Download pdf - Johdanto, mikroskooppiset tekniikat, solujen väliaine 1. Johdanto …cc.oulu.fi/~ehohtola/kb/hi01.pdf · 2015-02-05 · Johdanto, mikroskooppiset tekniikat, solujen väliaine 9 1

Johdanto, mikroskooppiset tekniikat, solujen väliaine

1

1

Histologia

http://cc.oulu.fi/~ehohtola/kb/

salasana kbkbkb


2

1

1. Johdanto

� Kirjallisuus

� Mikrotekniikka

� Mikroskopointi

2. Soluvälimateriaali

� Matrix

� Säikeet

3. Kudostyypit

� Epiteelikudos

� Sidekudos

• varsinainen sidekudos

• rusto

• luu

• veri

� Lihaskudos

• sileä lihaskudos

• poikkijuovainen

lihaskudos

• sydänlihas

� Hermokudos

4. Elimet, elinjärjestelmät

� Verenkiertoelimistö

� Lymfajärjestelmä

� Iho

� Aistinelimet

� Ruoansulatuskanava

+ rauhaset

� Hengityselimet

� Virtsanerityselimet

� Umpirauhaset

� Sukupuolielimet


3

1

1. Johdanto

kr. HISTOS = kudos, LOGOS = oppi

Kirjallisuutta

• Young & Heath: Wheater’s Functional Histology, A text and

colour atlas. Edinburgh, London : Churchill Livingston (4.

painos, 2000)

Lähitieteet

• Kehitysbiologia

• Fysiologia

• Solubiologia

• (Mikro)anatomia

• Patologia

• Oikeuslääketiede


4

1

Mikrotekniikka (mikroskooppinen tekniikka, erillinen kurssi)

Kudosten rakennetta ei voida tarkastella suoraan mikroskoopissa;

tarvitaan sopiva preparaatti ja värjäys � MIKROTEKNIKKA

Preparaattityypit

• totaalipreparaatti (esim. 1-soluiset, ohuet kalvot)

• leikepreparaatti (yleisin)

• sivelypreparaatti (esim. veri)

• murskepreparaatti (esim. kromosomipreparaatit)

Valmistusvaiheet

fikseeraus � valu � leikkaus � värjäys � mikroskopointi


5

1

• estää kudoksen autolyysin (lysosomit)

• kovettaa � kudos kestää leikkauksen

• edistää värjäytymistä

• formaldehydi, paraformaldehydi, alkoholi, pikriinihappo,

etikkahappo � seokset

• esim. Bouin: pikriinihappo (saturoitu vesiliuos) 75 osaa +

formaliini (40 % formaldehydi) 25 osaa + jääetikka (100 %

etikkahappo) 5 osaa

kudospalan oltava pieni 2-3

mm � nopea fikseeraus



6

1


• valu (petaus) parafiiniin tai muoviin � ”blokki” leikkausta varten

• vaatii veden poiston � 30 % alkoholi …� abs. alkoholi �

ksyleeni (ns. nouseva sarja)

• valu voidaan tehdä myös jäädyttämällä, jolloin fikseerausta ja

veden poistoa ei tarvita

muoviblokki parafiiniblokki


7

1


• leikkaus � leikkeet/leikenauha

• valomikroskopia mikrotomilla 1-15 µm, EM << 1µm

(ultramikrotomi), jääleikkeet kryostaattimikrotomilla (jäähdytys)


8

1

blokki

terä leike



9

1 Johdanto, mikroskooppiset tekniikat, solujen väliaine

10

1

• Leikkeet kiinnitetään objektilasille (EM:ssa kuparihilalle) esim. munanvalkuais-glyseroli-seoksella lämpöpöydällä (nauhojen oikaisu)

• Jääleikkeet suoraan lasille

• Värjäystä varten parafiini yleensä poistettava (värit vesiliukoisia) � laskeva sarja (ksyleeni � abs. alkoholi…�30 % alkoholi �vesi)



11

1


Värjäys perustuu väriaineisiin

• yleensä aromaattisia orgaanisia molekyylejä

• molekyylissä kaksi osaa

• kromofori eli ”värin kantaja”

• esim. parakinoni, Atso-ryhmiä -N=N-, atsiini, ym.

• auksokromi: värin sitoutuminen, pysyvyys

• -COOH, -NH2, -OH -ryhmät

• happamat, emäksiset värit (= anioniset ja kationiset

värit), neutraalit värit

• peittaus: värien saostus metallisuoloilla (kangasvärjäyksessä ”puretus”)

• EM-’värit’ esim. osmiumtetroksidi


12

1

hematoksyliini eosiini


Esimerkki


13

1


peitinlasi +

peitinaine (esim.

kanadanbalsami)

leikenauha


14

1

Histokemialliset värjäykset (molekyylien spesifinen osoittaminen)

• Entsyymihistokemia - entsyymien paikallistaminen kudoksissa

• entsyymireaktio kytketään värireaktioon

• Immunohistokemia

• vasta-aineiden hyväksikäyttö makromolekyylien osoittamisessa

ATP-aasi, lihasSyöpäspesifinen

antigeeni, eturauhanen



15

1


Valomikroskooppi

• yleisin, teoreettinen erotuskyky 0.2 µm

• erotuskyky riippuu: valon aallonpituudesta, väliaineen

taitekertoimesta ja objektiivin avautumiskulmasta

• tärkeimmät rakenteet havaittavissa ihmissilmin 40x

suurennoksella!

Fluoresenssimikroskooppi

• UV-heräte kohteeseen � fluoresenssi näkyvän valon alueella

• autofluoresenssi, väriaineilla aikaansaatu fluoresenssi

• konfokaalimikroskopia: herätevalo = laser � sopii paksuille

leikkeille, pistemäinen kohteen valaisu � skannaus


16

1

konfokaali fluoresenssi



17

1

Valomikroskoopin sovellutuksia

• pimeäkenttämikroskooppi

• faasikontrastimikroskooppi, värjäystä ei tarvita

• interferenssikontrastimikroskooppi

• polarisaatiomikroskooppi



18

1

Elektronimikroskopia

• läpivalaisu-EM (transmission-EM, TEM)

• pyyhkäisy-EM (Scanning-EM, SEM) – ”pintakuva”

• omat leike- ja värjäystekniikat

• elektronien läpäisevyys (elektroni-opaakkisuus)� ’väri’

TEM SEM



19

1

Historiaa

• Mikroskooppi Leeuwenhook 1700-luku

• Tuma: Brown 1831

• Soluteoria: Schwann & Schleiden 1838/39

• Ihmisen histologian oppikirja: Henle 1841

• Kudostyypit: Wirchow 1863

• Mikrotomit, leikkeiden valmistus: 1800-luvun loppu

• Elektronimikroskopia: 1940/50-luku

• Entsyymihistokemia: 1950-luku

• Immunohistokemia: 1960/70-luku

• In situ mRNA-hybridisaatio: 1980-luku


20

1

2. Soluvälimateriaali

�Kudos = solut + soluvälimateriaali (matrix, matriksi)

�Matrix ei varsinaisesti elävää materiaalia

�Aina solujen tuottamaa

�Kudosten ja tukirangan kovuus ja lujuus

• luu > rusto > verkkomainen sidekudos

�Toimii diffuusiotienä

�Väliaineen 2 perustyyppiä

• amorfinen eli homogeeninen

• säikeinen


21

1

2.1. Amorfinen väliaine

�Joko suhteellisen jäykkiä (geeli) tai juoksevampia (sooli)

�Päätehtävä diffundoitumistie, adheesio

�Erotetaan kaksi komponenttia: perusaine + sementti

�Yleensä seoksia

• glykoproteiinit + kollageeni (molekyylimuodossa)

• hiilihydraatit

• heksosamiinien ja heksuronihappojen polymeereja =

glykosaminoglykaanit (GAG) = mukopolysakkaridit

• lipidit

• vesi


22

1

GAG:t jaetaan ei-esteröityneisiin ja esteröityneisiin

1. Ei-esteröityneet

• hyaluronihappo: glukuronihapon ja asetyyliglukosamiinin

polymeeri M ≈ 1 000 000

• kondroitiini: glukuronihappo + N-asetyyligalaktosamiini M ≈

25 000

2. Esteröityneet (-OSO3H)

• kondroitiinisulfaatti (galaktosamiinin, glukuronihapon ja

sulfaatin polymeeri), dermataanisulfaatti

• keratohyaliini � ihon keratiini

• sulfatoituneet muodot jäykempiä � geelit (sementtiaine)

• liittyvät sulfaatin avulla proteiineihin � proteoglykaanit (vanh.

mukoproteiinit), runkona hyaluronihappo


23

1

hyaluronihappo

kondroitiinisulfaatti

proteoglykaani M ≈ 108

EM-kuva


24

1

Esiintyminen:

• hyaluronihappo

• useimpien elinten sidekudos-osassa

• lisäksi nivelpussit, napanuora, silmän lasiainen

• viskoosinen fluidi, sitoo helposti vettä, joka voi poistua

• viskositeettia säätelee hyaluronidaasi-entsyymi (hydrolysoi)

• kondroitiinisulfaatti

• rusto, luu, aorta, sydänläpät, sarveiskalvo, napanuora

’kondro’ = rusto (kr. chondro-)

’hyalo’ = kr. lasi

’muko’ = lima (lat. mucus)

Väliaineen valontaitto yleensä

sama kuin vedellä!


25

1

2.1. Säikeet

Huom: Biologiassa syy = solu, säie = fibrilli (lääketieteessä eri

käytäntö, esim. lihassäie = lihassolu)

A. Kollageenisäikeet

• tavataan kaikissa sidekudostyypeissä, eläinkudosten yleisin

proteiini, jopa 25 % kaikista proteiineista

• luun proteiini on pääosin kollageenia

• ainakin 27 eri tyyppiä: tyyppi I 70 % koko elimistön

kollageenista,

90 % luun kollageenista

• Lat. collum = liima, kollageeni = liimaa tuottava


26

1

• Kollageeni + raskasmetallisuolat tai tanniini � erittäin vaikealiukoinen yhdiste

(nahan parkitseminen!)

• Tanner = parkitsija


27

1

• perusrakenne 3 peptidiketjun helix, joka kolmas ah = glysiini

• GLY-X-Y

• X usein proliini, Y hydroksiproliini

• n. 1000 ah:n 1-kertainen helix

• 3-kertainen helix = tropokollageeni, gly helixin sisällä

• pituus 280 nm, läpimitta 1.4 nm

• tropokollageeni � mikrosäikeet (micofibrils)

• ¼ limittäisyys

• pituus useita µm, läpimitta 0.3 µm

• mikrosäikeet + ristisidokset � kollageenisäikeet

• läpimitta 1-12 µm


28

1

tropokollageeni(+telopeptidit)

mikrofibrilli

kollageenisäie


29

1

B. Retikuliinisäikeet

• verkkomaisia, haaroittuvia

• muodostavat pieniä verkostoja verisuonten, lihassolujen,

rasvasolujen ym. ympärille

• ”epäkypsää” kollageenia, muodostuu tropokollageenista

C. Elastiset säikeet

• paljon mm. löyhässä sidekudoksessa

• valtimoiden ympärillä, keuhkoissa

• joustavia, kumimaisia

• elastiini-proteiini, M ≈ 70 000, 8 ah,

• ”random-coil”, 3-ulotteinen rakenne oskilloi � joustavuus

• molekyylisillat lysiinin muodostamia (lysyylioksidaasi-entsyymi)


30

1

Kollageenisäikeet

iho

suolilieve

SEM


31

1

retikukulaarisäikeet

(imusolmuke)

elastiset säikeet

(valtimon seinämä)