Upload
others
View
7
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
Johdanto, mikroskooppiset tekniikat, solujen väliaine
1
1
Histologia
http://cc.oulu.fi/~ehohtola/kb/
salasana kbkbkb
Johdanto, mikroskooppiset tekniikat, solujen väliaine
2
1
1. Johdanto
� Kirjallisuus
� Mikrotekniikka
� Mikroskopointi
2. Soluvälimateriaali
� Matrix
� Säikeet
3. Kudostyypit
� Epiteelikudos
� Sidekudos
• varsinainen sidekudos
• rusto
• luu
• veri
� Lihaskudos
• sileä lihaskudos
• poikkijuovainen
lihaskudos
• sydänlihas
� Hermokudos
4. Elimet, elinjärjestelmät
� Verenkiertoelimistö
� Lymfajärjestelmä
� Iho
� Aistinelimet
� Ruoansulatuskanava
+ rauhaset
� Hengityselimet
� Virtsanerityselimet
� Umpirauhaset
� Sukupuolielimet
Johdanto, mikroskooppiset tekniikat, solujen väliaine
3
1
1. Johdanto
kr. HISTOS = kudos, LOGOS = oppi
Kirjallisuutta
• Young & Heath: Wheater’s Functional Histology, A text and
colour atlas. Edinburgh, London : Churchill Livingston (4.
painos, 2000)
Lähitieteet
• Kehitysbiologia
• Fysiologia
• Solubiologia
• (Mikro)anatomia
• Patologia
• Oikeuslääketiede
Johdanto, mikroskooppiset tekniikat, solujen väliaine
4
1
Mikrotekniikka (mikroskooppinen tekniikka, erillinen kurssi)
Kudosten rakennetta ei voida tarkastella suoraan mikroskoopissa;
tarvitaan sopiva preparaatti ja värjäys � MIKROTEKNIKKA
Preparaattityypit
• totaalipreparaatti (esim. 1-soluiset, ohuet kalvot)
• leikepreparaatti (yleisin)
• sivelypreparaatti (esim. veri)
• murskepreparaatti (esim. kromosomipreparaatit)
Valmistusvaiheet
fikseeraus � valu � leikkaus � värjäys � mikroskopointi
Johdanto, mikroskooppiset tekniikat, solujen väliaine
5
1
• estää kudoksen autolyysin (lysosomit)
• kovettaa � kudos kestää leikkauksen
• edistää värjäytymistä
• formaldehydi, paraformaldehydi, alkoholi, pikriinihappo,
etikkahappo � seokset
• esim. Bouin: pikriinihappo (saturoitu vesiliuos) 75 osaa +
formaliini (40 % formaldehydi) 25 osaa + jääetikka (100 %
etikkahappo) 5 osaa
kudospalan oltava pieni 2-3
mm � nopea fikseeraus
fikseeraus � valu � leikkaus � värjäys � mikroskopointi
Johdanto, mikroskooppiset tekniikat, solujen väliaine
6
1
fikseeraus � valu � leikkaus � värjäys � mikroskopointi
• valu (petaus) parafiiniin tai muoviin � ”blokki” leikkausta varten
• vaatii veden poiston � 30 % alkoholi …� abs. alkoholi �
ksyleeni (ns. nouseva sarja)
• valu voidaan tehdä myös jäädyttämällä, jolloin fikseerausta ja
veden poistoa ei tarvita
muoviblokki parafiiniblokki
Johdanto, mikroskooppiset tekniikat, solujen väliaine
7
1
fikseeraus � valu � leikkaus � värjäys � mikroskopointi
• leikkaus � leikkeet/leikenauha
• valomikroskopia mikrotomilla 1-15 µm, EM << 1µm
(ultramikrotomi), jääleikkeet kryostaattimikrotomilla (jäähdytys)
Johdanto, mikroskooppiset tekniikat, solujen väliaine
8
1
blokki
terä leike
fikseeraus � valu � leikkaus � värjäys � mikroskopointi
Johdanto, mikroskooppiset tekniikat, solujen väliaine
9
1 Johdanto, mikroskooppiset tekniikat, solujen väliaine
10
1
• Leikkeet kiinnitetään objektilasille (EM:ssa kuparihilalle) esim. munanvalkuais-glyseroli-seoksella lämpöpöydällä (nauhojen oikaisu)
• Jääleikkeet suoraan lasille
• Värjäystä varten parafiini yleensä poistettava (värit vesiliukoisia) � laskeva sarja (ksyleeni � abs. alkoholi…�30 % alkoholi �vesi)
fikseeraus � valu � leikkaus � värjäys � mikroskopointi
Johdanto, mikroskooppiset tekniikat, solujen väliaine
11
1
fikseeraus � valu � leikkaus � värjäys � mikroskopointi
Värjäys perustuu väriaineisiin
• yleensä aromaattisia orgaanisia molekyylejä
• molekyylissä kaksi osaa
• kromofori eli ”värin kantaja”
• esim. parakinoni, Atso-ryhmiä -N=N-, atsiini, ym.
• auksokromi: värin sitoutuminen, pysyvyys
• -COOH, -NH2, -OH -ryhmät
• happamat, emäksiset värit (= anioniset ja kationiset
värit), neutraalit värit
• peittaus: värien saostus metallisuoloilla (kangasvärjäyksessä ”puretus”)
• EM-’värit’ esim. osmiumtetroksidi
Johdanto, mikroskooppiset tekniikat, solujen väliaine
12
1
hematoksyliini eosiini
fikseeraus � valu � leikkaus � värjäys � mikroskopointi
Esimerkki
Johdanto, mikroskooppiset tekniikat, solujen väliaine
13
1
fikseeraus � valu � leikkaus � värjäys � mikroskopointi
peitinlasi +
peitinaine (esim.
kanadanbalsami)
leikenauha
Johdanto, mikroskooppiset tekniikat, solujen väliaine
14
1
Histokemialliset värjäykset (molekyylien spesifinen osoittaminen)
• Entsyymihistokemia - entsyymien paikallistaminen kudoksissa
• entsyymireaktio kytketään värireaktioon
• Immunohistokemia
• vasta-aineiden hyväksikäyttö makromolekyylien osoittamisessa
ATP-aasi, lihasSyöpäspesifinen
antigeeni, eturauhanen
fikseeraus � valu � leikkaus � värjäys � mikroskopointi
Johdanto, mikroskooppiset tekniikat, solujen väliaine
15
1
fikseeraus � valu � leikkaus � värjäys � mikroskopointi
Valomikroskooppi
• yleisin, teoreettinen erotuskyky 0.2 µm
• erotuskyky riippuu: valon aallonpituudesta, väliaineen
taitekertoimesta ja objektiivin avautumiskulmasta
• tärkeimmät rakenteet havaittavissa ihmissilmin 40x
suurennoksella!
Fluoresenssimikroskooppi
• UV-heräte kohteeseen � fluoresenssi näkyvän valon alueella
• autofluoresenssi, väriaineilla aikaansaatu fluoresenssi
• konfokaalimikroskopia: herätevalo = laser � sopii paksuille
leikkeille, pistemäinen kohteen valaisu � skannaus
Johdanto, mikroskooppiset tekniikat, solujen väliaine
16
1
konfokaali fluoresenssi
fikseeraus � valu � leikkaus � värjäys � mikroskopointi
Johdanto, mikroskooppiset tekniikat, solujen väliaine
17
1
Valomikroskoopin sovellutuksia
• pimeäkenttämikroskooppi
• faasikontrastimikroskooppi, värjäystä ei tarvita
• interferenssikontrastimikroskooppi
• polarisaatiomikroskooppi
fikseeraus � valu � leikkaus � värjäys � mikroskopointi
Johdanto, mikroskooppiset tekniikat, solujen väliaine
18
1
Elektronimikroskopia
• läpivalaisu-EM (transmission-EM, TEM)
• pyyhkäisy-EM (Scanning-EM, SEM) – ”pintakuva”
• omat leike- ja värjäystekniikat
• elektronien läpäisevyys (elektroni-opaakkisuus)� ’väri’
TEM SEM
fikseeraus � valu � leikkaus � värjäys � mikroskopointi
Johdanto, mikroskooppiset tekniikat, solujen väliaine
19
1
Historiaa
• Mikroskooppi Leeuwenhook 1700-luku
• Tuma: Brown 1831
• Soluteoria: Schwann & Schleiden 1838/39
• Ihmisen histologian oppikirja: Henle 1841
• Kudostyypit: Wirchow 1863
• Mikrotomit, leikkeiden valmistus: 1800-luvun loppu
• Elektronimikroskopia: 1940/50-luku
• Entsyymihistokemia: 1950-luku
• Immunohistokemia: 1960/70-luku
• In situ mRNA-hybridisaatio: 1980-luku
Johdanto, mikroskooppiset tekniikat, solujen väliaine
20
1
2. Soluvälimateriaali
�Kudos = solut + soluvälimateriaali (matrix, matriksi)
�Matrix ei varsinaisesti elävää materiaalia
�Aina solujen tuottamaa
�Kudosten ja tukirangan kovuus ja lujuus
• luu > rusto > verkkomainen sidekudos
�Toimii diffuusiotienä
�Väliaineen 2 perustyyppiä
• amorfinen eli homogeeninen
• säikeinen
Johdanto, mikroskooppiset tekniikat, solujen väliaine
21
1
2.1. Amorfinen väliaine
�Joko suhteellisen jäykkiä (geeli) tai juoksevampia (sooli)
�Päätehtävä diffundoitumistie, adheesio
�Erotetaan kaksi komponenttia: perusaine + sementti
�Yleensä seoksia
• glykoproteiinit + kollageeni (molekyylimuodossa)
• hiilihydraatit
• heksosamiinien ja heksuronihappojen polymeereja =
glykosaminoglykaanit (GAG) = mukopolysakkaridit
• lipidit
• vesi
Johdanto, mikroskooppiset tekniikat, solujen väliaine
22
1
GAG:t jaetaan ei-esteröityneisiin ja esteröityneisiin
1. Ei-esteröityneet
• hyaluronihappo: glukuronihapon ja asetyyliglukosamiinin
polymeeri M ≈ 1 000 000
• kondroitiini: glukuronihappo + N-asetyyligalaktosamiini M ≈
25 000
2. Esteröityneet (-OSO3H)
• kondroitiinisulfaatti (galaktosamiinin, glukuronihapon ja
sulfaatin polymeeri), dermataanisulfaatti
• keratohyaliini � ihon keratiini
• sulfatoituneet muodot jäykempiä � geelit (sementtiaine)
• liittyvät sulfaatin avulla proteiineihin � proteoglykaanit (vanh.
mukoproteiinit), runkona hyaluronihappo
Johdanto, mikroskooppiset tekniikat, solujen väliaine
23
1
hyaluronihappo
kondroitiinisulfaatti
proteoglykaani M ≈ 108
EM-kuva
Johdanto, mikroskooppiset tekniikat, solujen väliaine
24
1
Esiintyminen:
• hyaluronihappo
• useimpien elinten sidekudos-osassa
• lisäksi nivelpussit, napanuora, silmän lasiainen
• viskoosinen fluidi, sitoo helposti vettä, joka voi poistua
• viskositeettia säätelee hyaluronidaasi-entsyymi (hydrolysoi)
• kondroitiinisulfaatti
• rusto, luu, aorta, sydänläpät, sarveiskalvo, napanuora
’kondro’ = rusto (kr. chondro-)
’hyalo’ = kr. lasi
’muko’ = lima (lat. mucus)
Väliaineen valontaitto yleensä
sama kuin vedellä!
Johdanto, mikroskooppiset tekniikat, solujen väliaine
25
1
2.1. Säikeet
Huom: Biologiassa syy = solu, säie = fibrilli (lääketieteessä eri
käytäntö, esim. lihassäie = lihassolu)
A. Kollageenisäikeet
• tavataan kaikissa sidekudostyypeissä, eläinkudosten yleisin
proteiini, jopa 25 % kaikista proteiineista
• luun proteiini on pääosin kollageenia
• ainakin 27 eri tyyppiä: tyyppi I 70 % koko elimistön
kollageenista,
90 % luun kollageenista
• Lat. collum = liima, kollageeni = liimaa tuottava
Johdanto, mikroskooppiset tekniikat, solujen väliaine
26
1
• Kollageeni + raskasmetallisuolat tai tanniini � erittäin vaikealiukoinen yhdiste
(nahan parkitseminen!)
• Tanner = parkitsija
Johdanto, mikroskooppiset tekniikat, solujen väliaine
27
1
• perusrakenne 3 peptidiketjun helix, joka kolmas ah = glysiini
• GLY-X-Y
• X usein proliini, Y hydroksiproliini
• n. 1000 ah:n 1-kertainen helix
• 3-kertainen helix = tropokollageeni, gly helixin sisällä
• pituus 280 nm, läpimitta 1.4 nm
• tropokollageeni � mikrosäikeet (micofibrils)
• ¼ limittäisyys
• pituus useita µm, läpimitta 0.3 µm
• mikrosäikeet + ristisidokset � kollageenisäikeet
• läpimitta 1-12 µm
Johdanto, mikroskooppiset tekniikat, solujen väliaine
28
1
tropokollageeni(+telopeptidit)
mikrofibrilli
kollageenisäie
Johdanto, mikroskooppiset tekniikat, solujen väliaine
29
1
B. Retikuliinisäikeet
• verkkomaisia, haaroittuvia
• muodostavat pieniä verkostoja verisuonten, lihassolujen,
rasvasolujen ym. ympärille
• ”epäkypsää” kollageenia, muodostuu tropokollageenista
C. Elastiset säikeet
• paljon mm. löyhässä sidekudoksessa
• valtimoiden ympärillä, keuhkoissa
• joustavia, kumimaisia
• elastiini-proteiini, M ≈ 70 000, 8 ah,
• ”random-coil”, 3-ulotteinen rakenne oskilloi � joustavuus
• molekyylisillat lysiinin muodostamia (lysyylioksidaasi-entsyymi)
Johdanto, mikroskooppiset tekniikat, solujen väliaine
30
1
Kollageenisäikeet
iho
suolilieve
SEM
Johdanto, mikroskooppiset tekniikat, solujen väliaine
31
1
retikukulaarisäikeet
(imusolmuke)
elastiset säikeet
(valtimon seinämä)