LES LYMPHOCYTES B

I. Introduction

A. Généralités

Les lymphocytes constituent une population hétérogène avec :

Les lymphocytes B Les lymphocytes T

Conventionnels Non conventionnels (TNK et MAIT)

Les lymphocytes (ou cellules) NK.

B. Immunité adaptative : Lymphocytes B et T

Les lymphocytes B et T font partie de l’immunité adaptative, c'est-à-dire l'immunité dans laquelle le lymphocyte reconnait un antigène par un récepteur (BCR ou TCR). Si cet antigène pénètre une deuxième fois dans l'organisme la réponse immunitaire déclenchée sera plus ample et rapide.

Ces lymphocytes n'ont pas comme fonction que de reconnaitre un antigène par leur récepteur et de permettre une réponse. Ils sécrètent plusieurs substances solubles qui sont des cytokines (interleukines, interférons), permettant la modulation de la réponse immunitaire. Ce dialogue se fait aussi par le biais de récepteurs exprimés à la surface des cellules immunitaire, permettant une coopération et l'amplification (ou l'atténuation) de la réponse immunitaire.

Ces échanges ont pour but de contrôler les capacités d'adhésion et de migration des cellules immunitaires.

C. Lymphocytes B

Les lymphocytes B sont le support de la réponse immunitaire humorale spécifique.

C’est la seule cellule capable de produire des immunoglobulines puis de le sécréter (après différentiation en plasmocyte).Ces immunoglobulines pourront ensuite agir à distance.

C’est aussi une cellule présentatrice d’antigène (CPA) tout comme les macrophages et les cellules dendritiques.

Les lymphocytes B sont capables de moduler la réponse immunitaire et de contrôler le développement de certains lymphocytes (MAIT).

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D. Récepteurs et identification

Les lymphocytes B expriment une grande variété de molécules dont des récepteurs:

Spécifiques du lymphocyte B (comme CD19 ou CD20) Non spécifiques

Ces molécules spécifiques exprimées en surface sont importants pour identifier les lymphocytes B et connaitre leur état d'activation.

Pour ceci, on a recours à des anticorps monoclonaux ou polyclonaux fluorescents spécifiques qui sont dirigés contre ces molécules constitutives. On pourra les observer en microscopie (cellules en suspension, sections tissulaires) ou en cytométrie de flux.

II. Lymphopoïèse B

A. Généralités

1. Définition

Tous les lymphocytes B proviennent de la cellule souche hématopoïétique.

La lymphopoïèse est l’ensemble des étapes par lesquelles la cellule souche hématopoïétique devient un lymphocyte B mature qui exprime en surface le récepteur BCR composé de l’Immunoglobuline et de l’hétérodimère Igα et Igβ.

Au stade de lymphocyte B mature, l'immunoglobuline n'est pas sécrétée mais sert de récepteur.

Ce n’est que lorsque le lymphocyte B mature reconnait un antigène qu'il se différencie soit

En plasmocyte. Ce plasmocyte sécrète l'immunoglobuline. On parle d'anticorps quand l'immunoglobuline connait l'identité de sa cible (de l’antigène donc).

En lymphocyte B mémoire qui pourra se différencier en plasmocyte lors de la réintroduction de l'antigène dans l'organisme. Néanmoins, il restera toujours un contingent de lymphocytes B mémoires.

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2. Lymphopoïèse B médullaire

Les précurseurs hématopoïétiques (dont les cellules souches multipotentes) sont présents au niveau de la moelle osseuse.

Ils sont en étroite relation avec les cellules nourricières stromales qui envoient des signaux aux cellules souches par le biais de récepteurs, de cytokines, de facteurs de croissance et de diverses molécules d’adhésion… Ceci va diriger la cellule souche vers chacune de ses voies de différenciation.

Dans la moelle, la lymphopoïèse est un phénomène continu toute la vie (même si elle baisse avec l'âge). La progression de la lymphopoïèse se fait du cortex vers la médullaire.

3. Localisation de la lymphopoïèse B

La lymphopoïèse B débute tôt. Chez la souris elle débute à J12 in-utéro tandis que chez l’homme elle débute à la 8e semaine de développement.

C’est un processus continue mais qui diminue avec l’âge.

Cette lymphopoïèse B siège:

A la vie fœtale dans : La moelle osseuse Le foie La rate D’autres tissus (reins, poumons, épiploons)

Après la naissance dans la moelle osseuse.

4. Production

Il existe beaucoup de contrôles lors de cette lymphopoïèse, ainsi, la plupart des cellules engagées dans cette voie vont être éliminées.

Chez la souris, 10 à 20 millions de lymphocytes B sont produits dans la moelle osseuse. Seulement 1 à 2 millions atteignent la rate. Celle-ci contient 8 millions de lymphocytes B naïfs.

Chez l’homme jeune, on a une production journalière de 100 millions de lymphocytes B. Néanmoins, seulement 10% de ceux-ci réussiront leur différenciation. De plus, ceux qui ne rencontrent pas d’antigènes meurent.

On peut trouver quelques plasmocytes dans la moelle osseuse par le phénomène de domiciliation malgré que leur production soit localisée dans les organes lymphoïdes secondaires.

La transformation maligne de ces plasmocytes domiciliés est la maladie de Kahler ou myélome multiple. Dans cette pathologie, le plasmocyte malin restera dans la moelle osseuse.

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B. Lymphocyte pro-B

1. Caractéristiques

La première cellule engagée dans la lymphopoïèse est la cellule pro-B. Il n’y a pas de chaine légère et de chaine lourde exprimé en surface, car les gènes qui codent pour les chaines n’ont pas été réarrangées.

2. Diversité des Immunoglobulines (diversité des spécificités anticorps)

On distingue trois catégories de lymphocytes Pro-B :

Une partie des cellules pro-B présentent une configuration germinale c'est-à-dire sans réarrangement.

Sous l’effet d’un stimulus (environnement), un segment D et J sont associés, on a alors un réarrangement DJ.

Dans un deuxième temps DJ sera rejoint par un segment V, on a alors l’alignement VDJ qui est la première structure qui intervient dans la variabilité des immunoglobulines.

Tant qu’il n’y a pas de réarrangement productif (production de chaine lourde), on parle toujours de lymphocyte pro-B. Lorsque le réarrangement est productif, on passe au stade lymphocyte pré-B.

3. Enzymes de réarrangement génique

Ce processus de réarrangement est permis par plusieurs molécules

Les molécules Rag1 et Rag2 qui permettent les coupures au niveau des segments D, J et V.

Leur absence aboutit à une absence d'immunoglobuline mais pas seulement. Ces molécules sont impliquées dans la synthèse des récepteurs TCR. On aura donc des enfants qui auront un déficit combiné sévère. Ces enfants (enfants bulle) seront mis dans des structures stériles dans l'attente d'une greffe de moelle osseuse.

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Les molécules Ku 70/80, DNA PK, DNA ligase Iv, Artemis et Cernunnos réaliseront la ligature des segments.

Ces molécules peuvent être des marqueurs de maladies. Ils peuvent être lésés dans certaines maladies et contribuer à la formation de cancer. Leur déficience aboutit à l'absence de réarrangement des chaînes lourdes ou légères et des TCR. On a donc une absence d'immunité.

B. Lymphocyte pré-B

Il existe une catégorie de lymphocytes B dans la moelle osseuse qui exprime dans le cytoplasme la chaîne lourde µ de l'Immunoglobuline. C'est le lymphocyte pré-B.

Néanmoins, seule une petite fraction des chaines lourdes µ peut aller en surface. Ces chaînes lourdes sont associées à des pseudo-chaînes légères qui forment les récepteurs pré-B. Ils sont associés à l'hétérodimère: Igα (CD79A) et Ig β (CD79B).

1. Récepteur pré-B

Chacun des composants du récepteur pré-B se trouvent dans le cytoplasme (chaîne lourde µ, les molécules Igα et Igβ et même la pseudo chaîne légère). Ils s'associent lorsqu'ils se rendent en surface (néanmoins cela ne concerne qu'une petite partie de ces éléments.

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2. Formation du récepteur pré-B

La pseudo-chaîne légère est formée de deux molécules :

V-pré-B qui ressemble à la région variable (V) d'une chaîne légère mais qui comporte une région originale que l'on ne retrouve pas sur les chaînes légères normales.

λ5 qui comporte aussi une région originale.

Ces deux molécules s'associent de façon non covalente et forme une protubérance.

Cette pseudo chaîne légère s'associe avec la chaîne lourde via des ponts disulfures (liaison covalente donc).

On retrouve l'hétérodimère Igα et Igβ liés entre eux par des ponts disulfures (liaison covalente), mais lié avec la chaîne lourde µ par des liaisons non covalentes.

On ne retrouve qu'un seul hétérodimère Igα et Igβ par récepteur.

3. Rôle de l'hétérodimère Igα / Igβ

Igα et Igβ sont des molécules indispensables pour :

Le transport du complexe formé par la chaine lourde µ et la pseudo chaine légère vers la surface (récepteur pré-B) et dans le lymphocyte mature le transport de l’immunoglobuline.

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La transmission du signal à l’intérieur de la cellule. La chaine lourde µ possède 3 acides aminés dans la cellule mais qui ne peuvent pas transmettre de signaux.

Ces deux molécules Igα et Igβ présentent des séquences en acides aminés qui sont phosphorylables par des kinases : c'est le motif ITAM.

Ce motif ITAM permet la création d'une cascade de signalisation passant, notamment pas Btk et BLNK.

L'absence de ces deux molécules amène à une absence de production de pré-lymphocytes B, donc on n'aura pas de lymphocytes B, ni d'immunoglobulines ni de plasmocytes, …

4. Variétés des lymphocytes pré-B

Ils sont de deux types :

Les lymphocytes pré-B de grande taille qui sont en prolifération

Les lymphocytes pré-B de petite taille qui ont cessé de proliférer mais qui sont en train de subir un certain nombre de transformations qui va les préparer à la production de lymphocytes B immatures. On a un réarrangement J et V pour les chaines légères.

Dès qu'il y a production des chaînes légères il y a destruction et remplacement des pseudo-chaînes légères. La chaîne légère a une affinité pour la chaine lourde plus importante que la pseudo-chaine légère.

D. Lymphocyte B immature

C’est une cellule qui a perdu l’expression de la pseudo-chaine légère qui a été remplacée par l’expression de la chaine légère conventionnelle.

Elle exprime toujours une immunoglobuline M formée d’une chaine lourde et légère associé aux Igα et β.

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III. Régulation de la lymphopoïèse

A. Etapes de régulation

Il existe deux étapes de régulation :

Une étape antigène indépendante qui concerne les cellules souches, les lymphocytes pro-B et les lymphocytes pré-B.

Une étape antigène dépendante qui concerne les lymphocytes B immatures et les lymphocytes B matures.

B. Initiation de la lymphopoïèse

L'initiation de la lymphopoïèse à partir des cellules souches est permise par l'influence de substances qui activent un programme de différenciation qui engage la cellule de façon d'abord réversible puis irréversible. Les molécules responsables de cet engagement son Ikaros et Pu-1.

On a ensuite l'intervention séquentiel et dans un ordre précis de Pax5, E2A et EBF qui agissent les uns après les autres et sont indispensables à la fabrication de lymphocytes B.

S'il manque une seule de ces molécules on n'aura pas de lymphocytes B.

S'il y a surproduction de ces molécules ou une surexpression de ces molécules on pourra avoir la formation de cellules cancéreuses.

Chez la souris on a pu mettre en évidence l'action très importante d'une cytokine : l'interleukine 7. Chez l'homme on n'a pas trouvé de substance équivalente.

C. Stimulation du récepteur pré-B

1. Signal de prolifération et de survie

Si on stimule le récepteur du lymphocyte pré-B, il y aura transmission d’un signal de prolifération et de survie.

Ce signal est transmis par Igα et Igβ qui grâce à ses motifs ITAM permet d'activer des molécules comme Btk et BNKL. En même temps, ce récepteur pré-B va donner un signal d’extinction de l’expression des molécules Rag, de telle sorte qu’un lymphocyte pré-B ne fabrique qu’une seule variété de chaîne lourde µ.

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2. Agammaglobulinémies

Si on supprime le récepteur pré-B, on s'arrêtera au stade pro-B. On parle d'agammaglobulinémies.

On aura un taux de γ globuline inférieur à 1 g/L quand la normale se situe entre 7 et 15 g/L.

Cette anomalie est due aux altérations de l'expression ou des fonctions du récepteur pré-BCR :

Liés à l'X : Mutation du gène Btk (Maladie de Bruton) Autosomiques :

Mutation du gène de la chaîne lourde µ des immunoglobulines Mutation du gène λ 5 Mutation des gènes CD79a ou CD79b Mutation du gène BLNK

D. Stimulation des récepteurs B immatures

1. Mécanisme d'apoptose

Lorsqu’on stimule ce récepteur B immature, on induit la mort de la cellule par apoptose.

La raison qui entraîne cette apoptose est que dans un organisme sain, la moelle osseuse est stérile, il n’y a pas donc pas d'antigènes étrangers. Les seuls antigènes que peut rencontrer ce lymphocyte immature sont des antigènes du soi, il peut alors devenir auto-réactif (maladies auto-immunes). Il sera donc éliminé.

2. Processus d’editing

Il existe une exception à cette apoptose. Le lymphocyte B immature peut avoir une seconde chance.

Il doit essayer de changer de spécificité en recombinant ses gènes pour produire une nouvelle chaîne légère. C'est le processus d'éditing (édition en français).

Ce processus doit être rapide et efficace pour prévenir de l’apoptose. Il peut avoir lieu car les cellules continuent d'exprimer les molécules Rag 1 et 2 de façon transitoire.

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E. Différenciation des lymphocytes B matures

1. Différenciation et prolifération

Si on stimule l'immunoglobuline à la surface d'un lymphocyte B mature, on aura la plupart du temps la production de :

Plasmocytes après le passage par un intermédiaire : l'immunoblaste Cellules de mémoire.

Cette différenciation se fait dans les organes lymphoïdes secondaires.

Un lymphocyte prolifère par prolifération clonale. En effet, chaque lymphocyte "fils" exprimeront la même immunoglobuline.

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2. Différenciation dans les organes lymphoïdes secondaire et les centre germinatifs

a. Différenciation sans coopération avec un lymphocyte T

Dans le cortex des ganglions arrivent des lymphocytes T et des cellules dendritiques. Plus en profondeur, dans la médullaire, se trouve des structures arrondis : les follicules primaires, formés en grande partie de lymphocytes B matures mais aussi d'un peu de cellules dendritiques folliculaires et de très peu de lymphocytes T (Lymphocyte T folliculaire auxiliaire).

Entre le cortex et le follicule on a la zone marginale où l'on trouve des lymphocytes B qui ont des fonctions et propriétés différentes de ceux de la zone folliculaire.

Ainsi, un lymphocyte B naïf qui rentre dans le ganglion peut reconnaître un antigène polysaccharidique (capsule bactérienne) et se développer. Ces lymphocytes B expriment essentiellement des immunoglobulines M.

b. Différenciation avec coopération avec un lymphocyte T

Le lymphocyte B reconnait un antigène T-dépendant et pénètre dans le follicule primaire où il rencontre des lymphocytes T folliculaires et prolifère dans le centre germinatif.

En proliférant il va repousser les autres cellules du follicule primaire en périphérie dans une sorte de croissant : la zone du manteau.

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Dans le centre germinatif se différencient et prolifèrent les lymphocytes B spécifiques de l'antigène rencontré. Ce centre a deux zones :

Une zone sombre avec une forte densité cellulaire. Les lymphocytes B prendront le nom de centrocytes.

Une zone claire avec une densité cellulaire plus faible. Les lymphocytes B prendront le nom de centroblastes.

Il existe des lymphomes provenant des tissus lymphoïdes secondaires qui sont dit de la zone folliculaire, de la zone du manteau… Chacun de ces lymphomes a un pronostic et un mode d'expression différent.

3. Coopération entre lymphocyte B et lymphocyte T

Si l'immunoglobuline du lymphocyte B reconnaît l'antigène elle l'internalise. Il sera fragmenté en petits peptides grâce aux enzymes du protéasomes.

Ces peptides vont se lier à des molécules de CMH à la surface de la cellule (CMHII pour les lymphocytes T CD4 et CMH I pour les lymphocytes T CD8). Cette interaction ne suffit pas pour activer le lymphocyte T, on dit qu'il est dans un état d'ignorance immune.

Cette liaison CMH-peptide va activer la molécule CD40 L (ligand) qui va venir se fixer sur la molécule CD40 du lymphocyte B. Cette molécule CD40 est exprimée de façon constitutive sur le lymphocyte B, mais aussi sur d'autres cellules présentatrices d'antigène (CPA). Cette interaction permet un dialogue bidirectionnel entre les deux cellules.

Ce dialogue bidirectionnel induit l'expression de CD80 et CD86, au niveau du lymphocyte B, qui vont interagir avec la molécule CD28 exprimée par les lymphocytes T. Cela permet l'activation du lymphocyte T.

Néanmoins, CD80 et CD86 peuvent se lier à une autre molécule du lymphocyte T, CTLA4, entraînant une atténuation de la réponse immunitaire.

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Il existe des déficits immunitaires qui sont dus à l’absence de CD40 et de son ligand, ce sont des enfants chez qui le lymphocyte n’exprime que l'immunoglobuline M et pas les immunoglobulines A ou G.

Néanmoins, si on veut atténuer la réponse immunitaire (transplantation, maladies auto-immunes), on va pouvoir inhiber l'interaction entre CD40 et son ligand ou, au contraire, stimuler l'expression de CTLA4.

IV. Identification des lymphocytes B

A. Expression moléculaire

L’expression de CD34 est caractéristiques des précurseur des cellules hématopoïétiquesLors de greffe, on sélectionne les précurseurs sur la base de l’expression de cette molécule.

La CD10 est exprimé du stade pro-B jusqu’au stade B mature. Elle ne permet donc pas de distinguer les différents stades de développement de LB.

Igα et β sont exprimées dans le cytoplasme des cellules au stade pro-B (absence de chaîne lourde µ)

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Du stade pré-B au lymphocyte B mature, elles sont exprimées dans le cytoplasme et en surface. Leur expression disparait au stade plasmocyte car il y a alors sécrétion des immunoglobulines.

La pseudo chaine légère est exprimée au stade pro-B seulement dans le cytoplasme.

Au stade pré-B elle est exprimée dans le cytoplasme et la surface cellulaire. Elle disparait au stade de lymphocyte B mature.

Ainsi, la présence de pseudo chaîne légère dans le cytoplasme est un marqueur de l'identité des lymphocytes pro-B ou pré-BLa présence de pseudo chaîne légère dans le cytoplasme et à la surface de la cellule est un marqueur de l'identité des lymphocytes pré-B.

C'est donc un marqueur qui permet d'identifier une cellule engagée dans la lymphopoïèse.

CD19 est exprimé très tôt (juste après Igα et Igβ) à la surface.

Cette expression commence au niveau du stade pro-B et se termine au stade de lymphocyte B mature. Cette molécule sera donc perdue au stade de plasmocyte.

CD20 est exprimée au stade de pré-B de petite taille et continue à être exprimée jusqu’au stade de plasmocyte. L’ensemble des LB en périphérie expriment CD20.

Ainsi, un lymphocyte B peut être repéré dans le sang grâce à la co-expression de CD19 et CD20. Toute cellule exprimant ces deux molécules est un lymphocyte B.

Dans la moelle osseuse, les cellules qui expriment RAG sont des cellules B.

Cette molécule est exprimée très tôt au stade pré-B pour préparer la production de la chaine lourde, puis disparait pour éviter un second réarrangement de cette chaîne. On parle d'exclusion allélique.

Au stade pré-B tardif, On a de nouveau l'expression de Rag pour réarranger la chaine légère pour former l'immunoglobuline M.

On a une expression des Rag dans les lymphocytes B immatures afin de leur permettre de réaliser l'editing.

Le Tdt est exprimé au stade pro-B uniquement.

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B. Marqueurs spécifiques

Lymphocytes pro-B Lymphocytes pré-Bjeunes

Lymphocytes pré-B tardifs

Lymphocyte B immatures

Lymphocytes B matures

CD19+ Igα, Igβ pseudo-chaines

légères dans cytoplasme CD34+ Rag+ Tdt +

CD19+ Igα, Igβ, ψCL

(cytoplasme et surface) CD10+ Chaîne lourde+

Rag- CD20-

CD19+ Igα, Igβ, ψCL

(cytoplasme et surface) CD10+ Chaîne lourde+

Rag+ CD20+

CD19+Igα, Igβ +IgM+CD20+ψCL-CD40+

CD19+Igα, Igβ +Ig+CD20+CD40+

C. Sous population lymphocytaire B

La majorité des lymphocytes B circulants sont des lymphocytes B naïfs (150-450/mm3).

Il en existe plusieurs types :

La majorité des LB circulants sont des LB matures naïfs. Il y a plusieurs catégories de population LB :

Les lymphocytes B1 : Ils expriment CD5 ou pas (sisters). Chez les souris, ils sont retrouvés au niveau des séreuses. Chez l'homme on en retrouve partout.Ils sont très peu spécifiques et peuvent reconnaître beaucoup d'antigène. Lorsqu'ils se différencient ils affinent leur spécialisation antigénique.

Les lymphocytes B2 conventionnels : Les lymphocytes régulateurs : inhibent et contrôlent l'amplitude de la réponse

immunitaires des autres lymphocytes B et T Les lymphocytes B mémoires qui expriment CD27

D. Les plasmocytes

Ce sont des cellules qui ont changé de morphologie avec un noyau excentré et une chromatine en motte.

Ils n'expriment plus d'immunoglobuline en surface (mais toujours dans le cytoplasme) ni de CD79a, CD79b, CD19 et CD20.

On les mets en évidence grâce à la co-expression de CD38 et CD138.

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