Mljekarska mikrobiologija
I Opći dio
nastavni tekst
(radna verzija teksta)
Prof.dr. sc. Dubravka Samaržija
Sveučilište u Zagrebu Agronomski fakultet
2012.
2
Uvod
U ne tako davnoj prošlosti mljekarsku industriju činile su male mljekare
koje su otkupljivale mlijeko uglavnom od proizvoñača mlijeka koji su
držali mali broj životinja na farmama. Zato je ta proizvodnja, vrstama i
količinama mliječnih proizvoda bila ograničena, a proizvodi su se
uglavnom plasirali na lokalna tržišta. Današnju mljekarsku industriju, koja
se počela razvijati otprilike pedesetih godina 20. stoljeća, čine mljekare
velikog kapaciteta prerade. Proizvodnja mlijeka organizirana je najvećim
djelom na velikim farmama, od kojih neke imaju i više od tisuću muznih
grla. Zbog jake konkurencije koja danas vlada na globalnom tržištu,
mljekarska industrija gotovo svakodnevno plasira nove vrste mliječnih
proizvoda koji moraju udovoljavati najvišim standardima kvalitete. Te
značajne promjene koje su se dogodile u proizvodnji i preradi mlijeka,
uvjetovale su primjenu mljekarske mikrobiologije u svakom segmentu te
proizvodnje.
U tom smislu i nastavni tekst ove knjige dizajniran je na način koji
omogućuje studentima usvajanje specijalističkog znanja iz mljekarske
mikrobiologije potrebnog za uspješnu proizvodnju i kontrolu u
mljekarskoj industriji. Sadržajem ovaj tekst predstavlja i osnovu
mikrobioloških postulata koji vrijede za cijelu prehrambenu industriju.
Takoñer, on je i osnova za studente koji se žele dalje usavršavati na
području mikrobiologije općenito, ili imaju želju za znanstvenim
usavršavanjem na tom polju.
3
1. Osnove mikrobiologije i opća svojstva mikroorganizama
Mikrobiologija pripada grani biologije koja se zbog svoje
specifičnosti unutar te grane, razvila u samostalnu znanstvenu disciplinu.
Prema definiciji, mikrobiologija je nauka koja se bavi proučavanjem
mikroorganizama i njihovim aktivnostima.
Nove znanstvene spoznaje o mikroorganizmima, razvitak novih metoda,
prvenstveno molekularnih, te različiti ciljevi njihovog proučavanja
uvjetovali su daljnju podjelu mikrobiologije na različita specijalistička
polja ili subdiscipline. Neovisno da li se radi o bakteriologiji (proučava
bakterije), mikologiji (proučava gljive), protozoologiji (proučava
protozoae), filologiji (proučava alge), ili virologiji (proučava viruse),
zajedničko svima njima je proučavanje mikroorganizama na dvije
meñusobno povezane različite znanstvene i/ili stručne razine. Prvu razinu
čine fundamentalna istraživanja, koja se temelje na proučavanju strukture
mikrobne stanice, biokemijskim i fiziološkim reakcijama, te genetskim
karakteristikama pojedinačnih mikrobnih porodica, rodova, vrsta i sojeva.
Dok se na drugoj razini proučavanja u primijenjenoj mikrobiologiji
istražuje njihova povezanost s okolinom (sredinom) i ljudskom
aktivnošću. Unutar te druge razine proučavanja mikroorganizama, razvila
se i mljekarska mikrobiologija koja je dio šireg specijalističkog polja -
mikrobiologije hrane. Meñutim, niti jedna od specijalističkih
mikrobiologija, pa tako niti mljekarska ne djeluju izolirano, već zajedno s
fundamentalnom i svima ostalim primijenjenim mikrobiologijama čine
nedjeljivu dijalektičku cjelinu.
4
Mikroorganizmi su živi organizmi koji najvjerojatnije žive na gotovo
svim mjestima na Zemlji. Za većinu danas poznatih mikrobnih vrsta,
uvjeti koji pogoduju njihovom rastu i preživljavanju vrlo su slični
uvjetima u kojima čovjek prirodno živi. Zbog toga, u svakom smo
trenutku okruženi nebrojenim mikrobnim vrstama. Većina tih vrsta
potpuno je bezopasna za ljude, životinje i biljke s kojima one na odreñen
način žive u simbiotskom odnosu. Takoñer, bez odreñenih mikrobnih vrsta
koje nas okružuju, ne bi postojali niti brojni fermentirani prehrambeni
proizvodi (npr. jogurt, sir, kobasice). Ipak, neki od njih, kao što su npr.
Listeria ili Salmonella spp. mogu pod odreñenim okolnostima uzrokovati
bolest pa i smrtnost kod ljudi. Na sreću, razina mikrobiološkog znanja
kojom raspolažemo danas, omogućuje nam izbor najučinkovitijih metoda
kojima možemo te neželjene pojave spriječiti ili barem ublažiti.
Mikroorganizmi pripadaju skupinama bakterija, gljivica (kvasaca),
plijesni, protozoa, algi i virusa. Od tih skupina, direktno značenje za
proizvodnju, preradu i konzumaciju hrane jedino nemaju protozoe i alge.
1.1. Struktura i funkcija mikroorganizama
1.1.1. Bakterije
Bakterije su najmanji poznati samostalni jednostanični prokariotski
organizmi u prirodi. Prema svom osnovnom morfološkom obliku
5
pripadaju kokima (kuglasti oblik; grč. coccus-zrno), bacilima (oblik
štapića; lat. bacillus-štapić) ili spirilima (spirili ili vibrioni). (slika X)
Bojanje po Gram (metoda danskog biologa Christiana Grama) dijeli
ih na Gram- pozitivne i Gram- negativne bakterije. U identifikaciji
nepoznatih bakterija metoda bojanja po Gramu koristi se kao njezin prvi
korak. Za sam postupak bojanja koristi se slijedeće reagencije:i
kristalviolet, lugol, alkohol i safranin. Dodavanjem kristalvioleta (na
stakalce koje sadrži uzorak biološkog materijala) sve bakterije se boje
ljubičasto. Lugol koji se dodaje nakon kristalviolet bojila, fiksira boju
unutar stanične stjenke. Sve bakterije nakon dodavanja lugola i dalje
ostaju obojene ljubičaste. Nakon lugola, primarno bojilo se ispire
alkoholom. Primarno bojilo se neće isprati iz stanične stjenke Gram-
pozitivnih bakterija zbog gustog sloja peptidoglikana (50-90% stanične
stjenke). Suprotno, Gram-negativne bakterije čiji je sloj peptidoglukana
tanak (10% stanične stjenke postati će ponovno neobojene (slika X). Na
kraju postupka bojanja po Gramu, dodaje se safranin (kontrastno bojilo)
koji Gram-negativne bakterije boji u ružičastu ili crvenu boju.
6
Slika X: Bojanje bakterija po Gramu
Meñutim postoje i bakterije koje se ne mogu obojiti postupkom bojanja po
Gramu, poput na primjer spiroheta te se one svrstavaju u Gram-neosjetljive
bakterije. Takoñer, postoje i Gram-varijabilne vrste bakterija koje a koje u
različitim uvjetima rasta mogu pokazati osobine i gram-pozitivnih i gram-
negativnih bakterija.
Veličina bakterijske stanice izražava se u mikrometrima (µm; 1µm
= 0,001 milimetar). Koki su veličine izmeñu 0,4 i 1,5 µm, a bacili od 0,25-
1,0 µm širine i 0,5-6,0 µm dužine. Za koke i bacile karakteristična je
morfološka pojavnost u obliku pojedinačnih stanica, kratkih ili dugih
lanaca. Neke vrste koka pojavljuju se u obliku grozdastih nakupina
7
(Staphylococcus spp.), a neke tvore tetrakoke (Micrococcus spp.). Bacili
osim načina grupiranja, meñusobno se razlikuju i veličinom te oblikom
pojedinačne stanice (ravni, kratki, zakrivljeni štapić). Zavojite bakterije ili
spirili su u osnovi štapićaste bakterije jedanput ili više puta zavijene oko
svoje zamišljene osi. Mogu biti vibrioni (u obliku zareza) ili spirohete
(više zavoja). Oblik i način grupiranja bakterijskih stanica rod su
specifični.
L-oblik bakterije
U odreñenim okolnostima, kada su izložene konstantnim promijenjenim
uvjetima, bakterije se mogu transformirati u svoj L-oblik koji nema
staničnu stjenku.. Smatra se da je L-oblik, odgovor bakterije na stres zbog
kojeg im je onemogućena sinteza stanične stjenke, te im novi oblik stanice
omogućuje preživljavanje pod nepovoljnim uvjetima. Zbog toga, L-oblik
bakterije za razliku od svoje izvorne stanice iskazuje rezistentnost na
čimbenike koji su izazvali promjenu njenog prvotnog izgleda. Na primjer,
zna se da na L- oblik bakterije ne djeluje niti jedan poznati antibiotik.
Promjene u usporedbi s roditeljskom stanicom izražene su kroz značajnu
razliku u ekspresiji gena za morfološke i fiziološke funkcije stanice .
Takoñer, vjeruje se da je koegzistencija bakterija sa staničnom stjenkom i
L-oblika unutar heterogene bakterijske populacije prirodni fenomen koji
im omogućava razvitak vlastite strategije za izdržljivost i preživljavanje.
Meñutim, iako se zna se zna da je broj vrsta bakterija koje se u svom
8
prirodnom životnom ciklusu mogu transformirati u L- oblik velik, do
danas je opisano oko 50 vrsta.
L-oblik bakterije pokazuje znatan stupanj polimorfizma tako da se
pojavljuje u različitim veličinama i oblicima. Meñutim, većim dijelom
svog životnog ciklusa ona je izrazito sićušna stanica u promjeru veličine
0,01 mikrona (manja od virusa). Morfološki je kokoidnog oblika, ponekad
se stanice grupiraju te poprimaju izgled niske perli. Ponekada L- oblik
bakterija u laboratorijskim uvjetima može stvoriti tanki filamentozni
biofilm koji može biti dugačak i 60-70 mikrona. Biofilm je grañen od L-
oblika bakterije i zaštićen slojem proteina. Takoñer, iz nepoznatih razloga
L-oblik bakterije može prerasti u i veliku „stanicu“ (tijelo). Bakterije L-
oblika razmnožavaju se na različite načine koje uključuje pupanje,
filamentozni rast i binarnu fisiju. Neke vrste L-oblika poput Proteus spp.
mogu formirati veliko tijelo koje se replicira dijeljenjem. U drugim
okolnostima granula pupoljka s tijela bakterije se odvoji i izraste u malu
L-formu kolonije. Veličina i L- oblik omogućava im ulazak u bilo koju
eukariotsku stanicu i preživljavanje kroz vrlo dugi period bez da budu
prepoznate od stanica imunog sustava domaćina. Nakon što L- oblik
bakterije uspješno uñe u stanicu domaćina počinje koristiti stanične
nutrijente za svoje potrebe. Takoñer, ona je sposobna preuzeti i kontrolu
genetskog materijala stanice domaćina, te započinje tvorbu proteina
kojima zaštićuje svoju stanicu i tako dodatno povećava svoju sposobnost
preživljavanja. Izmeñu ostalog, zadnje studije L-oblika bakterija su na
primjeru E.coli potvrdile da odreñene bakterije mogu preživjeti i
sterilizaciju u autoklavu (>121° C) prelaskom u svoju L-formu. Općenito,
9
smatra se i da su neke kronične humane bolesti povezane s L-formom
bakterija.
Slika X: L –oblik Listeria monocytogenes
Bakterijska stanica-populacija
Zbog izuzetno male veličine pojedinačnih bakterijskih stanica, za njihovo
se proučavanje u praksi uvijek koristi čista kultura koja sadrži tisuće,
milijune pa čak i milijarde bakterijskih stanica iste vrste. Drugim riječima
proučava se populacija, a ne pojedinačna bakterijska stanica. Jednako
tako, kada se u odreñenom prehrambenom proizvodu, ili proizvodnoj
sredini želi ustanoviti prisutan broj bakterija takoñer se radi isključivo o
mikrobnoj populaciji . Naime, broj bakterija prosuñuje se na temelju
broja formiranih kolonija poraslih na čvrstom hranilištu. Dogovorno jedna
10
kolonija predstavlja jednu bakteriju neovisno koliko ih pojedinačna
kolonija zapravo stvarno sadrži. Te kolonije, ovisno o vrsti proizvoda,
predstavljaju broj prisutnih bakterija u jednom mililitru ili gra mu. U
internacionalnoj literaturi i praksi, što je prihvatila i Hrvatska, za
izražavanje broja bakterija u nekom mediju koristi se broj formiranih
kolonija na čvrstom hranilištu, a označava se oznakom CFU/g ili mL
(eng.Colony Forming Units).
Slika: bakterijske kolonije na različitim razrijeñenjima
1.1.1.1. Primarna struktura
Stanica svih bakterijskih vrsta sastoji se od stanične stjenke,
stanične ili plazmatske membrane, citoplazme, jednog kromosoma i
11
ribosoma. Bakterijski geni koji kontroliraju stanični razvitak i metaboličke
aktivnosti organizirani su na dva načina. Smješteni su na dugoj molekuli
DNK, bakterijskom kromosomu i/ili na maloj neesencijalnoj jedinici
DNK koja autonomno replicira plazmide. Prosječno kromosom sadrži oko
1000 gena. Plazmidi su mali cirkularni prsteni DNK koji unutar
bakterijske stanice egzistiraju neovisno o kromosomalnoj DNK. Oni su
nosioci 5-10 gena koji nisu esencijalni za preživljavanje bakterijske
stanice. Kada se bakterijska stanica dijeli, svaka stanica kćer dobije kopiju
kromosomalne DNK s kopijom ili kopijama svih plazmida koji su prisutni
u roditeljskoj stanici. Budući se plazmid(i) replicira neovisno o
kromosomu, bilo koja mutacija, ili jednostavno spontana reakcija
uzrokovana promjenom uvjeta medija može uzrokovati da stanice kćeri ne
dobiju plazmid(e). Tako one izgube funkciju koja je kodirana njihovim
genima. Gubitak plazmida kod bakterija mliječne kiseline (BMK) koji
kodiraju na primjer tvorbu mliječne kiseline to znači izostanak
fermentacije u proizvodnji fermentiranih mliječnih proizvoda. Indirektno,
gubitak proizvodno značajne bakterijske funkcije, za mljekarsku industriju
predstavlja i značajni financijski gubitak.
U nekim slučajevima bakterijski se plazmidi mogu prenositi i na
druge vrste bakterija. Opasnost od te bakterijske sposobnosti posebice je
značajna kada je ona vezana za patogene bakterije. Zbog toga, što se
njihova virulentnost tako može prenositi i na prirodno za čovjeka
neškodljive bakterije.
Kromosom i plazmid(i) zajedno čine bakterijski genom ili genetski
materijal bakterije koji se nasljeñuje. (SLIKA X) Ribosomi su mala
zaobljena tjelešca izgrañena od proteina i RNK. Oni su odgovorni za
12
sintezu proteina u bakterijskoj stanici, a poznati su i kao 70s ribosomi
(Svedbergova jedinica; mjera relativnog omjera sedimentacije čestica koja
nastaje centrifugiranjem pri velikoj brzini). Mitohondriji i kloroplasti
eukariotslih organizama sadrže ssrRNK koja je blisko srodna bakteiskoj
ribosomalnoj RNK , što ukazuje da su se te organele eukariti naslijedili od
prokariota. U praksi, ribosomiupravo su tjelešca koja su odgovorna za
intenzivnu reakciju bojanja bakterijske stanice osnovnim bojama kao što je
na primjer metilensko plavilo.
Slika X : Bakterijski genom
1.1.1.2. Stanična stjenka
Većina bakterija ima čvrstu staničnu stjenku koja štiti stanični
protoplast od mehaničkog oštećenja, osmotskog puknuća ili lize stanice.
Struktura stanične stjenke koja ima istovremenu čvrstoću i sposobnost
velike rastezljivosti izgrañena je od mureina, spoja koji postoji jedino u
bakterijskoj staničnoj stjenci i nigdje drugdje u prirodi. Murein je
13
jedinstvena vrsta peptidoglikana, polimera koji je sastavljen od dva šećera
N-acetil glukozamina (NAG) i N-acetil mureina (NAM) meñusobno
povezanih kratkim lancima aminokiselina. Peptidoglikan u staničnoj
stjenci imaju Gram- pozitivne i Gram-negativne bakterije.
Stanična stjenka Gram-pozitivnih bakterija (koje se boje plavo bojanjem
po Gramu) sastoji se od nekoliko slojeva peptidoglikana koji su povezani
teikoičnom kiselinom (polimer glicerola i ribitola povezanan fosfatnim
skupinama). Teikoična je kiselina s mureinskom kiselinom povezana
kovalentnom vezom i nalazi se u staničnoj stjenci jedino Gram-pozitivnih
bakterija. Njena uloga je održavanje čvrstoće i negativnog naboja stanične
stjenke.
Stanična stjenka Gram-negativnih bakterija (koje se boje crveno
bojanjem po Gramu) sadrži samo jedan sloj peptidoglikana. Meñutim, za
razliku od Gram-pozitivnih bakterija, peptidoglikan Gram-negativnih
bakterija okružen je membranskom strukturom koja se naziva vanjska
membrana ili vanjska opna. Ona se sastoji od lipida, proteina i ne
promjenjivog lipopolisaharida (LPS) ili endotoksina. LPS je toksičan za
ljude i životinje. Takoñer, zbog LPS vanjska membrana za Gram-
negativne bakterije prva je njena permeabilna barijera.
Molekula LPS sastoji se od hidrofobne regije - lipida A koja je čvrsto
povezana sa hidrofilnom linearnom polisaharidnom regijom sastavljenom
od ne varijabilnog (temeljnog) polisaharida i O-specifičnog polisaharida.
Lipid A predstavlja konzerviranu regiju, a funkcija mu je zaštita stanice od
lijekova, kemikalija i drugih štetnih agensa. O-polisaharid ili antigen je za
bakterijsku stanicu species specifičan čak i na razini soja unutar iste vrste.
14
Meñutim, bakterijska stanica pod odreñenim okolnostima može izmijeniti
strukturu O-polisaharid. Na primjer, sposobnost preureñenja strukture O-
antigena, patogene bakterije koriste za zaštitu svoje stanice od djelovanja
imunološkog sustava domaćina.
Peptidoglikan molekule se mogu razgraditi enzimom lizozimom koji
je prisutan u serumu, tkivu, te sekretornim i fagocitoznim eukariotskim
stanicama . Funkcija lizozoma je liza bakterijske stanice kao konstitutivne
obrane organizma od patogenih bakterija. Neke Gram-pozitivne bakterije
izuzetno su osjetljive prema lizozimu. Na djelovanje lizozima znatno su
manje osjetljive Gram- negativne bakterije budući je njihov sloj
peptidoglikana zaštićen periplazmatskim prostorom i vanjskom
membranom. Lizozim izaziva lizu stanice cijepanjem 1,4 veze izmeñu N-
acetil glukozamina i N-acetil mureina. Na sličan način na patogene bakterije
djeluju i antibiotici. Mnogi antibiotici, uključujući i penicilin, djeluju
baktericidno upravo tako što priječe sintezu proteoglikanskog sloja stanične
stijenke (inhibiraju završnu reakciju poprečnog povezivanja
peptidoglikanskih niti). Istovremeno, zbog odsustva mureina u stjenci
eukariotskim stanica ne štete ljudskim i životinjskim stanicama.
U periplazmatskom prostoru koji se u bakterijskoj stanici nalazi
izmeñu peptidoglikanskog sloja, vanjske membrane i citoplazmatske
membrane smješteni su bakterijski digestivni enzimi i proteinski toksini.
Gram-pozitivne bakterije za razliku od Gram-negativnih bakterija imaju
zanemarivo mali periplazmatski prostor, te se enzimi i toksini iz stanice
izlučuju u okoliš. Suprotno, ti se spojevi kod Gram-negativnih bakterija iz
stanice oslobañaju tek njezinom razgradnjom. Funkcije stanične stjenke
bakterija su slijedeće:
15
- daje oblik stanici
- štiti stanicu od vanjskih uvjeta
- osigurava životne aktivnosti stanice
- najznačajnije je mjesto za djelovanje antibiotika
- sadrži receptore za prihvaćanje stanice za površinu
- sadrži receptori za lijekove, kemikalije, bakteriofage
- mjesto je virulentnosti stanice
- sadrži spojeve za utvrñivanje imunološke različitost izmeñu vrsta i
sojeva unutar iste vrste
- svojom strukturalnom grañom dijeli bakterije u dvije osnovne
skupine: Gram-pozitivne i Gram- negativne bakterije
Slika X . Graña stanične stjenke: A- Gram- negativne, B- Gram-pozitivne
16
1.1.1.3. Stanična membrana
Stanična ili citoplazmatska membrana je najdinamičnija struktura
prokariotske stanice koja je izgrañena od približno 40% fosfolipida i 60%
proteina. Njena je glavna funkcija selektivna regulacija prolaska supstanci
u stanicu i iz stanice. Stanična membrana u stanicu propušta prolaz vode i
za stanicu neškodljive molekule do veličine 100 Da (dalton; atomska
jedinica mase = 1/12 mase atoma ugljika 12C). U stanicu, stanična
membrana bakterija ne propušta veće molekule niti bilo koju škodljivu
supstancu. Neškodljive veće molekule ili druge supstance u stanicu
bakterije unose specijalnim transportnim procesima i/ili transportnim
sustavima smještenim na staničnoj membrani.
Prokariotska bakterijska stanica nema intracelularne organele zbog toga,
njihovu je funkciju preuzela stanična membrana. Posljedično tome,
membrana ima različite funkcije u procesima stvaranju energije i
biosintezi neophodnih za život bakterijske stanice.. Takoñer, stanična
membrana je mjesto oksidativne fosforilacije i fotofosforilacije koje su
analogne funkciji mitohondrija i kloroplasta u eukariotskim stanicama.
Citoplazmatska membrana sadrži i enzime koji su uključeni u mnoge
metaboličke procese poput sinteze stanične stjenke, sinteze membrane,
DNK replikacije, formiranja septuma tijekom dijeljenja stanice, CO2
fiksacije i oksidacije amonijaka.
Izmeñu brojnih i različitih funkcija koje ima citoplazmatska membrana
bakterijske stanice, njene dominantne funkcije su slijedeće:
17
- osmotske ili permeabilne barijere
- mjesto je transportnog sustava za specifične otopine nutrienata i
iona
- ima funkciju stvaranja energije uključivo respiratorne i fotosintetske
transportne sustave, uspostave proton pokretačke sile i ATP sinteze
ATPase.
- sinteze membranskih lipida uključivo i lipopolisaharida u staničnoj
stjenci G-negativnih bakterija
- sinteze mureina (peptidoglikan - stanična stjenka)
- tvorbe i sekrecija ekstra-citoplazmatskih proteina
- kordinacije DNK replikacije i procesa formiranja septuma tijekom
dijeljenja stanice
- mjesto je za specifični enzimatski sustav
- mjesto je za stvaranje flagela i pila
1.1.1.4. Citoplazma
Bakterijska citoplazma je gelu slična vodena otopina u koju su uklopljene
tri grupe makromolekula: proteini (enzimi), mRNK,i tRNK; male
molekule koje služe za: energetski izvor, prekursore makromolekula,
metaboliti, vitamini i slično; različiti anorganski ioni i kofaktori. Dok su
primarni strukturni elementi bakterijske citoplazme nukleotid (DNA) i
ribosomi, te moguće neke vrste inkluzija. Bakterijski kromosom odreñuje
18
sva svojstva i funkcije bakterije. Tijekom staničnog rasta i razmnožavanja,
prokariotski kromosom se replicira na način da daje istu kopiju molekule
za stvaranje stanica kćeri. Replikacija i odvajanje DNK koordinirana je
citoplazmatskom membranom i različitim proteinima smještenim u
citoplazmi.
1.1.1.5. Endospore
Bakterijsku strukturu ponekad čini vidljiva tvorba latentne stanice koja se
naziva endospora. Sposobnost stvaranja spora unutar vlastite stanice od
svih poznatih bakterija imaju jedino bakterijske vrste rodova Bacillus i
Clostridium. Zbog načina kako te bakterijske vrste stvaraju spore nazivaju
se endospore, premda one samostalno egzistiraju u okolišu. Nakon što je
spora unutar stanice majke formirana dogaña se liza stanice, a spora izlazi
u okoliš. U latentnom stanju spora ostaje u okolišu do nastanka povoljnih
uvjeta za rast vegetativne stanice. Meñutim, da bi se iz spore ponovno
razvila vegetativna stanica dodatno je potreban odreñeni kemijski ili
fizikalni stimulans od kojih je, vjerojatno, najvažniji temperaturni šok. To
saznanje posebno je značajno u mljekarskoj industriji koja u proizvodnji
svojih proizvoda gotovo uvijek koristi temperature izmeñu 60 i 140°C
(pasterizacija, sterilizacija).
Strukturalno spora je od unutrašnjosti prema vanjskom dijelu grañena od
slijedeći slojeva:
19
- unutrašnjosti koju čini citoplazma s bakterijskim genomom
- debele kore (korteks) koja se sastoji od peptidoglikana i visoke
koncentracije Ca-dipikolinata (inertne kiseline koja se u prirodi nalazi
jedino u bakterijskim endosporama)
- unutrašnje stjenke izgrañene od proteina keratinske vrste
- vanjske stjenke izgrañene od proteina, ugljikohidrata i lipida
Slika X: strukturna graña bakterijske endospore
Zbog svoje specifične grañe, fizioloških i biokemijskih karakteristika, te
visoke koncentracije Ca-dipikolinata, endospore su znatno rezistentnije na:
temperaturu, kemikalije uključujući i dezinficijense, zamrzavanje,
ekstremne pH vrijednosti sredine, dehidraciju, niski aktivitet vode,
isušivanje i druge nepovoljne uvjete sredine u usporedbi s vegetativnom
stanicom. Te znanstveno utvrñene činjenice, mljekarska industrija koristi
za postavljanje tehnološko-sanitarnih protokola i standarda u proizvodnji i
kontroli kvalitete svojih proizvoda. Za prehrambenu industriju općenito,
značenje u smislu kvarenja i/ili uzročnika zdravstvene neispravnosti
proizvoda podjednako su značajne Clostridium i Bacillus spp.
20
1.1.1. 6. Ekstacelularne strukture
1. 1.1.6.1. Kapsula i glikokolaks
Za razliku od sposobnost tvorbe endospora, velika većina
bakterijskih vrsta ima sposobnost stvaranja materijala koji se izlučuje
izvan bakterijske stanice. Zbog te sposobnosti bakterijske stanica mogu
formirati još jedanu estracelularni sloj (opnu) oko svoje stanične stjenke
koji nije strukturni element stanične stjenke. On može biti čvrsto
priljubljen uz staničnu stjenku te se tada naziva – kapsula. U slučajevima
kada ta ektracelularna struktura samo difuzno okružuje bakterijsku stanicu
poznata je pod imenom sluzavi omotač ili glikokoliks . Prema svojoj
kemijskoj strukturi ekstacelularna struktura bakterijske stanice je
polisaharidnog ili lipopeptidnog sastava zavisno o raspoloživom izvoru
ugljika u mediju (ugljikohidrati, aminokiseline). Uloga te strukture
prvenstveno je zaštita bakterijske stanice od isušivanja, infekcije
bakteriofaga (bakterijski virus), djelovanja antibiotika, dezinficijensa i
drugih sličnih štetnih agensa koji stanicu mogu oštetiti ili uništiti. Druga
uloga ekstracelularne strukture je funkcionalna u smislu sposobnosti
prihvaćanja bakterije za odreñenu površinu. Nakon adhezije na čvrstu
površinu bakterije mogu formirati biofilm.
Ekstracelularnu strukturu bakterijske stanice čine strukturalno različite
grupe metabolita koji im omogućavaju adheziju na čvrstu površinu na kojoj
formiraju biofilm.
21
Biofilm može formirati samo jedna bakterijska vrsta, ali češće ga
istovremeno formira više bakterijskih vrsta. Zbog toga, biofilm se općenito
definira kao kompleksna strukturno heterogena, genetski divergentna
zajednica mikroorganizama koja egzistira na čvrstoj površini u formi
ekstracelularnog matriksa sastavljenog od polimeričnih spojeva. Priroda
ekstracelularnog trodimenzionalnog matriksa, omjera razmnožavanja i
interakcije izmeñu stanica unutar biofilma odreñena je raspoloživim
uvjetima rasta, medijem i supstratom.
Fiziološki blisko povezane stanice unutar biofilma, pokazuju značajno
različita svojstva i promjene u bakterijskoj fiziologiji u usporedbi sa
slobodnom bakterijskom stanicom. Zbog nastalih promjena, zajednica
bakterija unutar biofilma pokazuje znatniju otpornost na okolišni stres, poput
djelovanja antibakterijskih sredstava ili rezistentnosti na većinu antibiotika. .
Značajna je i činjenica da su bakterijske vrste poput na primjer, B.cereus
(fakultativno anaerobne bakterije) i P.fluorescens (aerobna bakterija)
takoñer sposobne zajedno formirati biofilm. U formiranom binarnom
biofilmu te dvije bakterijske vrste preživljavanje bakterije P.fluorescens
nakon izlaganja na primjer klor dioksidu (ClO2) značajno je veće u
prisutnosti vrste B.cereus.. Osim toga, biofilm ima funkciju izvora slobodnih
bakterijskih stanica različitih karakteristika u odnosu na slobodne bakterijske
stanice i stanice iste vrste povezane u biofilm. Naime, bakterijske stanice
unutar biofilma razvijaju veću biomasu stanica i imaju mogućnost
povremenog izdvajanja iz stvorenog biofilma. Iz tih razloga, biofilm koji se
može formirati na svim površinama mljekarske opreme, predstavlja
tvrdokoran i dugotrajan izvor permanentne kontaminacije mliječnih
proizvoda. U mljekarskoj industriji, ta skupina bakterija je i uzročnikom
kvarenja proizvoda koja se manifestira pojavom sluzavosti na njegovoj
22
površini. Dobar primjer, česta je pojava sluzavosti površine svježeg sira
zbog rasta odreñenih vrsta Gram-negativnih bakterija koje imaju sposobnost
stvaranja sluzavog omotača izvan svoje stanične stjenke. Suprotno, bakterije
mliječne kiseline koje imaju istu sposobnost koriste se za poboljšanje
teksture fermentiranih mlijeka.
Slika X kapsula ili glikokolaks
Slika X: biofilm B.cereus
1. 1.1.6.2. Flagele i pili
23
Bakterijske flagele su izgrañene od nekoliko vrsta proteina od kojih
je najznačajniji flagelin (jedinstveni protein) i kompleksne su filamentozne
(nitaste) strukture. Za pokretanje približno ih koristi polovica bacila, te
sve bakterije spiralnog i zakrivljenog oblika. Suprotno, flagele za
pokretanje koristi svega nekoliko koka što ukazuje da su se koki adaptirali
na suho okruženje i tako izgubili potrebu za hidrodinamičku strukturu
stanice.
Flagele na bakterijskoj stanici mogu biti različito rasporeñene, ali načelno
razlikujemo dva osnovna oblika flagela: polarne (jedna ili više flagela koje
izbijaju iz jednog ili oba pola stanice) i peritrihalne ( flagele koje lateralno
okružuju cijelu stanicu). Raspored flagela genetski je odreñen, stoga se to
svojstvo ponekad koristi za karakterizaciju ili razlikovanje bakterijskih
vrsta. Na primjer izmeñu Gram-negativnih bakterija rod Pseudomonas ima
polarne flagele, te se može razlikovati od crijevnih bakterija koje imaju
peritrihalni oblik flagela. Osim funkcije kretanja flagele bakterijama služe
kao senzori, odnosno imaju sposobnost odgovora na odreñeni stimulans iz
okoliša. Tako se na primjer bakterije počinju kretati prema za njih
korisnom nutrientu, odnosno udaljavaju se od štetnih supstanci u okolišu.
Ostali „taktički“ odgovori bakterijskih flagela na okolišne uvjete su
odgovor na svjetlost, kisik i zračenje. Funkcija odgovora na nepovoljne
uvjete okoliša kojima raspolažu flagele još je jedan dokaz koji objašnjava
sposobnost preživljavanja bakterija u različitim ekološkim uvjetima.
Složenost grañe i funkcije bakterijskih flagela potvrñuje i činjenica da je
otprilike 50 gena potrebno za njihovu sintezu i definiranje funkcionalnih
svojstva.
24
Pili ili fimbrije su kratke, kosi slične strukture koje se nalaze na površini
bakterijske stanice. Uobičajene su za Gram-negativne bakterije, ali ih
mogu imati i neke od Gram-pozitivnih bakterija. Pili omogućuju
bakterijama prihvaćanje za površine, supstrate i druge stanice ili tkiva u
prirodi. Posebno značenje za humani organizam imaju pili patogenih
bakterija koje tim bakterijama omogućavaju dobru kolonizaciju tkiva i/ili
rezistentnost na djelovanje fagocita bijelih krvnih stanica. Specijalizirani
pili (F ili seksualni pili) služe bakterijama za stabiliziranje procesa
konjugacije bakterijskih stanica. Poput flagela i pili su grañeni od proteina.
1.1.2. Gljivice
Gljivice se svrstavaju u odreñene skupine na osnovu njihovog
životnog ciklusa, strukture i načina razmnožavanja. Mikroskopske gljivice
su kvasci i plijesni. Od bakterija, one se razlikuju veličinom, strukturom,
staničnom organizacijom i načinom razmnožavanja. Kvasci se najčešće
pojavljuju kao pojedinačne stanice, a plijesni dolaze u obliku velikih
nakupina razgrananih stanica –hifa. U pravilu, kvasci tvore kolonije glatke
površine, koje su karakteristične i za veliki broj bakterijskih vrsta. Dok
plijesni, tvore pahuljaste ili paučinaste makroskopski vidljive kolonije.
Prosječna veličina stanice kvasaca varira od 5-8 µm do više od 100 µm, a
stanice plijesni je
25
10 x 40µm. Za prehrambenu industriju, praktično značenje imaju slijedeće
skupine gljivica: Zygomycetes, Ascomycetes, Basidiomycetes i
Deuromycetes.
Za mikroskopske gljivice karakteristično je istovremeno kvarenje
odreñenih vrsta hrane, dok se neke vrste unutar te iste skupine koriste u
proizvodnji različitih prehrambenih proizvoda. Tako je proizvodnja kefira
nezamisliva bez korištenja mnogih vrsta kvasaca kao što su npr.
Kluyveromyces marxianus var. lactis, Saccharomyces cerevisiae, Candida
maris. Njihova prisutnost u svakom drugom fermentiranom mlijeku
smatra se ozbiljnom pogreškom.
1.1.2.1. Plijesni
Termin plijesni koristi se za bilo koje filamentozne, višestanične
gljivice koje su industrijski značajne za fermentaciju hrane, industrijsku
fermentaciju, procese biorazgradnje supstrata, ili su uzročnici kvarenja
prehrambenih proizvoda. Zbog toga, one i nemaju signifikantnu
taksonomsku identifikaciju. Neke od tih plijesni pripadaju skupini
Zygomycetes, neke skupini onih Deuromycetes plijesni koja se ne
razmnožavaju spolnim načinom, a neke su vrste pripadnici Ascomycetes
skupine. Karakterizira ih rast u obliku isprepletene nakupine koja se brzo
širi, te može za 2-3 dana prekriti površinu od nekoliko centimetara.
Izmeñu tih plijesni, neke su posebno interesantne mikrobiolozima zbog
jedinstvenih bioloških svojstava ili njihove ekonomske važnosti.
26
1.1.3. Virusi
Za prehrambenu industriju, virusi su interesantni, jer se prenose i
hranom, služe za identifikaciju patogenih bakterija, te mogu uzrokovati
pogreške mliječne fermentacije. Identifikacija virusa uključuje kulturu
tkiva ili staničnu kulturu, te elektronsku mikroskopiju. U svijetu, većina
laboratorija prehrambene industrije koristiti taj način identifikacije virusa
kao rutinsku metodu u kontroli hrane.
2. Rast mikroorganizama i mikrobne populacije
Većina studija rasta mikroorganizama temelji se na rastu
populacije, iz razloga izuzetno male veličine pojedinačne mikrobne
stanice. Meñutim, mikrobna populacija ovisna je o rastu pojedinačne
stanice, te je korisno razlikovati rast jedne stanice od rasta njene
populacije. Rast jedne stanice definiran je povećanjem staničnih sastojaka
i strukture stanice. Posljedica je povećanje veličine i težine stanice, nakon
čega obično slijedi njeno razmnožavanje. Omjer povećanja stanice u
vremenu je gotovo linearan. Dok rast populacije, s druge strane znači
povećanje broja stanica, što je posljedice rasta i razmnožavanja svake
pojedinačne mikrobne stanice. Za razliku od staničnog rasta koji je
linearan, rast mikrobne populacije je eksponencijalan ili logaritamski.
Omjer eksponencijalnog rasta u vremenu izražava se kao generacijsko
27
vrijeme koje označava vrijeme potrebno da se populacija udvostruči.
Zbog činjenice da su u prirodnoj populaciji pojedinačne stanice u
različitim fazama svoga životnog ciklusa, te da se sve stanice istovremeno
ne dijele, često se umjesto termina generacijsko vrijeme koristi i termin
prosječno generacijsko vrijeme. Generacijsko vrijeme izmeñu različitih
mikrobnih vrsta varira izmeñu svega nekoliko minuta do više sati.
Najkraće poznato generacijsko vrijeme od približno 10 minuta, utvrñeno je
za bakteriju Clostridium perfingens. Za većinu ostalih bakterijskih vrsta,
generacijsko vrijeme je izmeñu 30. i 60. minuta. Ono je za svaku
mikrobnu vrstu u optimalnim uvjetima rasta (nutrijenti, pH, redoks
potencijal, aktivitet vode) manje ili više konstantno. Meñutim, kada se bilo
koji od čimbenika mikrobnog rasta promijeni u odnosu na optimalno
potrebnu vrijednost, generacijsko vrijeme se povećava. Za Escerichia coli
čije je generacijsko vrijeme 20 minuta, promjenom jedino temperature
sredine s 37°C (optimum)na 20°C, znači povećanje generacijskog vremena
na više od 40 minuta.
Zbog eksponencijalnog ili logaritamskog rasta jednostaničnih
mikroorganizama koji se razmnožavaju binarno, njihov broj u populaciji,
vrlo često, je toliki da ga je teško izraziti. Najjednostavniji, a ujedno i
najčešći način interpretacije mikrobnog broja u populaciji je logaratamski
po bazi 10 (log10). Tako je ekvivalent broja mikroorganizama od 106 - 1
000000, 108 - 100 000000, a od 6,5 x 103- 6500. Takoñer, za izražavanje
mikrobnog broja u populaciji koristi se logaritam po bazi 2 (log 2) za opis
karakteristika udvostručenja broja stanica koje se binarno dijele, te
prirodni logaritam (log e) za dijeljenje stanica populacije u različitom
vremenu. Meñutim, krivulja rast mikrobne populacija u tekućem mediju
28
(SLIKA) odreñena je vremenom, a ne ukupnim brojem koji uključuje žive
i mrtve mikrobne stanice. Krivulja rasta mikrobne populacije u stvari
pokazuje četiri faza njezina rasta u tekućem mediju: lag faza, log ili
eksponencijalna faza, stacionarna faza i faza odumiranja ili smrti.
Lag faza
Lag faza označava vrijeme koje je potrebno za početak rasta
mikrobne populacije u novom tekućem mediju. U samom početku, kada se
mikrobna populacija inokulira u svježi medij, rast obično ne započinje
odmah već nakon odreñenog vremena. Vremensko trajanja lag faze
odreñuju uvjeti pod kojima je organizam bio kultiviran prije inokulacije,
broju organizama, te stupnjem optimalnih uvjeta u novom mediju za
mikrobni rast. Lag faza trajati će duže vrijeme kada je mikrobna
populacija u novi medij inokulirana iz stacionarne faze rasta. Ona će biti
duža i slučajevima kada su stanice u populaciji iz bilo kojeg razloga
oštećene (temperatura, radijacija, kemikalije), ili ako je ona iz bogatog
premještena u nutrijentima siromašan medij. Suprotno, lag faza može i
potpuno izostati, kada se u novi medij identičan starom, inokulira
mikrobna populacija koja je potjecala iz svoje eksponencijalne faze rasta.
Log ili eksponencijalna faza
Log ili eksponencijalna faza rasta je ona u kojoj se mikrobna
populacija udvostručuje. U bogatom mediju koji sadrži sve potrebne
sastojke za rast odreñene mikrobne populacije stvara se enormno veliki
broj stanica, a dužina log faza je vrlo kratka. Suprotno, ako u mediju
nedostaje samo jedan od esencijalnih sastojaka koji mikroorganizam sam
29
ne može sintetizirati, omjer rasta mikrobne populacije je značajno
usporen.
Stacionarna faza
Stacionarna faza rasta slijedi nakon eksponencijalne, a gustoća
mikrobne populacije dostiže svoj maksimum. Maksimalna gustoća, nakon
koje populacija prestaje rasti, odreñena je jednim ili kombinacijom
različitih čimbenika. Vrsta mikroorganizma i njegova sposobnost
konvertiranja sastojaka medija u svoju staničnu masu uz nutritivni sastav
medija, pH i temperaturu, smatraju se najodgovornijima za omjer gustoće
mikrobne populacije. U vrijeme stacionarne faze bakterije Bacillus i
Clostridium spp. stvaraju spore. Vegetativne stanice svih bakterijskih
vrsta u ovoj fazi stvaraju vidljive kolonije na čvrstom hranilištu.
Faza odumiranja
U fazi odumiranja nastupa postupna smrt stanica, a mikrobna se
populacija eksponencijalno smanjuje. Smrt mikrobne stanice unutar
populacije dogaña se zbog nedostatka raspoloživih nutrijenata u mediju,
te je stanica prinuñena trošiti vlastite energetske rezerve do svog
iscrpljenja. Takoñer, kao posljedice mikrobnog metabolizma mijenja se
pH i akumuliraju toksični produkti koji dodatno uzrokuju bržu smrt
stanice.
30
Slika X Rast bakterijske populacije
1. 2. 1. Rast micelijskih gljivica
Rast micelijskih gljivica, koje su predmetom interesa za prehrambenu
industriju, značajno se razlikuje od rata bakterija. U tom smislu, za
proučavanju njihovog rasta ne koristi se krivulja koja vrijedi za populaciju
jednostaničnih mikrobnih organizama. Rast te skupine mikroorganizama
karakteriziran je povećanjem: dužine i volumena hife i brojem hifa koje se
granaju. Rast u mediju započinje iz spore ili fragmenta hife, zatim se
povećava dužina i promjer hife, te raste broj novostvorenih razgrananih
hifa i rast (kolonija) postaje vidljiv. Neke vrste plijesni kao što su npr.
Rhizopus spp. rastu tako dugo dok ima prostora na za njih pogodnom
supstratu. Što znači da je veličina njihovih kolonija jedino ograničena
veličinom raspoloživog supstrata. Meñutim, neke druge vrste plijesni, pod
31
istim uvjetima tvoriti će kolonije samo do odreñene veličine, neovisno o
veličini raspoloživog supstrata. Ovoj drugoj vrsti plijesni, pripada i
Penicillium spp. čija je veličina kolonije odreñena razinom stvorenih
toksičkih supstanci u supstratu koje zaustavljaju daljnji rast hifa.
2. Rast mikroorganizama u hrani
Hrana se prema sastavu i svojstvima u većini slučajeva značajno razlikuje
od idealnog laboratorijski pripremljenog mikrobnog hranilišta. Usprkos
tome, bakterije i jednostanični kvasci u hrani zadržavaju sličnu krivulju
rasta kao što je imaju u tekućem laboratorijski pripremljenom mediju.
Odnosno, jasno se razlikuju lag, log, stacionarnu i faza odumiranja
tijekom njihovog rasta u hrani. Ista krivulja rasta, tipična je i za mikrobnu
kulturu koja se koristi za proizvodnju fermentirane hrane. Od vanjskih
čimbenika, temperatura za rast mikroorganizama u hrani ima posebno
značajan utjecaj. Što se temperatura približava minimalno potrebnoj
temperaturi rasta pojedinog mikroorganizam, ne samo da se smanjuje
omjer rasta, već se i produžuje lag faza. Značenje te prirodne zakonitosti,
prehrambena industrija koristi u kontroli rasta različitih mikrobnih skupina
u hrani. Naime, pohranom hrane na niskim temperaturama (-1 do 5°C)
smanjuje se omjer rasta mikroorganizmima uzročnicima kvarenja, a
vrijeme kada se populacija u hrani ne povećava se produžuje.
2.1. Čimbenici rasta
32
2.1.1. Temperatura
Mikroorganizmi kao skupina, sposobni su aktivno rasti na
temperaturama od -150°C do + 250°C. Unutar skupine, svaka
pojedinačna vrsta ima meñutim ograničeni temperaturni raspon
rasta. Temperaturni raspon odreñen je negativnim utjecajem kojeg
temperatura ima na membranu i stanične enzime pojedinačne mikrobne
vrste. Omjer rasta i utjecaja temperature grafički se zorno može prikazati
na primjeru E.coli (SLIKA 6.1. str.55). Od točke A do točke B, u prvom
djelu grafa, bakterijski rast povećava se u omjeru koji je sličan omjeru
enzimatski kataliziranih reakcija. Tako se omjer mikrobnog rasta gotovo
udvostručuje za svakih 10°C povećanja temperature okoliša. Kada je
dosegnuta točka B, omjer rasta je najveći, nakon toga rast se relativno brzo
smanjuje, a u točki C on potpuno prestaje. Temperaturni raspon rasta za
E.coli je: minimum 8 °C; optimum 37°C; maksimum 47°C.
33
U odnosu na temperaturni raspon mikrobnih vrsta, krivulja rasta,
neovisno o minimalnim, optimalnim i maksimalnim temperaturama je
ista. Slovo "A" na krivulji uvijek označava onu temperaturu ispod koje
više nema mikrobnog rasta. Na temperaturi ispod minimalne, mijenjaju se
34
svojstva mikrobne membrane i zbog toga stanica više ne može
transportirati hranu iz medija. Slovo "B" označava optimalnu temperaturu,
odnosno temperaturu na kojoj organizam najbrže raste. Najvišu
temperaturu iznad koje organizam više ne može rasti označava slovo "C".
Iznad te temperature mikrobni se enzimi denaturiraju, što zaustavlja
katalizu esencijalnih staničnih reakcija. Te temperature, takoñer, oštećuju
proteine i lipide stanične stjenke te izostaje njezina normalna funkcija.
Posljedično, dolazi do kolapsa stanične stjenke i naposljetku do lize
stanice.
Meñutim, svi mikroorganizmi nemaju točno odreñenu optimalnu
temperaturu rasta. Prilično često, optimalna temperatura pokriva širi
temperaturni raspon, npr. Clostridium perfingens ima optimalnu
temperaturu rasta od 37do 45°C. Minimalne i maksimalne temperature,
navedene za odreñeni organizam, ovise o čimbenicima koji odreñuju
njihovu optimalnu temperaturu rasta, npr. pH i aktivitet vode. Ukoliko se
ti vanjski čimbenici promijene u odnosu na optimalne uvjete sredine,
minimalna temperatura rasta odreñenog organizma će se povećati, a
maksimalna smanjiti. Dobar primjer za objašnjenje je bakterija
Staphylococcus aureus (patogeni mikroorganizam), čija je minimalna
temperatura rasta 6,7°C, a maksimalna 48°C jedino u sredini s pH 7,0 i
aktivitetom vode od 0,99. Promjenom pH na 5,0 i redukcijom aktiviteta
vode (npr. dodatak od 3,0% natrijevog klorida u medij), S. aureus više ne
može raste na 48°C, a minimalna temperatura rasta mijenja se na 30°C.
Na temelju optimalnih temperatura rasta, mikroorganizme radi
lakšeg snalaženja najčešće dijelimo u četiri osnovne skupine:
35
• psihrofilni organizmi
• psihrotrofni organizmi
• mezofilni organizmi
• termofilni organizmi
Temperaturni raspon rasta osnovnih skupina mikroorganizama prikazan je
u tablici X, a za neke pojedinačne vrste i rodove u tablici X.
Tablica: Skupine mikroorganizama u odnosu na temperature rasta
Grupa Minimum °C Optimum °C Maksimum °C
Psihrofilni
organizmi
-10 10 - 15 20
Psihrotrofni
organizmi
-10 20-30 42
Mezofilni organizmi 5 28-43 52
Termofilni
organizmi
Ekstremno
termofilni
30
65
50-65
80-90
70
100
(modificirano prema Garbutt, 1997.)
Tablica: Minimalne, optimalne i maksimalne temperature
36
rasta nekih mikrobnih vrsta
Organizam Min. °C Optimum °C Maksimum °C Grupa
Flavobacterium spp. -10,0 10 20 psihrofilni
Pseudomonas fragii -6,5 24 38 psihrotrofni
Escherichia. coli 8 37 45 mezofilni
Bacillus
stearothermophilus
28 55 72 termofilni
Bacillus subtilis 10 28 51 mezofilni
Bacillus coagulans 30 45 56 ttermofilni
Pseudomonas
fluorescens
-4 26 40 psihrotrofni
Aeromonas spp. 0 28 42 psihrotrofni
(modificirano prema Garbutt, 1997.)
2.1.1.1. Psihrofilni mikroorganizmi
Skupina psihrofilnih mikroorganizama živi u zemlji i vodi
hladnijih krajeva zemlje, odnosno područja koja imaju tijekom cijele
godine temperaturu tla ispod 0°C, a vode od 0-5°C. Organizmi te skupine
imaju minimalnu temperaturu rasta -10°C, a optimalna i maksimalna
takoñer im je niska.
2.1.1.2. Mezofilni mikroorganizmi
37
Mezofilni mikroorganizmi adaptirali su se na život na čovjeku i
toplokrvnim životinjama, te u zemlji i vodi u tropskim i subtropskim
područjima. Važna karakteristika mezofilnih mikroorganizama je njihova
nesposobnost rasta na niskim temperaturama (-1 do 5°C). Mnogi, ali ne svi
imaju optimalnu temperaturu rasta na 37°C (temperatura ljudskog tijela).
Mezofilnoj skupini mikroorganizama pripadaju mnogi rodovi bakterija,
kvasaca i plijesni. Mnogi uzročnici kvarenja hrane kao i patogeni
mikroorganizmi koji se prenose hranom takoñer pripadaju mezofilnoj
skupini organizama. Meñutim, treba istaknuti da se optimalna temperatura
za rast nekih patogenih organizama uvijek ne poklapa s optimalnom
temperaturom potrebnom za tvorbu njihovih toksina. Temperature rasta
za S. aureus i za tvorbu toksina prikazane su u tablici
Tablica Temperature rasta i tvorbe toksina bakterije Staphylococcus
aureus
Temperature rasta
°C
Temperature za tvorbu toksina
°C
Minimum 6,7 10
Optimum 37,0 40-45
maksimum 45,6 45,6
(modificirano prema Garbutt, 1997.)
2.1.1.3. Termofilni mikroorganizmi
Termofilna skupina mikroorganizama ima svoja staništa u toploj
zemlji, kompostu, silaži, i sl., gdje temperature mogu biti i 70°C.
Eksremno termofilni mikroorganizmi mogu se naći u sredinama koje
imaju temperature više i od 100°C. Smatra se da je ta skupina
38
mikroorganizama odgovorna za samo-zapaljivanje slame i sijena. Kada je
sijeno mokro, rastu mezofilni mikroorganizmi, njihovi metabolički procesi
generiraju toplinu i zbog izolirane sredine u stogu sijena temperatura se
povećava do termofilne zone. Tada nastupaju uvjeti za rast termofilnih
mikroorganizama zbog čijih se metaboličkih procesa temperatura u stogu
sijenu dalje povećava ( više od 70°C). Novonastale kemijske oksidacije
potom su uzrokom spontanog zapaljenja sijena. Izmeñu termofilnih
mikrobnih skupina, svega je nekoliko vrsta koji imaju značajan negativan
utjecaj na kvalitetu hrane. Bacillus steraothermophilus, Clostridium
termosaccharolyticum i Clostridium nigrificans su vrste koje uzrokuju
kvarenje konzervirane hrane koja se pohranjuju na povišenim
temperaturama. U mljekarskoj mikrobiologiji, skupina mikroorganizama
koja preživljava temperature pasterizacije, ne raste na tim temperaturama,
ali može rasti na niskim temperaturama naziva se termorezistentna
skupina mikroorganizama. Rodovi Bacillus, Clostridium, Arthrobacter,
Miccrobacterium, Microccocus, Streptococcus, Lactobacillus i
Corynebacterium pripadnici su te skupine. U termorezistentne
mikroorganizme spadaju i termofilni mikroorganizmi koji preživljavaju
najnižu temperaturu pasterizacije (63°C/30 min.).
2.1.1.4. Psihrotrofni mikroorganizmi
Psihrotrofni mikroorganizmi su posebna skupina bakterija,
kvasaca i plijesni koju karakterizira sposobnost rasta na niskim
temperaturama, neovisno o svojoj optimalnoj temperaturi rasta. Općenito,
psihrotrofni mikroorganizmi su najvažnija skupina organizama uzročnika
39
kvarenja hrane (TABLICA) koja se pohranjuje u hladnim uvjetima (-1 do
7°C). Patogene bakterije Listeria monocytogenes, Yersinia enterocolitica i
Clostridium botulinum tip E, bez obzira što imaju optimalnu i maksimalnu
temperaturu rasta više karakterističnu za mezofilne organizme, takoñer se
svrstavaju u psihrotrofnu mikrobnu populaciju. Razlog tome je njihova
minimalna temperatura rasta koja je niža od 5°C. Za psihrotrofne
mikroorganizma povezane s mlijekom i mliječnim proizvodima
Meñunarodna mljekarska federacija (International Dairy Federation IDF)
1976. godine prihvatila je definiciju psihrotrofnih mikroorganizama
povezanih s mlijekom i mliječnim proizvodima koja glasi: "Psihrotrofni
mikroorganizmi mogu rasti na temperaturi 7°C i nižoj, bez obzira na
optimalnu temperaturu rasta (rast se u ovom kontekstu odnosi na sve
metaboličke procese koji su nužni za rat i razmnožavanje)".Ti
mikroorganizmi ne sačinjavaju specifičnu taksonomsku skupinu, već su
svrstani u 15 različitih rodova. Većina psihrotrofne populacije u sirovom
mlijeku pripada Gram- negativnim rodovima, iako se, ali u znatno manjem
broju, mogu naći i pripadnici Gram- pozitivnih rodova.
2. 1. 2. Aktivitet vode (aw )
Raspoloživa količina vode potrebna za rast mikroorganizama u
hrani ili aktivitet vode (aw) definira se kao omjer tlaka vodene pare iznad
površine proizvoda (p) i vodene pare prisutne u vodi (po) na istoj
temperaturi (aw= p/ po). Vrijednost aw je od 0, 0 do 1,0. Radi usporedbe aw
za mlijeko je 0,995, a za sir ovisan je o vrsti sira, periodu i dužini zrenja.
40
Većina Gram- negativnih bakterija za svoj rast zahtijeva aw od minimalno
0,95, a većina Gram-pozitivnih bakterija od minimalno 0,90. Bakterije
mliječne kiseline, u odnosu na ostale Gram- pozitivne bakterije,
zahtijevaju viši aw (npr. Lactobacillus spp. ≥0,96). Kvasci i plijesni, za
razliku od bakterija, mogu rasti u uvjetima vrlo niskih vrijednosti
aktiviteta vode. Tako je za rast kvascima dovoljan aw od 0,85, a osmofilni
kvasci mogu rasti i u uvjetima aw nižim od 0,60. Većini vrsta plijesni za
rast je dovoljan aw 0,75.
Promjena vrijednosti aw odreñuje mikrobne skupine u proizvodu.
Poznavanjem zahtjeva za količinom potrebne raspoložive vode (aw)
pojedinih mikrobnih skupina, koje mogu biti povezane sa proizvodom
može se utjecati na ukupnu kvalitetu proizvoda. Odnosno, smanjenjem
vrijednosti aw mijenja se krivulju rasta odreñenih mikrobnih vrsta,
smanjuje se njihov omjer rasta, produžuje se lag faza, smanjuje se broj
stanica u stacionarnoj fazi, a veći broj stanica odumire u fazi odumiranja
(slika 3.)
41
Slika 3.: Utjecaj aktiviteta vode (aw) na krivulju rasta mikroorganizama
(Garbutt, 1997.)
Općenito, prisutna voda u proizvodu (mediju) nije garancija da je ta voda
raspoloživa za mikrobni rast i zato ona ne predstavlja aktivitet vode (aw).
Voda u hrani nije dostupna mikroorganizmima kada sadrži otopljene tvari
kao što su šećeri ili soli i/ili je ona u kristaliziranom ili hidratacijskom
obliku ("vodeni plašt" npr. oko bjelančevina). Dobar primjer za
objašnjenje dostupnosti raspoložive vode je maslac (emulzija vode u
ulju) s niskim udjelom soli (2-3%) što sugerira da je aw u proizvodu
0,993-0,989. Meñutim zbog polarnog svojstva soli, ona je otopljena u
vodenoj fazi maslaca što podiže njenu koncentraciju na približno 18%, te
je stvarni aw 0,86. Takoñer, svaki specifični mikroorganizam ima svoj
vlastiti aw raspon, ali je za sve vrste zajedničko da je apsolutni aw limit
42
0,61. Izmeñu skupina mikroorganizama, bakterije su najosjetljivije na
smanjenje aw, a kvasci i plijesni su najrezistentniji ( graf X str.67 fig. 6.6.)
Na osnovu tih činjenica i potencijalne mogućnost kvarenja, hrana se može
podijeliti u hranu s visokim, srednjim i niskim udjelom vode.
• Hrana s visokim udjelom vode (aw 0,95-0,90); svi svježi proizvodi
(bez ili s vrlo malo promjena u smislu njihovog konzerviranja), mlijeko,
svježi sir, nesoljeni maslac i mliječni namazi. Kvarenje tih proizvoda
uzrokuju Gram-negativne bakterije, brzo rastuće plijesni i ne-osmolitski
kvasci. Meñutim kada se hrana konzervira isušivanjem, dodatkom šećera
ili soli (npr. soljeni maslac, sirevi koji zriju) uzročnici kvarenja postaju
gram-pozitivne bakterije, kvasci i plijesni.
• Hrana s srednje visokim udjelom vode (aw 0,90-0,61), odnosno
hrana pripremljena intenzivnim sušenjem i/ili dodatkom znatnih količina
šećera ili soli, kvariti će se zbog rasta kvasaca, plijesni, kserofilnih
plijesni i halofilnih bakterija. Od mliječnih proizvoda u ovu skupinu hrane
spadaju zreli sirevi.
• Hrana s niski udjelom vode (aw niži od 0,61), odnosno hrana
pripremljena potpunim isušivanjem (čokolada, brašno, šećer, mlijeko u
prahu i sl.) smatra se potpuno sigurnom u smislu kvarenja. No kvarenje se
dogaña u slučajevima kada se ti proizvodi drže u uvjetima s mogućnosti
ponovnog upijanja vlage.
Snižavanje aw u hrani iznimno je važno i u kontroli rasta patogenih
mikroorganizama. Uz izuzetak S.aureus, B.cereus i plijesni koje tvore
mikotoksine, patogeni mikroorganizmi neće rasti u hrani čiji je aw niži od
0,93 (48% saharoze, 10% NaCl). Meñutim, ne smije se zaboraviti
43
činjenica da patogeni mikroorganizmi premda neće rasti, mogu u
osušenom proizvodu čiji je aw niži od minimalnog, preživjeti kroz duži
period. Salmonella spp. može tako preživjeti u mliječnom prahu i do
sedam mjeseci.
2.1.3. pH
Vrijednost pH hrane ili mikrobnog hranilišta je jedan od najvažnijih
čimbenika koji utječu na rast i preživljavanje mikroorganizama.
Pojednostavljeno, termin pH je mjera koja pokazuje da li je medij kiseli,
bazični ili neutralan:
• otopina koji sadrži 10-7 mol H+/L ima pH vrijednost 7 i ona je
neutralna
• otopina koji sadrži 10-5 mol H+/L ima pH vrijednost 5 i ona je
kisela
• otopina koji sadrži 10-8 mol H+/L ima pH vrijednost 8 i ona je
bazična
Ne smije se zaboraviti da je pH skala logaritamska, te se kiselost ili
bazičnost sredine promjenom za jednu jedinicu povećava za faktor 10. Na
primjer, ako medij ima pH vrijednost 4 on je 1000x kiseliji u usporedbi s
medijem čija je pH vrijednost 7.
Svi mikroorganizmi imaju svoju specifičnu toleranciju prema pH
vrijednostima sredine i svoj optimalni pH, kada rastu najbolje. Slika (X)
44
prikazuje utjecaj pH na omjer rasta najvećeg broja bakterija, kvasaca i
plijesni.
Slika X: pH
Za rast bakterija minimalno potrebna vrijednost pH sredine je 4,0-
4,5, optimalna izmeñu 6,8-7,0, a maksimalna od 8,0-9,0. Neke bakterijske
vrste čine izuzetak od tog općeg pravila, na primjer Lactobacillus spp.
rastu unutar 3,8-7,2 a optimalna im je vrijednost oko pH 5. Acinetobacter
spp. raste izmeñu 2,8 i 4,3, s optimalnim pH oko 3.
Kvasci i plijesni su općenito manje senzibilni na pH sredine u usporedbi s
bakterijama, te rastu u puno širem rasponu pH vrijednosti. Plijesni
45
Fusarium spp. tako može rasti u mediju čija je pH vrijednost izmeñu 1,8 i
11,1. Optimalna vrijednost pH za kvasce je izmeñu 4,0 i 4,5, a za plijesni
izmeñu 3,0 i 3,5. Takoñer, pH nema samo utjecaj na rast mikroorganizma,
već i na njegovu krivulju rasta. Utjecaj pH medija na krivulju rasta
mikroorganizama ilustriran je na slici X.
Slika X.: promjena optimalnog pH
46
Odstupanjem od optimalne pH vrijednosti za odreñeni mikroorganizam
znači:
• smanjenje omjera rasta
• smanjenje broja novo stvorenih stanica
• produženje trajanje lag faze
• skraćenje trajanje stacionarne faze
• povećanje omjera odumiranja stanica
Za rast odreñenog mikroorganizma, minimalno potrebna pH vrijednost
sredine odreñena je temperaturom, izvorom raspoloživih hranjivih tvari,
aktivitetom vode i razinom inhibitornih tvari. Interni pH mikrobne stanice
je približno 7 (premda može biti i niži za neke organizme, npr. kvasce čiji
je pH u stanici 5,8) i kod te pH vrijednosti metabolizam stanice najbolje
funkcionira.
Hrana je općenito prilično varijabilna u smislu pH vrijednosti, ali
vrlo rijetko ima bazičnu reakciju (jaja su jedna od rijetke hrane koja imaju
bazičnu reakciju). Meñutim, osnovna pH vrijednost hrane mijenja se
njenom mikrobnom kontaminacijom. Mlijeko postaje kiselo zbog
djelovanja streptokoka i laktobacila koji imaju sposobnost tvorbe mliječne
kiseline.
Kvarenjem hrane Gram-negativnim bakterijama Pseudomonas spp.
(koriste amino kiseline za izvor ugljika), nastaje amonijak koji stvara
bazične uvjete sredine.
47
Hrana koja ima visoki puferni kapacitet (visoki udjel proteina u
namirnici), pokazuje veću rezistentnost na promjene pH od hrane s nižim
pufernim kapacitetom. U tom smislu, za kontrolu rasta patogenih i
mikroorganizama uzročnika kvarenja u hrani, vrlo često se korekcija pH
vrijednosti vrši organskim kiselinama (mliječna, limunska, octena). One
u prehrambenom proizvodu imaju ulogu konzervansa.
Hrana s vrijednošću pH nižom od 4,2, smatra se u smislu rasta patogenih
bakterija sigurnom. Naravno odreñene patogene bakterije mogu rasti i u
uvjetima tako niskih pH vrijednosti, ali uz pretpostavku da svi ostali
čimbenici rasta imaju optimalnu vrijednost. Takvi uvjeti su karakteristični
za kulturološku hranjivu podlogu, ali na sreću, u hrani su izuzetno rijetki.
2. 1. 4. Kisik
Mikroorganizmi se meñusobno razlikuju i prema svojim potrebama
za kisikom. Tako neki mikroorganizmi zahtijevaju kisik da bi stvarali
staničnu energiju u formi adenozin trifosfata -ATP (aerobno disanje).
Proces uključuje glikolizu, Krebsov ciklus i sustav transporta elektrona
gdje kisik služi kao terminalni akceptor elektrona. Potrebna energija se
stvara potpunom oksidacijom organskog supstrata, a konačni produkt su
CO2 i voda. Kada je glukoza organski supstrat, stvara se 38 ATP iz ADP
(adenozin difosfat) po svakoj molekuli oksidirane glukoze.
Mikroorganizmi koji mogu rasti jedino u prisutnosti kisika zovu se
aerobni mikroorganizmi. U hrani obligatni aerobni mikroorganizmi su
bakterija Pseudomonas fluorescens, plijesni Penicillium spp. i neki kvasci.
48
Mikroorganizmi koji ne rastu u prisutnosti kisika nazivaju se anaerobni
mikroorganizmi. Za svoj rast potrebnu energiju stvaraju isključivo
fermentativnim putem, gdje, koriste organski akceptor elektrona. U
usporedbi s aerobnim mikroorganizmima stvara se znatno manje energije,
a organski meñu-produkti se oslobañaju iz stanice. Jedini obligatni
anaerobni mikroorganizam povezan sa hranom je Clostridium spp.
Meñutim, neke vrste tog roda, toleriraju odreñenu koncentraciju kisika u
sredini u kojoj rastu, te se opisuju kao aerotolerantni. Clostridium
perfingens, patogeni mikroorganizam povezan s hranom, pripada toj
mikrobnoj skupini.
Osim podjele na aerobne i anaerobne, mikroorganizmi mogu prema
svojim zahtjevima prema kisiku biti: mikroaerofilni, fakultativno
anaerobni, kisik-neovisni i fermentativni mikroorganizmi (SLIKA X)
49
Slika X odnos bakterija prema kisiku
Mikroaerofilni mikroorganizmi trebaju kisik za stvaranje potrebne
energije za rast, ali njegova razina u mediju mora biti manja od 20%.
Campylobacter spp. može tako rasti u hrani koja ima koncentraciju kisika
izmeñu 1 i 10% (optimum 6%). Koncentracija kisika veća od 10%
toksična je za te bakterije. Fakultativni anaerobni mikroorganizmi
mogu rasti u prisutnosti ili odsutnosti kisika. Kada je kisik u dovoljnoj
50
koncentraciji u mediju oni stvaraju energiju kao aerobni mikroorganizmi i
tada najbolje rastu. U odsutnosti kisika ta skupina mikroorganizama stvara
znatno manje raspoložive energije (2 ATP/molekuli glukoze). Mnoge
bakterije i kvasci povezani s hranom su fakultativno anaerobni
mikroorganizmi. Sve vrste koje pripadaju familiji Enterobacteriaceae, koja
uključuje i Escherichia coli te Salmonella spp. bakterije pripadaju toj
skupini. Takoñer, skupini fakultativno anaerobnih mikroorganizama
pripada i toksična bakterija Staphylococcus aureus. Većina bakterija
mliječne kiseline pripada skupini kisik-neovisnim mikroorganizmima
budući mogu rasti u mediju neovisno o prisutnom kisiku. Ti
mikroorganizmi u oba slučaja uvijek stvaraju organske meñu-produkte i
odreñenu količinu energije. Vrlo često, bakterije mliječne kiseline opisuju
se kao mikroaerofilne ili fakultativno anaerobne bakterije, meñutim
kako ne posjeduju citokrome niti jedan od tih termina nije prikladan za
njihov opis. Termin fermentativni mikroorganizmi koristi se za opis
mikroorganizama koji kao alternativni način kisiku, za stvaranje energije,
koriste organski akceptor elektrona. Fermentativni mikroorganizmi samo
djelomično oksidiraju ugljikohidrate i drugi organske spojeve, na način da
organske molekule ostaju kao rezidualni metabolički produkti.
Vrste metaboličkih produkata koji nastaju tom vrstom oksidacije znatno se
razlikuju izmeñu skupina mikroorganizama ( SLIKA str.80 fig.6.14.).
Fermentativni mikroorganizmi prema svom zahtjevu prema kisiku mogu
biti ili fakultativni anaerobni ili kisik-neovisni ili obligatni anaerobni
organizmi.
Kisik sam po sebi, neovisno da li ga organizam koristi ili ne koristi za
stanično disanje, kada je apsorbiran u stanicu, toksičan je za sve
51
mikroorganizme. Naime, prijenosom elektrona na kisik u stanici nastaju
toksični spojevi superoksid (O- 2) i vodikov peroksid (H2O2). Oni kao jaki
oksidansi, mogu oksidirati molekule vitalnih staničnih komponenti kao
što su fosfolipidi u staničnoj stjenci, te tako uzrokovati znatna oštećenja i
smrt stanice. Obligatno aerobni, fakultativno anaerobni i mikroaerofilni
organizmi, te bakterije mliječne kiseline tvore enzim superoksid dismutazu
koja im omogućava katalizu superoksida u vodikov peroksid. Stvoreni
vodikov peroksid djelovanjem drugog enzima - katalaze brzo se
razgrañuje do vode i kisika. Enzim katalazu posjeduju obligatni aerobni,
fakultativno anaerobni, mikroaerofilni i aerotolerantni anaerobni
mikroorganizmi. Bakterije mliječne kiseline za razgradnju vodikovog
peroksida koriste enzim peroksidazu. Obligatni anaerobni mikroorganizmi
ne mogu tvoriti enzime superoksid dismutazu i katalazu što objašnjava
smrt njihove stanice u prisutnosti kisika u mediju. Takoñer, zbog
vjerojatno istog razloga mikroaerofilni mikroorganizma ne mogu tolerirati
koncentraciju kisika u mediju koja je viša od one u atmosferi, te su u
usporedbi s drugim aerobnim mikroorganizmima senzitivniji na toksičnost
kisika.
2.1. 5. Oksido-redoks potencijal (Eh)
Svaka mikrobna vrsta ima svoj oksido-redoks raspon u kojem raste.
On je primarno odreñen reakcijom odreñene mikrobne vrste koju ona ima
prema kisiku u okolišu (Tablica 6.1. str. 81.). Oksido-redoks potencijal
(Eh) je mjera koja pokazuje da li materijal ima tendenciju davanja
elektrona (postaje reduciran) ili gubitka elektrona (postaje oksidiran).
52
Reducirani supstrat u odnosu na referentnu elektrodu (vodikova/platinasta
elektroda) koja ima vrijednost 0 pokazuje negativnu a oksidirani supstrat
pozitivnu vrijednost. Vrijednost oksido-redoks potencijala izražava se u
milivoltima (mV). Meñutim, oksido-redoks potencijal i mikrobni rast
izuzetno je kompleksan u prirodnom mediju i hrani koji sadrže mješovitu
mikrobnu populaciju. Osim toga na rast mikrobne populacije istovremeni
utjecaj imaju pH. aw, izvor hranjiva, te relativni broj odreñene vrste. No,
općenito rast mikrobne populacije u hrani u odnosu na oksido-redoks
potencijal ovisiti će o raspoloživom kisiku:
• površina proizvoda izložena zraku podržavati će rast obligatnih
aerobnih, fakultativnih anaerobnih ili kisik-neovisnih organizama
• hrana koja ne sadrži kisik i/ili je kisik iz proizvoda odstranjen
mehaničkim načinom kao što je zagrijavanje, ili hrana koja sadrži jake
reduktivne tvari podržavati će rast obligatnih anaerobnih, fakultativnih
anaerobnih ili kisik-neovisnih organizama
• hrana iz koje je djelomično odstranjen kisik podržavati će rast
mikroaerofilnih mikroorganizama
Poznavanje sposobnosti rasta različitih mikrobnih vrsta u odnosu na
njihov oksido-redoks potencijal i njihov odgovor na prisutni kisik u
mediju, prvenstveno su značajni za stvaranje uvjeta rasta u laboratorijskom
mediju. Mikroorganizmi koji rastu u laboratoriju prirodno se kultiviraju u
formi čistih kultura. Karakteristike rasta tako uzgajanih mikrobnih vrsta
odreñene su sastavom kulturološkog medija, pH, oksido-redoks
potencijalom i temperaturom inkubacije. U praksi, uvjeti slični
53
kultivacijskim, koriste se za mnoge industrijske fermentacijske procese.
Ta metoda, uspješno se može koristiti za suzbijanje mikrobnog rasta u
onim slučajevima kada je toplinski obrañen proizvod (npr. UHT mlijeko)
kontaminiran samo jednom mikrobnom vrstom (Clostridium spp. i /ili
Micrococcus spp.). Svježa hrana prirodno je kontaminirana mješovitom
mikrobnom populacijom koja potječe od životinja, biljaka i okoliša.
Takoñer, mješovita populacija može biti prisutna u tehnološki obrañenoj
hrani u kojoj značajna razina mikrobne populacije preživljava proces
prerade, ili ukoliko doñe do njene re-infekcije. Pasterizirano mlijeko je
dobar primjer za obje navedene moguće situacije rasta mješovite mikrobne
populacije. U hrani gdje su pH, temperatura i aw takvi da dozvoljavaju rast
više od jedne mikrobne vrste, organizmi će se meñusobno natjecati za
raspoloživi supstrat. Organizam(i) koji brže raste u zadanim uvjetima
sredine postati će dominantnom mikrobnom populacijom. Meñutim, ako je
početna razina kontaminiranosti neke vrste visoka, ona može ostati
dominantnom vrstom u hrani, neovisno što bi u normalnim okolnostima
njezin rast bio ograničen rastom kompetitivnih mikrobnih vrsta. Odreñene
mikrobne vrste iskazuju antagonizam prema drugim vrstama, na način da
brzo mijenjaju uvjete u mediju u kojem rastu. Bakterije mliječne kiseline
u mlijeku pohranjenom na sobnu temperaturu tvore mliječnu kiselinu koja
inhibira rast Gram-negativnih bakterija. Drugi antimikrobni spojevi
(vodikov peroksid ili nizin) koje one mogu stvarati u sredini rasta takoñer
inhibitorno djeluju na ostale Gram- negativne mikrobne vrste.
54
3. Taksonomija mikroorganizama
Taksonomija je znanstvena disciplina biologije koja se bavi
svrstavanjem organizama u grupe koje se nazivaju takse, a čine je tri
povezane cjeline:
• imenovanje organizama -nomenklatura
• grupiranje organizama-klasifikacija
• razlikovanje izmeñu pojedinačnih organizama- identifikacija
Sustav imenovanja koji se koristi za sve žive organizme pa tako i
mikroorganizme temelji se na binominalnom sustavu koji je u 18 stoljeću
razvio znanstvenik Carla von Linné. Nomenklatura mikroorganizama
djeluje na slijedeći način:
• svaki različiti mikroorganizam prepoznaje se kao vrsta (species;
množina, species)
• svakoj vrsti (species) daju se dva imena
• prva riječ je generičko ime (uvijek se piše velikim slovom)
• druga riječ je specifično ime (uvijek se piše malim slovom)
• specifično ime je obično riječ koja objašnjava generičko ime i često
nam govori o organizmu
Specifično ime na primjeru bakterije Escerichia coli znači da je prvo ime
Escerichia ta bakterija dobila u čast njemačko-austrijskog profesora
pedijatrije Theodora Escherich (1857.-1911.) koji ju je 1919. godine otkrio
i opisao. Drugo ime coli znači da je ona povezana s crijevima.
55
3.1. Nomenklatura
Nomenklatura znači imenovanje mikroorganizama. Imena
mikroorganizama pišu se u tiskanom tekstu uvijek u kurzivu a kada je tekst
napisan rukom njihova imena uvijek moraju biti podvučena ravnom crtom.
Dogovorene skraćenice generičkih imena mikroorganizama npr. E. coli
koriste se u svim knjigama, stručnim i znanstvenim radovima, ali samo
nakon što je početno u tekstu navedeno njihovo puno ime. Imena
mikroorganizama se nakon ozbiljnih kritičkih studija ponekad mijenjaju,
ali na sreću to nije tako često. Promjena imena već imenovanih
mikroorganizama dogaña se ako se prijašnja klasifikacija temeljila na
ograničenom broju njihovih karakteristika, i/ili ako je novim metodama
utvrñen drugačiji odnos izmeñu pojedinih organizama (npr. analizama
ribosomalne RNA mikroorganizama). Meñutim, promjena imena može
dovesti do zabune. Tako je originalno ime za Lactococcus lactis subsp.
lactis bilo Streptococcus lactis koje još uvijek koriste neki tehnolozi pa
čak i neki znanstvenici što dovodi do ozbiljnijih nesporazuma u
komunikaciji meñu stručnjacima. Korištenje točnih nazivlja
mikroorganizama osigurava: transparentnu verbalnu i znanstvenu
informaciju u literaturi, osigurava točnost i pouzdanost mikrobnih zbirki
kultura, ima veliko značenje u usporedbi poznate s nepoznatom
mikrobnom vrstom, te osigurava točnu i pouzdanu klasifikaciju
organizama.
Premda imenovanje mikroorganizama omogućuje razlikovanje
pojedinih vrsta prema brojnim karakteristikama, u praksi to nije uvijek
tako jednostavno. Općenito, problem imenovanja pojedinih mikrobnih
vrsta je u činjenici da se neke vrste spolno razmnožavaju u klasičnom
56
smislu, a neke svoj genetski materijal, prenose i plazmidima i/ili
dijelovima DNK konjugacijom ili transformacijom. Na taj način, te
mikrobne vrste dijele zajednički genski fond što otežava njihovo
imenovanje. Suprotno, za one mikrobne vrste koje nemaju te sposobnosti
kao što je na primjer E.coli definicija vrste na osnovu strukturnih,
biokemijske i molekularnih analiza relativno je jednostavna.
3.2. Klasifikacija
Klasifikacija ili grupiranje pojedinačnih vrsta (species)
mikroorganizama u veće, a potom u još veće skupine temelji se na
njihovoj prirodnoj genetičkoj povezanosti. Jednako kao i kod ostalih živih
organizama što se spuštamo od vrha piramide sličnost organizama se
povećava. Pojedina vrsta najmanje je slična svojoj domeni, ali su zato
sojevi unutar jedne mikrobne vrste vrlo slični. Najjednostavnija je
klasifikacija svrstavanja u rodove i vrste na osnovu karakteristika koje se
mogu ispitati u rutinskom laboratoriju. Tako su bojanje po Gramu, kratki i
dugi biokemijski nizovi, te morfološke karakteristike klasični postupci
prema kojima se najjednostavnije klasificiraju bakterije.
57
Slika: Klasifikacija vrsta
3.3. Identifikacija
Razlikovanje izmeñu pojedinačnih mikroorganizama naziva se
identifikacija . Ona se provodi složenijim morfološkim, fiziološkim i
biokemijskim testovima, te metodama temeljenim na principima
molekularne biologije. Kada se radi o bakterijama, rutinska identifikacija
u laboratoriju obavlja se na dva osnovna principa. Prvi uključuje izolaciju
na diferencijalnim ili selektivnim hranilištima nakon čega slijede potvrdni
testovi npr. bojanje, biokemijski testovi, serološki testovi, fag tipiziranje
itd. Drugi pristup je izolacija na općem hranilištu nakon čega slijede
standardne mikrobiološke procedure: bojanje po Gramu, bojanje spora,
test pokretljivosti, oksidativno-fermentativni testovi, glukoza
fermentativni test, katalaza test, oksidaza test i test fluorescencije. Ti
testovi daju preliminarne rezultate identifikacije na razini roda ili porodice.
Klasična fenotipska i biokemijska karakterizacija koristi se potom za
preliminarnu determinaciju vrste. Meñutim, točna identifikacija na razini
vrste ili još niže na razini soja moguća je jedino molekularno biološkim-
58
tehnikama koje proučavaju nukleinske kiseline što omogućava
diferencijaciju na razini genoma, neovisno o fazi i uvjetima rasta
mikroorganizama. Identifikacija bakterija molekularnim metodama na
razini vrste i/ili soja provodi se najvećim dijelom u istraživačko-
znanstvenim laboratorijima.
4. Mljekarska mikrobiologija
4.1. Značaj i podjela
Mlijeko i mliječni proizvodi obvezni su sastavni dio hrane u gotovo
cijelom njenom proizvodnom lancu. Oni se konzumiraju kao zasebni
proizvodi, bitan su sastojak mnogih drugih prehrambenih proizvoda, te
služe za pripremu različitih vrsta jela. Zbog svog sastava i svojstava
mlijeko i većina mliječnih proizvoda gotovo su savršen medij za rast i
razmnožavanje različitih vrsta mikroorganizama. Zbog toga, mljekarska
mikrobiologija ima prioritetno značenje ne samo za mljekarsku industriju
već i za svaku drugu koja se na nju naslanja.
Prema predmetu izučavanja mljekarska mikrobiologija obuhvaća:
• patogene mikroorganizme koji se mogu prenositi mlijekom i
mliječnim proizvodima i biti uzročnikom različitih bolesti ljudi i životinja
• mikroorganizme uzročnicima kvarenja mlijeka i mliječnih
proizvoda koji umanjuju njihovu kvalitetu i stvaraju gubitke u proizvodnji
59
• mikroorganizme koji se u sastavu mikrobnih kultura koriste u
proizvodnji fermentiranih mlijeka, vrhnja, maslaca i sira
Veliki broj bolesti kako ljudi tako i životinja mogu biti uzrokovani
patogenim mikroorganizmima koji se prenose mlijekom i mliječnim
proizvodima. Poznavanje izvora, načina njihovog rasta u mlijeku i
mliječnim proizvodima te postupaka njihovog uništenja čine osnovu
prema kojoj se odreñuju svi tehnološki procesi prerade mlijeka i
mliječnih proizvoda. Takoñer, poznavanje patogenih mikroorganizama
povezanih s mlijekom i mliječnim proizvodima služi i za sve sanitarno
higijenske i ostale tehničke mjere radi sprečavanja njihovog širenja.
Mikroorganizmi uzro čnici kvarenja izazivaju neželjene promjene u
mlijeku i mliječnim proizvodima. Te promjene, u većem ili manjem obimu
vidljive su pogreške proizvoda. Meñutim, da li će se pogreška
manifestirati u promjeni okusa, mirisa, teksture ili svih tih svojstava
proizvoda zajedno prvenstveno ovisi mikrobnoj vrsti i njenom broju .
No, i najmanja pogreška izazvana djelovanjem mikroorganizama
uzročnika kvarenja umanjuje hranjivu vrijednost tog proizvoda. U nekim
slučajevima kvarenje je takvog obima da proizvod postaje potpuno
neupotrebljiv za ljudsku i životinjsku hranu, premda ta skupina
mikroorganizama nema patogena svojstva.
Proizvodnja svih fermentiranih mliječnih proizvoda (fermentirana mlijeka,
vrhnje, maslac, sir) nezamisliva je bez upotrebe odreñenih vrsta
mikroorganizama. Oni takoñer, kao i druge dvije gore navedene skupine
60
mikroorganizama pripadaju bakterijama, kvascima i plijesnima. U
mljekarskoj industriji oni se koriste u sastavu mikrobnih kultura čijim
svojstvima i osobinama zahvaljujemo veliku brojnost i različitost
mliječnih proizvoda. Osim toga korištenjem specifičnih sojeva u sastavu
mikrobne kulture različitost u okusu, aromi i konzistenciji izmeñu
mliječnih proizvoda dodatno je povećana.
4.1.1.. Rast mikroorganizama u mlijeku
Mlijeko je kompleksna biološka tekućina koja sadrži više od 100 000
različitih molekula i kemijskih sojeva, te ima jedinstvene fizikalno-
kemijske karakteristike. Veći dio mlijeka čini vodena otopina laktoze,
organskih i anorganskih soli, vitamina, kiselina i enzima, te drugih malih
molekula. Dispergirani sirutkini proteini na molekulskoj razini, kazeini
kao velike nakupine (50-600nm), drugi globularni proteini i Ca-fosfat
čine koloidnu otopinu mlijeka. Lipidi, kao globule mliječne masti
(promjera 0,1-22 µm), u mlijeku prisutni su u formi emulzije (ulje u
vodi). Svi ti sastojci u savršenoj su prirodnoj fizikalnoj ravnoteži
uspostavljenoj izmeñu emulzije, koloidne i vodene otopine mlijeka.
Upravo zbog sastava i osobina, mlijeko nije samo kompletna hrana u
ishrani mladunčadi, gotovo kompletna u ishrani ljudi, već predstavlja i
odlučan izvor hranjiva za rast i razmnožavanje različitim vrstama
mikroorganizama prisutnim posvuda u prirodi. Iz mlijeka, kao najlakše
dostupan izvor energije mikroorganizmi najčešće koriste laktozu (mliječni
šećer). Bjelančevine i mliječna mast dodatni su izvor energije onim
mikrobnim vrstama koje tvore proteolitičke i lipolitičke enzime potrebne
61
za njihovu razgradnju. Veliki broj lako dostupnih vitamina i minerala,
gotovo neutralna pH vrijednost mlijeka (~6,6) i njegov visoki puferni
kapacitet daljnje su osobine mlijeka koje pogoduju mikrobnom rastu. Zato
se ne bez razloga, mlijeko smatra gotovo savršenim hranilištem za rast i
razmnožavanje brojnim mikrobnim vrstama.
Pogodnost mlijeka za rast i razmnožavanje mikroorganizama dodatno se
povećava ako oni rastu u mješovitim populacijama. Tada se u mlijeku
uspostavljaju brojni simbiotski i metabolički odnosi koji ubrzavaju njihov
rast. Meñutim brzina razmnožavanja pojedinih mikrobnih vrsta ne ovisi o
sastojcima mlijeka već je ovisna o inhibitornim svojstvima mlijeka i
vanjskim uvjetima od kojih je najvažnija temperatura.
4.1.1.1. Inhibitorna svojstva mlijeka i temperatura
Inhibitorne svojstva mlijeka objašnjavaju se postojanjem
bakteriocidnih i bakteriostatskih tvari ili kemijskih spojeva koji se krvlju u
procesu njegove sekrecije prirodno izlučuju u mlijeko. Bakteriocidno i/ili
bakteriostatsko djelovanje pripisuje se imunoglobulinima, laktoferinu
(glukoprotein s vezanim Fe), vitaminima vezani na protein, vitaminu B12,
folnoj kiselini, lizozimu- enzim stanične stjenke i enzimu
laktoperoksidazi. Te tvari, nakon mužnje odreñeno vrijeme inhibiraju rast
i razmnožavanje mikroorganizama, te na taj način pozitivno utječu na
održivost sirovog mlijeka. Trajanje inhibitorne faze ovisno je o vrsti i
indvidualnim osobinama životinje, početnom broju mikroorganizama i
62
temperaturi čuvanja mlijeka. Trajanje infibitorne faze znatno se produžava
snižavanjem temperature pohrane mlijeka. U odnosu na inhibitorna
svojstva i temperaturu razlikujemo četiri karakteristične faze
razmnožavanja mikroorganizama u mlijeku:
• inhibitorna ili mikrobicidna faza
• faza mješovite mikrobne populacije
• faza rasta bakterija mliječne kiseline
• faza rasta kvasaca i plijesni
Na završetku infibitorne ili mikrobicidne faze , koja prosječno za kravlje
mlijeko traje 2, a za ovčje i kozje 4 sata, započinje faza mješovite
mikrobne populacije. Ovu fazu karakterizira veći ili manji intenzitet rasta
svih mikroorganizama kojima mlijeko kao hranjiva sredina odgovara.
Meñutim, koja će od mikrobnih vrsta potom postati dominantnom,
odreñeno je temperaturom mlijeka. U mlijeku ohlañenom na temperaturu
nižu od 10° C dominantnu mikrobnu populaciju činiti će psihrotrofni
mikroorganizmi . Kada je temperatura mlijeka viša od 18°C dominantna
mikrobna populacija biti će mezofilna, te tada započinje faza rasta
bakterija mlije čne kiseline od kojih prevladavaju laktokoki.
Razgradnjom laktoze te bakterije stvaraju mliječnu kiselinu, koja se u
početku veže sa alkalnim spojevima te nastaju laktati, a kasnije se izdvaja
mliječna kiselina u slobodnom stanju. Pojavom mliječne i ostalih
organskih kiselina snižava se pH mlijeka, te se zaustavlja rast ostalih, a
prvenstveno proteoliti čkih bakterija . Uz bakterije mliječne kiseline na
početku te fazi u sirovom mlijeku razvijaju se i koliformne bakterije .
Povećanjem kiselosti zaustavlja se rast koliformnih bakterija, te nakon 6-
63
10 sati pohrane u sirovom mlijeku potpuno prevladavaju bakterije
mliječne kiseline. Na taj način faza mješovite populacije prelazi u fazu
bakterija mliječne kiseline. Proces stvaranja mliječne kiseline nastavlja se
do njezine koncentracije u mlijeku od 1,5%. Ta koncentracija mliječna
kiselina dovoljna je za početak inhibitornog djelovanja na rast bakterija
mliječne kiseline koji potpuno prestaje kada ona dosegne razinu od 2-3%.
Sirovo mlijeko tada ima pH vrijednost nižu od 4, odnosno kiselost koja je
dovoljna za inhibiciju rast većine bakterijskih vrsta. Uz prisustvo zraka,
kisela sredina mlijeka tada pogoduje rastu kvasaca i plijesni te započinje
nova faza mikrobnog rasta - faza rasta kvasaca i plijesni. Ti
mikroorganizmi za svoj rast koriste mliječnu kiselina za izvor ugljika i
pritom smanjuju kiselost mlijeka do vrijednosti pH 6-7. Zbog sada gotovo
ponovno neutralne vrijednosti mlijeka, uz kvasce i plijesni, započinju rasti
proteolitičke i lipolitičke bakterije. Oni zajedno intenzivno razgrañuju
bjelančevine i mliječnu mast mlijeka, a ono prelazi u gustu prljavo-žutu
tekućinu neugodna mirisa na trulež. Proces mikrobne razgradnje
kemijskih sastojaka mlijeka nastavlja se do njegove potpune
mineralizacije. Na kraju, dolazi do autolize samih mikroorganizama.
4.1.1.2. Početna mikrobna populacija
Mlijeko se u svijetu proizvodi u područjima u kojima temperatura
može biti niža od 0°C i te viša od 30°C. U prvima, mlijeko je potrebno
zaštititi od smrzavanja, a u drugima, nemoguće ga je zaštititi od mikrobne
64
kontaminacije bez hlañenja. Neovisno gdje se proizvodi, temperature i
vrijeme čuvanja mlijeka nakon mužnje značajno se razlikuju. Zbog toga,
broj i vrsta prisutnih mikroorganizama u mlijeku kada ono napušta farmu
su različiti. Često puta iz istih razloga bakteriološka kvaliteta je čak i pod
istim uvjetima proizvodnje nepredvidiva. Zakonskim odredbama odreñeno
obvezno hlañenja sirovog mlijeka i pridržavanja striktnih higijenskih
mjerna u načinu proizvodnje i pohrane do prerade, općenito bakteriološka
kvaliteta u znatnoj je mjeri poboljšana. Problemi s kojima se danas
mljekarska industrija susreće su povratni bakteriološki efekt zbog
prolongirane pohrane i subklinički - mastitično mlijeko. Maskiranje
bakteriološke kvalitete hlañenjem mlijeka premda postoji u modernoj
proizvodnji, smatra se manjim problemom.
Mlijeko u vimenu zdravih muznih životinja gotovo je sterilno.
Meñutim napuštanjem vimena u bilo kojim uvjetima proizvodnje, mlijeko
će se neizbježno bakteriološki kontaminirati iz dva izvora:
eksterijernog dijela vimena i sisa
preko pribora za mužnju i čuvanje mlijeka
Taj broj mikroorganizama čini početnu mikrobnu populaciju koja ima
direktan utjecaj na kasniju preradu mlijeka . Kontaminacija sirovog
mlijeka od 102-103/ml smatra se prirodnom kontaminacijom koja
potječe iz unutrašnjosti vimena i sisnog kanala. U uvjetima higijenski čiste
mužnje, kontaminacija od 104/ml smatra se prihvatljivom početnom
populacijom. koja potječe s površine sisa i mljekarskog pribora. Meñutim
65
broj i vrsta mikroorganizama koja će se razviti u mlijeku determinirani
su temperaturom pohrane mlijeka. Tako ovisno o broju, vrsti i
temperaturi, mlijeko postaje supstratom za patogene i mikroorganizme
uzročnike kvarenja. Neki sojevi bakterija mliječne kiseline sposobne su
preživjeti na temperaturi od 60°C/20 min., ali mali ih postotak preživljava
temperature niske pasterizacije (60-65°C/30 min). Dakle, bakterije
mliječne kiseline koje kontaminiraju sirovo mlijeku, nisu korisne
bakterije i uvijek se smatraju uzročnicima kvarenja.
Kada se mlijeko odmah nakon mužnje ohladi na ≤4°C i na toj temperaturi
čuva do transporta, niska temperatura onemogućiti će razmnožavanje
bakterija najmanje 24 sata. Broj mikroorganizama biti će gotovo identičan
početnom broju onih mikrobnih vrsta koje su neminovno dospjele tijekom
mužnjom u mlijeko. Ukoliko je početna mikrobna populacija u netom
pomuženom mlijeku bila 50 000 bakterija/mL, a mlijeko ostavljeno na
temperaturi od 30°C, za otprilike 1-2 sata broj bakterija će biti 108/ml.
U mlijeku bez obzira na način čuvanja, prisutni mikroorganizmi pripadaju
bakterijama, a rjeñe kvascima i plijesnima.
4.1.1.3. Glavne mikrobne vrste
Sirovo mlijeko, neposredno nakon higijenski provedene mužnje, uvijek
sadrži manje od 5000 organizama/ml. Dominantnu populaciju takovog
mlijeka uglavnom čine Micrococcus, Streptococcus, Lactococcus i
Corynebacterium, te zanemariv broj ostalih Gram-pozitivnih i Gram-
negativnih bakterija koji nemaju praktično značenje (tablica 1.) .
66
Tablica 1.: Prisutnost glavnih mikrobnih skupina u sirovom mlijeku
neposredno nakon mužnje, koje sadrži < 5000 bakterija/mL
Mikrobne skupine Učešće %
Mikrokoki 30-99
Streptokoki 0-50
Ostali Gram- rodovi < 10
Ostali Gram+rodovi (uključivo koliformni) < 10
____________________________________________________________
_
Modificirano prema Causin i Bremley,
1985.
Meñutim, hlañenje mlijeka odmah nakon mužnje mijenja prirodno
prisutnu mikrobnu populaciju, dok se istovremeno u neohlañenom mlijeku
mijenja jedino njihova razina kontaminacije. Neohlañeno mlijeko i/ili
ohlañeno na sobnu temperaturu ( ≥13) sadrži uglavnom Gram-pozitivne
bakterije mlije čne kiseline, Lactobacillus, Lactococcus, Enterococcus i
Streptococcus spp. Suprotno, u ohlañenom mlijeku (≤4°C) dominantne
Gram-pozitivne bakterije, zamjenjuju se Gram-negativnim i Gram-
pozitivnim psihrotrofnim bakterijama koje mogu negativno utjecati na
67
ukupnu kvalitetu mlijeka produženim čuvanjem u hladnim uvjetima.
Naime, hlañenjem mlijeka značajno se usporava rast i razmnožavanje
većini organizama u mikrobnoj populaciji koja se spontano razvija u
mlijeku. Meñutim, hlañenje mlijeka značajno pogoduje rastu psihrotrofnih
mikroorganizmima. Brzina kojom će razina kontaminiranosti mlijeka tim
organizmima dostići vrijednost >106/mL, ovisi o njihovu početnom
(inicijalnom) broju neposredno nakon mužnje. Meñutim, čak i njihova
niska početna razina kontaminiranosti, nakon čuvanja mlijeka 3 do 4 dana
na temperaturi izmeñu 4 do 5°C, prije pasterizacije biti će >107/ml. Takvo
mlijeko i nakon pasterizacije potpuno je neprihvatljivo u proizvodnji
mliječnih proizvoda. Naime, većina psihrotrofnih mikroorganizama
stvara termostabilne hidroliti čke enzime (stabilni i nakon zagrijavanja
na 100°C/ 30 minuta) koji negativno utječu na ukupnu kvalitetu. Niskom
razinom kontaminiranosti psihrotrofnim mikroorganizmima smatra se
ohlañeno mlijeko u kojemu je ukupan broj bakterija <50 000/ml.
Koliformne bakterije , premda su neke od vrsta psihrotrofni
mikroorganizmi, druga su skupina Gram-pozitivnih bakterija koja vrlo
često kontaminira sirovo mlijeko . Kako ta skupina mikroorganizama
obično ne preživljava temperature pasterizacije, njihovo prisustvo i/ili
odsustvo često se koristi kao indikator uspješnosti proizvodnje.
Koliformne bakterije u mlijeku, ne moraju uvijek biti dokaz fekalne
kontaminacije. One vrlo brzo rastu i u vlažnim uvjetima, te na ostacima
mlijeka mljekarske opreme. Vrlo često, upravo je nečista mljekarska
oprema glavni izvor prisutnosti koliformnih mikroorganizmima u
mlijeku. Broj koliformnih mikroorganizama u mlijeku veći od 100/mL,
prema mnogim mljekarskim mikrobiolozima, je dokaz njegove
68
nehigijenske proizvodnje. Odreñeni sojevi te skupine bakterija pripadaju
i enteropatogenim organizmima, te njihovo prisustvo u mlijeku
predstavlja potencijalnu opasnost za zdravlje čovjeka.
Konačno, mikrobna populacija sirovog mlijeka može sadržavati i različite
patogene vrste, te sojeve bakterijskih vrsta koje imaju sposobnost
stvaranja toksičnih tvari. Osim toga, Listeria monocytogenes, Yersinia
enterocolitica i Bacillus cereus koje su za čovjeka izrazito patogeni
mikroorganizmi, pripadaju skupini psihrotrofnih organizmima. Iz sirovog
mlijeka najčešće izolirane mikrobne vrste prikazane su u tablici 2.
69
Tablica 2 Mikroorganizmi prisutni u sirovom mlijeku
(Scott, 1998.)
70
4.1.1.3.1. Skupina psihrotrofnih mikroorganizmama
Za skupinu psihrotrofnih mikroorganizama povezanih s mlijekom
i mliječnim proizvodima Meñunarodna mljekarska organizacija
(International Dairy Federation) 1976.godine, usvojila je slijedeću
definiciju koja glasi: "Psihrotrofni mikroorganizmi mogu rasti na
temperaturama nižim od 7° C, bez obzira na optimalnu temperaturu rasta
(rast se u ovom kontekstu odnosi i na sve metaboličke procese koji su
nužni za rast i razmnožavanje)."
Psihrotrofni mikroorganizmi nisu specifična taksonomska skupina
mikroorganizama, već su svrstani u 15 različitih rodova. Većina
psihrotrofne populacije u sirovom mlijeku pripada Gram-negativnim
rodovima. Premda, ali u znatno manjem broju u mlijeku se mogu naći i
pripadnici Gram-pozitivnih rodova. Široko rasprostranjeni u prirodi,
ponajprije u vodi i nedovoljno očišćenoj mljekarskoj opremi za mužnju i
čuvanje mlijeka, psihrotrofni mikroorganizmi vrlo lako dospijevaju u
mlijeko. Karakterizira ih brzi rast u ohlañenom mlijeku i sposobnost
stvaranja ekstracelularnih hidroliti čkih termostabilnih enzima. U
današnjim uvjetima proizvodnje mlijeka psihrotrofni mikroorganizmi ,
smatra se, glavni su uzročnici njegovog kvarenja. Nastalim promjenama
u načinu rada, period držanja mlijeka na niskim temperaturama nakon
mužnje i prije proizvodnje produžio se u prosjeku za 2-4 dana. Zbog toga,
prosječni broj aerobnih psihrotrofnih bakterija u mlijeku najčešće je veći
od 105/mL. Pohranom mlijeka prije početka prerade slijedećih 48 sati na
temperaturi od ≤ 6°C, broj psihrotrofnih bakterija povećava se na 107/mL.
71
Porast psihrotrofnih bakterija je isti i u slučajevima dnevnog sakupljanja
mlijeka (jutarnja i večernja mužnja) koje se prije prerade, sljedećih 18 sati
pohranjuje na temperaturi izmeñu 4 i 10°C. Upravo miješanje toplog i
hladnog mlijeka dviju mužnji smatra se uzrokom tako brzom povećanju
njihovog broja.. Kada broj psihrotrofnih bakterija u sirovom mlijeku
dostigne ≥107/ml koncentracija njihovih termostabilnih enzima postaje
značajna za neželjene lipolitičke i proteolitičke promjene.
Od bakterijskih vrsta, takvo mlijeko uglavnom sadržava Pseudomonas
spp. (~70%), Enterobacteriaceae (~ 8%), Gram-pozitivne bakterije (~7%),
te manji broj ostalih Gram-negativnih bakterijskih vrsta, Flavobacterium,
Seratia, Aerobacter i Proteus. Učinak hladnog čuvanja mlijeka na
temperaturi 4-10°C nekoliko dana, na porast psihrofnih bakterija prikazan
je na slici 1.
72
Slika 1.: Učinak hlañenja i čuvanja mlijeka, nekoliko dana na temperaturi izmeñu 4-
10°C, na broj različitih bakterijskih vrsta prisutnih u sirovom mlijeku. Ukupan broj
bakterija u pasteriziranom mlijeku prikazan je radi usporedbe.
(Scott,
1998.)
4.1.1.3.1.1. Ekstracelularni enzimi
Većina psihrotrofnih bakterija prisutnih u sirovom mlijeku ne
preživljava temperature pasterizacije > 60 °C. Meñutim, ta skupina
mikroorganizama ima sposobnost stvaranja nekoliko vrsta enzima,
proteinaze, lipaze, fosfolipaze, egzopeptidaze i glikozidaze, koje
73
temperature pasterizacije i sterilizacije (120-140°C) ne inaktiviraju u
potpunosti. Tako većina proteinaza i lipaza psihrotrofnih bakterija, nakon
toplinske obrade mlijeka, zadržava svoju aktivnosti izmeñu 60 i 70 %
4.1.1.3.1.1.1. Proteinaze
Proteinaze psihrotrofnih bakterija izoliranih iz mlijeka pripadaju
skupini metalo-enzima koji u svojoj molekuli sadrže jedan atom Zn i do
16 atoma Ca. Molekularna težina većine proteinaza je izmeñu 40-50kDa, a
mogu biti neutralne (~7 pH) i alkalne (8-9 pH). Optimalno djelovanje
proteinaza je na temperaturi izmeñu 30-50°C, na višim temperaturama ono
se značajno smanjuje, ali se aktivnost zadržava na temperaturi od 4°C.
Pojedini sojevi psihrotrofnih bakterijskih vrsta stvaraju više od jedne vrste
proteinaza. Varijabilnost u sposobnosti tvorbe proteinaza izmeñu vrsta i
sojeva unutar iste vrste, je uobičajen. Gotovo sve proteinaze pokazuju
sposobnost zgrušavanja mlijeka i razgradnje κ-, αs1- i β kazeina.
4.1.1.3.1.1.2. Lipaze
Lipaze psihrotrofnih bakterija (lecitinaze i fosfolipaze), zbog
sposobnosti hidrolize zaštitne membrane masne globule djeluju na
mliječnu mast mlijeka. Jednako kao i proteinaze, lipaze su termostabilni
enzimi. Izmeñu bakterijskih vrsta Aeromonas, Acinetobacter,
Flavobacterium, lipaze Pseudomonas spp., a posebice Ps. fluorescens
pokazuju najveću termostabilnost. Nakon pasterizacije mlijeka, lipaze Ps.
74
fluorescens zadržavaju aktivnost gotovo 100%. Molekularna težina im je
od 32 do 633kDa, a mogu djelovati u uvjetima pH vrijednosti od 5-11.
Optimalna temperatura djelovanja većine lipaza psihrotrofnih bakterija je
izmeñu 30°C i 50°C. Slično kao i proteinaze, lipaze svoju aktivnost
zadržavaju i na temperaturama od 1-8°C .
4.1.1.3.2.Gram-negativne psihrotrofne bakterija
Rodovi Pseudomonas, Flavobacterium Achromobacter, Alcaligenes,
Acinetobacter, Aeromonas, Chromobacterium, i Enterobacter najčešći su
predstavnici Gram-negativne psihrotrofne populacije bakterija
izoliranih iz sirovog mlijeka. Meñutim, u ohlañenom i na temperaturi od
4-5°C čuvanom mlijeku četiri dana, od ukupne Gram-negativne populacije
izdvaja se Pseudomonas spp. s izrazitom dominacijom vrste
Pseudomonas fluorescens . U odnosu na sve Gram-pozitivne i ostale
Gram-negativne psihrotrofne bakterije, Pseudomonas spp. na
temperaturama nižim od 6°C karakterizira brži rast, duže vrijeme
preživljavanja i kratko generacijsko vrijeme.
4.1.1.3.2.1. Pseudomonas
Rod Pseudomonas najčešće je izolirani psihrotrofni mikroorganizam
iz sirovog mlijeka. Unutar roda razlikujemo P. fluorescens, P.aeruginosa,
P. putida, P.maltophilia, P.cepacia, P.fragi, P.putrefaciens. Vrsta P.
fluorescens ima pet biovara, a vrsta Pseudomonas putida dva.
75
Zajedničke osobine svih vrsta: Gram-negativni ravni ili zakrivljeni štapići
(0,5-1µm x 1,5-4µm); pokretni s polarnim flagelama; katalaza pozitivne;
vrlo često oksidaza pozitivne; kemoorganotropne; striktni aerobni, (osim
vrsta koje mogu koristiti i nitrate iz medija).
4.1.1.3.2.2. Flavobacterium, Aeromonas , Chromobacterium
Meñusobno, rodovi Flavobacterium, Aeromonas i Chromobacterium
razlikuju se u pigmentaciji kolonija na čvrstom hranilištu. Aeromonas,
osim vrste A. salmonicida, ne stvara pigmentirane kolonije. Žuto-
narančaste, crvene ili smeñe kolonije stvara Flavobacterium, a ljubičaste
kolonije karakteristika su Chromobacterium bakterijskih vrsta.
Zajedničke osobine: Gram-negativni ravni ili zakrivljeni štapići (0,2-
2,0µm x 0,6-6,0µm); obično pokretni polarnim flagelama; aerobni i
fakultativno anaerobni; kemoorganotropni; oksidaza pozitivni.
4.1.1.3.2.3. Acinetobacter, Alcaligenes, Achromobacter
Rodovi Alcaligenes i Achromobacter pripadaju prirodnoj mikrobnoj
populaciji koja se spontano razvija u sirovom mlijeku. Zajednička im je
osobina sposobnost stvaranja lipoliti čkih enzima koji uzrokuju značajnu
razgradnju masti u mlijeku. Svojim morfološkim i fiziološkim
karakteristikama oba roda vrlo su slična. Jedan od pretpostavljenih načina
razlikovanja roda Achromobacter od roda Alcaligenes je njegova
sposobnost oksidacije glukoze i peritrihne flagele. Meñutim, opisani su i
76
nepokretni organizmi koji oksidiraju glukozu i neke druge šećere, te
pokretni organizmi koji ne oksidiraju laktozu. Rod Acinetobacter je Gram-
negativni organizam za kojeg je karakteristično grozdasto nakupljanje
stanica. Oksidaza je negativan, nepokretan, aeroban organizam.
4.1.1.3.2.4. Enterobacter
Rod Enterobacter pripada porodici Enterobacbacteriaceae. Zbog
ubikvitarnosti, Enterobacter je vrlo često prisutan u sirovom mlijeku.
Vrsta Enterobacter aerogenes može biti i fekalnog podrijetla. Neki sojevi
Enterobacter spp. imaju sposobnost stvaranja kapsule. Meñutim, premda
pripadaju psihrotrofnim mikroorganizmima, Enterobacter spp. bakterije
nisu dominante u populaciji koja se spontano razvija u mlijeku na
temperaturama nižim od 8°C.
4.1.1.3.3. Gram-pozitivne psihrotrofne bakterije
Gotovo svi Gram–pozitivni psihrotrofni mikroorganizmi povezani
s mlijekom su termorezistentni organizmi. Odnosno, termorezistentni
psihrotrofni mikroorganizmi su skupina bakterija koja preživljava
temperature pasterizacije, ne raste na tim temperaturama, a može rasti na
temperaturama od 4 do 7°C. Termorezistentne psihrotrofne bakterije
pripadaju sljedećim rodovima: Bacillus, Clostridium, Arthrobacter,
Microbacterium, Streptococcus, Micrococcus, i Corynebacterium. U
77
usporedbi s Gram-negativnim psihrotrofnim bakterijama, te bakterijske
rodove karakterizira prilično dugo generacijsko vrijeme i/ili dugačka log
faza. Osim rodova Bacillus i Clostridium, u mješovitoj populaciju sirovog
te kratko čuvanog ohlañenog mlijeka, kvantitativno termorezistentne
prsihrotrofne Gram-pozitivne bakterije imaju minorno značenje.
4.1.1.3.3.1. Bacillus i Clostridium.
Rodu Bacillus primarno stanište je tlo, premda može biti i široko
rasprostranjen u prirodi. U mlijeko i mliječne proizvode dospijeva zrakom,
vodom, životinjskom hranom i steljom. Od ukupno 60 različitih vrsta koje
pripadaju rodu Bacillus značenje za mljekarstvo u svojstvu uzročnika
kvarenja i/ili zdravstvenog rizika imaju vrste, B. cereus, B. subtilis, B.
stearothermophilus i B.coagulans.
Rod Clostridium je striktni anaerobni organizam kojega nalazimo u
različitim sedimentima, kao i u intestinalnom traktu ljudi i životinja. U
mlijeko dospijeva najčešće preko silaže ili fecesa. U svojstvu uzročnika
kvarenja sira najznačajnije su vrste: C. thermosaccharolyticum, C.
butyricum, C. tyrobutyricum i C. sporogenes. Premda rijetko, nažalost, sir
preko mlijeka može biti i izvorom izrazito za čovjeka patogene vrste C.
botulinum. Ovisno o proteolitičkom djelovanju i vrsti toksina, vrstu C.
botulinum čine četiri različite skupine sojeva: (a) proteolitički, A, B i F,
78
(b) neproteolitički, B, E i F, (c) proteolitički i neproteolitički, C i D, (d)
proteolitički, G. Svi toksini C. botulinum bakterija spadaju u skupinu
neurotoksina i imaju na čovjeka 100 000 puta jače djelovanje u odnosu na
najjači zmijski otrov. Meñutim, uzročnicima bolesti/trovanja ljudi
smatraju se sojevi C. botulinum A i B bakterija.
Zajedničke osobine rodova Bacillus i Clostridium: gram pozitivne
bakterije, pojedinačne stanice u obliku ravnih štapića koji mogu biti i
prilično veliki (0,3 -2,2 x1,2-7,0µm); dolaze pojedinačno, u parovima, ili u
lancima; stvaraju endospore otporne na toplinu i druge destruktivne
agense. Rod Bacillus stvara spore u aerobnim, a Clostridium u anaerobnim
uvjetima. Većina vrsta koje pripadaju rodu Bacillus su katalaza pozitivne,
a one koje pripadaju rodu Clostridium katalaza su negativne. Većina vrsta
rodova Bacillus i Clostridium ima sposobnost rasta na temperaturama
nižim od 4°C ali i na temperaturi od 50°C. Karakterizira ih i sposobnost
rasta u rasponu pH vrijednosti u mediju od 4,0-9,3, koncentraciji soli do
7% i aktivitetu vode od 0,92.
4.1.1.3.4. Skupina koliformnih mikroorganizama
Koliformni mikroorganizmi mogu se opisati kao Gram-negativni,
oksidaza negativni, ne-sporotvorni štapići koji mogu rasti aerobno na
čvrstom hranilištu koje sadrži žučne soli i fermentirati laktozu unutar 48
79
sati na temperaturi od 37°C uz stvaranje kiselina i plina. Premda nekoliko
rodova pripada koliformnim mikroorganizmima, u sirovom mlijeku
najčešće su prisutne bakterije vrsta: Enterobacter, Aerobacter,
Escherichia, Citrobacter i povremeno Klebsiella. U odnosu na
psihrotrofne bakterije, ove bakterijske vrste rastu sporije, ali znatno bolje
od mnogih drugih bakterija prisutnih u sirovom ohlañenom mlijeku.
4.1.1.3.4.1. Aerobacter
Bakterije roda Aerobacter su aerobni do fakultativno anaerobni
kratki Gram-negativni, pokretni ili nepokretni štapići. Pokretne vrste imaju
peritrihne flagele. Fermentiraju glukozu i laktozu uz stvaranje kiseline i
plina. Koncentracija na taj način stvorenog CO2 dva puta je viša od
koncentracije stvorenog H2.
4.1.1.3.4.2. Escherichia
Rod Escherichia sadrži samo jednu vrstu, E. coli. Bakterije su
oblikom kratki Gram-negativni pokretni ili nepokretni štapići. E. coli
fermentira glukozu i laktozu i neke druge šećere uz stvaranje mliječne,
octene i mravlje kiseline. Hidrolizom mravlje kiseline nastaju jednake
koncentracije plinova CO2 i H2. Sposobnost stvaranja različitih spojeva
80
fermentacijom šećera koristi se za razlikovanje E.coli od ostalih
koliformnih organizama ( IMViC reakcija -Metil Red, Voges-Proskauer i
Citrat)
4.1.1.3.4.3. Citrobacter
Vrste koje pripadaju rodu Citrobacter su Gram-negativni, aerobni, ili
fakultativno anaerobni organizmi koji ne tvore spore. Bakterije obično
koriste citrat za izvor ugljika, fermentiraju glukozu, laktozu i druge šećere
uz stvaranje kiselina i plina. Oksidaza su negativni, katalaza pozitivni,
metil red pozitivni, a Voges-Proskauer negativni organizmi. Taksonomski,
rod Citrobacter usko je povezan s rodovima Salmonella i Escherichia.
4.1.1.3.4.4. Klebsiella
Rod Klebsiella, kao i Citrobacter, Enterobacter te Escherichia
pripada porodici Enterobacteriaciae. Klebsiella spp. bakterije su Gram-
negativni nepokretni kratki štapići okruglih krajeva koji uglavnom dolaze
pojedinačno, stvaraju kapsulu. Aerobani su do fakultativno anaerobani
organizmi koji fermentiraju glukozu uz stvaranje kiseline.
81
4.1.1.3.5. Skupina termorezistentnih mikroorganizama
Pasterizacija mlijeka (72°C/4-15 sekundi) obično je dovoljna za
uništenje svih patogenih bakterija koje ne stvaraju spore. Meñutim, na
tim temperaturno/vremenskim uvjetima pasterizacije, termorezistentna
mikrobna populacija, ovisno o vrsti, preživljava izmeñu 10 do 100%.
Rodovi bakterija Micrococcus, Microbacterium, Streptococcus,
Lactobacillus, Enterococcus, i Corynebacteriun čine tu mikrobnu skupinu.
Termorezistentna skupina mikroorganizama općenito slabo raste u
ohlañenom mlijeku (<5°C) i jedino u velikom broju može uzrokovati
kvarenje mlijeka i mliječnih proizvoda. Meñutim, ti mikroorganizmi
povećavaju ukupan broj bakterija koji se koristi za standardizaciju
mikrobiološke kvalitete mlijeka za daljnju preradu. Povećanje ukupnog
broja bakterija uzrokovano je njihovom mezofilnom prirodom (rast u
temperaturnom rasponu od 20 do 45°C).
4.3. Higijenska kvaliteta sirovog mlijeka
Ukupnu kvalitetu sirovog mlijeka odreñuju kemijski sastav, fizikalna
svojstva i higijenska kvaliteta. Kemijska kvaliteta odreñena je
genetikom, pasminom, vrstom, hranidbom i menagmentom. Direktno ili
indirektno u pozitivnom ili negativnom smislu higijenska kvaliteta mlijeka
značajno utječe na njegovu kemijsku kvalitetu. Zbog toga nemoguće ih je
odvojeno promatrati.
82
Mlijeko u zdravom vimenu životinje sadrži zanemariv broj bakterija, što
se smatra prirodnom bakterijskom populacijom. Pravilnom i higijenski
ispravnom mužnjom u proizvodnim uvjetima, mlijeko sadrži u 1 mL
izmeñu 100 i 5000 bakterija i manje od 250000 somatskih stanica.
Suprotno, nehigijenskom mužnjom i nehigijenskim postupcima s
mlijekom nakon mužnje i u slučajevima bakterijske upale vimena ukupan
broj bakterija u mlijeku može biti i veći od 107 /ml. Bakterijska upala
vimena, istovremeno, uzrokuje značajno povećanje broja somatskih
stanica iznad fiziološke granice, a nastaje zbog imunološkog odgovora
organizma na upalni proces.
Postoje brojni kriteriji za procjenu higijenske ispravnosti mlijeka odnosno
neškodljivosti mlijeka i mliječnih proizvoda kao namirnice. Ukupan broj
bakterija i broj somatskih stanica u mlijeku, dogovorno su usvojeni kao
najefikasniji higijenski kriteriji na nacionalnoj i internacionalnoj razini.
Premda se primarno svi higijenski kriteriji temelje na principima
očuvanja zdravlja ljudske populacije. U tom smislu, sirovo mlijeko kao
osnovna sirovina za izradu mliječnih proizvoda, smatra se higijenski
ispravno kada ne sadrži:
• patogene mikroorganizme ili viruse
• mikroorganizme iz skupine zoonoza
• bakterijske toksine
• ekološke zagañivače
• ostatke lijekova
• mikroorganizme uzročnike kvarenja u količini koja može
promijeniti njegove fizikalno-kemijska osobine
83
• broj somatskih stanica iznad fiziološke granice
Kada kontaminacija mlijeka nije posljedica upale vimena, ili bolesti
životinje, ono se patogenim mikroorganizmima može kontaminirati
tijekom mužnje, hlañenja i transporta. Uzročnik je uvijek nedovoljna
higijena, neznanje ili nesavjesnost radnika. Meñutim, kontaminacija tim
mikroorganizmima može se dogoditi i usprkos svim higijensko -
sanitarnim mjerama tijekom i nakon mužnje. Tako su zbog konzumacije
mliječnih proizvoda posljednjih godina zabilježena i trovanja ljudi
ekstremno patogenim bakterijama L. monocytogenes i E.. coli O 157: H7
nažalost sa smrtnim posljedicama. Zbog toga, kao obvezna mjera u
sprečavanju njihovog širenja, preporuča se povremena nasumična kontrola
prisutnosti patogenih mikroorganizama u sirovom mlijeku.
4.3.1. Zoonoze
Zoonoze su bolesti koje se prenose s životinje na čovjeka i s čovjeka
na životinje. U proizvodnji mlijeka, zahvaljujući zakonskoj legislativi one
su izuzetno rijetke. Prema tim propisima, mlijeko se može stavljati u
promet samo onda kada su ispunjeni slijedeći uvjeti:
• muzne životinje moraju biti pod stalnim veterinarskim nadzorom
• muzne životinje moraju biti slobodne od tuberkuloze i bruceloze
(službena potvrda)
• muzne životinje ne smiju pokazivati simptome bilo koje
infekcije koja se mlijekom može prenositi na čovjeka
84
• muzne životinje ne smiju imati infekcije genitalnog trakta sa
sekrecijom ili imati probavne infekcije s proljevima, temperaturu ili
klinički mastitis
• muzne životinje ne smiju imati oštećeno vime koje može postati
izvorom kontaminacije mlijeka
U slučaju kada je kod jedne ili kod svega nekoliko životinja utvrñena
tuberkuloza (zoonoza) u inače zdravom stadu, zakon dozvoljava njegovu
upotrebu tek nakon provedene visoke pasterizacije (≥80°C) sirovog
mlijeka.
4.3.2. Ekološki kontaminenti i ostaci lijekova
Ekološki kontaminenti u mlijeku su: pesticidi, teški metali,
nemetali, te ostaci sanitacijskih sredstava. Pod pojmom ostaci lijekova
smatraju se ostaci koji zaostaju u mlijeku nakon liječenja životinja.
Razina dozvoljenih ekoloških kontaminenata i ostataka lijekova u mlijeku
u svakoj zemlji regulirana je zakonskim propisima.
4.3.3. Somatske stanice
Somatske stanice prirodni su sastojak mlijeka čija je razina u
mlijeku prvenstveno odreñena pasminom, te periodom i brojem laktacija.
Tako se prosječnim fiziološkim brojem somatskih stanica u kravljem
mlijeku smatra njihova razina od 50 000-250 000 /mL, u kozjem od 1 000
000 do 1 500 000 /mL, a u ovčjem do 1 000 000/mL. U zdravoj mliječnoj
85
žlijezdi somatske stanice čine leukociti i epitelne stanice. Od leukocita ,
najvećim dijelom zastupljeni su makofazi (35-79%) slijede linfociti (16-
28%) i polimorfonuklearni neutrofili (3-26%). Od ukupnog broja vrsta
stanica, epitelne stanice koje nastaju od alveola, mliječnih kanalića i
cisterne vimena u procesu sinteze mlijeka čine 2-15%. U slučajevima kada
se na bilo koji način dogodi infekcija mliječne žlijezde broj somatskih
stanica u mlijeku značajno se povećava iznad fiziološke razine. Povećanje
broja somatskih stanica posljedica je prelaska leukocita iz krvi u mliječnu
žlijezdu kao imuni odgovor na upalni stimulans. Osim toga, povećanje
broja somatskih stanica mijenja i omjer vrsta stanica, te razina
polimorfonuklearnih neutrofila može biti i do 90%. Indirektno, povećanje
broja somatskih stanica iznad fiziološke granice povezano je s
promjenama u sekreciji i kemijskom sastavu mlijeka, fizikalnim,
bakteriološkim i tehnološkim osobinama mlijeka. Do značajnijih promjena
kvalitete sirovog mlijeka dolazi kada je broj somatskih stanica veći od 250
000/mL, a do izražajnijih kada je veći od 750 000/mL. U mlijeku s
povećanim brojem somatskih stanica Zato je broj somatskih stanica u
mlijeku meñunarodno priznati pokazatelj zdravstvenog stanja vimena.
Skupno sirovo kravlje mlijeko prema tim kriterijima ne smije sadržavati
više od 400 000 somatskih stanica/mL.
Najčešći uzročnici upale vimena su patogeni mikroorganizmi,
prvenstveno Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae,
Streptococcus spp. (uberis, pyogenes, dysgalactiae). Rjeñi su uzročnici:
Corynebacterium bovis, koagulaza-negativni stafilokoki, Mycobacterium
bovis. Predispozicije za nastanak upale su genetske (nepravilna graña),
fiziološke (hranidba, hormonalni poremećaj), bolesti (ozljeda kože, loše
86
zdravstveno stanje muzare), vanjski utjecaji (nepravilnosti tijekom
mužnje). Infekcija vimena patogenim mikroorganizmima dogaña se
njihovim ulaskom kroz sisni kanal (galaktogeno), preko ozlijeñene kože
(limfogeno) i krvlju (hematogeno). Upale se javljaju u kliničkom (3-5%) i
subkliničkom obliku (95-97%) kada simptomi bolesti nisu vidljivi. Prema
trajanju one mogu biti akutne (do 7. dana) subakutne (do 14.dana) i
kronične (više od 14. dana). S tehnološkog gledišta, za preradu mlijeka,
značenje ima jedino subklinički oblik mastitisa kod kojeg nema vidljivih
promjena u mlijeku. Osim toga, velik broj sojeva stafilokoka ima
sposobnost stvaranja ekstracelularnih termostabilnih enterotoksina, koji
svoju biološku aktivnost zadržavaju i nakon toplinske obrade mlijeka.
Broj rezistentnih sojeva na primjenu antibiotika u liječenju mastitisa
takoñer se povećao na približno 70%. Zato, mlijeko infektivnog vimena,
ovisno o uzročniku, može sadržavati i do 108 bakterija /mL.
Ujedno, upala vimena još uvijek je najskuplja bolest mljekarske
industrije. Najveći dio troškova (~70%) odnosi se na smanjenu
proizvodnju mlijeka, a ostatak na nekvalitetno mlijeko (~11%), izdatke za
obnovu stada (~8%), umanjenu tržnu vrijednost grla (~4,9%), izdatke za
lijekove (~3,2%), povećane troškove rada (~1,9%) i usluga (~1,7%).
4.3.4. Ukupan broj bakterija
Ukupan broj bakterija (UBB) predstavlja direktnu kontaminaciju
mlijeka bakterijama tijekom proizvodnje. Meñutim UBB nije indikacija
izvora i vrste mikrobne kontaminacije, niti ukazuje na pogreške u
87
proizvodnji koje su uvjetovale visoku razinu kontaminacije. Prema
meñunarodno prihvaćenom standardu UBB pokazatelj je higijenskih
uvjeta u proizvodnji mlijeka. Broj bakterija u mlijeku veći od 100
000/mL pokazatelj je ozbiljnih pogreška tijekom i nakon mužnje.
Bakterije u sirovom mlijeku, za potrebe vlastitog metabolizma razgrañuju
pojedine i/ili istovremeno više sastojaka mlijeka. Na taj način umanjena je
nutritivna i tehnološka vrijednost mlijeka, ili je u ekstremnim slučajevima
sirovo mlijeko u potpunosti neiskoristivo za daljnju preradu. U većini
zemalja odreñivanje ukupnog broja bakterija u sirovom mlijeku, provodi
se u prvom redu radi svrstavanja mlijeka u odreñeni bakteriološki razred,
na osnovi kojeg se korigiraju cijene mlijeka. Stoga je utvrñivanje ukupnog
broja bakterija u mlijeku klasičnom metodom na Petrijevim zdjelicama
osnovna metoda prosuñivanja njegove bakteriološke kvalitete. Metoda se
temelji na činjenici da jedino žive bakterijske stanice mogu rasti na
pogodnom mediju i tvoriti vidljive kolonije koje se mogu brojiti. Kolonije
nastaju umnažanjem jedne ili nakupine stanica, a sastoji i od nekoliko
milijuna organizama. Bilo koji stanični ekstracelularni materijala, ako ga
stanica tvori takoñer je sastavni dio kolonije. Kada stanica dosegne
stacionarnu fazu rasta, ona prestaje rasti i kolonija postaje vidljiva. Oblik,
veličina i boja kolonije species su karakteristični. Klasična metoda
utvrñivanja ukupnog broja bakterija u mlijeku odabrana je za
referentnu, te je metoda standardizirana na meñunarodnoj i nacionalnoj
razini (FIL-IDF 100B:1991.; HRN ISO 6610: 2001.). Ostale bakterijske
skupine koje su sadržane u ukupnom broju bakterija u mlijeku, mogu se
izbrojiti njihovim selektivnim izdvajanjem. Na primjer, psihrotrofne
bakterije - inkubacijom istog hranilišta na temperaturi od 5-7°C /10 dana,
88
a termorezistente bakterije - laboratorijskom pasterizacijom istog uzorka
mlijeka.
Utvrñivanje broja psihrotrofnih, termorezistentnih, sporotvornih,
koliformnih ili nekih drugih, kao dopunu u otkrivanju izvora bakteriološke
kontaminacije mlijeka, s većom ili manjom točnošću može biti korisno.
Meñutim, ti dodatni testovi nepraktični su u svakodnevnoj praksi, te ih
mljekarska industrija koristi za savjetovanje, istraživanja i nadzor
proizvodnje mlijeka.