNA replikacija je znatno kompleksnija i zahtijeva vie od jedne enzimske reakcije. U cjelokupan proces su ukljueni brojni drugi proteini, a nuna je i prisutnost korigirajuih mehanizma kako bi se osiguralo da tonost replikacije bude kompatibilna s malom uestalou pogreaka to je potrebno za normalno odvijanje stanine reprodukcije. Dodatni proteini, kao i specifini DNA sljedovi, potrebni su i za inicijaciju replikacije i kopiranje krajeva eukariotskih kromosoma.

5.1.1 DNA-polimeraze

DNA-polimerazu prvi je otkrio Arhtur Kornberg 1956. u lizatima bakterije E.coli. Sposobnost ovog enzima da tono kopira DNA kalup pruila je biokemijsku podlogu za model replikacije DNA molekule kojeg su prvotno predloili Watson i Crick, tako da njena izolacija predstavlja jedno od temeljnih otkria molekularne biologije. Ironino, prva identificirana DNA-polimeraza (danas zvana polimeraza I) nije glavni enzim odgovoran za replikaciju DNA E.coli. Umjesto toga danas znamo da i prokariotske i eukariotske stanice sadre nekoliko DNA-polimeraza koje imaju razliite uloge u replikaciji i popravku DNA.

Viestrukost DNA-polimeraza prvi put je otkrivena izolacijom mutantnog soja E.coli s nedostatkom polimeraze I (slika 5.1). Kulture E.coli tretitane su kemijskim imbenikom (mutagen) koji inducira veliku uestalost mutacija, nakon ega su izolirane i ispitane pojedinane bakterijske kolonije kako bi se identificirao mutirani soj s nedostatkom polimeraze I. Analiza nekoliko tisua kolonija dovela je do izolacije eljenog mutanta kojemu je gotovo u potpunosti nedostajala aktivost polimeraze I. Zaudo, mutirana bakterija rasla je normalno to je vodilo do zakljuka da polimeraza I nije potrebna za replikaciju DNA. S druge strane, mutirane bakterije bile se iznimno osjetljive na imbenike koji oteuju DNA (primjerice UV zraenje) ukazujui na to da je polimeraza I ukljuena prvenstveno u popravak DNA oteenja, a ne u replikaciju DNA per se.

Zakljuak da polimeraza I nije potrebna za replikaciju implicirao je da E.coli mora sadravati druge DNA-polimeraze te su naknadni eksperimenti doveli do identifikacije dva enzima, danas poznatih kao DNA-polimeraza II i III. Potencijalna uloga ovih enzima ispitana je izolacijom odgovarajuih mutanata. Pokazalo se da sojevi E.coli s mutacijom polimeraze II rastu normalno, a uloga ovoga enzima u posebnom obliku popravka DNA sklonom pogrekama (prikazanom u odjeljku ''Popravak DNA'') tek je nedavno utvrena. Nasuprot tome, temperaturno osjetljivi mutanti s nedostatkom polimeraze III nisu bili u mogunosti replicirati svoju DNA pri visokoj temperaturi, a daljnje studije su potvrdile da je polimeraza III glavni replikacijski enzim E.coli.

Danas je poznato da je za replikaciju DNA E.coli uz polimerazu III potrebna i prisutnost polimeraze I. Prvotno opisani mutant za polimerazu I nije bio u potpunosti deficitaran za taj enzim, a daljnji eksperimenti pokazali su da prisutna aktivnost polimeraze I u tom soju igra kljunu ulogu u replikacijskom procesu. Replikacija DNA E.coli prema tome ukljuuje dvije razliite DNA-polimeraze ije su specifine uloge raspravljene u daljnjem tekstu.

Eukariotske stanice sadre pet tipinih DNA-polimeraza: (, (, (, ( i (. Polimeraza ( se nalazi u mitohondrijima i odgovorna je za replikaciju mitohondrijske DNA. Preostala etiri enzima smjetena su u jezgri i stoga je bilo opravdano vjerovati da su ukljueni u replikaciju jezgrine DNA. Polimeraze (, ( i ( najaktivnije su u stanicama koje se dijele, to sugerira njihovu ulogu za vrijeme replikacije. Nasuprot tome, polimeraza ( i ( podjednako su aktivne i u stanicama koje se dijele i u onima koje se ne dijele, to je u skladu s njihovom funkcijom u popravku DNA oteenja.

Dva tipa eksperimenata pruila su daljnje dokaze koji ukazuju na uloge polimeraza (, ( i ( u procesu replikacije DNA. Prvo, replikacija DNA nekih animalnih virusa poput SV40 moe se prouavati u bezstaninim (od engl. cell-free) ekstraktima. Prouavanje replikacije in vitro omoguilo je izravnu identifikaciju odgovornih enzima, a analiza takvih bezstaninih sustava pokazala je da su polimeraze ( i ( nune za replikaciju DNA virusa SV40. Drugo, polimeraze (, ( i ( naene su u kvascima kao i u stanicama sisavaca to je omoguilo direktno testiranje njihovih biolokih uloga na modelu kvasaca (vidi poglavlje 3). Studije genetike kvasaca ukazuju da su mutanti kvasaca s nedostatkom bilo kojeg od tri navedena enzima nesposobni za proliferaciju implicirajui kritinu ulogu polimeraze ( kao i polimeraze ( i ( u replikaciji DNA. Ipak, daljnje studije su pokazale da esencijalna funkcija polimeraze ( u kvascima ne zahtijeva njezino enzimsko djelovanje u svojstvu DNA-polimeraze. Stoga, uloga polimeraze ( u replikaciji DNA ostaje nejasna iako je mogue da funkcionira slino kao i polimeraza ( koja moe katalizirati DNA replikaciju u odsutnosti polimeraze (, kako u bezstaninim sustavima tako i u intaktnim kvascima.

Sve poznate DNA-polimeraze dijele dva osnovna svojstva koja su od presudne vanosti za replikaciju DNA (slika 5.2). Prvo, sve polimeraze sintetiziraju DNA samo u 5' ( 3' smjeru dodajui dNTP na 3' hidroksilnu skupinu rastueg lanca. Drugo, DNA-polimeraze mogu dodati nove dNTP samo na prethodno formirani lanac poetnice koji je vodikovim vezama spojen s kalupom - one nisu u mogunosti zapoeti sintezu DNA de novo katalizirajui polimerizaciju slobodnih dNTP-ova. S obzirom na to, DNA-polimeraze se razlikuju od RNA polimeraza koje mogu zapoeti sintezu novog RNA lanca u odsustvu poetnice. Kao to je opisano dalje u ovom poglavlju, navedene karakteristike DNA-polimeraza ine se kljunima za odravanje visoke vjernosti DNA replikacije potrebne za razmnoavanje stanica.

5.1.2 Replikacijske ralje

DNA molekule u procesu replikacije prvi je analizirao John Cairns u eksperimentima u kojima je E. coli uzgajana u prisutnosti radioaktivnog timidina to dozvoljava naknadnu vizualizaciju novoreplicirane DNA pomou autoradiografije (slika 5.3). U nekim sluajevima mogue je opaziti kompletne krune molekule u procesu replikacije. Ove DNA molekule sadre dvije replikacijske ralje koje predstavljaju podruja DNA sinteze. U svakim raljama roditeljski lanci DNA molekule su razdvojeni i sintetiziraju se dva nova lanca keri.

Sinteza novih DNA lanaca komplementarnih roditeljskim lancima DNA molekule postavlja vaan problem za razumijevanje biokemijskih procesa ukljuenih u replikaciju DNA. Budui da lanci dvolanane DNA uzvojnice teku u suprotnim (antiparalelnim) smjerovima, kontinuirana sinteza dvaju novih lanaca u replikacijskim raljama zahtijevala bi da jedan lanac bude sintetiziran u 5' ( 3' smjeru, dok se drugi sintetizira u suprotnom (3' ( 5') smjeru. No, DNA-polimeraza katalizira polimerizaciju dNTPa samo u 5' ( 3' smjeru. Kako se onda vri sinteza drugog DNA lanca?

Ova enigma rijeena je eksperimentima koji pokazuju da se samo jedan lanac DNA molekule sintetizira kontinuirano u smjeru sveukupne DNA replikacije dok se drugi formira iz kratkih diskontinuiranih ulomaka DNA (1-3 kb) koji se sintetiziraju unatrag u odnosu na smjer kretanja replikacijskih ralji (slika 5.4). Ovi mali ulomci novosintetizirane DNA (prema njihovom otkrivau, nazvani Okazakijevi fragmenti) spajaju se djelovanjem DNA-ligaze stvarajui cjeloviti novi DNA lanac. Kontinuirano sintetizirani lanac naziva se vodei lanac jer njegovo produljenje u smjeru kretanja replikacijskih ralji izlae kalup koji se koristi za sintezu Okazakijevih fragmenata drugog novog takozvanog zaostajueg ili tromog lanca.

Premda otkrie diskontinuirane sinteze tromog lanca daje mehanizam za produljenje oba DNA lanaca u replikacijskim raljama, ono postavlja sljedee pitanje: budui da DNA-polimeraza zahtijeva poetnicu i ne moe zapoeti sintezu de novo, kako zapoinje sinteza Okazakijevih fragmenata? Odgovor je da kratki fragmenti RNA slue kao poetnice za DNA replikaciju (slika 5.5).

Nasuprot DNA sintezi, sinteza RNA moe zapoeti de novo, a enzim zvan primaza sintetizira kratke fragmente RNA (primjerice dugake 3-10 nukleotida) komplementarne kalupu tromomog lanca u replikacijskim raljama. Okazakijevi fragmenti se zatim sintetiziraju produljenjem ovih RNA poetnica djelovanjem DNA-polimeraze. Otkrie RNA-DNA spojeva u novosintetiziranim Okazakijevim fragmentima pruilo je kljuni dokaz za ulogu RNA poetnica u replikaciji DNA.

Da bi se formirao kontinuirani zaostajui (tromi) lanac DNA, RNA poetnice se moraju na kraju ukloniti iz Okazakijevih fragmenata i zamijeniti s DNA sljedovima. Kod E.coli RNA poetnice se uklanjaju kombiniranim djelovanjem RNaze H, enzima koji degradira RNA lanac RNA-DNA hibrida, i polimeraze I. Ovo je aspekt DNA replikacije u E.coli u kojem DNA-polimeraza I igra kljunu ulogu. Uz njenu DNA-polimeraznu aktivnost, polimeraza I djeluje kao egzonukleaza koja moe hidrolizirati DNA (ili RNA) ili u 3' ( 5' ili u 5' ( 3' smjeru. 5' ( 3' egzonukleazna aktivnost polimeraze I uklanja ribonukleotide s 5' kraja Okazakijevih fragmenata te se oni zamjenjuju s deoksiribonukleotidima kako bi se stvorili fragmenti u potpunosti graeni od DNA sljedova (slika 5.6). U eukariotskim stanicama umjesto polimeraze I poetnice uklanja druga egzonukleaza, a pukotine izmeu Okazakijevih fragmenata popunjavaju se djelovanjem polimeraze (. Kao i kod prokariota ovi DNA fragmenti spajaju se zatim djelovanjem DNA-ligaze.

Vidljivo je da u replikacijskim raljama razliite DNA-polimeraze igraju zasebne uloge (slika 5.7). U prokariotskim stanicama, glavna replikacijska polimeraza je polimeraza III koja vri sintezu i vodeeg lanca DNA i Okazakijevih fragmenata produljenjem RNA poetnica. Polimeraza I zatim uklanja RNA poetnice i ispunjava pukotine izmeu Okazakijevih fragmenata. U eukariotskim stanicama, polimeraza ( pronaena je u kompleksu s primazom te se ini da zajedno s njom sudjeluje u sintezi kratkih RNA-DNA fragmenata tijekom sinteze tromog lanca. Polimeraza ( moe zatim izvriti sintezu i vodeeg i tromog lanca produavanjem DNA poetnica prvotno sintetiziranih djelovanjem kompleksa polimeraza (-primaza. Uz to, polimeraza ( moe nakon ukanjanja poetnica zauzeti mjesto polimeraze I E.coli u popunjavanju pukotina izmeu Okazakijevih fragmenata. Premda uloga polimeraze ( jo nije u potpunosti shvaena, njezino je djelovanje , ini se, slino djelovanju polimeraze (.

Uz polimeraze i primaze, u replikacijskim raljama aktivan je itav niz drugih proteina. Ti dodatni proteini identificirani su podjednako analizom mutanata E.coli defektnih za replikaciju DNA kao i proiavanjem proteina iz sisavaca, potrebnih za in vitro replikaciju SV40 DNA. Jedna skupina tih proteina potrebnih za replikaciju vee se za DNA-polimeraze pojaavajui njihovu aktivnost i zadravajui ih vezanima uz DNA kalup kako bi nastavile sintezu novog DNA lanca. Polimeraza III E.coli i eukariotske polimeraze ( i ( zdruene su s dvije vrste pomonih proteina (proteinima kliue stezaljke, engl. sliding-clamp proteins, i proteinima za stavljanje stezaljke, engl. clamp-loading proteins) koji postavljaju polimerazu na poetnicu i odravaju njenu stabilnu povezanost s kalupom (slika 5.8). Proteini za stavljanje stezaljke (u E.coli nazvani ( kompleks, a u eukariotima replikacijski faktor C, RFC) specifino prepoznaju i veu DNA na mjestu spajanja poetnice i kalupa. Proteini kliue stezaljke (( protein E.coli i proliferativni stanini jezgrin antigen, PCNA, engl. proliferating cell nuclear antigen) veu se na protein za stavljanje stezaljke i stvaraju prsten oko DNA kalupa. Proteini kliue stezaljke smjetaju zatim DNA-polimerazu u DNA na mjesto spajanja poetnice i kalupa. Prsten stvoren proteinima kliue stezaljke odrava zdruenost polimeraze s njezinim kalupom tijekom replikacijskog procesa dozvoljavajui neometanu ugradnju vie tisua nukleotida u novosintetizirani DNA lanac.

Drugi proteini razmotavaju DNA kalup i stabiliziraju jednolanana podruja (slika 5.9). Helikaze su enzimi koji kataliziraju razmotavanje roditeljske DNA ispred replikacijskih ralji to je povezano s hidrolizom ATP-a. Proteini koji veu jednolananu DNA (engl. single stranded DNA-binding proteins, primjerice eukariotski replikacijski faktor A, RFA) nakon toga stabiliziraju razmotani DNA kalup odravajui ga u ispruenom jednolananom stanju kako bi se mogao kopirati djelovanjem polimeraze.

Dok se lanci roditeljske DNA razmataju, DNA ispred replikacijskih ralji je prisiljena na rotaciju. Nekontrolirana rotacija dovela bi do toga da se krune DNA molekule (poput SV40 DNA i kromosoma E.coli) omotaju same oko sebe to bi na kraju blokiralo proces replikacije (slika 5.10). Ovaj problem rijeen je djelovanjem topoizomeraza, enzima koji kataliziraju reverzibilno cijepanje i ponovno spajanje DNA lanaca. Postoje dvije vrste ovih enzima: topoizomeraze tipa I cijepaju samo jedan lanac DNA, dok topoizomeraze tipa II istovremeno cijepaju oba lanca. Prekidi nastali djelovanjem topoizomeraza slue kao osi koje dozvoljavaju da se dva lanaca DNA kalupa slobodno rotiraju jedan oko drugoga tako da se replikacija moe nastaviti bez uvijanja DNA ispred replikacijskih ralji (slika 5.10). Premda su eukariotski kromosomi graeni od linearnih, a ne krunih DNA molekula, njihova replikacija takoer zahtijeva djelovanje topoizomeraza jer bi se u suprotnom kompletni kromosomi morali kontinuirano rotirati za vrijeme DNA sinteze.

Topoizomeraza tipa II potrebna je ne samo za razmotavanje DNA ve i za razmotavanje novorepliciranih krunih DNA molekula koje su postale meusobno isprepletene. ini se da je topoizomeraza tipa II u eukariotskim stanicama takoer ukljuena u kondenzaciju mitotskih kromosoma. Ispitivanja mutanata kvasaca, kao i eksperimenti na vonoj muici (Drosophila) te stanicama sisavaca, ukazuju da je topoizomeraza II potrebna za razdvajanje kromatida keri u mitozi sugerirajui njenu funkciju u razmotavanju novorepliciranih petlji DNA eukariotskih kromosoma.

Enzimi ukljueni u DNA replikaciju djeluju na koordiniran nain sintetizirajui istovremeno vodei i zaostajui lanac DNA u replikacijskim raljama (slika 5.11). Ovaj zadatak postie se stvaranjem dimera replikativnih DNA-polimeraza (polimeraza III kod E.coli ili polimeraze (/( kod eukariota) od kojih svaka sadri i odgovarajue pratee proteine. Jedna molekula polimeraze tada sintetizira vodei lanac dok druga djeluje u sintezi tromog lanca. Smatra se da zaostajui lanac stvara petlju u replikacijskim raljama tako da se podjedinica polimeraze ukljuena u sintezu tromog lanca kree u istom sveukupnom smjeru kao druga podjedinica koja sintetizira vodei lanac.

5.1.3 Vjernost replikacije

Preciznost umnaanja DNA kritina je za stanino razmnoavanje, a procjena mutacijskih stopa za razliite gene ukazuje da uestalost greaka tijekom replikacije odgovara samo jednoj pogrenoj bazi na svakih 109 do 1010 ugraenih nukleotida. Ova uestalost greaka znatno je manja od one koja bi se mogla predvidjeti samo na osnovu komplementarnosti sparivanja baza. Konkretno, razlika u slobodnoj energiji koja proistjee iz promjena u sparivanju vodikovim vezama izmeu korektno i nekorektno sparenih baza iznosi tek toliko da favorizira stvaranje komplementarnog baznog para za svega tisuu puta. Zbog toga bi izbor baza reguliran samo sparivanjem vodikovim vezama na temelju komplementarnosti rezultirao uestalou greaka koja odgovara ugradnji otprilike jedne pogrene baze na svakih 103 nukleotida. Mnogo vei stupanj vjernosti replikacije koji se ustvari postie proistjee uglavnom iz aktivnosti DNA-polimeraze.

Jedan od mehanizama kojim DNA-polimeraza poveava vjernost replikacije je taj da pomae u izboru odgovarajue baze za ugradnju u novosintetizirani lanac. Polimeraza ne katalizira ugradnju bilo kojeg nukleotida koji je vodikovim vezama povezan s lancem kalupa. Umjesto toga, ona aktivno diskriminira ugradnju pogrene baze prilagoavajui se konformaciji komplementarnog baznog para. Nedavna ispitivanja stukture nekoliko DNA-polimeraza ukazuju na to da vezanje korektno sparenih dNTP-ova inducira konformacijske promjene u DNA-polimerazi koje dovode do ugradnje nukleotida u DNA. Izgleda da sposobnost DNA-polimeraze da favorizira ugradnju pravilno sparenih nukleotida poveava preciznost replikacije za oko tisuu puta smanjujui time oekivanu uestalost greaka sa 10-3 na oko 10-6 puta.

Drugi glavni mehanizam odgovoran za preciznost DNA replikacije je korigirajua (proofreading) aktivnost DNA-polimeraze. Kao to je ve spomenuto, polimeraza I iz E.coli posjeduje 3'(5' kao i 5'(3' egzonukleaznu aktivnost. 5'(3' egzonukleaza djeluje u smjeru DNA sinteze i pomae u uklanjanju RNA poetnica iz Okazakijevih fragmenata. 3'(5' egzonukleaza djeluje u suprotnom smjeru od smjera DNA sinteze i sudjeluje u tonom oitavanju novosintetiziranog lanca (slika 5.12). Korekcija je efikasna jer DNA-polimeraza zahtijeva prisutnost poetnica i nije u stanju zapoeti sintezu de novo. Tijekom sinteze radije e se koristiti one poetnice koje su vodikovim vezama sparene s kalupom. Kada doe do ugradnje pogrene baze vrlo je vjerojatno da e se ona ukloniti 3'(5' egzonukleaznom aktivnou, a ne iskoristiti za nastavak sinteze. 3'(5' egzonukleazna aktivnost DNA-polimeraze I povezana je s 3'(5' egzonukleaznom aktivnou polimeraze III iz E.coli i eukariotskih polimeraza ( i ( koja selektivno isjeca nepravilno sparene baze ugraene na kraj rastueg DNA lanca poveavajui time vjernost replikacije za oko sto do tisuu puta.

Vanost korektnog oitavanja novosintetiziranog lanca moe objasniti zato DNA-polimeraze zahtijevaju prisutnost poetnica i kataliziraju rast lanaca DNA samo u 5'(3' smjeru. Kada se DNA sintetizira u 5'(3' smjeru energija potrebna za polimerizaciju proistjee iz hidrolize 5' trifosfatne skupine slobodnog dNTP-a dok se isti dodaje na 3' hidroksilnu skupinu rastueg lanca (vidi sliku 5.2). Nasuprot tome, kada bi se DNA produivala u 3'(5' smjeru, energija polimerizacije morala bi potjecati iz hidrolize 5' trifosfatne skupine terminalnih nukleotida ve ugraenih u DNA. To bi onemoguilo korektno oitavanje zbog toga to ukanjanje nepravilno sparenog terminalnog nukleotida takoer uklanja 5' trifosfatnu skupinu potrebnu kao izvor energije za daljnje produenje lanca. Prema tome, iako sposobnost DNA-polimeraze da vri produenje poetnice samo u 5'(3' smjeru ini replikaciju naizgled kompliciranom, ona je neophodna da bi osigurala precizno umnaanje genetikog materijala.

Uz sposobnost da razlikuje ugradnju pogreno sparene baze, korigirajua aktivnost DNA-polimeraze dovoljna je da smanji uestalost greaka replikacijskog procesa na otprilike jednu pogreno sparenu bazu na svakih 109 ugraenih nukleotida. Kako bi se uklonile pogreno sparene baze ugraene u novosintetiziranu DNA, djeluju dodatni mehanizmi (prikazani u odjeljku ''Popravak DNA''), osiguravajui time jo veu vjernost umnaanja genske informacije.

5.1.4 Ishodite i inicijacija replikacijeUmnaanje prokariotskih i eukariotskih DNA zapoinje na jedinstvenom mjestu zvanom ishodite replikacije koje slui kao specifino vezno mjesto za proteine koji iniciraju proces replikacije. Prvo ishodite replikacije opisano je u E.coli. Prvo je otkriveno da umnaanje uvijek zapoinje na jedinstvenom mjestu bakterijskog kromosoma, a detaljnije analize su pokazale da je ishodite replikacije graeno od 245 parova baza iji djelovi slue kao vezna mjesta za proteine potrebne za inicijaciju DNA replikacije (slika 5.13). Kljuni korak predstavlja vezanje inicijacijskog proteina za specifini nukleotidni slijed unutar ishodita ime zapoinje razmatanje dvostrukog heliksa. Osim toga, inicijacijski protein regrutira i druge poteine ukljuene u sintezu DNA. Nakon toga helikaza i proteini koji veu jednolananu DNA djeluju u daljnjem razmotavanju DNA kalupa, a primaza zapoinje sintezu vodeeg lanca. Formira se dvoje replikacijskih ralji u kojima sinteza tee u suprotnim smjerovima uzdu krunog kromosoma E.coli.

Prouavanje ishodita replikacije nekoliko animalnih virusa kao to je SV40 posluilo je kao model za istraivanje inicijacije DNA sinteze u eukariota. Ovaj virus posjeduje jedno ishodite replikacije (graeno od 64 parova baza) koje funkcionira i u inficiranim stanicama i u bezstaninim sustavima. Replikaciju zapoinje T antigen - protein kodiran virusnim genomom - koji se vee za ishodite replikacije i istovremeno djeluje kao helikaza. Za stabilizaciju razmotanog kalupa potrebno je prisutstvo proteina koji se vee za jednolananu DNA, a zatim kompleks DNA-polimeraza ( - primaza zapoinje sintezu DNA.

Premda su jednostruka ishodita dovoljna za replikaciju bakterijskih i virusnih genoma, za replikaciju mnogo veih genoma eukariotskih stanica unutar prihvatljivog vremenskog perioda potrebno je prisutsvo viestrukih ishodita replikacije. Tako se primjerice sveukupni genom E.coli (4 x 106 parova baza) replicira iz jednostrukog ishodita za otprilike 30 minuta. Kada bi se genom sisavaca (3 x 109 parova baza) replicirao istom brzinom iz jednog ishodita za replikaciju DNA bilo bi potrebno oko 3 tjedna (30 000 minuta). Takoer je poznato da je brzina replikacije DNA u stanicama sisavaca ustvari oko deset puta manja nego u E.coli, vjerojatno radi pakiranja eukariotske DNA u kromatin. Unato tome, genomi stanica sisavaca uglavnom se repliciraju unutar nekoliko sati, to zahtijeva koritenje vie tisua replikacijskih ishodita.

Prisutstvo viestrukih ishodita replikacije u eukariotskim stanicama prvi put je pokazano izlaganjem kulture stanica sisavaca radioaktivnom timidinu unutar razliitih vremenskih intervala to je praeno autoradigrafijom kako bi se detektirala novosintetizirana DNA. Rezultati takvih ispitivanja ukazuju da DNA sinteza zapoinje na vie mjesta iz kojih se zatim nastavlja u oba smjera uzdu kromosoma (slika 5.14). Ishodita replikacije u stanicama sisavaca meusobno su udaljena za otprilike 50 do 300 kb - prema tome humani genom ima oko 30 000 replikacijskih ishodita. Genomi jednostavnijih eukariota takoer posjeduju viestruka ishodita; tako primjerice replikacija u kvascima zapoinje u ishoditima meusobno udaljenim oko 40 kb.

Ishodita replikacije eukariotskih kromosoma prvi put su prouavana u kvascu S.cerevisiae u kojem su identificirani kao slijedovi koji podupiru replikaciju plazmida u transformiranim stanicama (slika 5.15). To je ujedno bio funkcionalni test za ove slijedove i do sada je izolirano nekoliko takvih elemenata (zvani autonomno replicirajui slijedovi ili ARS). Njihova uloga kao ishodita replikacije potvrena je direktnom biokemijskom analizom ne samo u plazmidima ve i u kromosomskoj DNA kvasaca.

Funkcionalni ARS elementi obuhvaaju oko 100 parova baza, ukljuujui slijed dug 11 parova baza koji je prisutan u mnogim razliitim ARS elementima (slika 5.16). Ovaj izvorni slijed (engl. core sequence) nuan je za funkciju ARS elemenata te predstavlja vezno mjesto za proteinski kompleks (zvan kompleks ishodita replikacije ili ORC od engl. origin replication complex) koji je potreban za inicijaciju DNA replikacije u ishoditima S.cerevisiae. ini se da ORC kompleks regrutira druge proteine prema ishoditu (ukljuujui DNA-helikazu), to dovodi do inicijacije replikacije. Mehanizam zapoinjanja DNA replikacije u S.cerevisiae prema tome izgleda slian onome u prokariotskim i eukariotskim virusima - inicijacijski protein se specifino vee za nukleotidni slijed ishodita replikacije.

Daljnja ispitivanja su pokazala da je uloga ORC proteina kao inicijatora replikacije konzervirana u svim eukariotima od kvasaca do sisavaca. Ipak, ishodita replikacije drugih eukariota znatno su manje definirana od ARS elemenata S. cerevisiae. Ishodita replikacije u genomu S. pombe nalaze se unutar nukleotidnog sljeda dugog 1 kb. Ona nemaju jasno definiranih ORC veznih mjesta kao to su ARS elementi S. cerevisiae ali sadre ponavljajue sljedove bogate AT bazama koji vjerojatno slue kao vezno mjesto za ORC kompleks. Otkriveno je da ishodite replikacije vone muice obuhvaa preko 2 kb dugi nukleotidni sljed te da sadri nekoliko ORC veznih mjesta ije sekvence jo nisu poznate. Kod sisavaca je lokalizirano nekoliko ishodita u podrujima genoma koja obuhvaaju nekoliko kilobaza. U drugim sluajevima, replikacija moe zapoeti u viestrukim ishoditima s velikom ''inicijacijskom zonom'' koja obuhvaa 10-50 kb. Stoga se ini da sekvence koje definiraju ishodite replikacije znatno variraju unutar eukariota iako je uloga ORC proteina kao inicijatora replikacije vrlo konzervirana.

5.1.5 Telomere i telomeraze: umnaanje krajeva kromosoma

Budui da DNA-polimeraze produuju poetnice samo u 5'(3' smjeru, one ne mogu kopirati krajnje 5' djelove linearnih DNA molekula. Zbog toga su za replikaciju terminalnih sljedova linearnih eukariotskih kromosoma potrebni posebni mehanizmi. Terminalni djelovi kromosoma (telomere) graeni su od uzastopnih ponavljanja jednostavnih DNA sljedova (vidi poglavlje 4). Telomere se odravaju djelovanjem posebnog enzima, zvanog telomeraza, koji je sposoban replicirati krajnje DNA sljedove u odsutnosti DNA kalupa.

Telomeraza je reverzna-transkriptaza, tip DNA-polimeraze koji sintetizira DNA uz pomo RNA kalupa, a prvi je puta otkrivena u retrovirusima (vidi poglavlje 3). Vano je napomenuti da je telomeraza enzimski kompleks koji sadri svoj vlastiti RNA kalup komplementaran s ponavljajuim telomernim sljedovima kromosoma. Koritenje RNA kalupa omoguuje telomerazi da stvori viestruke kopije ponavljajuih sljedova telomera odravajui ih na taj nain u odsustvu konvencionalnog DNA kalupa.

Mehanizam telomerazne aktivnosti objasnili su 1985. godine Carol Greider i Elizabeth Blackburn prouavajui protozou Tetrahymena (slika 5.17). Telomeraza Tetrahymena nalazi se u kompleksu s 159 nukleotida dugom RNA koja sadri slijed 3'-AACCCCAAC-5'. Ovaj je slijed komplementaran s telomernim ponavljanjem Tetrahymena (5'-TTGGGG-3') i slui kao kalup za sintezu telomerne DNA. Koritenje ove RNA kao kalupa dozvoljava telomerazi da produi 3' kraj kromosomske DNA za jednu ponavljajuu jedinicu vie od originalne duljine. Komplementarni lanac se moe tada sintetizirati djelovanjem kompleksa polimeraza (-primaza koritenjem konvencionalne RNA poetnice. Uklanjanje RNA poetnice ostavlja jednolanani 3' kraj kromosomske DNA koji moe stvarati petlje na kraju eukariotskih kromosoma (vidi sliku 4.22).

Telomeraze su otkrivene u razliitim eukariotima, a geni koji kodiraju telomerazne RNA klonirani su iz Tetrahymena, kvasaca, mia i ovjeka. Telomerazna RNA uvijek sadri sljedove komplementarne s ponavljajuim slijedom telomere organizma iz kojeg je izolirana (vidi tablicu 4.4). Uloga telomeraze u odravanju krajeva eukariotskih kromosoma dokazana je i unoenjem mutiranih telomeraznih RNA gena u kvasce to je rezultiralo odgovarajuim promjenama ponavljajuih sljedova na krajevima kromosoma.

2 Popravak DNADNA, kao i svaka druga molekula, moe biti izloena razliitim kemijskim reakcijama. Budui da DNA slui kao jedinstvena, trajna kopija staninog genoma, promjene njene strukture imaju znatno vee posljedice nego promjene drugih staninih komponenti, poput RNA ili proteina. Mutacije mogu proizii iz ugradnje pogrene baze za vrijeme umnaanja DNA. Uz to, u molekuli DNA dogaaju se razliite kemijske promjene , bilo spontano (slika 5.18) bilo kao posljedica izloenosti kemikalijama ili zraenju (slika 5.19). Takva oteenja DNA mogu blokirati replikaciju ili transkripciju, a mogu i rezultirati visokom uestalou mutacija ije su posljedice neprihvatljive s gledita stanine reprodukcije. Da bi odrale integritet svojeg genoma stanice su morale razviti mehanizme za popravak DNA oteenja. Mehanizmi popravka DNA mogu se podijeliti u dvije ope grupe: (1) direktni obrat kemijske reakcije odgovorne za oteenje DNA i (2) uklanjanje oteenih baza nakon ega slijedi njihova zamjena s novosintetiziranom DNA. U sluajevima kada zataje oba mehanizma popravka DNA evolucija je razvila dodatne mehanizme koji stanici pomau da se nosi s oteenjima.

2.1 Izravni obrat DNA oteenja

Veina DNA oteenja popravlja se uklanjanjem oteene baze nakon ega slijedi ponovna sinteza uklonjenog podruja. Neke DNA lezije se ipak mogu popraviti izravnim obratom oteenja to moe biti znatno uinkovitiji nain borbe sa specifinim tipom DNA oteenja koji se uestalo deava. Samo nekoliko tipova DNA oteenja popravlja se na ovaj nain - pirimidinski dimeri nastali kao rezultat izlaganja ultraljubiastom (UV) svjetlu i alkilirani gvaninski ostaci, modificirani dodatkom metilne ili etilne skupine no O6 poziciju purinskog prstena.

UV svjetlo jedan je od znaajnijih izvora DNA oteenja, a takoer je najvie proueni tip oteenja u smislu mehanizama popravka. Na njegovu vanost ukazuje injenica da izlaganje sunevom UV zraenju predstavlja uzrok gotovo svih karcinoma koe kod ljudi. Glavni tip oteenja induciran UV svjetlom je formiranje pirimidinskih dimera u kojem su susjedni pirimidini na istom lancu DNA spojeni uz pomo ciklobutanskog prstena nastalog zasienjem dvostruke veze izmeu petog i etog atoma ugljika (vidi sliku 5.19A). Stvaranje ovakvih dimera naruava strukturu DNA lanca i blokira transkripciju ili replikaciju nizvodno od mjesta oteenja pa je njihov popravak usko povezan sa sposobnou stanica da preive UV zraenje. Jedan od mehanizama za popravljanje UV induciranih pirimidinskih dimera je direktni obrat dimerizacijske reakcije. Proces se naziva fotoreaktivacija jer se za kidanje strukture ciklobutanskog prstena koristi energija vidljive svjetlosti (slika 5.20). Fotoreaktivacijom izvorna pirimidinska baza, vraena u normalno stanje, ostaje u molekuli DNA.. Kako je sunevo UV zraenje glavni izvor oteenja molekule DNA u razliitim tipovima stanica, logino je za oekivati da je popravak pirimidinskih dimera fotoreaktivacijom zajedniki razliitim prokariotskim i eukariotskim stanicama, ukljuujui E.coli, kvasce i neke vrste biljaka i ivotinja. Zanimljivo je, ipak, da fotoreaktivacija nije univerzalana; mnoge vrste (ukljuujui ovjeka) nemaju ovaj mehanizam popravka DNA.

Drugi oblik direktnog popravka odnosi se na oteenja proizila iz reakcije izmeu alkilirajuih imbenika i DNA. Alkilirajui imbenici su reaktivne komponente koje mogu prenijeti metilnu ili etilnu skupinu na DNA bazu i time je kemijski modificirati (vidi sliku 5.19B). Osobito vaan tip oteenja je metilacija O6 pozicije gvanina stoga to nastali produkt, O6-metilgvanin, stvara komplementarne bazne parove s timinom umjesto s citozinom. Ova lezija moe biti popravljena djelovanjem enzima, zvanog O6-metilgvanin metiltransferaza, koji prenosi metilnu skupinu s O6-metilgvanina na cisteinski ostatak u svom aktivnom mjestu (slika 5.21). Time je uklonjena potencijalna mutagena kemijska modifikacija i restauriran izvorni gvanin. Enzimi koji kataliziraju ovu direktnu reakciju popravka zastupljeni su u znatnom broju prokariotskih i eukariotskih organizama, ukljuujui i ovjeka.

2.2 Ekscizijski popravak

Premda je direktni popravak efikasan nain noenja s odreenim tipovima DNA oteenja, ekscizijski popravak predstavlja openitiji nain popravka iroke skupine kemijskih promjena DNA molekule. Prema tome, razliiti tipovi ekscizijskog popravka predstavljaju najvanije mehanizme popravka DNA kako u prokariotskim tako i u eukariotskim stanicama. U ekscizijskom popravku, oteena DNA biva prepoznata i uklonjena bilo u vidu slobodnih baza ili nukleotida. Nastala pukotina se zatim popunjava sintezom novog DNA lanca koritenjem neoteenog komplementarnog lanca kao kalupa. Tri tipa ekscizijskog popravka ekscizija baza, ekscizija nukleotida i popravak krivo sparenih baza (engl. mismatch repair) omoguavaju stanicama da se bore sa irokim spektrom razliitih DNA oteenja.

Popravak molekule DNA koja sadri uracil predstavlja dobar primjer popravka ekscizijom baza, u kojem jedna oteena baza biva prepoznata i uklonjena iz DNA molekule (slika 5.22). Uracil se moe pojaviti u DNA putem dva mehanizma: (1) Uracil (kao dUTP deoksiuridin-trifosfat) se povremeno ugrauje na mjestu timina za vrijeme DNA sinteze i (2) uracil se moe pojaviti u DNA deaminacijom citozina (vidi sliku 5.18A). Drugi mehanizam je od mnogo vee bioloke vanosti budui da mijenja normalni obrazac komplementarnog sparivanja baza i time predstavlja mutageni dogaaj. Ekscizija uracila katalizirana je djelovanjem DNA-glikozilaze, enzima koji kida vezu izmeu baze (uracila) s deoksiribozom DNA okosnice. Ova reakcija stvara slobodni uracil i apirimidinsko mjesto eer bez pridruene baze. DNA-glikozilaze takoer prepoznaju i uklanjaju druge nepravilne baze ukljuujui hipoksantin stvoren deaminacijom adenina, pirimidinske dimere, alkilirane purine (osim O6-alkil gvanina) i baze oteene oksidacijom ili ionizirajuim zraenjem.

Rezultat aktivnosti DNA-glikozilaze je formiranje apirimidinskog ili apurinskog mjesta (uobiajeno zavano AP mjesto) u DNA. Slina AP mjesta nastaju kao rezultat spontanog gubitka purinskih baza (vidi sliku 5.18B), to se dogaa s znaajnom uestalou u normalnim staninim uvjetima. Tako se primjerice procjenjuje da svaka stanica u ljudskom tijelu dnevno gubi nekoliko tisua purinskih baza. Ta mjesta se popravljaju djelovanjem AP-endonukleaze koja cijepa DNA lanac uz AP mjesto (vidi sliku 5.22). Preostali deoksiribozni ostatak se zatim ukloni, a nastala pukotina od jedne baze popunjava se djelovanjem DNA-polimeraze i ligaze.

Dok DNA-glikozilaze prepoznaju samo specifine oblike oteenih baza, drugi sustavi ekscizijskog popravka prepoznaju iroku skupinu oteenih baza koje naruavaju strukturu DNA molekule, ukljuujui pirimidinske dimere inducirne UV zraenjem i velike skupine dodane bazama DNA kao rezultat interakcije mnogih kancerogen s DNA (vidi sliku 5.19C). Ovaj iroko rasprostranjeni oblik DNA popravka poznat je kao popravak ekscizijom nukleotida jer se oteene baze (primjerice dimeri timina) uklanjaju kao dio oligonukleotida koji sadri odreenu leziju (slika 5.23).

Kod E.coli popravak ekscizijom nukleotida kataliziran je djelovanjem produkata tri gena (uvrA, B i C) koji su otkriveni zahvaljujui injenici da mutacije ovih lokusa rezultiraju ekstremnom osjetljivou na UV svjetlo. Protein UvrA prepoznaje oteenu DNA i regrutira UvrB i UvrC k mjestu lezije. UvrB i UvrC zatim cijepaju lanac na 3' i 5' strani oteenog mjesta odvajajui oligonukleotid graen od 12 ili 13 baza. UvrABC kompleks se esto naziva ekscinukleaza, imenom koje odraava njegovu sposobnost da direktno isjeca (engl. excise) odreeni oligonukleotid. Nakon toga je potrebna aktivnost helikaze kako bi se iz dvolanane DNA molekule uklonio oligonukleotid koji sadi oteenje, a nastala pukotina popunjava se djelovanjem DNA-polimeraze i ligaze.

Sustav popravka ekscizijom nukleotida takoer je intenzivno prouavan u eukariotskim organizmima, ukljuujui kvasce, glodavce i ovjeka. U kvascima, kao i u E.coli, otkriveno je nekoliko gena ukljuenih u popravak DNA (nazvanih RAD geni engl. radiation sensitivity) izolacijom mutanata s poveanom osjetljivou na UV svjetlo. U ovjeka su geni DNA popravka otkriveni uglavnom prouavanjem osoba koje pate od nasljednih bolesti uzrokovanih nemogunou popravka DNA oteenja. Najintenzivnije prouavana od ovih bolesti je Xeroderma pigmentosum (XP), rijetki genetski poremeaj koji pogaa otprilike jednu od 25 000 osoba. Pojedinci s ovom boleu su ekstremno osjetljivi na UV zraenje i razvijaju multiple karcinome koe na podrujima tijela izloenima sunevom svijetlu. James Cleaver je 1968. godine doao do kljunog otkria da su kultivirane stanice izolirane iz pacijenata koji pate od Xeroderma pigmentosum deficitarne u sposobnosti provoenja popravka ekscizijom nukleotida. Ovo opaanje ne samo da je pruilo prvu vezu izmeu popravka DNA i karcinoma, ve je takoer predloilo koritenje XP stanica kao eksperimentalnih sustava za identifikaciju humanih gena ukljuenih u popravak DNA. Humani geni ukljueni u popravak DNA otkriveni su osim toga i prouavanjem druge dvije bolesti ljudi koje nastaju kao posljedica defekata u popravku DNA (Cockayne-ov sindrom i trihotiodistrofija), te prouavanjem UV senzitivnih staninih linija glodavaca. Vrata eksperimentalne analize popravka ekscizijom nukleotida u sustavima sisavaca otvorilo je kloniranje gena zaduenih za popravak DNA oteenja. Tome su pridonijeli eksperimenti prijenosa gena provedeni u stanicama sisavaca s defektima u popravku DNA, a koji se baziraju na sposobnosti alela divljeg tipa da restauriraju normalnu UV senzitivnost mutiranih stanica.

Molekularnim kloniranjem otkriveno je sedam razliitih gena popravka (oznaenih XPA do XPG) koji su mutirani kod osoba oboljelih od Xeroderma pigmentosum, a otkriveni su i geni mutirani u osoba koje pate od Cockayne-ovog sindroma i trihotiodistrofije, te geni u UV senzitivnim mutantama staninih linija glodavaca. Proteini kodirani ovim genima popravka oteenja DNA u sisavaca usko su srodni proteinskim produktima RAD gena kvasaca, to ukazuje na visoku konzerviranost mehanizma popravka ekscizijom nukleotida u eukariotskim organizmima. Kada su klonirani geni popravka u kvasaca i sisavaca bilo je mogue dobiti i proteine koje oni kodiraju u istom obliku te razviti in vitro sustave za ispitivanje njihove uloge u mehanizmima popravka (slika 5.24). Poetni korak popravka ekscizijom nukleotida u stanicama sisavaca ukljuuje prepoznavanje krivo sparenih baza pomou kompleksa graenog od XPC proteina i proteina pod imenom hHR23B, homolognog kvaevom Rad23 proteinu. Nakon toga slijedi usmjeravanje XPB, XPD i XPG proteina ka mjestu DNA oteenja. XPB i XPD proteini su komponente transkripcijskog faktora TFIIH, graenog iz vie podjedinica, a koji je potreban za inicijaciju transkripcije eukariotskih gena (vidi poglavlje 6.) - oni djeluju kao helikaze, odmatajui otprilike 30 parova baza DNA oko mjesta oteenja. XPA protein zatim potvruje oteenje i usmjerava heterodimer XPF i ERCC1 protein (protein popravka identificiran u UV senzitivnim staninim linijama glodavaca) ka mjestu oteenja. XPF/ERCC1 i XPG su endonukleaze koje cijepaju DNA u 5'(3' smjeru od oteenog mjesta. Tim cijepanjem se izrezuje oligonukleotid duljine od otprilike 30 baza. Nastala pukotina popunjava se djelovanjem DNA-polimeraze ( ili ( (uz suradnju RFC i PCNA) i ligaze.

Dok XPC/hHR23B kompleks moe prepoznati oteenja DNA bilo gdje u genomu, alternativni oblik popravka ekscizijom nukleotida, zvan popravak povezan s transkripcijom, specifian je za popravak oteenja unutar gena koji se prepisuju. Veza izmeu transkripcije i popravka gena prvi puta je dokazana nakon eksperimenata koji pokazuju da se transkribirani lanac DNA popravlja znatno bre od netranskribirajueg lanca, kako u E. coli tako i u stanicama sisavaca. Budui da oteenje DNA blokira transkripciju stanica favorizira popravak za vrijeme transkripcije jer joj omoguava da popravi prvenstveno oteenja gena koji se eksprimiraju. Kod E.coli mehanizam povezanosti transkripcije i popravka ukljuuje prepoznavanje RNA polimeraze zakoene pri leziji u DNA lancu koji se prepisuje. Zakoenu RNA polimerazu prepoznaje protein, zvan faktor povezan s transkripcijskim popravkom, koji uklanja RNA polimerazu i usmjerava UvrABC excinukleazu prema mjestu oteenja.

U stanicama sisavaca, popravak povezan s transkripcijom ukljuuje prepoznavanje zakoene RNA polimeraze djelovanjem CSA i CSB proteina koji su kodirani genima odgovornim za Cockayne-ov sindrom (slika 5.25). Za razliku od pacijenata koji pate od Xeroderma pigmentosum, pacijenti s Cockayne-ovim sindromom pokazuju specifian defekt popravka povezanog s transkripcijom to je u skladu s ulogom CSA i CSB proteina kao faktora povezanih s transkripcijskim popravkom . CSA i CSB djeluju analogno XPC/ERCC1 kompleksu usmjeravajui XPB, XPD i XPG ka mjestu oteenja. Nakon toga slijedi mobiliziranje XPA proteina i XPF/ERCC1 kompleksa te ekscizija oteenog oligonukleotida. Popravak povezan s transkripcijom se prema tome nastavlja slino uobiajenom popravku ekscizijom nukleotida s izuzetkom poetnog prepoznavanja zakoene RNA polimeraze djelovanjem CSA i CSB proteina, a ne direktnim prepoznavanjem DNA oteenja pomou XPC/hHR23B kompleksa.

Trei ekscizijski mehanizam popravka prepoznaje krivo sparene baze ugraene za vrijeme DNA replikacije. Mnoge od tih krivo sparenih baza uklanjaju se ''proofreading'' aktivnou DNA-polimeraze. Preostale krivo sparene baze objekt su kasnijeg korekcijskog mehanizma zvanog popravak krivo sparenih baza (engl. mismatch repair system) koji provjerava novorepliciranu DNA. Mehanizmi ovog popravka sposobni su otkriti i specifino izrezati krivo sparenu bazu iz novosintetiziranog DNA lanca omoguivi time korekciju greke i restauraciju izvornog slijeda.

Kod E. coli, sposobnost sustava popravka krivo sparenih baza da razlikuje roditeljski od novosintetiziranog DNA lanca bazira se na injenici da je DNA ove bakterije modificirana metilacijom adeninskih ostataka unutar slijeda GATC ime se adenin pretvara u 6-metiladenozin (slika 5.26). Kako se metilacija odvija nakon replikacije, novosintetizirani DNA lanci nisu metilirani i mogu se specifino prepoznati enzimima popravka pogreno sparenih baza. Popravak pogreno sparenih baza zapoinje djelovanjem proteina MutS koji prepoznaje krivo sparene baze te tvori kompleks s dva druga proteina zvana MutL i MutH. MutH endonukleaza zatim cijepa nemetilirani DNA lanac unutar GATC slijeda. MutL i MutS djeluju nakon toga zajedno s egzonukleazom i helikazom isjecajui DNA izmeu prekida lanca i krivo sparenih baza, a nastala pukotina popunjava se djelovanjem DNA-polimeraze i ligaze.

Eukarioti imaju slian sustav popravka krivo sparenih baza premda se mehanizam kojim eukariotske stanice prepoznaju novorepliciranu DNA razlikuje od onog koritenog u E.coli. ini se da u stanicama sisavaca specifinost pogreno sparene baze u novosintetiziranom lancu nije odreena metilacijom DNA. Umjesto toga, prisustvo jednolananog loma (u ovom sluaju u novosintetiziranom lancu DNA) ili pak povezivanje eukariotskih homologa proteina MutS i MutL s replikacijskom mainerijom mogli bi odrediti koji je lanac potrebno popraviti. Homolozi MutS i MutL proteina veu se zatim za krivo sparenu bazu i upravljaju isjecanjem DNA izmeu loma lanca i krivo sparenih baza, kao i u sluaju E coli. Vanost ovog mehanizma popravka dramatino je ilustrirana injenicom da su mutacije ljudskih homologa MutS i MutL gena odgovorne za uobiajeni tip nasljednog karcinoma debelog crijeva (nasljedni nepolipozni kolorektalni karcinom ili HNPCC). HNPCC predstavlja jedno od najuobiajenijih nasljednih oboljenja s uestalou od jedne na 200 osoba, a odgovoran je za 15 % svih kolorektalnih karcinoma u SAD-u. Povezanost izmeu HNPCC i poremeaja u popravku krivo sparenih baza otkrivena je 1993. godine kada su dvije grupe znanstvenika klonirale ljudski homolog MutS gena i pronale da je mutacija u ovom genu odgovorna za otprilike polovinu HNPCC sluajeva. Naknadna ispitivanja pokazala su da je veina preostalih sluajeva HNPCC rezultat mutacije jednog od tri ljudska homologa MutL gena. ini se da defekti ovih gena rezultiraju visokom uestalou mutacija drugih staninih gena s odgovarajuom visokom vjerojatnou da e neke od njih na kraju dovesti do razvoja karcinoma.

2.3 Popravak sklon pogrekama

Mehanizmi direktnog obrata DNA oteenja i ekscizijskog popravka popravljaju DNA oteenje prije replikacije tako da se DNA moe sintetizirati koritenjem neoteenog DNA lanca kao kalupa. U sluaju da ovi mehanizmi zakau, stanica ipak posjeduje alternativne mehanizme za popravak oteenja DNA u replikacijskim raljama. Pirimidinski dimeri i mnogi drugi tipovi lezija ne mogu se kopirati normalnom aktivnou DNA-polimeraza pa je replikacija na mjestima tih oteenja blokirana. No, stanice takoer posjeduju nekoliko specijaliziranih DNA-polimeraza koje su u stanju izvriti replikaciju i uzdu mjesta s DNA oteenjem. Replikacija oteene DNA djelovanjem takvih specijaliziranih polimeraza moe dovesti do uestalog ugraivanja neodgovarajuih baza pa se ovaj oblik borbe s DNA oteenjima naziva popravak sklon pogrekama (engl. error - prone repair).

Prva DNA-polimeraza sklona pogrekama otkrivena je u E. coli 1999. godine. Ovaj enzim, nazvan polimeraza V, induciran je u odgovoru na ekstenzivno UV zraenje. Polimeraza V moe sintetizirati novi lanac DNA molekule uzdu mjesta s timinskim dimerima (slika 5.27). Druge dvije DNA-polimeraze u E. coli, polimeraza II i IV, na slian nain su inducirane DNA oteenjem i djeluju umehanizmu popravka sklonom pogrekama. Eukariotske stanice takoer sadre vie DNA-polimeraza sklonih pogrekama. Devet takvih enzima je do sada otkriveno u stanicama ovjeka.

Sve DNA-polimeraze sklone pogrekama iskazuju malu vjernost izvornom kalupu kad kopiraju neoteenu DNA, sa stopama greaka u rasponu od 100 do 10 000 puta veim no to su stope pogreaka normalnih replikacijskih DNA-polimeraza (primjerice polimeraze III u E. coli ili polimeraze ( i ( u eukariota). Uz to, polimeraze sklone pogrekama nemaju 3'(5' korigirajuu aktivnost svojstvenu normalnim replikacijskim DNA-polimerazama (vidi sliku 5.12).

Vano je ipak da su polimeraze sklone pogrekama specijalizirane za ugradnju odgovarajuih baza smjetenih nasuprot specifinim lezijama u oteenoj DNA i stoga su u mogunosti tono sintetizirati novi lanac koristei neke oblike oteenog lanca kao kalupa. Tako na primjer polimeraza V u E. coli specifino prepoznaje timinske dimere i korektno ugrauje AA na nasuprotnom mjestu novosintetiziranog lanaca. Dakle, ovi enzimi sposobni su specifino ugraditi odgovarajuu bazu smjetenu nasuprot nekim oblicima DNA oteenja, premda su sklone pogrekama u ugraivanju baza smjetenih nasuprot drugih oblika oteene DNA ili u sintezi DNA koritenjem normalnog neoteenog kalupa.

2.4 Rekombinacijski popravak

Drugi nain popravka DNA, rekombinacijski popravak, bazira se na zamjeni oteene DNA rekombinacijom s neoteenom molekulom. Ovaj mehanizam se uestalo koristi za popravak oteenja na koja se nailazi za vrijeme DNA replikacije kada prisutnost timinskih dimera ili drugih lezija, koje ne mogu biti kopirane djelovanjem normalne replikativne DNA-polimeraze, blokira napredovanje replikacijskih ralji. Rekombinacijski popravak ovisi o injenici da je jedan lanac roditeljske DNA ostao neoteen, i stoga je bio kopiran za vrijeme replikacije, dajui normalnu sestrinsku molekulu koja tada moe biti iskoritena za popravak oteenog lanca.

Premda molekularni mehanizmi rekombinacijskog popravka nisu u potpunosti poznati i mogu varirati meu razliitim tipovima stanica opi ilustrativni model prikazan je na slici 5.28. U ovom primjeru normalna replikacija blokirana je prisustvom timinskog dimera u jednom lancu DNA molekule. Ipak, nizvodno od mjesta oteenja replikacija moe opet biti zapoeta sintezom Okazakijevog fragmenta i moe se nastaviti uzdu oteenog lanca kalupa. Rezultat toga je sestrinski lanac koji sadri pukotinu nasuprot mjestu oteenja roditeljskog lanca. Neoteeni roditeljski lanac, koji je repliciran dajui normalni sestrinski lanac, moe zatim biti upotrijebljen za popunjavanje pukotine nasuprot mjestu oteenja pomou rekombinacije homolognih DNA sljedova (vidi daljnji tekst). Budui da je tako nastala pukotina u prethodno intaktnom roditeljskom lancu smjetena nasuprot neoteenom lancu ona moe biti popunjena djelovanjem DNA-polimeraze . Iako druga roditeljska molekula i dalje sadri izvorno oteenje (timinski dimer), ono sada lei nasuprot normalnom lancu i moe se kasnije popraviti ekscizijskim popravkom.

Rekombinacijski popravak takoer prua glavni mehanizam za popravljanje dvolananih lomova koji se mogu pojaviti u molekuli DNA kao posljedica ionizirajueg zraenja (primjerice X zrake) ili djelovanja nekih kemijskih imbenika (slika 5.29). Kako ovaj tip oteenja pogaa oba lanca DNA osobito je teak za popravak. Rekombinacija sa homolognim DNA slijedom u neoteenom kromosomu osigurava mehanizam za popravljanje ovakvih oteenja i restauriranje normalnog DNA slijeda. Alternativno, dvolanani lomovi mogu se popraviti jednostavno spajanjem prekinutih krajeva zahvaene DNA molekule, no to bi rezultiralo visokom uestalosti greaka koje nastaju uslijed delecije baza oko mjesta oteenja. Treba napomenuti da geni odgovorni za nasljedni karcinom dojke (BRCA1 i BRCA2) kodiraju proteine koji su ukljueni u popravak dvolananih lomova posredstvom homologne rekombinacije, to sugerira da defekti ovog tipa DNA popravka mogu imati za posljedicu nastanak jednog od najuestalijih karcinoma u ena.

3 Rekombinacija izmeu homolognih DNA sljedova

Precizna replikacija DNA i popravak DNA oteenja nuni su za odranje genetske informacije i osiguranje njenog tonog prijenosa s roditelja na potomstvo. Kao to je raspravljano u prethodnom tekstu, rekombinacija predstavlja vaan mehanizam za popravak DNA oteenja. Uz to, rekombinacija je kljuna za stvaranje genetske raznolikosti, osobito vane s evolucijskog gledita. Genetska razliitost meu jedinkama prua osnovni startni materijal prirodne selekcije koji dozvoljava vrstama da evoluiraju i prilagode se promjenjivim uvjetima okolia. Rekombinacija igra centralnu ulogu u tom procesu, dozvoljavajui genima da se presloe u razliite kombinacije. Tako primjerice genetska rekombinacija rezultira izmjenom gena u sparenim homolognim kromosomima za vrijeme mejoze. Uz to, rekombinacija je ukljuena u preslagivanje specifinih DNA sljedova koji mijenjaju ekspresiju i funkciju nekih gena tijekom razvoja i diferencijacije. Stoga, rekombinacija igra vanu ulogu u ivotu pojedinanih stanica i organizama, a istovremeno doprinosi genetskoj raznolikosti vrsta.

U ovom dijelu poglavlja raspravljeni su mehanizmi rekombinacije izmeu DNA molekula iji su sljedovi izrazito homologni. Primjeri ukljuuju homolognu rekombinaciju za vrijeme popravka DNA kao i rekombinaciju izmeu sparenih eukariotskih kromosoma tijekom mejoze te rekombinaciju izmeu bakterijskih kromosoma za vrijeme seksualnog razmnoavanja. Budui da ovaj tip rekombinacije podrazumijeva izmjenu genske informacije izmeu dvije homologne DNA molekule, on ne dovodi do promjene u sveukupnom aranmanu gena na kromosomu. Drugi tipovi rekombinacije ne zahtijevaju izrazitu homolognost DNA sljedova i stoga se mogu odvijati i izmeu nesrodnih DNA molekula. Rekombinacijski dogaaji tog tipa dovode do preslagivanja gena o emu e biti govora kasnije u ovom poglavlju.

3.1 DNA molekule se rekombiniraju lomljenjem i ponovnim spajanjem

Genetika rekombinacija je prvi put definirana kada je primijeeno da se geni na razliitim kopijama homolognih kromosoma vone muice mogu presloiti tijekom mejoze. Nedugo zatim, otkrie DNA kao materijala od kojeg su graeni geni dalo je dva alternativna modela za objanjenje rekombinacije na molekularnoj razini (slika 5.30). Model izbora kopije (engl. copy choice model) pretpostavlja da rekombinantna DNA molekula nastaje za vrijeme DNA sinteze na taj nain da DNA-polimeraza prvo zapone kopiranje jednog roditeljskog DNA kalupa, a zatim se prebaci na kopiranje drugog roditeljskog lanca. Alternativni prijedlog kae da rekombinacija rezultira lomom i ponovnim spajanjem dvije roditeljske DNA molekule, a ne sintezom nove DNA molekule.

Ova dva modela prvi put su predloena 1961. godine na temelju zapaanja prilikom analize rekombinacije izmeu genoma bakterijskih virusa (slika 5.31). Poznato je da infekcija E.coli virusima koji nose razliite genske markere dovodi do nastanka rekombinantnih potomaka. Da bi se odgovorilo na pitanje ukljuuje li ova rekombinacija lom i ponovno spajanje roditeljskih DNA molekula, jedan od roditeljskih virusa uzgajan je u mediju koji sadri teki izotop ugljika (13C) i duika (15N) dok je drugi uzgajan u mediju koji sadri normalne lake izotope (12C i 14N). Time su dobiveni roditeljski virusi razliite gustoe koji se mogu razdvojiti centrifugiranjem u gradijentu gustoe CsCl. Nakon toga je E.coli inficirana razliito obiljeenim roditeljskim virusima u uvjetima koji inhibiraju replikaciju, a novostvorene virusne estice su analizirane prema njihovoj gustoi i genetskim karakteristikama. Dobiveni su genetski rekombinirani virusi intermedijarne gustoe to ukazuje na to da nose DNA molekule oba roditelja kao to je predvieno modelom loma i ponovnog spajanja, ali ne modelom izbora kopije.

3.2 Modeli homologne rekombinacije

Otkrie da se rekombinacija odvija lomom i ponovnim spajanjem postavlja novo kljuno pitanje: kako dvije roditeljske DNA molekule mogu biti prekinute tono na istom mjestu tako da se mogu ponovo spojiti, a da pri tome ne nastanu mutacije zbog delecija odnosno adicija nukleotida u mjestu loma? Za vrijeme rekombinacije izmeu homolognih DNA molekula (opi tip homologne rekombinacije) takvo poravnavanje omogueno je sparivanjem baza komplementarnih DNA lanaca (slika 5.32). Preklapajui jednolanani krajevi izmjenjuju se izmeu homolognih DNA molekula dovodei do stvaranja heterodupleksa u kojem dva lanca rekombinantne dvolanane uzvojnice potjeu od razliitih roditelja. Kada se DNA molekule hetrodupleksa genetiki razlikuju, DNA molekula koja nastaje sadri dva razliita genska biljega. U nekim sluajevima krivo sparene baze u heterodupleksu mogu biti prepoznate i ispravljene mehanizmom popravka krivo sparenih baza na nain koji je opisan ranije u ovom poglavlju. Molekularni model rekombinacije predloen je 1964. godine na temelju ispitivanja rekombinacije u gljivicama i bakterijama kada su dobiveni prvi genetiki dokazi za stvaranje i popravak heterodupleksa. Ovaj model, poznat kao Holliday-ev model (nazvan prema istraivau Robinu Hollidayu), premda modificiran stjecanjem novih podataka i danas prua osnovu poimanja rekombinacijskih mehanizama.

Izvorna verzija Holliday-evog modela predlae da rekombinacija zapoinje uvoenjem ureza (engl. nick) u istom mjestu obiju roditeljskih molekula (slika 5.33). DNA lanci sa urezom djelomino se razmotaju i svaki izvri nukleofilni napad na drugu molekulu na taj nain da se spari s komplementarnim neprekinutim lancem. Ligacija prekinutih lanaca stvara zatim ukrtanje poznato kao Holliday-eva struktura koja predstavlja glavni meuprodukt u rekombinaciji. Direktni prikaz Holliday-eve strukture dobiven uz pomo elektronskog mikroskopa dao je jasnu potporu za ovaj model rekombinacije (slika 5.34).

Jednom stvorena Holliday-eva struktura moe biti razrijeena kidanjem i ponovnim spajanjem ukrtenih lanaca to dovodi do stvaranja rekombinantne molekule (slika 5.35). To se moe dogoditi na dva razliita naina ovisno o orijentaciji Holliday-eve strukture koja zapravo odreuje dva razliita izomera. U izomeru koji nastaje iz poetne izmjene lanaca ukrteni su oni lanci koji su zarezani na poetku rekombinacijskog procesa. No, jednostavna rotacija ove strukture daje drugaiji izomer u kojem su ukrteni neprekinuti roditeljski lanci. Razrjeenje razliitih izomera ima razliite genetike posljedice. U prvom sluaju nastale molekule imaju heterodupleksna podruja, ali DNA koja omeuje ta podruja nije rekombinirana. Ako doe do izomerizacije, kidanje i spajanje ukrtenih lanaca rezultirat e molekulama ija su podruja koja omeuju heterodupleks rekombinirana.. Stvaranja rekombiniranih i nerekombiniranih heterodupleksa odreeno je upravo Holliday-evom strukturom to je u skladu sa genetikim podacima na kojima je baziran Holliday-ev model.

Kao to je u poetku reeno, Holliday-ev model nije u stanju objasniti kako dolazi do inicijacije rekombinacije istovremenim zarezivanjem obiju roditeljskih molekula na istovjetnom poloaju. ini se da rekombinacija openito poinje dvolananim lomom kako za vrijeme DNA popravka tako i za vrijeme rekombinacije izmeu homolognih kromosoma tijekom mejoze (slika 5.36). Oba lanca DNA na mjestu dvolananog loma se prvo razgrade djelovanjem nukleaze koja razgrauje DNA u 5'(3' smjeru stvarajui jednolanane krajeve. Ti jednolanani krajevi izvre nukleofilni napad na drugu roditeljsku molekulu pri emu se spare komplementarne baze. Pukotine se zatim popunjavaju sintezom kao pri popravku DNA, a lanci spajaju ligacijom stvarajui molekulu sa dvostrukom Holliday-evom vezom koja moe biti razrijeena dajui ili rekombinantne ili nerekombinantne heterodupleksne molekule kao to je to ranije opisano.

3.3 Enzimi ukljueni u homolognu rekombinaciju

Veina enzima za koje se danas zna da su ukljueni u rekombinaciju prvotno je identificirana analizom rekombinacijski defektnih mutanata E.coli. Takve genetike analize utvrdile su da rekombinacija zahtijeva specifine enzime, zajedno s proteinima (kao to su DNA-polimeraza, ligaza i proteini koji veu jednolananu DNA) koji imaju viestruke uloge u metabolizmu DNA. Otkrie gena potrebnih za efikasnu rekombinaciju u E.coli omoguilo je izolaciju njima kodiranih proteina ije su karakteristike ispitane biokemijskom analizom u bezstaninim sustavima. Ta ispitivanja razjasnila su djelovanje nekoliko enzima koji kataliziraju stvaranje i razrjeenje Holliday-evih struktura.

Sredinji protein ukljuen u homolognu rekombinaciju je RecA koji promovira izmjenu lanaca izmeu homolognih DNA molekula to rezultira stvaranjem heterodupleksa (slika 5.37). Aktivnost RecA proteina moe se opisati u tri koraka. RecA protein se prvo vee za jednolananu DNA stvarajui pri tome protein-DNA nit. Budui da sadri dva vezna mjesta za DNA, RecA protein vezan za jednolananu DNA moe vezati i drugu, dvolananu DNA, stvarajui tako kompleks izmeu dvije DNA molekule. Ovo nespecifino povezivanje, posredovano RecA proteinom, popraeno je specifinim sparivanjem baza izmeu jednolanane DNA i njoj komplementarnog podruja dvolanane DNA. Zatim jednolanani kraj DNA molekule, obavijen RecA proteinom, zamijeni homologni lanac dvolanane DNA molekule formirajui pri tome heterodupleks. Ovaj proces kataliziran je samim RecA proteinom. Stoga je RecA protein sposoban da sam katalizira reakcije izmjene lanaca koje imaju sredinju ulogu u stvaranju Holliday-evih struktura. Za genetiku rekombinaciju kao i za popravak dvolananih lomova kod kvasaca potreban je RecA proteinu srodan protein nazvan RAD51. Osim to je strukturno slian RecA proteinu RAD51 je takoer sposoban katalizirati izmjenu lanaca in vitro. Proteini srodni proteinu RAD51 otkriveni su u i sloenijim eukariotskim organizmima, ukljuujui ovjeka, to ukazuje da proteini srodni RecA proteinu imaju kljune uloge u homolognoj rekombinaciji kako u prokariotskim tako i u eukariotskim stanicama.

Kad se Holliday-eva struktura formira, u rekombinaciju se ukljuuje kompleks sastavljen od sljedea tri proteina bakterije E.coli, a to su RuvA, RuvB i RuvC (slika 5.38). RuvA prepoznaje Holliday-evu strukturu i regrutira RuvB. Ruv B djeluje kao motor koji upravlja migracijom mjesta u kojem su ukrteni DNA lanci mijenjajui na taj nain veliinu heterodupleksa i poloaj na kojem e ukrteni lanci biti pocijepani i ponovno spojeni. RuvC razrjeuje Holliday-evu strukturu cijepajui ukrtene DNA lance. Proces zavrava ponovnim spajanjem prekinutih lanaca ligacijom na taj nain da se stvore dvije rekombinantne molekule. Eukariotske stanice ne posjeduju homologe proteina RuvA, RuvB i Ruv C koje nalazimo u E. coli. Umjesto toga, razrjeavanje Holliday-eve strukture u eukariotskim stanicama posredovano je nekim drugim proteinima koji nisu jo u potpunosti poznati.

4 Preslagivanje DNA

Homologna rekombinacija rezultira preraspodjelom gena izmeu homolognih kromosoma pri emu se ne mijenjanja sadraj genoma. Nasuprot tome, druge vrste rekombinacijskih dogaaja dovode do preslagivanja genomske DNA. Neki od tih preslagivanja DNA vani su u kontroli ekspresije gena u specifinim tipovima stanica, dok drugi doprinose genetikoj raznolikosti pri emu mogu biti vani za evoluciju.

Otkrie da se geni mogu premjetati na razliita mjesta u kromosomima potjee iz istraivanja kukuruza koje je etrdesetih godina prolog stoljea provela Barbara McClintock. Ona je samo na osnovi genetike analize opisala nove genske elemente koji se mogu pomicati na razliita podruja u genomu kukuruza te mijenjati ekspresiju susjednih gena. No, prolo je skoro tri desetljea prije no to je fizika osnova njenog zapaanja rasvijetljena otkriem pokretnih elemenata u bakterijama ime je ideja o pokretnim genetikim elementima postala iroko prihvaena od strane znanstvene javnosti. Danas je poznato nekoliko tipova preslagivanja DNA koji se zbivanju u eukariotskim i prokariotskim genomima, ukljuujui i premjetanje elemenata koje je prva opisala Barbara McClintock. Nadalje, danas znamo da pokretni genetiki elementi ine veliki dio genoma biljaka i ivotinja, ukljuujui i humani genom gdje njihov udio gotovo 50%.

4.1 Mjesno specifina rekombinacija (engl. site-specific recombination)

Za razliku od uobiajene homologne rekombinacije, koja se dogaa na svakom veem podruju homologije nukleotidnih sljedova, mjesno specifina rekombinacija odvija se izmeu specifinih sljedova u podrujima DNA manje homologije. Glavna interakcija u ovom procesu nije posredovana komplementarnim sparivanjem baza ve aktivnou proteina koji prepoznaju specifini ciljni nukleotidni slijed.

Prototip rekombinacije u specifinom mjestu dobiven je istraivanjem bakteriofaga (. Kad bakteriofag ( inficira E.coli, on se moe ili replicirati uzrokujui lizu stanica ili integrirati u bakterijski kromosom formirajui profag koji se tada odrava kao dio genoma E.coli (lizogeni ciklus) (slika 5.39). U povoljnim okolnostima DNA integracija moe biti reverzna, to kao rezultat ima eksciziju DNA bakterofaga ( i inicijaciju litike virusne replikacije. I integracija i ekscizija DNA bakteriofaga ( ukljuuje site-specific rekombinaciju izmeu DNA sljedova virusa i stanice domaina.

DNA E.coli i DNA bakteriofaga ( rekombiniraju se u specifinom mjestu zvanom mjesto privrivanja (engl. attachment site, att). Stoga, integracija DNA bakteriofaga ( ukljuuje rekombinaciju izmeu att mjesta faga (attP) dugog otprilike 240 nukleotida i att mjesta bakterije (attB) dugog otprilike 25 nukleotida (slika 5.40). Proces je posredovan proteinom bakteriofaga ( zvanim integraza (Int) koji se specifino vee i za attP i za attB slijed. Int se poetno vee za attP stvarajui kompleks u kojem je DNA att mjesta faga omotana oko viestrukih kopija Int proteina. Int-attP kompleks se zatim vee za attB poravnavajui att mjesta bakteriofaga ( i bakterije. Nakon toga fag i bakterija izmjenjuju DNA lance ova se izmjena deava izmeu 15 nukleotida zajednikih za attP i attB mjesto (slika 5.41). Int protein ree unutar ovog slijeda od 15 nukleotida u attB i attP mjestu na taj nain da ostavlja nazubljene (ljepljive) krajeve, zatim katalizira izmjenu lanaca i povezuje prekinute lance ime se DNA bakteriofaga ( integrira u kromosom E.coli. Protein Int takoer sudjeluje u eksciziji profaga (, to je u osnovi obrnuto od procesa integracije.

Mjesno specifina rekombinacija vana je ne samo u interakciji virusa, poput bakteriofaga (, sa stanicama domaina, ve i u programiranim preslagivanjima gena unutar staninih genoma. Kod kraljenjaka je mjesno specifina rekombinacija kritina za razvoj imunog sustava koji prepoznaje strane tvari koje uu u tijelo (antigene) i titi od infekcija. Dvije su glavne grupe imunolokog odgovora posredovane B odnosno T limfocitima. B limfociti izluuju protutijela (imunoglobulini) koja reagiraju s topljivim antigenima dok T limfociti izluuju proteine stanine povrine (receptori T stanica) koji reagiraju sa antigenima prisutnim na povrini drugih stanica. Kljuna osobina imunoglobulina i receptora T stanica je njihova iznimno velika raznolikost koja omoguuje prepoznavanje irokog spektra stranih antigena. Tako je primjerice svaka osoba sposobna stvoriti vie od 1011 razliitih protutijela, to je znatno vie od ukupnog broja gena u humanom genomu (30 000-40 000). Ta razliita imunoglobulinska protutijela (kao i receptori T stanica) nisu kodirana jezgrinim genima germinativnih stanica, ve jedinstvenim limfocitnim genima koji se formiraju tijekom razvoja imunolokog sustava kao rezultat mjesno specifine rekombinacije izmeu razliitih segmenata imunoglobulina i gena za receptore T stanica.

Ulogu mjesno specifine rekombinacije u stvaranju imunoglobulinskih gena prvi put je 1976. godine prikazao Susumu Tonegawa. Imunoglobulini su graeni od dva identina para tekog i lakog polipeptidnog lanca (slika 5.42). Oba lanca sadre konstantno podruje na C kraju te varijabilno podruje na N kraju. Varijabilno podruje, koje ima razliit slijed aminokiselina u razliitim imunoglobulinskim molekulama, odgovorno je za vezanje antigena i upravo ta raznolikost aminokiselinskog slijeda varijabilnog podruja omoguava razliitim protutijelima da prepoznaju specifine antigene. Premda je svaka osoba u stanju stvoriti irok spektar razliitih protutijela, svaki B limfocit stvara samo jedan tip protutijela. S. Tonegawa je otkrio da je svako protutijelo kodirano jedinstvenim genom stvorenim mjesno specifinom rekombinacijom tijekom razvoja B limfocita. Preslagivanje gena stvara razliite imunoglobulinske gene u razliitim B limfocitima tako da je populacija od otprilike 1012 B limfocita ovjejeg tijela sposobna stvoriti protutijela protiv irokog spektra stranih antigena.

Geni koji kodiraju lake lance imunoglobulina graeni su od tri podruja: V podruja koje kodira 95-96 N-terminalnih aminokiselina varijabilnog podruja polipeptida, J podruje (engl. joining region) koje kodira 12-14 C terminalnih aminokiselina varijabilnog podruja proteina, i C podruje koje kodira konstantnu regiju polipeptida (slika 5.43). Glavna skupina gena lakog lanca u mieva formira se kombinacijom otprilike 250 V podruja i 4 J podruja s jednim C podrujem. Tijekom razvoja limfocita mjesno specifina rekombinacija dovodi do preslagivanja gena - jedno V podruje rekombinira s jednim J podrujem stvarajui funkcionalni gen lakog lanca. Razliita V i J podruja rekombiniraju u razliitim B limfocitima tako da mogue kombiniranje 250 V podruja s 4 J podruja moe stvoriti otprilike 1000 x (4 x 250) jedinstvenih lakih lanaca.

Geni tekog lanca sadre etvrto podruje poznato kao D podruje (engl. diversity) koje kodira aminokiseline smjetene izmeu V i J podruja (slika 5.44). Stvaranje funkcionalnog gena tekog lanca zahtijeva dva rekombinacijska dogaaja. D podruje se prvo rekombinira s J podrujem, a zatim se V podruje rekombinira s presloenim DJ podrujem. Kod mieva postoji oko 500 V podruja tekih lanaca, 12 D podruja i 4 J podruja, tako da ukupni broj tekih lanaca koji moe biti stvoren rekombinacijskim dogaajima iznosi 24 000 x (500 x 12 x4).

Kombiniranje otprilike 1000 razliitih lakih lanaca i 24 000 tekih lanaca stvorenih mjesno specifinom rekombinacijom moe proizvesti oko 2 x 107 razliitih imunoglobulinskih molekula. Raznolikost je nadalje poveana stoga to spajanje segmenata imunoglobulinskih gena esto ukljuuje gubitak ili dodatak od jednog do nekoliko nukleotida. Mutacije proizile zbog tih delecija i insercija poveavaju raznolikost varijabilnih podruja imunoglobulina za oko 100 puta, to odgovara formiranju otprilike 105 razliitih lakih lanaca i 2x106 tekih lanaca koji se zatim mogu kombinirati stvarajui vie od 1011 razliitih protutijela. Nakon formiranja presloenih imunoglobulinskih gena moe se postii jo vea raznolikost protutijela procesom somatske hipermutacije koji rezultira uestalim mutacijama u varijabilnim podrujima gena za laki i teki lanac.

Slino tome, receptori T limfocita graeni su od dva lanca (zvani ( i (), a svaki od njih sadri varijabilna i konstantna podruja (slika 5.45). Geni koji kodiraju ove polipeptide stvaraju se rekombinacijom izmeu V i J podruja (( lanac) ili izmeu V, D i J podruja (( lanac), analogno stvaranju imunoglobulinskih gena. Mjesno specifina rekombinacija izmeu tih razliitih podruja DNA, a takoer i mutacije koje su se desile tijekom rekombinacije, stvaraju stupanj raznolikosti receptora T stanica slian onome imunoglobulina. No, receptori T stanica razlikuju se od imunoglobulina u tome to nisu podvrgnuti unoenju daljnje raznolikosti somatskom hipermutacijom.

VDJ rekombinacija posredovana je kompleksom sainjenim od dva proteina, RAG1 i RAG2, koji se specifino eksprimiraju u limfocitima. RAG proteini prepoznaju takozvane sljedove rekombinacijskog signala (RS) smjetene uz kodirajue sljedove svakog genskog podruja i potiu preslagivanje DNA uvoenjem dvolananog loma izmeu RS slijeda i kodirajueg slijeda (slika 5.46). Kodirajui krajevi genskih podruja se zatim spajaju stvarajui presloene imunoglobuline ili gene za receptore T stanica, pri emu se vrlo esto deavaju delecije ili adicije nukleotida. Zanimljivo je da je RAG1 usko srodan enzimima koji kataliziraju transpoziciju DNA i integraciju retrovirusa o emu e biti objanjeno dalje u ovom poglavlju.

4.2 Rekombinacija posredovana DNA intermedijerima

Mjesno specifina rekombinacija odvija se izmeu dva specifina slijeda koji posjeduju barem malo homologije. Za razliku od toga, transpozicija ukljuuje premjetanje sljedova unutar genoma i ne zahtijeva homologiju nukleotidnih sljedova. Elementi koji se premjetaju transpozicijom, poput onih koje je prva opisala McClintock, zovu se pokretni elementi (engl. transposable elements) ili transpozoni. Oni se dijele u dvije ope skupine ovisno o tome premjetaju li se putem DNA intermedijera ili putem RNA intermedijera. Ovdje se opisuje prva skupina pokretnih elemenata dok se o premjetanju putem RNA intermedijera raspravlja u narednom tekstu.

Prvi detaljno opisani transpozoni koji se premjetaju putem DNA intermedijera naeni su u bakterijama (slika 5.47). Najjednostavniji od tih elemenata su insercijski sljedovi ija se veliina kree u rasponu od oko 800 do 2 000 nukleotida. Insercijski sljedovi sadre samo gen za enzim ukljuen u transpoziciju (transpozaza) omeen kratkim invertnim ponavljanjima koji predstavljaju mjesta aktivnosti same transpozaze. Kompleksni transpozoni graeni su od dva insercijska slijeda koji omeuju druge gene i premjetaju se kao jedna cjelina.

Insercijski sljedovi premjetaju se s jednog na drugo mjesto na kromosomu a da se pri tome ne repliciraju (slika 5.48). Transpozaza cijepa ciljnu DNA tako da napravi nazubljene krajeve te cijepa na krajevima obrnutih ponavljajuih sljedova transpozona. Premda transpozaza djeluje specifino na obrnutim ponavljanjima transpozona, ona je obino manje specifina u odnosu na slijed ciljne DNA tako da katalizira premjetanje transpozona nasumino unutar cjelokupnog genoma. Dok je aktivnost transpozaze specifina na obrnutim ponavljanjima transpozona, njena specifinost za sljedove unutar genoma (ciljne sljedove) je puno manja tako da katalizira premjetanje transpozona nasumino uzdu genoma. DNA u genomu Nakon cijepanja transpozona i ciljne DNA, tanspozaza spaja ljepljive krajeve ciljane DNA s pokretnim elementom. Pukotina koja nastaje u ciljanoj DNA popravlja se DNA sintezom nakon ega slijedi ligacija s drugim lancem transpozona. Rezultat ovog procesa je kratko direktno ponavljanje ciljnog slijeda s obje strane integriranog pokretnog elementa to je karakteristino za integraciju transpozona.

Ovaj mehanizam dovodi do premjetanja transpozona s jednog na drugo mjesto kromosoma. Drugi tipovi transpozona premjetaju se znatno sloenijim mehanizmima kojima se istovremeno uz integraciju na novo mjesto unutar genoma repliciraju. Kao rezultat takvog premjetanja jedna kopija transpozona biti e integrirana na novo mjesto u genomu dok e druga kopija ostati na svom izvornom poloaju.

Transpozoni koji se premjetaju putem DNA intermedijera prisutni su u eukariotskim genomima kao i u bakterijskim. Tako primjerice humani genom sadri otprilike 300 000 DNA transpozona koji ine oko 3 % humane DNA. Pokretni elementi koje je McClintock opisala u kukuruzu premjetaju se nereplikativnim mehanizmom kao to to ini veina pokretnih elemenata i u drugim biljkama i ivotinjama. Poput bakterijskih transpozona, ovi se elementi premjetaju na razliita ciljna mjesta uzdu genoma. Takvo premjetanje na nespecifina mjesta u genomu najvjerojatnije nije korisno za stanice u kojima se odvija, ali je sigurno igralo veliku ulogu u evoluciji putem preslagivanja DNA.

Nasuprot tome, u genomima kvasaca i protozoa transpozicija pomou replikativnog mehanizma odgovorna je za programirana preslagivanja DNA koje regulira ekspresiju gena. U tom sluaju transpozicija zapoinje djelovanjem nukleaze koja cijepa specifino ciljano mjesto u koje se zatim ubacuje kopija pokretnog elementa. Prema tome, pokretni elementi se ne premjetaju samo na nespecifina mjesta uzdu genoma ve mogu sudjelovati i u specifinim presloenim gena koji rezultiraju programiranom promjenom ekspresije.

4.3 Transpozicija posredovana RNA intermedijerima

Veina pokretnih elemenata u eukariotskim stanicama su retrotranspozoni koji se premjetaju putem reverzne transkripcije RNA intermedijera. U ovjeka postoji oko 3 milijuna kopija retrotranspozona koji ine oko 40 % ukupnog genoma (vidi tablicu 4.l). Mehanizam transpozicije ovih elemenata slian je replikaciji retrovirusa. Stoga je mehanizam replikacije retrovirusa uzet kao prototip za prouavanje ove skupine pokretnih DNA sljedova.

Retrovirusi sadre RNA genome u svojim virusnim esticama ali se repliciraju sintezom DNA provirusa koji se integrira u kromosomsku DNA inficirane stanice (vidi sliku 3.13). DNA kopija virusne RNA sintetizira se virusnim enzimom zvanim reverzna-transkriptaza. Reverznom transkripcijom nastaje DNA molekula koja sadri direktna ponavljanja od nekoliko stotina nukleotida na oba svoja kraja (slika 5.49). Ovi ponavljajui sljedovi zvani duga terminalna ponavljanja (engl. long terminal repeats) ili LTR-ovi nastaju duplikacijom onih mjesta virusne RNA za koja se veu poetnice kako bi inicirale DNA sintezu. LTR sljedovi imaju prema tome centralnu ulogu u reverznoj transkripciji, a uz to su ukljueni u integraciju i naknadnu transkripciju provirusne DNA.

Kao sve DNA-polimeraze, reverzna-transkriptaza zahtijeva prisutnost poetnica, a to su u sluaju retrovirusa tRNA molekule vezane za specifina mjesta (mjesta vezanja poetnica) blizu 5' kraja virusne RNA (slika 5.50). Budui da se DNA sinteza odvija u 5'(3' smjeru, samo se mali dio DNA sintetizira prije no to reverzna-transkriptaza doe do kraja svog kalupa. Nastavak DNA sinteze nakon toga ovisi o sposobnosti reverzne-transkriptaze da se premjesti na 3' kraj RNA kalupa. To se postie putem RNaza H aktivnosti reverzne-transkriptaze koja degradira RNA lanac DNA-RNA hibrida. Kao rezultat toga novosintetizirana DNA prevodi se u jednolananu molekulu koja moe hibridizirati s kratkim ponavljajuim slijedom prisutnim i na 5' i na 3' kraju virusne RNA. DNA sinteza se nakon toga moe nastaviti, a kao produkt dobit e se jednolanana DNA komplementarna virusnoj RNA. Sinteza suprotnog DNA lanca zapone fragmentom virusne RNA koji djeluje kao poetnica na mjestu uz 3' kraj DNA kalupa. To opet rezultira kratkim ulomkom DNA koji ukljuuje mjesto vezanja poetnice kopirano s tRNA koja je koritena kao inicijalna poetnica za reverznu transkripciju. Nukleotidni slijed tRNA koji vee poetnicu zatim se degradira djelovanjem RNaze H ostavljajui ljepljivi DNA lanac koji se opet premjeta i spari s komplementarnnim slijedom na drugom kraju kalupa. Nakon toga DNA sinteza se moe nastaviti pri emu na kraju nastaje linerana DNA koja sadri LTR sljedove na oba kraja.

Linearna virusna DNA integrira se u kromosom stanice domaina procesom koji podsjea na integraciju DNA pokretnih elemenata. Integracija je katalizirana virusnom integrazom i odvija se u mnogo razliitih ciljanih sljedova unutar stanine DNA. Integraza cijepa dvije baze na krajevima virusne DNA i stvara nazubljene krajeve u ciljnom mjestu stanine DNA. Ljepljivi krajevi stanine DNA se zatim spajaju s krajevima virusne DNA, a nastala pukotina popunjava se sintezom DNA. Integrirani provirus je prema tome omeen direktnim ponavljanjima sljedova stanine DNA, slino ponavljanjima koji omeuju integrirane DNA transpozone.

ivotni ciklus virusa nastavlja se transkripcijom integriranog provirusa ime se stvara virusna genomska RNA te mRNA molekule koji upravljaju sintezom virusnih proteina (ukljuujui reverznu-transkriptazu i integrazu). Genomska RNA se zatim pakira u virusne estice koje se oslobaaju iz stanice domaina. Tako nastale virusne estice mogu inficirati nove stanice zapoinjui novi krug DNA sinteze i integracije. Sveukupni efekt moe se promatrati kao premjetanje provirusa s jednog na drugo mjesto u kromosomu putem sinteze i reverzne transkripcije RNA intermedijera.

Drugi retrotranspozoni razlikuju se od retrovirusa po tome to se ne pakiraju u infektivne estice i zato se ne mogu iriti s jedne stanice na drugu. Ipak, ti retrotranspozoni se mogu premjetati na nova mjesta u kromosomima unutar jedne stanice mehanizmom u osnovi slinim onom koji je ukljuen u replikaciju retrovirusa.

Neki retrotranspozoni (zvani retrovirusima-slini elementi ili LTR retrotranspozoni) strukturno su slini retrovirusima (slika 5.51). Retrotranspozoni ovog tipa ine oko 8 % humanog genoma. Oni sadre LTR sljedove na oba kraja; kodiraju reverznu-transkriptazu i integrazu i premjetaju se (poput retrovirusa) putem transkripcije u RNA molekulu, sinteze nove DNA kopije s RNA kalupa djelovanjem reverzne-transkriptaze i integracijom u staninu DNA.

Retrotranspozoni bez LTR sljedova razlikuju se od retrovirusa po tome to ne sadre LTR sljedove, premda kodiraju svoju vlastitu reverznu-transkriptazu. Glavnu skupinu ovih retrotranspozona u sisavaca ine visokoponavljajui dugi raspreni elementi (engl. highly repetitive long interspersed elements -LINE) koji se ponavljaju oko 850,000 puta i ine oko 21 % genomske DNA (vidi poglavlje 4). Cijeli LINE element je dug 6 do 7 kb, iako je veina lanova ove obitelji skraena na 5' kraju (slika 5.52). Na svom 3' kraju LINE imaju slijed bogat adeninom za koji se smatra da je nastao reverznom transkripcijom poli A repova koji su dodani mRNA molekulama nakon transkripcije (vidi poglavlje 6). Kao i drugi pokretni elementi, LINE su omeeni kratkim direktnim ponavljanjima ciljanih DNA mjesta, to ukazuje da integracija ukljuuje stvaranje nazubljenih krajeva i popravak sintezom.

Kako LINE ne sadre LTR sljedove, mehanizam njihove reverzne transkripcije i naknadne integracije u kromosomsku DNA se razlikuje od onog koji koriste retrovirusi i retrotranspozoni koji sadre LTR sljedove. Konkretno, reverzna transkripcija kao poetnicu koristi prekinute krajeve kromosomske DNA koju je pocijepala nukleaza, kodirana od strane retrotranspozona, na ciljnim mjestima za integraciju retrotranspozona (slika 5.53). Reverzna transkripcija tada zapoinje unutar poli A slijeda na 3' kraju transpozonske RNA i nastavlja se uzdu molekule. Suprotni lanac DNA sintetizira se koritenjem drugog prekinutog kraja ciljne DNA kao poetnice, to rezultira istovremenom sintezom i integracijom retrotranspozonske DNA.

Drugi sljedovi koji ne kodiraju svoju vlastitu reverznu-transkriptazu takoer se premjetaju putem RNA intermedijera. Ovi elementi ukljuuju visokoponavljajue kratke rasprene elemente (engl. highly repetitive interspersed elements SINE) koji dolaze u otprilike 1.5 milijuna kopija u genomu sisavaca (vidi poglavlje 4). Glavna porodica ovih elemenata kod ljudi sastavljena je od Alu sljedova dugih otprilike 300 baza. Ovi su sljedovi na svom 3' kraju bogati adeninom i omeeni su kratkim duplikacijama nukleotidnog slijeda ciljne DNA pa su po tome strukturno slini retrotranspozonima bez LTR sljedova (primjerice LINE). SINE nastaju reverznom transkripcijom malih RNA molekula ukljuujui tRNA molekule i male citoplazmatske RNA molekule ukljuene u transport proteina. Kako SINE elementi vie ne kodiraju funkcionalne RNA produkte oni predstavljaju pseudogene koji nastaju putem RNA posredovane transpozicije. Pseudogeni mnogih protein-kodirajuih gena (zvani procesirani pseudogeni) takoer nastaju na slian nain reverznom transkripcijom glasnikih RNA molekula (slika 5.54). Takvi procesirani pseudogeni lako se prepoznaju ne samo zbog toga to zavravaju sljedom nukleotida bogatim adeninom, ve i stoga to su introni prisutni u njihovim funkcionalno odgovarajuim genima ovdje uklonjeni tijekom procesiranja glasnikih RNA molekula. Smatra se da se transpozicija SINE elemenata i drugih procesiranih pseudogena odvija slino transpoziciji LINE elemenata. No, kako ovi elementi ne posjeduju gene za reverznu-transkriptazu ili nukleazu, njihovo premjetanje vjerojatno ukljuuje djelovanje reverzne-transkriptaze i nukleaze kodiranih genima koji se nalaze negdje drugdje u genomu najvjerojatnije drugim retrotranspozonima kao to su LINE elementi.

Premda visokoponavljajui SINE i LINE elementi ine znaajan udio genomske DNA, njihova transpozicija na nasumina mjesta u genomu po svemu sudei nije od koristi za stanicu u kojoj su smjeteni. Kada se integriraju na nova ciljna mjesta ovi transpozoni induciraju mutacije koje su i poput onih izazvanih drugim imbenicima najvjerojatnije tetna za stanicu. I zaista, mutacije nastale transpozicijom LINE i SINE elemenata dovedene su u vezu s nekim sluajevima hemofilije, miine distrofije, karcinoma dojke i karcinoma debelog crijeva. S druge strane, neke mutacije nastale premjetanjem pokretnih elemenata mogu biti korisne na taj nain to doprinose evolucijskom razvoju vrste. Tako se primjerice pronalo da neki retrotranspozoni u genomu sisavaca sadre regulatorne sljedove koji kontroliraju ekspresiju susjednih gena.

Osim to imaju mutageni uinak, retrotranspozoni su odigrali veliku ulogu u oblikovanju genoma stimuliranjem preslagivanja DNA. Tako primjerice preslagivanje kromosomske DNA moe nastati uslijed rekombinacija LINE elemenata integriranih na razliita mjesta u genomu. Nadalje, sljedovi stanine DNA susjednih LINE elemenata uestalo se prenose tijekom transpozicije to ima za posljedicu njihovo premjetanje na nova mjesta u genomu. Kako se LINE elementi mogu integrirati u aktivne gene, s njima povezana transpozicija staninih DNA sljedova moe dovesti do stvaranja novih regulatornih i/ili kodirajuih sljedova to direktno doprinosi evolucijskom razvoju novih gena.

Velika veina pokretnih elemenata u ljudskom genomu nije aktivna i svega je oko 100 kopija LINE elemenata koji jo uvijek sadre protein-kodirajue sljedove potrebne za njihovu transpoziciju. Preme tome, svi humani DNA transpozoni i veina retrotranspozona predstavlja evolucijske relikte, a ne trenutno funkcionalne elemente. Ipak, to nije sluaj kod drugih vrsta ukljuujui Arabidopsis, C. elegans, vonu muicu i mia koji imaju mnogo veu razinu postojee transpozonske aktivnosti. Tako su u genomu mia svi LTR retrotranspozoni, LINE i SINE elementi aktivni. Procjenjuje se da oko 10 % svih mutacija u genomu mia nastaje aktivnou transpozona dok je svega 1 na 600 mutacija u genomu ovjeka uzrokovana transpozicijom. Ovakva dramatina razlika u aktivnosti transpozona u genomu mia odnosno ovjeka intrigira i tek e se razjasniti novim istraivanjima.

4.4 Amplifikacija ili viestruko umnaanje gena

Preslagivanja DNA o kojima se do sada govorilo mijenjaju poloaj DNA sljedova unutar genoma. Amplifikacija gena ili viestruko umnaanje gena moe se promatrati kao drugaiji tip izmjena strukture genoma ona naime poveava broj genskih kopija unutar stanice. Amplifikacija podrazumijeva ponavljajuu replikaciju DNA ime se proizvode viestruke kopije odreenih podruja (slika 5.55). Viestruko umnoeni DNA slijed moe se nai ili kao slobodna ekstrakromosomska molekula ili kao niz uzastopno ponavljajuih sljedova unutar kromosoma. U oba sluaja dolazi do poveane ekspresije amplificiranog gena zahvaljujui jednostavnoj injenici da je prisutno vie kopija dostupnih za transkripciju.

U nekim sluajevima amplifikacija gena odgovorna je za razvojno programirana poveanja ekspresije gena. Tipian primjer je amplifikacija ribosomskih RNA (rRNA) gena u oocitama vodozemaca. Oocite su iznimno velike stanice koje zahtijevaju poveanu sintezu proteina. S obzirom na volumen oocite vodozemaca su oko milijun puta vee od tipinih somatskih stanica pa moraju posjedovati velike koliine proteina tijekom ranog razvoja. To zahtijeva poveanu sintezu rRNA molekula to se jednim dijelom postie amplifikacijom rRNA gena. Kao to je spomenuto u poglavlju 4, u somatskim stanicama rRNA geni dolaze u nekoliko stotina kopija to je potrebno za sintezu dovoljne koliine rRNA molekula nunih da se zadovolje metabolike potrebe stanica. U oocitama vodozemaca ovi su geni amplificirani dodatnih 2 000 puta na otprilike 1 milijun kopija po oociti. Drugi primjer programirane genske amplifikacije odvija se u genomu vone muice. Naime, geni u stanicama jajnika enki vone muice, koji kodiraju proteine jajne ovojnice (korionski geni), amplificirani su zato da bi se zadovoljila potreba za velikom koliinom ovih proteina. Poput drugih programiranih preslagivanja gena i amplifikacija gena je relativno rijedak dogaaj koji se odvija u visoko specijaliziranim tipovima stanica, i ne moe se smatrati uobiajenim mehanizmom regulacije gena.

Amplifikacija gena odvija se i kao nenormalni proces u zloudnim tumorskim stanicama gdje dovodi do poviene ekspresije gena koji doprinose nekontroliranom rastu stanica. Ovaj tip amplifikacije gena prvi put je uoen u stanicama karcinoma koje su postale otporne na metotreksat, lijek koji se uobiajeno koristi u kemoterapiji karcinoma. Metotreksat inhibira enzim dihidrofolat-reduktazu koji je ukljuen u sintezu dTTP-a i stoga je potreban za DNA sintezu. Otpornost na metotreksat razvija se amplifikacijom gena za dihidrofolat-reduktazu na taj nain to metotreksat ne moe vie inhibirati djelovanje poveane koliine enzima dihidrofolat-reduktaze. Osim toga, amplifikacija gena u stanicama karcinoma uestalo rezultira poveanom ekspresijom gena koji upravljaju proliferacijom stanica (onkogeni) te tako direktno doprinose razvoju tumora (vidi poglavlje 15). Tako se primjerice amplifikacija onkogena erbB-2 uestalo odvija u karcinomu dojke. Prema tome, kao i kod drugih tipova preslagivanja DNA, posljedice amplifikacije gena mogu biti korisne ali i katastrofalne za stanicu ili organizam.

SAETAK

DNA REPLIKACIJA

DNA-polimeraze: Razliite DNA-polimeraze igraju specifine uloge u replikaciji i popravku DNA kako u prokariotskim tako i u eukariotskim stanicama. Sve poznate DNA-polimeraze sintetiziraju DNA samo u 5' ( 3' smjeru dodajui dNTP na prethodno sintetizirane poetnice.

Replikacijske ralje: Roditeljski lanci DNA molekule se razdvoje i slue kao kalupi za sintezu dva nova lanca u replikacijskim raljama. Jedan novosintetizirani lanac (vodei lanac) sintetizira se kontinuirano dok se drugi lanac (zaostajui lanac) formira spajanjem kratkih ulomaka DNA koji se sintetiziraju u obrnutom smjeru u odnosu na sveukupni smjer replikacije. DNA-polimeraze i razliiti drugi proteini djeluju koordinirano sintetizirajui i vodei i zaostajui lanac DNA.

KLJUNI POJMOVI

DNA-polimeraza, mutagen

replikacijske ralje, Okazakijevi fragmenti, DNA-ligaza, vodei lanac, zaostajui lanac, primaza, RNaza H, egzonukleaza, helikaza, proteini koji veu jednolananu DNA, topoizomeraza

Vjernost replikacije: DNA-polimeraze poveavaju tonost replikacije odabirom odgovarajue baze za unos u novosintetizirani lanac i lektoriranjem novosintetizirane DNA na taj nain da eliminiraju krivo sparene baze.

Ishodite i inicijacija replikacije: DNA replikacija zapoinje u specifinom ishoditu replikacije koje sadri vezna mjesta za proteine zaslune za poetak procesa replikacije.

Telomere i telomeraze - replikacija krajeva kromosoma: Ponavljajui sljedovi nukleotida na krajevima kromosoma (telomere) repliciraju se djelovanjem reverzne-transkriptaze (telomeraze) koja sadri svoj vlastiti RNA kalup.

POPRAVAK DNADirektni obrat DNA oteenja: Nekoliko tipova estih DNA lezija, poput pirimidinskih dimera i alkiliranih gvaninskih ostataka, popravljaju se direktnim obratom oteenja.

Proofreading ili lektorirajua sposobnost DNA-polimeraze

ishodite replikacije, autonomno replicirajui slijedovi (ARS), kompleks ishodita replikacije (ORC)

telomere, telomeraza, reverzna-transkriptaza

pirimidinski dimeri, fotorea