Biosenzor za glukozu s heksacianoferatnim katalitičkim slojem
• Glukoza + GOD (FAD) glukolakton + GOD (FADH2)• O2 + GOD(FADH2) H2O2 + GOD(FAD)
• H2O2+ 2 Fe(CN)64- + 2H+→2H2O + 2Fe(CN)6
3-
• 2Fe(CN)63 -+ e-→2 Fe(CN)6
4-
E LE K T R O D A E N Z IM S K I S LO J O T O P IN A
-+ 2 e
H 2 O 2
O2H
g lu k o z a + G O D (F A D ) g lu k o la k to n + G O D (F AD H 2 )
2O6F e (C N )4 -
(+ 2 )
(+ 3 )3 -F e (C N )6
g lu k o z a o to p in ag lu k o z a
Shematski prikaz rada enzimskog biosenzora
redM
Mox
e -
redA
Aox
e lectrode
ENZIMSKA KINETIKA
• Michaelis-Menten: enzimska reakcija nastaje reakcijom enzima i supstrata: nastajanje enzimsko-supstratnog kompleksa
• Osnovne pretpostavke Michaelis-Mentenove kinetike :• 1. Reakcija je prvog reda ukoliko su koncentracije
supstrata relativno niske• 2. Ukoliko koncentracija supstrata kontinuirano raste, red
reakcije za supstrat postupno pada od 1 do 0• 3. Brzina reakcije je proporcionalna ukupnoj koncentraciji
enzima
• Michaelis-Menten: enzimska reakcija nastaje reakcijom enzima i supstrata: nastajanje enzimsko-supstratnog kompleksa
• Enzimsko-supstratni kompleks se razlaže na produkt P i oslobađase enzim
E + S ES
k1
k2
(1)
k4
ES E + Pk3
(2)
• Maksimalna brzina enzimske reakcije je postignuta kada je enzim zasićen supstratom :karakteristična veličina za svaki enzim i njegov supstrat
• Km vrijednost - odnos konstanti brzina nastajanja i razlaganjeENZIM-SUPSTRATNOG kompleksa
• Km =
• eksperimentalno je nemoguće utvrditi nastajanje E-S kompleksa od slobodnog enzima i produkta reakcije P- doprinos k4 ( jako mala)može se zanemariti
4132
kkkk
++
Km =1
32k
kk +
• Vrijednost Km se određuje eksperimentalno: mjerenje brzine nastajanja produkata kao funkcije poznatih koncentracija supstrata.
• Brzina nastajanja ES kompleksa proporcionalana je koncentraciji slobodnog enzima(·[E] - [ES]) i koncentraciji supstrata prema izrazu 1.
• a prema izrazu 2
• - = k2 ([ES] + k3[ES] - oznaćava smanjenje
koncentracije ES kompleksa
v = = k1 ( [E]- [ES]) ·[S]dtESd )(
dtESd )(
U ravnoteži se izjednačuju brzine nastajanja i nestajanja ESkompleksa
• Za ravnotežnu koncentraciju ES kompleksa dobivamo izraz:
k1 ( [E]- [ES]) ·[S] = k2 ([ES] + k3[ES]
( [E]- [ES]) ·[S]) / [ES] = = Km132
kkk +
[ES]=[S] Km
.[S] [E]+
Brzina koja se eksperimentalno mjeri je brzina nastajanja produkta P i iznosi
• Uvrštavanjem u prethodnu jednadžbu dobiva seizraz:
v = k3·[ES]
v = k3[S]
[E].[S]+Km
Maksimalna brzina je proporcionalana prisutnoj koncentraciji enzima:
• V max = k3 ·[E]• i zamjenom u prethodnom izrazu k3 s• V max / [E] dobiva se•
• v = : Michaelis – Mentonova jednadžba[S][ES]max+Km
V
Ovisnost brzine enzimske reakcije o koncentraciji supstrata
•• U trenutku kada je brzina enzimske reakcije jednaka polovici
maksimalne brzine kemijske rekcije, koncentracija nastalog kompleksa ES i regeneriranog enzima E su jednake, te se izrazmože prikazati:
• c (S)polovica maksimalne brzine = Km
• Konstanta Km -Michaelis-ova konstanta• 10-2 i 10-6 mol/L. • Visoke vrijednosti Michaelis-ove konstante ukazuju na visoke
koncentracije supstrata potrebnih za postizanje poluzasićenja(SLABA SELEKTIVNOST ENZIMA PREMA SUPSTRATU).
• ako se na grafičkom prikazu nađe ona koncentracija supstrata kod koje je postignuta½ maksimalne brzine (V max)
v = Vmax/ 2 = [S][ES]max+Km
V
·[S]Km[S]+½ =
dobiva se:
Km= [S]
Lineweaver-Burkova transformirana jednadžba
• Recipročna vrijednost Michael-Mentonova izraza
vvcvK 11
)S(1*
maxmax
m =+
Wilson i Shu predložili su metodu za određivanje Michaelisove konstante enzimski kataliziranih reakcija
• - Is ravnotežna vrijednost struje• - c[S] je pripadajuća vrijednost koncentracije supstrata• - Imax je maksimalna vrijednost struje koja se može
izmjeriti biosenzorom.
• 1/v = f(1/c[S]) je linearan. • - odsječak na ordinati odgovara vrijednosti 1/Imax
• - odsječak na apscisi odgovara vrijednosti -1/Km.
smax
m
max
1*)S(
11II
KcI
=+
Amperometrijski enzimski senzori
• -produkt enzimske reakcije se reducira ili oksidira na površini elektrode
• O + ne-→R• - struja je proporcionalna koncentraciji
oksidiranog ili reduciranog oblika• - određena je Faradayevim zakonom:
I = z F d nd t
* *
• -D difuzijski koeficijent• - je gradijent promjene količine tvari.• Povezivanjem Fickovog i Faradayevog zakona
dolazi se do izraza za struju :
dndt
D A dndl
= * *
I z F ADl
c= * * * *
• - A -površina elektrode• - debljina difuzijskog sloja.• SVE OVO VRIJEDI ZA PROCESE KOJI SU
KONTROLIRANI DIFUZIJOM (MJEŠANJE ELEKTROLITA I NASTRUJAVANJE ELEKTROAKTIVNE TVARI NA PLANARNOJ POVRŠINI)
• I – granična difuzijska struja (zbroj katodne i anodne struje)
Potencijal brze elektrokemijske reakcije može se prikazati Nernstovom jednadžbom:
E = E0 + frCrfoCo
ZFRT
**ln
ako se koncentracija oksidiranog i reduciranog oblika redoks para izračuna iz izraza za graničnu difuzijsku struju E dobiva oblik:
E = E0 +frDofoDr
ZFRT
IIlo
zFRT
**lnln +−
• za slučaj Dr = Do i fo = fr dobiva se
• E = E0 + IIlo
zFRT −ln
kada je I = Io/2 tada je E = E ½ tj poluvalni potencijal = standardnom potencijalu.
NERAVNOTEŽNI UVJETI
• - NEMA MJEŠANJA OTOPINE
• - DIFUZIJSKI SLOJ SE VREMENOM POMIČE UNUTAR OTOPINE (RASTE TIJEKOM ELEKTROKEMIJSKE REAKCIJE)
• ZBIVANJA SE ODVIJAJU NA PLANARNOJ POVRŠINI ELEKTRODE
DIFUZIJA ELEKTROAKRIVNE TVARI SE OPISUJE DRUGIM FICKOVIM ZAKONOM
• DIFERENCIJALNA JEDNADŽBA - IMA VIŠE RJEŠENJA OVISNO O GRANIČNIM UVJETIMA
IZRAZ ZA IZRAČUNAVANJE KONCENTRACIJE OVISI O PARAMETRU x i t
• Uvrštavanjem u izraz za struju dobiva se:
Cottrell-ova jednadžba
Ponašanje biosenzora
Za enzimske biosenzore kod kojih je enzimska reakcija najsporiji proces Lineweaver-Burkov prikaz je linearan, i tada je odziv senzora kontroliran enzimskom reakcijom:
)S()S(*
m
max
cKcvv
dtdn
+==
odziv biosenzora tada je
)S()S(*
m
max
cKcII
+=
• Utjecaj difuzije na odziv biosenzora.• (a), predstavlja konvencionalnu Michaelis Mentenovu hiperbolu
tj. situaciju kada je senzor pod kinetičkom kontrolom• (b), odziv senzora je pod utjecajem difuzije iz vanjske membrane.
Linearno područje se proširuje (približno 4 x KM) premda je struja odziva niža
• (c), odziv biosenzora je pod totalnom difuzijskom kontrolom.Linearno područje je prošireno na približno 9 x KM.
THE END