Biosenzor za glukozu s heksacianoferatnim katalitičkim slojem

• Glukoza + GOD (FAD) glukolakton + GOD (FADH2)• O2 + GOD(FADH2) H2O2 + GOD(FAD)

• H2O2+ 2 Fe(CN)64- + 2H+→2H2O + 2Fe(CN)6

3-

• 2Fe(CN)63 -+ e-→2 Fe(CN)6

4-

E LE K T R O D A E N Z IM S K I S LO J O T O P IN A

-+ 2 e

H 2 O 2

O2H

g lu k o z a + G O D (F A D ) g lu k o la k to n + G O D (F AD H 2 )

2O6F e (C N )4 -

(+ 2 )

(+ 3 )3 -F e (C N )6

g lu k o z a o to p in ag lu k o z a

Shematski prikaz rada enzimskog biosenzora

redM

Mox

e -

redA

Aox

e lectrode

ENZIMSKA KINETIKA

• Michaelis-Menten: enzimska reakcija nastaje reakcijom enzima i supstrata: nastajanje enzimsko-supstratnog kompleksa

• Osnovne pretpostavke Michaelis-Mentenove kinetike :• 1. Reakcija je prvog reda ukoliko su koncentracije

supstrata relativno niske• 2. Ukoliko koncentracija supstrata kontinuirano raste, red

reakcije za supstrat postupno pada od 1 do 0• 3. Brzina reakcije je proporcionalna ukupnoj koncentraciji

enzima

• Michaelis-Menten: enzimska reakcija nastaje reakcijom enzima i supstrata: nastajanje enzimsko-supstratnog kompleksa

• Enzimsko-supstratni kompleks se razlaže na produkt P i oslobađase enzim

E + S ES

k1

k2

(1)

k4

ES E + Pk3

(2)

• Maksimalna brzina enzimske reakcije je postignuta kada je enzim zasićen supstratom :karakteristična veličina za svaki enzim i njegov supstrat

• Km vrijednost - odnos konstanti brzina nastajanja i razlaganjeENZIM-SUPSTRATNOG kompleksa

• Km =

• eksperimentalno je nemoguće utvrditi nastajanje E-S kompleksa od slobodnog enzima i produkta reakcije P- doprinos k4 ( jako mala)može se zanemariti

4132

kkkk

++

Km =1

32k

kk +

• Vrijednost Km se određuje eksperimentalno: mjerenje brzine nastajanja produkata kao funkcije poznatih koncentracija supstrata.

• Brzina nastajanja ES kompleksa proporcionalana je koncentraciji slobodnog enzima(·[E] - [ES]) i koncentraciji supstrata prema izrazu 1.

• a prema izrazu 2

• - = k2 ([ES] + k3[ES] - oznaćava smanjenje

koncentracije ES kompleksa

v = = k1 ( [E]- [ES]) ·[S]dtESd )(

dtESd )(

U ravnoteži se izjednačuju brzine nastajanja i nestajanja ESkompleksa

• Za ravnotežnu koncentraciju ES kompleksa dobivamo izraz:

k1 ( [E]- [ES]) ·[S] = k2 ([ES] + k3[ES]

( [E]- [ES]) ·[S]) / [ES] = = Km132

kkk +

[ES]=[S] Km

.[S] [E]+

Brzina koja se eksperimentalno mjeri je brzina nastajanja produkta P i iznosi

• Uvrštavanjem u prethodnu jednadžbu dobiva seizraz:

v = k3·[ES]

v = k3[S]

[E].[S]+Km

Maksimalna brzina je proporcionalana prisutnoj koncentraciji enzima:

• V max = k3 ·[E]• i zamjenom u prethodnom izrazu k3 s• V max / [E] dobiva se•

• v = : Michaelis – Mentonova jednadžba[S][ES]max+Km

V

Ovisnost brzine enzimske reakcije o koncentraciji supstrata

•• U trenutku kada je brzina enzimske reakcije jednaka polovici

maksimalne brzine kemijske rekcije, koncentracija nastalog kompleksa ES i regeneriranog enzima E su jednake, te se izrazmože prikazati:

• c (S)polovica maksimalne brzine = Km

• Konstanta Km -Michaelis-ova konstanta• 10-2 i 10-6 mol/L. • Visoke vrijednosti Michaelis-ove konstante ukazuju na visoke

koncentracije supstrata potrebnih za postizanje poluzasićenja(SLABA SELEKTIVNOST ENZIMA PREMA SUPSTRATU).

• ako se na grafičkom prikazu nađe ona koncentracija supstrata kod koje je postignuta½ maksimalne brzine (V max)

v = Vmax/ 2 = [S][ES]max+Km

V

·[S]Km[S]+½ =

dobiva se:

Km= [S]

Lineweaver-Burkova transformirana jednadžba

• Recipročna vrijednost Michael-Mentonova izraza

vvcvK 11

)S(1*

maxmax

m =+

Wilson i Shu predložili su metodu za određivanje Michaelisove konstante enzimski kataliziranih reakcija

• - Is ravnotežna vrijednost struje• - c[S] je pripadajuća vrijednost koncentracije supstrata• - Imax je maksimalna vrijednost struje koja se može

izmjeriti biosenzorom.

• 1/v = f(1/c[S]) je linearan. • - odsječak na ordinati odgovara vrijednosti 1/Imax

• - odsječak na apscisi odgovara vrijednosti -1/Km.

smax

m

max

1*)S(

11II

KcI

=+

Amperometrijski enzimski senzori

• -produkt enzimske reakcije se reducira ili oksidira na površini elektrode

• O + ne-→R• - struja je proporcionalna koncentraciji

oksidiranog ili reduciranog oblika• - određena je Faradayevim zakonom:

I = z F d nd t

* *

• -D difuzijski koeficijent• - je gradijent promjene količine tvari.• Povezivanjem Fickovog i Faradayevog zakona

dolazi se do izraza za struju :

dndt

D A dndl

= * *

I z F ADl

c= * * * *

• - A -površina elektrode• - debljina difuzijskog sloja.• SVE OVO VRIJEDI ZA PROCESE KOJI SU

KONTROLIRANI DIFUZIJOM (MJEŠANJE ELEKTROLITA I NASTRUJAVANJE ELEKTROAKTIVNE TVARI NA PLANARNOJ POVRŠINI)

• I – granična difuzijska struja (zbroj katodne i anodne struje)

Potencijal brze elektrokemijske reakcije može se prikazati Nernstovom jednadžbom:

E = E0 + frCrfoCo

ZFRT

**ln

ako se koncentracija oksidiranog i reduciranog oblika redoks para izračuna iz izraza za graničnu difuzijsku struju E dobiva oblik:

E = E0 +frDofoDr

ZFRT

IIlo

zFRT

**lnln +−

• za slučaj Dr = Do i fo = fr dobiva se

• E = E0 + IIlo

zFRT −ln

kada je I = Io/2 tada je E = E ½ tj poluvalni potencijal = standardnom potencijalu.

NERAVNOTEŽNI UVJETI

• - NEMA MJEŠANJA OTOPINE

• - DIFUZIJSKI SLOJ SE VREMENOM POMIČE UNUTAR OTOPINE (RASTE TIJEKOM ELEKTROKEMIJSKE REAKCIJE)

• ZBIVANJA SE ODVIJAJU NA PLANARNOJ POVRŠINI ELEKTRODE

DIFUZIJA ELEKTROAKRIVNE TVARI SE OPISUJE DRUGIM FICKOVIM ZAKONOM

• DIFERENCIJALNA JEDNADŽBA - IMA VIŠE RJEŠENJA OVISNO O GRANIČNIM UVJETIMA

IZRAZ ZA IZRAČUNAVANJE KONCENTRACIJE OVISI O PARAMETRU x i t

• Uvrštavanjem u izraz za struju dobiva se:

Cottrell-ova jednadžba

Ponašanje biosenzora

Za enzimske biosenzore kod kojih je enzimska reakcija najsporiji proces Lineweaver-Burkov prikaz je linearan, i tada je odziv senzora kontroliran enzimskom reakcijom:

)S()S(*

m

max

cKcvv

dtdn

+==

odziv biosenzora tada je

)S()S(*

m

max

cKcII

+=

• Utjecaj difuzije na odziv biosenzora.• (a), predstavlja konvencionalnu Michaelis Mentenovu hiperbolu

tj. situaciju kada je senzor pod kinetičkom kontrolom• (b), odziv senzora je pod utjecajem difuzije iz vanjske membrane.

Linearno područje se proširuje (približno 4 x KM) premda je struja odziva niža

• (c), odziv biosenzora je pod totalnom difuzijskom kontrolom.Linearno područje je prošireno na približno 9 x KM.

THE END