This work has been digitalized and published in 2013 by Verlag Zeitschrift für Naturforschung in cooperation with the Max Planck Society for the Advancement of Science under a Creative Commons Attribution4.0 International License.

Dieses Werk wurde im Jahr 2013 vom Verlag Zeitschrift für Naturforschungin Zusammenarbeit mit der Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung derWissenschaften e.V. digitalisiert und unter folgender Lizenz veröffentlicht:Creative Commons Namensnennung 4.0 Lizenz.

Wasserstoff-Brücke bildet, wobei sich das of fenbar instabile Restradikal dem ESR-Nachweis entzieht. Da von diesem Sauerstoff drei Wasserstoff-Brücken ausgehen, und deren Koordinat ion regulär und eben i s t 1 2 , kann näherungsweise & = 3 0 ° gesetzt werden. Dies ergibt :

Q « 0,47 .

V o n zentraler strahlenbiologischer Bedeutung ist die Frage nach der genetischen Wirksamkeit des Cytosin-Radikals. Nicht nur im Kristall, sondern auch in der Desoxyribonucleinsäure ( D N S ) , w o sich Cytosin mit der Purinbase Guanin paart, sind die Wasserstoff-Brücken an der C = O-Gruppe des Cyto-sins betätigt. Ihre Zerstörung könnte eine Mutation bedingen.

ESR-Dubletts mit einer isotropen Aufspaltung < 2 0 Oe werden außer bei Cytosin noch bei Uridin, Uridyl- und Thymidylsäure 14 sowie bei Desoxyuri -din und Thymin 4 bei tiefen Temperaturen erhalten. Nach den Zusammenstellungen von MORTON9 sind

solche Aufspaltungen für a-ständigen Wasserstoff atypisch, und es ist daher sehr wahrscheinlich, daß auch hier Hydroxy-Radika le vorliegen. Man kann vermuten, daß dieser Radikaltypus eine mutagene W i r k u n g hat und für die Strahlenbiologie an Bedeu-tung gewinnt. In diesem Zusammenhang sei abschlie-ßend auf die ESR-Experimente von V A N D E V O R S T

und V I L L E E 1 5 hingewiesen, aus denen diese Autoren schließen, daß die Spektren bestimmter DNS-Präpa-rate von Cytosin- und Guanin-Radikalen erzeugt werden.

Ich danke Herrn Prof. Dr. K. G. ZIMMER und Herrn Priv.-Doz. Dr. A. MÜLLER für viele Ratschläge und klä-rende Diskussionen.

A n m. b. d. K o r r . : Die zu den Satelliten-Linien in Abb. 2 gehörenden Radikale wurden inzwischen von J. B. C O O K , J. B. ELLIOT und S. J. W Y A R D , Molecular Physics 13, 49 [1967] identifiziert.

14 M. G . O R M E R O D , Int. J. Rad. Biol. 9, 291 [1965]. 15 A. VAN DE V O R S T U. F. V I L L E E , C . R. hebd. Seances Acad.

Sei. 259,928 [1964].

Die Totalsynthese des Pankreas-Hormons Glucagon E . W Ü N S C H

Max-Planck-Institut für Eiweiß- und Lederforschung, Abteilung für Peptiddiemie, München ( Z . Natur f o r s chg . 22 b , 1 2 6 9 — 1 2 7 6 [ 1 9 6 7 ] ; e i n g e g a n g e n am 25 . O k t o b e r 1967 )

Die Synthese eines Nonicosapeptids mit der von B R O M E R und Mitarbb. für das Pankreas-Hormon Glucagon vorgeschlagenen Sequenz-Struktur wird beschrieben. Das auf präparativem Wege erhal-tene Nonicosapeptid [1—29 b] zeigt in biologischen und analytischen Testen weitgehende Identität mit dem natürlichen Peptid-Hormon.

S T A U B und M i t a r b b . 1 gelang 1953 aus Roh-Insu-lin die Isolierung eines Oligopeptids, das für eine Verminderung des hypoglykämischen Insulin-Schocks nach Roh-Insulin-Injektionen verantwortlich w a r ; die Autoren gaben diesem biologisch-aktiven Peptid den Namen Glucagon. 1 9 5 6 führten Untersuchungen von B R O M E R und Mitarbb. 2 zum ersten und bislang einzigen Strukturvorschlag; danach ist das H o r m o n ein homodet -homöomeres Nonicosapeptid der Se-quenz :

H-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr--Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln--Asp-Phe-Val-Gln-Try-Leu-Met-Asn-Thr-OH.

1 A . S T A U B , L . G . SINN U. 0 . K . BEHRENS, Science [Washing-ton 117, 6 2 8 [ 1 9 5 3 ] ; J . biol. Chemistry 214, 6 1 9 [ 1 9 5 5 ] .

2 W . W . B R O M E R , L . G . SINN, A . STAUB U . O . K . B E H R E N S , Amer. Soc. 78, 3 8 5 8 [ 1 9 5 6 ] ; W. W. B R O M E R , A. S T A U B , E . R . D I L L E X , H . L . B I R D , L . G . SINN U . O . K . BEHRENS, 7 9 , 2 7 9 4 [ 1 9 5 7 ] ; W . W . B R O M E R , L . G . SINN U . O . K .

Die Totalsynthese des Glucagons sah zwei Etappen v o r :

A. Darstellung von fünf zur weiteren Verknüpfung entsprechend geschützter Teilsequenzen

1. Teilsequenz 27-29 (V) 3

O-tert.-Butyl-threonin-tert.-butylester-Dibenzolsulf-imidsalz [ 2 9 c - D B S I ] wurde mit Benzyloxycarbonyl -asparagin-4-nitro-phenylester [ 2 8 b ] in Pyridin in Gegenwart von 1 Äquivalent Triäthylamin mit 90-proz. Ausbeute zum Benzyloxycarbonyl-dipeptidester [ 28 — 2 9 a] kondensiert ; fo lgende hydrogenolytische

B E H R E N S , 7 9 , 2 7 9 8 [ 1 9 5 7 ] ; W . W . B R O M E R , A . STAUB, L . G . SINN U . O . K . B E H R E N S , 7 9 , 2 8 0 1 [ 1 9 5 7 ] ; L . G . SINN, O . K . B E H R E N S U. W . W . B R O M E R , 7 9 , 2 8 0 5 [ 1 9 5 7 ] ; W . W . B R O -MER, L . G . SINN U . O . K . BEHRENS, 7 9 , 2 8 0 7 [ 1 9 5 7 ] .

3 E . W Ü N S C H , F . D R E E S U . J . JENTSCH, Chem. Ber. 9 8 , 8 0 3 [ 1 9 6 5 ] .

Entfernung der Aminoschutzgruppe ergab quantita-tiv Asparaginyl-O-tert.-butyl-threonin-tert.-butylester [ 2 8 - 2 9 b ] , der mit ( l -Methyl -2-benzoyl -v inyl ) -me-thionin [27 a] nach dem Alkylkohlensäure-Anhydrid-Verfahren zum geschützten Tripeptid-Derivat [ 2 7 — 29 a ] verknüpft wurde. Dieses ließ sich mit 70-proz . Essigsäure bei 4 0 " unter Abspaltung von Benzoyl-aceton in Methionyl-asparaginyl-O-tert.-butyl-threo-nin-tert.-butylester [ 2 7 — 2 9 b ] ( V ) überführen (s. Schema 1 ) .

2. Teilsequenz 22-26 (IV)*'5

Die Synthese dieser Teilsequenz wurde in stufen-weisem Aufbau vol lzogen: Leucin-tert.-butylester [ 2 6 e ] wurde mit Benzyloxycarbonyl-tryptophan [ 2 5 a ] nach dem S h e e h a n - Verfahren zum Ben-zyloxycarbonyl-dipeptid-ester [ 2 5 — 2 6 e ] verknüpft, der nach hydrogenolytischer Entfernung der Amino -schutzgruppe resultierende Dipeptid-ester [25 — 26 f ] mit Benzyloxycarbonyl-glutamin [ 2 4 c ] nach dem Alkylkohlensäure-Anhydrid-Verfahren zum Benzyl-oxycarbonyl-glutaminyl-tryptophyl-leucin-tert.-butyl-ester [ 2 4 — 2 6 e ] umgesetzt. Die fo lgende Entacylie-rung zum Glutaminyl-tryptophyl-leucin-tert.-butyl-ester [ 2 4 — 26 f ] in methanolischer Lösung mit kata-

tBu

Z-Asn-ONP [28b] H-Thr-OtBu [29c]

| t B u

Z-Asn-Thr-OtBu [ 2 8 - 2 9 a ]

Ho/Pd tBu

i MBV-Met-OH [27a] H-Asn-Thr-OtBu [ 2 8 - 2 9 b ]

ANM

i t B u

MBV-Met-Asn-Thr-OtBu [27 - 2 9 a] AcOH

tBu

H-Met-Asn-Thr-OtBu [ 2 7 - 2 9 b ] (V) Schema 1. Teilsequenz 27 —29 (V).

lytisch-erregtem Wasserstoff gelang ohne Nebenreak-tionen, wenn der während der Hydrierung anfallende Tripeptid-ester sofort durch Titration mittels Chlor-wasserstoff in Methanol (bei PH 5 — 5 ,5 ) als Hydro -chlorid abgefangen wurde. Der Anbau von Valin zum Acyl-tetrapeptid-ester [23 — 26 a] erfolgte mit Hil fe des symmetrischen Anhydrids von Benzyloxy-

Z-Trp-OH [25a] H-Leu-OtBu [26e]

| DCCD

Z-Trp-Leu-OtBu [ 2 5 - 2 6 e ] | Hj /Pd

Z-Gln-OH [24c] H-Trp-Leu-OtBu [ 2 5 - 2 6 f ] 1 !

| ANM

Z-Gln-Trp-Leu-OtBu [ 2 4 - 2 6 e ] Hj/Pd

(Z-Val)20 [23g] H-Gln-Trp-Leu-OtBu [ 2 4 - 2 6 f ] I 1]

I

Z-Val-Gln-Trp-Leu-OtBu [23 - 2 6 a]

BOC-Phe-OSU [22 d] H-Val-Gln-Trp-Leu-OtBu [ 2 3 - 2 6 b ] I

BOC-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-OtBu [22—26 e] j HCl/Eisessig

H-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-OH [22 —26f] | N P S - C l (NaOH)

NPS-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-OH [ 2 2 - 2 6 g ]

Schema 2. Teilsequenz 2 2 - 2 6 (IV). 4 E . WÜNSCH U. F . DREES, Chem. Ber. 99, 110 [1966]. 5 E . WÜNSCH u. F . DREES, Chem. Ber. 1 0 0 , 816 [1967].

carbonyl-val in [ 2 3 g ] ; nach üblicher hydrogenolyti -scher Entfernung der Benzyloxycarbonyl-Schutz-gruppe wurde der freie Tetrapeptid-ester (Valyl-glutaminyl-tryptophyl-leucin-tert.-butylester [ 2 3 bis 2 6 b ] ) mit tert.-Butyloxycarbonyl-phenylalanin-hy-droxysuccinimid-ester [ 2 2 d ] zum tert.-Butyloxy-carbonyl-pentapeptid-tert.-butylester [ 22 — 2 6 e ] um-gesetzt. Nach Protonen-solvolytischer Entfernung der Schutzgruppen (Amino - und Ester-Schutzgruppe) mittels Chlorwasserstoff in Eisessig konnte das in

hoher Ausbeute anfallende freie Pentapeptid [ 2 2 bis 2 6 f ] mit 2-Nitro-phenylsulfenylchlorid bei pn 7 ,5 zum 2-Nitro-phenylsulfenyl-phenylalanyl-valyl-glut-aminyl-tryptophyl-leucin [ 2 2 — 26 g ] ( I V ) acyliert werden (s. Schema 2 ) .

3. Teilsequenz 16-21 (III)6-8

Gestützt auf die Erfahrungen einer Synthese mit der Glucagon-Sequenz 16 — 2 3 konnte ein zur Total-synthese „brauchbares" Teilstück mit der Sequenz

OtBu

Z-Gln-OH [20] H-Asp-OMe [21]

D C C D

; o t ß u T

Z-Gln-Asp-OMe [ 2 0 - 2 1 a] H j / P d

, OtBu T

Z-Ala-OH [19] H-Gln-Äsp-OMe [ 2 0 - 2 1 b]

D C C D

OtBu

Z-Ala-Gln-Asp-OMe [ 1 9 -•21a] H j / P d

HBr OtBu

Z-Arg-OH [18b] H-Ala-Gln-Asp-OMe [19--21c ]

D C C D / H O S U

1 OtBu

1

Z-Arg-Ala-Gln-Asp-OMe [ 1 8 - 2 1 b]

i OtBu I |

Z-Arg-Ala-Gln-Asp-OH [ 1 8 - 2 1 d]

Z2 AcOH OtBu

Z-Arg-ONP [17 d] H-Arg-Ala-Gln-Asp-OH [ 1 8 - 2 1 g] ! I

Z2 OtBu

Z-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-OH [ 1 7 - 2 1 b] H j / P d ( H B r , A c O H )

HBr AcOH OtBu i

NPS-Ser-ONP H-Arg-Arg-Ala-Gln-Äsp-OH [ 1 7 - 2 1 c]

tBu

[16f] I

6 E . W Ü N S C H , Chem. Ber. 98, 7 9 7 [ 1 9 6 5 ] . 7 E . W Ü N S C H U. G . W E N D L B E R G E R , Chem. Ber. 1 0 0 , 8 2 0 [ 1 9 6 7 ]

tBu HBr OtBu

NPS-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-OH [ 1 6 - 2 1 e] (III) Schema 3. Teilsequenz 16 — 21 (III).

8 E . W Ü N S C H U . G . W E N D L B E R G E R , Chem. Ber., im Drude.

16 — 21 wie folgt synthetisiert werden : Ausgehend v o m Asparaginsäure-/?-tert.-butylester-a-methylester [ 2 1 ] , Benzyloxycarbonyl-glutamin [ 2 0 ] und Benzyl-oxycarbonyl-alanin [ 1 9 ] war in bekanntem „stufen-weisen" Anbau-Verfahren Alanyl-glutaminyl-aspara-ginsäure-/?-tert.-butylester-a-methylester [ 1 9 — 21 a ] leicht zugänglich; dieser Tripeptid-ester konnte mit Benzyloxycarbonyl -arginin-hydrobromid [ 1 8 b ] nach dem Carbodiimid-Verfahren zum Benzyloxycarbonyl -tetrapeptid-ester [ 1 8 — 2 1 b ] umgesetzt werden, wo-bei die höchsten Ausbeuten in Gegenwart von min-destens 1 Äquivalent A-Hydroxy -succ in imid erzielt wurden. Alkalische Versei fung führte zum Acyl-tetra-peptid [ 1 8 — 21 d ] , katalytische Hydrogeno lyse des letzteren in Gegenwart von Essigsäure zu Arginyl -(hydroacetat) - alanyl - glutaminyl - asparaginsäure - ß -

tert.-butylester [ 1 8 - 2 1 g ] . Verknüpfung des Tetrapeptids [ 1 8 — 2 1 g ] mit

Na, N<5, Na) - Tr i -benzyloxycarbonyl - arginin - nitro -phenylester [ 1 7 d ] und anschließende hydrogenoly -tische Entfernung der Benzyloxycarbonyl-Schutz-gruppe erbrachte fast quantitativ das freie Penta-peptid [ 1 7 — 2 1 c ] , isoliert als A r g i n y l ( h y d r o b r o -mid) -arginyl (hydroacetat) -alanyl-glutaminyl-aspara-ginsäure-/3-tert.-butylester. Das Pentapeptid ließ sich mit 2-Nitro-phenylsulfenyl-0-tert.-butyl-serin-nitro-phenylester [ 16 f ] zum 2-Nitro-phenylsulfenyl-O-tert. butyl-seryl-arginyl(hydrobromid)-arginyl-alanyl-glut-aminyl-asparaginsäure-/?-tert.-butylester [ 1 6 — 21 c ] ( I I I ) verknüpfen (s. Schema 3 ) .

4. Teilsequenz 7-15 (II)9'10

In stufenweisem Anbau-Verfahren wurde aus Asparaginsäure-/?-tert.-butylester-a-methylester[15 b ] , Benzyloxycarbonyl- leucin [ 1 4 b ] , Benzyloxycarbo-nyl-O-tert.-butyl-tyrosin [ 1 3 b ] , Not-Benzyloxycarbo-nyl-Nf-tert.-butyloxycarbonyl-lysin [ 1 2 b ] , Benzyl-oxycarbonyl-O-tert.-butyl-serin [ I I a ] und erneut Benzyloxycarbonyl-O-tert.-butyl-tyrosin [ 1 0 ] — aus-schließlich nach dem Carbodi imid-Verfahren — das allseits geschützte Hexapeptid-Derivat [ 1 0 — 1 5 c ] aufgebaut; dessen alkalische Versei fung und fol-gende hydrogenolytische Entfernung der Benzyloxy-carbonyl-Schutzgruppe führte schließlich zum O-tert.-Butyl-tyrosyl-O-tert.-butyl-seryl-Ne-tert.-butyloxycar-bonyl - lysyl-O- tert.- butyl - tyrosyl - leucyl - asparagin-säure-/?-tert.-butylester [ 1 0 — 15 e ] .

9 E. W Ü N S C H , A. Z W I C K U. G. W E N D L B E R G E R , Chem. Ber. 1 0 0 ,

173 [1967]. 1 0 E . W Ü N S C H , A . ZWICK U. A . FONTANA, Chem. Ber., im Druck.

Dieses freie Hexapeptid ließ sich durch stufenwei-sen Anbau von Benzyloxycarbonyl-asparaginsäure-/9-tert.-butylester-a-hydroxysuccinimidester [ 9 b ] , Benzyloxycarbonyl-O-tert. -butyl-serin-hydroxysuccin-imidester [8 f ] und 2-Nitro-phenylsulfenyl-O-tert.-butyl-threonin-hydroxysuccinimidester [ 7 g ] zum 2-Nitrophenyl-O-tert.-butyl-threonyl-0-tert.-butyl-seryl-asparagyl (ß- tert.-butylester) - 0 - tert.-butyl-tyrosyl-O-tert.- butyl - seryl - Ne - tert.- butyloxycarbonyl - lysyl -O-tert.- butyl-tyrosyl - leucyl -asparingsäure-jö-tert.- butyl-ester [ 7 — 1 5 b ] ( I I ) aufstocken (s. Schema 4 ) .

5. Teilsequenz 1—6 (1) l i

In üblichem stufenweisen Anbau von Benzyloxy-carbonyl-glutamin [ 3 ] bzw. Benzyloxycarbonyl -O-tert.-butyl-serin [ 2 a ] an Glycin-methylester [ 4 c ] wurde Benzyloxycarbonyl-O-tert.-butyl-seryl-glutami-nyl-glycin-methylester [2 — 4 d ] erhalten. Das nach alkalischer Versei fung aus [2 — 4 d ] zugängliche A -Acyl-tripeptid [2 — 4 e ] ließ sich nach dem Carbo-d i imid-Hydroxysucc in imid-Ver fahren 4 ' 1 3 mit O-tert.--Butyl-threonyl-phenylalanin-methylester [ 5 — 6 h ] — durch Verknüpfung von Benzyloxycarbonyl -O-tert.-butyl-threonin [5 c ] und Phenylalanin-methyl-ester [ 6 f ] und anschließende hydrogenolytische Ent-acyl ierung des erhaltenen Dipeptid-Derivats [ 5 bis 6 g ] zugänglich — in hoher Ausbeute zum Benzyl-oxycarbonyl -O- tert.- butyl-seryl-glutaminyl-glycyl-O-tert.-butyl-threonyl-phenylalanin-methylester [ 2 bis 6 a ] umsetzen; dessen schonende alkalische Ester-hydro lyse und anschließende Behandlung mit kata-lytisch-angeregtem Wasserstoff führte zum freien Pentapeptid O-tert.-Butyl-seryl-glutaminyl-glycyl-O-tert.-butyl-threonyl-phenylalanin [2 — 6 c ] .

Da der peptidsynthetische Einsatz von K o p f k o m p o -nenten mit A(im)-ungeschützten Histidin-Resten in der Sequenz generell Schwierigkeiten bereitet, wurde für den Anbau des aminoendständigen Histidins an das Pentapeptid [2 — 6 c ] A a , A ( i m ) -Di-adamantyloxy-carbonyl-histidin [1 d ] 12 als di-blockiertes Histidin-Derivat gewählt. Die Synthese verlief mit Hi l fe des Hydroxysuccinimidester-Verfahrens erfo lgreich; Na,N ( im) -Di-adamantyloxycarbonyl-histidyl-O-tert.-butyl-seryl-glutaminyl - glycyl -O- tert.- butyl - threonyl-phenylalanin [1 — 6 a ] (I) konnte in 80-proz. Aus-beute gewonnen werden (s. Schema 5 ) .

1 1 E . W Ü N S C H , A . Z W I C K U. E . JAEGER, Chem. Ber., im Druck. 1 2 W . L . H A A S , E . V . KRUMKALNS U. K . G E R Z O N , Amer. Soc. 8 8 ,

1988 [1966].

OtBu tBu tBuBOCtBu OtBu

Z-Leu-OH [14b] H-Asp-OMe [15b] ! I

I DCCD OtBu I

Z-Leu-Äsp-OMe [ 1 4 - 1 5 a ] II2/Pd

| OtBu

Z-Tyr-OH [13 b] H-Leu-Asp-OMe [ 1 4 - 1 5 b ]

tBu

DCCD (IIOSU) tBu j OtBu I 1 I

Z-Tyr-Leu-Asp-OMe [13—15f] II8/Pd

BOC tBu ^ OtBu

Z-Lys-OH [12b] H-Tyr-Leu-Asp-OMe [ 1 3 - 1 5 g ] 1 DCCD

BOG tBu | OtBu I I 1 I

Z-Lys-Tyr-Leu-Asp-OMe [ 1 2 - 1 5 c ] Ilj/Pd

OtBu tBu BOC tBu I I I

Z-Ser-OH [ I I a ] H-Lys-Tyr-Leu-Asp-OMe [12—15d]

DCCD

tBu

tBu BOC tBu OtBu

Z-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-OMe [11 — 15 c] | II,/Pd

Z-Tyr-OH [10] H-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-OMe [11 -15(1 ]

DCCD

tBu tBuBOCtBu OtBu

Z-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-OMe [10—15 c] NaOII

tBu tBuBOCtBu OtBu

tBuBOCtBu OtBu I I I I I

Z-Tyr-OH [10] H-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-OMe [ l l - 1 5 d ]

Z-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-OH [ 1 0 - 15d] II./Pd

OtBu I

tBu tBuBOCtBu OtBu

Z-Asp-OSU [9b] H-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-OH [ 1 0 - 1 5 e ]

OtButButBuBOCtBu OtBu

Z-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-OH [ 9 - 15b] | I I l / P J

tBu OtButButBuBOCtBu OtBu

Z-Ser-OSU [ 8 f ] H-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-OH [ 9 - 1 5 c ]

I tBuOtButButBuBOCtBu OtBu

tBu

Z-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-OH [ 8 - 15a] j Hj/Pd

tBuOtButButBuBOCtBu OtBu

NPS-Thr-OSU [7g] H-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-OH [ 8 - 15c] L I

i tBu tBuOtButButBuBOCtBu OtBu

NPS-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-OH [7—15b]

Schema 4. Teilsequenz 7 —15 (II). ts3 Co

Z-Gln-OH [3] H-Gly-OMe [4 c] A N M

tBu

Z-Gln-Gly-OMe [ 3 - 4 c ] H . / P d

tBu I

Z-Ser-OH [2c] H-Gln-Gly-OMe [ 3 - 4 d ] Z-Thr-OH [5c] H-Phe-OMe [6f ]

A N M Y tBu

Z-Ser-Gln-Gly-OMe [ 2 - 4 d ] | N a O I I

tBu

Z-Ser-Gln-Gly-OH [ 2 - 4 e ]

I I

tBu

Z-Thr-Phe-OMe [5—6g]

I tBu

H-Thr-Phe-OMe [ 5 - 6 h ]

tBu D C C D / H O S U

tBu

Z-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-OMe [ 2 - 6 a ] N a O H

AdOC tBu tBu

AdOC-His-OH [ l d ] Z-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-OH [ 2 - 6 b ] | D C C D / H O S U | H s / P d

AdOC tBu tBu

AdOC-His-OSU [ l e ] H-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-OH [ 2 - 6 c]

I AdOC tBu tBu

AdOC-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-OH [ l - 6 a ] Schema 5. Teilsequenz 1— 6 (I).

B. Vereinigung vorstehend genannter fünf Teil-sequenzen I —V nach dem Carhodiimid-Hydroxy-

succinimid- Verfahren 4'13 zur Gesamtsequenz 1—29 (s. Schema 6)

2-Nitro-phenylsulfenyl-phenylalanyl-valyl-glutami-nyl-tryptophyl-leucin [ 2 2 - 2 6 g ] ( I V ) und Methio-nyl-asparaginyl-O-tert.-butyl-threonin-tert.-butylester [ 2 7 - 2 9 b ] ( V ) ließen sich mit 87-proz . Ausbeute zum 2-Nitro-phenylsulfenyl-octapeptid-ester [ 2 2 bis 29 b ] verknüpfen. Anschließende Desulfenylierung mittels Chlorwasserstoff in Dioxan /Dimethy l form-amid unter Zusatz von 2 0 Äquivalenten I n d o l 1 4 er-gab Phenylalanyl-valyl-glutaminyl-tryptophyl-leucyl-methionyl-asparaginyl-O-tert.- butyl-threonin-tert.- bu-tvlester-hydrochlorid [ 2 2 — 29 c - H C l ] , woraus mit-

tels Natr iumhydrogencarbonat in wäßrigem Dime-thyl formamid schließlich der freie Octapeptid-ester [ 2 2 - 2 9 c ] resultierte ( 7 8 % ) 5 .

Die Kondensation des Octapeptid-ester-hydrobro-mids [ 2 2 — 29 c -HBr ] — hergestellt aus dem freien Octapeptid-ester [ 2 2 — 2 9 c ] in Dimethyl formamid durch Titration mit der berechneten Menge 0,1-/7. Bromwasserstoffsäure — mit 2-Nitro-phenylsulfenyl-O-tert.-butyl-seryl-arginyl (hydrobromid)-arginyl-ala-nyl-glutaminyl-asparaginsäure-jö-tert.-butyl-ester [ 1 6 bis 21 c ] ( I I I ) zum 2-Nitro-phenylsulfenyl-tetra-decapeptid-ester [ 1 6 — 2 9 b ] gelang zu 7 0 Prozent, dessen Entacylierung in Dimethylformamid/Metha-nol mittels 0,1-n. methanolischer Bromwasserstoff-säure in Gegenwart von 2 0 Äquivalenten 2-Methyl-indol 1 4 : O-tert.-Butyl-seryl-arginyl ( h y d r o b r o m i d ) -

1 3 F . W E Y G A N D , D . HOFFMANN u. E. W Ü N S C H , Z . Naturforschg. 21b. 426 [1966].

14 E. W Ü N S C H , A . FONTANA U. F . D R E E S , Z. Naturforschg. 22 b, 607 [1967].

NPS- 2 2 - 2 6 1 - O H [ 2 2 - 2 6 g ] H- 2 7 - 2 9 -OtBu [ 2 7 - 2 9 b ]

(IV) (V)

| 2 2 - 2 9 -OtBu [22 - 2 9 b]

1

122 -29 -OtBu [22 - 2 9 c]

(III) 1

NPS- 1 6 - 2 9

1 NPS- 7 - 1 5 -OH [7 — 15b] H- 1 6 - 2 9 |

(II) I

NPS- 7 - 2 9 -OtBu [7—29a]

I AdOC- 1 - 6 OH [1 —6a] H- 7 - 2 9 -OtBu [ 7 - 2 9 b ]

(I)

AdOC-TFE

1 - 2 9 1 - O t B u [ l - 2 9 a ] l. Dowex-4 (OH-Form) ,-Roh-Glucagon" [ 1 - 2 9 b ] 2. C H j CO J H

Sdiema 6. Gesamtsequenz 1—29.

arginyl (hydrobromid ) - alanyl - glutaminyl-asparagyl-( ß - tert. - butylester) - phenylalanyl - valyl - glutaminyl -

tryptophyl - leucyl - methionyl - asparaginyl -O-tert.- bu-tyl-threonin-tert.-butylester-hydrobromid [ 16 — 2 9 c-H B r ] konnte rein als Trihydrat in 90-proz . Ausbeute isoliert werden 8 .

Der Anbau der Teilsequenz II (2-Nitro-phenylsul-fenyl-O-tert.-butyl-threonyl-O-tert.-butyl-seryl-aspara-gyl (/?-tert.-butylester)-0-tert.-butyl-tyrosyl-0-tert,-bu-tyl-seryl-Ae-tert.-butyloxycarbonyl-lysyl-O-tert.-butyl-tyrosyl-leucyl-asparaginsäure-/?-tert.-butylester [ 7 bis 1 5 b ] ) an den freien Tetradecapeptid-ester [ 1 6 bis 2 9 c ] , aus [ 1 6 — 29 c -HBr] mit 1 Äquivalent Tri-äthylamin in Freiheit gesetzt, ließ sich in Dimethyl-acetamid mit gutem Ergebnis ( 6 8 % ) vollziehen. Die Entfernung der Aminoschutzgruppe von dem so erhaltenen 2-Nitro-phenylsulfenyl-tricosapeptid-ester [ 7 — 2 9 a ] mittels sehr verdünnter methanolischer Bromwasserstoffsäure unter Zusatz großer Mengen 2 -Methyl indo l 1 4 ( 100 Äquivalente) verlief ohne K o m -plikationen : O-tert.-Butyl-threonyl-O-tert.-butyl-seryl-asparagyl (ß- tert.-butylester) -O-tert.-butyl -tyrosyl-O-tert.- butyl - seryl - Ne - tert.- butyloxycarbonyl - lysyl - 0 -tert.-butyl-tyrosyl-leucyl-asparagyl(/?-tert.-butylester)-O - tert.- butyl - seryl - arginyl (hydrobromid ) - arginyl -

( h y d r o b r o m i d ) - alanyl - glutaminyl-asparagyl (/?-tert.-butylester) -phenylalanyl-valyl-glutaminyl-tryptophyl-leucyl - methionyl - asparaginyl-O-tert.- butyl -threonin-tert.-butylester-hydrobromid [7 — 29 b -HBr ] fiel als Dihydrat in 88-proz . Ausbeute rein an 8 .

Letztlich gelang die Verknüpfung des Tricosapep-tid-esterhydrobromids [7 - 29 b -HBr] mit A a , A ( i m ) -Di-adamantyloxycarbonyl-histidyl-O-tert.-butyl-seryl-glutaminyl-glycyl-O-tert.-butyl-threonyl-phenylalanin [ 1 — 6 a ] ( I ) in Dimethylacetamid/Phosphorsäure-tris-dimethylamid unter Zusatz von 1 Äquivalent Triäthylamin zu 84 Prozent, wenn die K o p f k o m p o -nente in vierfachem Überschuß eingesetzt wurde : das allseits geschützte Nonicosapeptid [1 — 2 9 a ] konnte in F o r m eines Hexahydrats in hoher Reinheit als weißes amorphes Pulver isoliert werden 15 .

Aminosäure-Analyse

Ausgewertet a) ohne, b) mit Hilfe einer künstlichen Testmischung, die den analogen Hydrolyse- und Auf-arbeitungs-Bedingungen unterworfen wurde; Ber. (Gef. a/b) :

His 1 (0,90/0,98) ; Ser 4 (3,57/3,95) ; Glu 3 (3,0/3,06) ; Gly 1 (1,04/1,04) ; Thr 3 (2,84/2,89) ;

15 E. WÜNSCH u. G . WENDLBERGER, Chem. Ber., im Drude.

Phe 2 ( 2 , 0 1 / 2 , 0 5 ) ; A s p 4 ( 3 , 9 9 / 4 , 0 6 ) ; Tyr 2 ( 1 , 8 4 / 1 , 8 7 ) ; Lys 1 ( 0 , 9 5 / 1 , 0 2 ) ; Leu 2 ( 1 ,97 / 2 , 0 0 ) ; A r g 2 ( 1 , 8 7 / 1 , 9 1 ) ; A la 1 ( 1 , 0 / 1 , 0 1 ) ; Va l 1 ( 1 , 0 3 / 1 , 0 4 ) ; Trp 1 ( - / - ) ; Met 1 ( 0 , 9 7 / 1 , 0 ) ; N H 3 4 (4 ,03 /4 ,03 )

für C 23 2H 3 6 8N430 5 5Br 2S + 6 H 2 0 ( 4 9 3 8 , 8 2 6 ) ; C 56 ,42 (56 ,01 ) ; H 7,74 (7 ,49) ; N 12,20 (12 ,31 ) ; 0 19 ,76 ( 1 9 , 6 1 ) .

A b s p a l t u n g der Schutzgruppen a m al lseits -gesdiütz-ten N o n i c o s a p e p t i d [ 1 — 2 9 a ] mittels w a s s e r f r e i e r Tr i f luoress igsäure (2 Stdn . unter A r g o n - A t m o s p h ä r e ) , B e h a n d e l n des Dest i l la t ions -Rückstands m i t e iner w ä ß r i g e n A u f s c h l ä m m u n g v o n D o w e x - 4 ( O H - F o r m ) , A n s ä u e r n mit Ess igsäure u n d f o l g e n d e Ge f r i e r t ro ck -n u n g des Filtrats erbrachte e in w e i ß e s a m o r p h e s Pu l -ver 1 5 ( A u s b e u t e fast quantitat iv unter E inka lku la -t i on e ines d e m natürl ichen H o r m o n a n a l o g e n W a s s e r -g e h a l t e s ) . D a s so erhaltene „ R o h - G l u c a g o n " [ 1 b i s 2 9 b ] , das sich i m c h r o m a t o g r a p h i s c h e n u n d e lektro -phore t i s chen Vergle ichstest in h o h e m Prozentsatz mi t d e m natürl ichen H o r m o n identisch e rwies , ze igte i m b i o l o g i s c h e n Test ( B e s t i m m u n g d e r Blutzucker -Steigerung a m H u n d i m Verg l e i ch mi t kristal l is ier-tem natür l i chem G l u c a g o n aus R i n d e r p a n k r e a s nach

H . - H . S c h ö n e ) e ine ca . 5 0 - p r o z . b i o l o g i s c h e A k -tivität.

Ü b e r d i e zur Ze i t l a u f e n d e n R e i n i g u n g s - O p e r a t i o -nen a m „ R o h - G l u c a g o n " w i r d in K ü r z e n o c h be -richtet.

Das gesamte Forschungsvorhaben wurde von den Farbwerken Hoechst A G . mit großem finanziellen und materiellen A u f w a n d ge fördert ; der Firma, insbeson-dere den Herren Pro f . Dr. G. EHRHART, Pro f . Dr . W . SCHULTHEIS und Pro f . Dr. W . SIEDEL gebührt hierfür mein allerhöchster Dank. Herrn Pro f . Dr. F . WEYGAND, T H München, danke ich für stete Förderung und wert-volle Mithi l fe , der Deutschen Forschungsgemeinschaft für eine hohe Sachbeihilfe.

Meinem gesamten Mitarbeiterstab, den wissenschaft-lichen Mitarbeitern Dr. F. DREES, Dr. E. JAEGER, Dr. G. WENDLBERGER, Dr. A . ZWICK, Frau Dipl . -Chem. M . DEFFNER u n d D r . A . FONTANA ( a l s G a s t ) , d e n t e c h n i -schen Assistenten Frau B. KALIX-BOUSCHKA, O. KRAUS, J . MUSIOL, F r a u B . RÖHRLE-SCHERER, F r l . R . SCHARF, H . STOCKER und Frau U. STROBEL-GRUBER sowie der Beleg-schaft des mikroanalytischen Laboratoriums der Abtei -lung (Leitung W . BECK) , habe ich für die unermüdliche und aufopferungsvol le Mitarbeit, den Herren Dr. H. -H. SCHÖNE und Dr. W . PFAFF (beide Farbwerke Hoechst A G . ) für die Aus führung der biologischen Teste zu danken.