บทท 3 กรดแอมโนและโปรตน
โปรตนเปนแหลงสะสมพลงงานทส าคญของเซลลและเปนโมเลกลชวภาพขนาดใหญ พบในสงมชวตทกชนด เชน เนอปลา พบรอยละ 13 น านม รอยละ 3 และถวเหลอง รอยละ 36 เปนตน หรอเปนองคประกอบในอวยวะของสงมชวต เชน เคราทน (Keratin) ในผวหนงและเลบ และคอลลาเจน (Collagen) ในกลามเนอ เปนตน โปรตนมหนาททางชวภาพ (biological function) แตกตางกน เชน เปนเอนไซมและฮอรโมนชวยเรงปฏกรยาการท างานภายในสงมชวต ชวยล าเลยงแกสออกซเจนจากปอดไปสหวใจและเซลลตาง ๆ และล าเลยงแกสคารบอนไดออกไซดจากเซลลกลบไปยงปอด ชวยท าใหกลามเนอยดหยนและเกดการเคลอนไหว เปนตน โดยคณสมบตตาง ๆ เหลานขนอยกบชนดและล าดบของกรดแอมโนในโซโปรตน ซงเปนหนวยยอยเลกทสดของโปรตน
แอลฟา-กรดแอมโน
ลกษณะสตรโครงสรางทวไปของกรดแอมโน ประกอบดวยหมแอมโนอยทต าแหนงแอลฟา- ของหมคารบอกซล ดงภาพท 3.1 จงเรยกวา แอลฟา-กรดแอมโน และโซขาง (side chain) หรอหมแทนท (R) ซงแตกตางกนในกรดแอมโนแตละชนด ในธรรมชาตสวนมากพบกรดแอมโนโครงแบบชนดแอล- โดยเทยบกบภาพฉายแบบฟสเชอรของเซอรน (Serine) มหมแอมโนอยดานซาย ซงมความสมพนธกบแอล-กลเซอแรลดไฮด ยกเวน ในแบคทเรยและแมลงบางชนดจะพบกรดแอมโนโครงแบบชนดด- มากกวา
H2N HCOOH
CH2OHHO H
CHO
CH2OH
L-Serine L-Glyceraldehyde
H2N HCOOH
R
-amino acid
carboxyl group
amino groupside chain
ภาพท 3.1 ภาพฉายแบบฟสเชอรของแอล-เซอรน เทยบกบแอล-กลเซอแรลดไฮด
66
การเรยกชอและการจ าแนกกรดแอมโน
รางกายของสงมชวตชนสงจะไมสามารถสงเคราะหกรดแอมโนไดเองทงหมด เพอใชสรางโปรตน แตสามารถไดจากการบรโภคอาหารเขาไป จงเรยกกรดแอมโนเหลานวา กรดแอมโนจ าเปน (essential amino acids) มทงหมด 10 ชนด ไดแก วาลน (Valine) ลวซน (Leucine) ไอโซลวซน (Isoleucine) ฮสทดน (Histidine) อารจนน (Arginine) เมไธโอนน (Methionine) ฟนลอะลานน (Phenylalanine) เธรโอนน (Threonine) ทรปโทแฟน (Tryptophan) และไลซน (Lysine) จากกรดแอมโนทงหมดในธรรมชาต สวนใหญโครงสรางพบหมแอมโนและหมคารบอกซลอยางละ 1 หม เรยกวา กรดแอมโนเปนกลาง (neutral amino acids) สวนกรดแอมโนบางชนดมหมแอมโน 1 หม และหมคารบอกซล 2 หม เรยกวา กรดแอมโนเปนกรด (acidic amino acids) และกรดแอมโน ทมหมแอมโนมากกวาหมคารบอกซล เรยกวา กรดแอมโนเปนเบส (basic amino acids) การเรยกชอกรดแอมโน นยมเรยกชอสามญ และสามารถเขยนค ายอ จากอกษรภาษาองกฤษ 3 พยางคแรก ยกเวน ทรปโทแฟน ยอเปน “Trp” ไอโซลวซน ยอเปน “Ile” แอสพาราจน (Asparagine) ยอเปน “Asn” ไฮดรอกซโพรลน (Hydroxyproline) ยอเปน “Hyp” หรอใชอกษรภาษาองกฤษพมพใหญตวเดยวแทนกรดแอมโนของแตละชนด ดงตารางท 3.1 ตารางท 3.1 แอล-กรดแอมโนสามญ
กรดแอมโน (ชอเตม/ค ายอ) โครงสราง
ชอแอมน , * พไอ pKa
-COOH -NH2 -R
กรดแอมโนเปนกรด แอล-กรดแอสพารทก (L-Aspartic acid/ Asp (D))
H2NHC
CH2CO2H
CO2H
บตา-อะลานน (-Alanine)
+6.7o 3.0 1.89 9.60 3.65
แอล-กรดกลทามก (L-Glutamic acid/ Glu (E))
H2NHC
CH2CH2CO2H
CO2H
แกมมา-อะมโนบวทรกแอซด (-Amino- butyric acid ,GABA)
+17.7o 3.2 2.19 9.67 4.25
กรดแอมโนเปนเบส แอล-ฮสทดน (L-Histidine/ His (H))
H2NHC
H2C
CO2H
HNN
ฮสทามน (Histamine) -59.8o 7.5 1.80 9.17 6.00
67
ตารางท 3.1 แอล-กรดแอมโนสามญ (ตอ)
กรดแอมโน (ชอเตม/ค ายอ) โครงสราง
ชอแอมน , * พไอ pKa
-COOH -NH2 -R
แอล-ไลซน (L-Lysine/ Lys (K))
H2NHC CO2H
CH2(CH2)3NH2
คาดาวรน-1.5-ไดแอม-โนเพนเทน(Cadaverine-1,5-diamino pentane)
+19.7o 9.6 2.18 8.95 10.52
แอล-อารจนน (L-Arginine, Arg (R))
H2NHC CO2H
(CH2)3-NH-C=NH
NH2
4-กวนโดบวทลแอมน (4-Guanido- butylamine)
+21.8o 11.2 2.17 9.04 12.48
กรดแอมโนเปนกลาง แอล-ซสทน (L-Cystine/ Cys)
CH2-CH-CO 2HS
NH2
CH2-CH-CO 2HS
NH2
- -509o (1 M HCl)
5.0
แอล-ซสทอน (L-Cysteine/ Cys (C))
H2NHC CO2H
CH2SH
2-เมอรแคปโทเอธล- แอมน (2-Mercapto- ethylamine)
-20.0o 5.1 1.96 8.18 10.29
แอล-แอสพาราจน (L-Asparagine/ Asn (N))
H2NHC CO2H
CH2-C-NH2
O
บตา-อะลานลแอมน (-Alanyl amine)
-7.4o 5.4 2.01 8.80
แอล-เธรโอนน (L-Theonine/ Thr (T))
H2NHC CO2H
CH3HO
2-ไฮดรอกซโพรพล- แอมน (2-Hydroxy- propyl amine)
-33.9o 5.6 2.11 9.62 13.60
แอล-เซอรน (L-Serine/ Ser (S))
H2NHC CO2H
CH2-OH
เอธานอลแอมน(Ethanolamine)
-7.9o 5.7 2.21 9.95 13.60
แอล-กลทามน (L-Glutamine/ Gln (Q))
H2NHC CO2H
CH2-CH2C-NH2
O
แกมมา-แอมโนบวทรา-
ไมด (-Amino- Butyramide)
+9.2o 5.7 2.17 9.13
68
ตารางท 3.1 แอล-กรดแอมโนสามญ (ตอ)
กรดแอมโน (ชอเตม/ค ายอ) โครงสราง
ชอแอมน , * พไอ pKa
-COOH -NH2 -R
แอล-เมไธโอนน (L-Methionine/ Met (H))
H2NHC CO2H
CH2-CH2-SCH3
3-เมธลเมอรแคปโท- โพรพลแอมน (3-Methylmercapto-propylamine)
-14.9o 5.7 2.28 9.20
แอล-ไทโรซน (L-Tyrosine/ Tyr (T))
H2NHC CO2H
OH
ไทแรมน (Tyramine) -18o 5.7 2.20 9.11 10.06
แอล-โพรลน (L-Proline/ Pro (P))
NH
CO2H
ไพรโรลดน (Pyrrolidine)
-99.2o 6.3 1.99 10.9
แอล-ไฮดรอกซโพรลน (L-Hydroxyproline/ Hyp)
NH
CO2H
HO
-99.6o 5.7
แอล-ทรปโทแฟน (L-Tryptophan/ Trp (W))
H2NHC CO2H
NH
ทรปแทมน (Tryptamine)
-68.8o 5.9 2.38 9.39
ไกลซน (Glycine/ Gly (G))
H2NH2C CO2H
6.0
แอล-อะลานน (L-Alanine/ Ala (A))
H2NHC
CH3
CO2H
เอธลแอมน(Ethylamine)
+1.6o 6.0 2.34 9.69
แอล-วาลน (L-Valine/ Val (V))
H2NHC CO2H
ไอโซบวทลแอมน (iso-Butylamine)
+6.6o 6.0 2.32 9.61
แอล-ลวซน (L-Leucine/ Leu (L))
H2NHC CO2H
3-เมธลบวทลแอมน (3-Methylbutyl- amine)
+14.4o 6.0 2.36 9.60
69
ตารางท 3.1 แอล-กรดแอมโนสามญ (ตอ)
กรดแอมโน (ชอเตม/ค ายอ) โครงสราง
ชอแอมน , * พไอ pKa
-COOH -NH2 -R
แอล-ไอโซลวซน (L-Isoleucine/ Ile (I))
H2NHC CO2H
2-เมธลบวทลแอมน (2-Methylbutyl- amine)
+16.3o 6.0 2.35 9.89
แอล-ฟนลอะลานน (L-Phenylalanine/ Phe (F))
H2NHC CO2H
ฟนลเอธลแอมน(Phenylethylamine)
-57.0o 5.5 1.83 9.12
*คาการหมนเชงแสงวดในสารละลายน าทความเขมขน 1-2 กรม ตอ 100 มลลลตร
ทมา (Bhat, Nagasampagi & Meenakshi, 2009, pp. 5.2-5.4; Dewick, 2006, pp. 500-501; Torssell, 1997, pp. 314-315)
อยางไรกตาม ในธรรมชาตอาจพบสตรโครงสรางทมลกษณะเหมอนกบกรดแอมโน แตไมใช
กรดแอมโนและไมเปนสวนประกอบในโปรตน ซงมประมาณ 300 ชนด เชน บตา-ไซยาโนอะลานน (-Cyanoalanine) และเบทาอน (Betaine) เปนตน ดงภาพท 3.2 ซงชวสงเคราะหของสารดงกลาว คาดวาเกดจากกรดแอมโนแทจรง (true amino acid) เปนสารตงตน ดงภาพท 3.3
Cyclopent-2-en-1-yl glycine
NC-CH2-CH-COOHNH2
-Cyanoalanine
(CH3)3N-CH2-COO
Betaine
COOH
NH2
Hypoglycine
NH
COOH
Azetidine
HO COOH
NH2
Homoserine
H3C
COOHH2N
ภาพท 3.2 ตวอยางสารทมลกษณะเหมอนกบแอลฟา-กรดแอมโน แตไมเปนแอลฟา-กรดแอมโน
70
NC-CH2-CH-COOHNH2
-Cyanoalanine
(CH3)3N-CH2-COO
Betaine
H2C CS
NH2
HCOOH PLP
(Pyridoxal phophate)
COOH
NCH
PLP
CN
H2O
NH2-CH2-COOH[CH3] NH-CH2-COOH
CH3
[CH3] N-CH2-COOHCH3
CH3 [CH3]
[O]
(CH3)3N-CH2-CH2OH1. [CH3]2. H2O
NH2-CH2-CH2OP1. ATP2. -CO2
HO-CH2-CH-COOHNH2
Serine
Glycine
Cycteine
Sarcosine Dimethylglycine
Choline-Aminoethylphosphate
H
ภาพท 3.3 ชวสงเคราะหบตา-ไซยาโนอะลานนและเบทาอน ทมา (ดดแปลงจาก Torssell, 1997, pp. 318-319) การแตกตวของกรดแอมโน
โครงสรางกรดแอมโนประกอบดวยหมแอมโนทมคณสมบตเปนเบส และหมคารบอกซลทมคณสมบตเปนกรด มลกษณะของไอออนขวค (dipolar ion) ในสถานะของแขงจะอยในรปสวตเตอรไอออน (zwitterionic form) โดยหมแอมโนจะรบโปรตอน (H+) จากหมคารบอกซล เกดแอมมเนยมไอออน (Amminium ion, NH3
+) และคารบอกซเลตไอออน ดงภาพท 3.4 ซงรปสวตเตอรไอออนจะเปลยนไป ขนอยกบความเปนกรด-เบสของสารละลาย
RHC
NH3
COO
ภาพท 3.4 รปสวตเตอรไอออนของกรดแอมโน
กรณในสภาวะกรด กรดแอมโนจะท าหนาทเปนเบส โดยคารบอกซเลตไอออนรบโปรตอนจากกรด ท าใหรปสวตเตอรไอออนของกรดแอมโนเปลยนเปนรปไอออนบวก (cationic form) ดงสมการ (3.1) แตในสภาวะเบส กรดแอมโนจะท าหนาทเปนกรด โดยแอมมเนยมไอออนจะใหโปรตอนแกเบส
71
ซงรปสวตเตอรไอออนจะเปลยนเปนรปไอออนลบ (anionic form) ดงนน กรดแอมโนจงเปนไดทงกรดและเบส เรยกสารหลานวา แอมโฟเทอรก (amphoteric) ดงสมการ (3.2)
R
HCNH3
COO + H R HCNH3
COOH (3.1)
RHCNH3
COO + OH RHCNH2
COO + H2O (3.2)
เมอกรดแอมโนมผลรวมประจเปนศนย เรยกวา จดไอโซอเลกทรก (Isoelectric point) ซง คาความเปนกรด-เบสของสารละลาย เรยกวา ไอโซอเลกทรกพเอชหรอพไอ (Isoelectric pH หรอ pI) ซงเปนคณสมบตเฉพาะของกรดแอมโนแตละชนด ดงตารางท 3.1 เชน ไกลซน มคาพไอ เทากบ 5.97 อยในรปสวตเตอรไอออน แตเมออยในสารละลายทมคาความเปนกรด-เบส เทากบ 2.34 จะท าใหเปลยนเปนรปไอออนบวก แตเมออยในสารละลายคาความเปนกรด-เบส เทากบ 9.60 จะเปลยนเปน รปไอออนลบ ดงสมการ (3.3) (Bhat, Nagasampagi & Meenakshi, 2009, p. 5.4)
CH3N COOHH
HCH3N COOH
HpKa1 CH2N COOH
HpKa2
2.34 + 9.602
pI =
= 5.97
pH 2.34 pH 9.60
(3.3)
กรดแอสพารทก ซงโครงสรางมหมคารบอกซลมากกวา 1 หม เมออยในสารละลายกรดแกทมคาความเปนกรด-เบส เทากบ 2.10 โครงสรางจะอยในรปไอออนบวกหนงประจ (monocationic form) ซงหมคารบอกซลทงสองหมจะไมเกดการแตกตวใหโปรตอนได จนกระทงมคาความเปน กรดเบส เทากบ 3.90 เนองจากหมคารบอกซลกทต าแหนงบตา- จะแตกตวใหโปรตอน ดงนน คาพไอของกรดแอสพารทก เทากบ 3.0 และเมอสารละลายมคาความเปนกรด-เบส เทากบ 10 จะท าใหอยในรปไอออนลบสองประจ (dianionic form) ดงสมการ (3.4) (Bhat, Nagasampagi & Meenakshi, 2009, p. 5.5)
72
CH3N COOHH
CH2COOHCH3N COOH
CH2COOHpKa1CH3N COOH
CH2COOpKa2
2.10 + 3.902
pI =
= 3.00
pH 2.10 pH 3.90
+ H
pKa3
CH2N COOH
CH2COO
pH 10.00
(3.4)
ส าหรบประโยชนของคาพไอ คอ การแยกสารผสมเชงซอนของกรดแอมโน โดยใชเทคนคซงเรยกวา การเคลอนสขวไฟฟา (electrophoresis)
คณสมบตของกรดแอมโน
กรดแอมโนมสถานะเปนของแขงไมมส มคณสมบตทวไป ดงน 1. จดหลอมเหลว กรดแอมโนมจดหลอมเหลวคอนขางสง จงอาจสลายตว (decomposed) ได
ขณะเกดการหลอม 2. การละลาย เมอกรดแอมโนละลายไดในน า จะแตกตวใหประจ หรอละลายในตวท าละลายอนทรยบางชนดทมขว ไดแก แอลกอฮอล 3. การดดกลนรงสยว กรดแอมโนสวนมากจะดดกลนแสงยวทความยาวคลน 220 นาโนเมตร ยกเวน โครงสรางทมวงแอโรแมตก ไดแก ไทโรซน ทรปโทแฟน และฟนลอะลานน จะดดกลนรงสยวในชวงความยาวคลน 260-280 นาโนเมตร ดงภาพท 3.5 (ดาวลย ฉมภ, 2553, หนา 112) ดงนน จงสามารถวเคราะหหาปรมาณกรดแอมโนในโปรตนได 4. การหมนเชงแสง กรดแอมโนทกชนดทโมเลกลเปนอสมมาตร (asymmetry) ยกเวน ไกลซน สามารถมคณสมบตการหมนเชงแสง [] เชนเดยวกบมอโนแซกคาไรด ซงขนกบคาความเปนกรด-เบสของสารละลายและโซขาง ถามทศทางหมนระนาบแสงไปทางขวา เรยกวา เดกซโทรโรทาทอร หรอ “d- หรอ (+)” เชน แอล-อารจนน คา [] เทากบ +21.8 องศา หรอกรณมทศทางการหมนไปทางซาย เรยกวา เลโวโรทาทอร หรอ “l- หรอ (-)” เชน แอล-ฟนลอะลานน คา [] เทากบ -57 องศา (Bhat, Nagasampagi & Meenakshi, 2009, pp. 5.2, 5.4) (ตารางท 3.1) แตถาเปนสารผสมของกรดแอมโน (+) และ (-) ในปรมาณโมลาร (molar) เทากน จะไมมคาการหมนเชงแสง
73
ภาพท 3.5 สเปกตรมการดดกลนแสงยวของทรปโทแฟน ไทโรซน และฟนลอะลานน ทมา (Malnasi-Csimadia, 2014) 5. บฟเฟอร (buffer) เมอกรดแอมโนละลายน า จะอยในรปสวตเตอรไอออน มทงประจบวกของแอมมเนยมไอออน ซงมคณสมบตเปนเบสออน และประจลบของคารบอกซเลตไออน เปนกรดออน ท าใหเปนสารละลายบฟเฟอร ทงนขนอยกบโซขางของกรดแอมโน ทส าคญ ไดแก หมอมดาโซล (imidazole) ของฮสทดน
หนาททางชวภาพของกรดแอมโน
กรดแอมโนชนดตาง ๆ พบในเซลลเนอเยอและของเหลว ไดแก เลอดของสงมชวต ซงมบทบาทหนาทส าคญตาง ๆ เชน เปนสารตงตนในการสงเคราะหพอลเพปไทด (polypeptide) หรอโปรตน ใหพลงงาน ชวยสงเคราะหกลโคส หรอเกบสะสมในรปของไขมน เปนตน นอกจากน ยงท าหนาท ทางชวภาพเฉพาะ ดงน
- ไกลซน เปนสารสอประสาท (neurotransmitter) เชนเดยวกบเซโรโทนน (Serotonin, 3.1) ดงภาพท 3.6 ซงเปนอนพนธของทรปโทแฟน โดยเซโรโทนนจะใชเปนสารตงตนเพอสงเคราะหฮอรโมนเมลาโทนน (Melatonin, 3.2) ท าหนาทเปนสารสอประสาท ถาถกกระตนใหหลงออกมามาก จะท าใหมความรสกตนตวลดลงหรอเฉอยชา (Coto-Montes, et al., 2012, pp. 12-13) นอกจากน ไกลซนยงใชเปนสารตงตนสงเคราะหโครงสรางทมธาตเหลก
- ไทโรซน เปนสารตงตนในการท าปฏกรยากบไอโอดน ไดฮอรโมนไธรอกซน (Thyroxine hormone, 3.3) หรอไทรอยดฮอรโมน ดงภาพท 3.6 ชวยควบคมการเจรญเตบโตและการเผาผลาญอาหารในรางกาย
74
- อารจนน เปนสารตงตนรวมกบไกลซนในชวสงเคราะหครเอทน (Creatine, 3.4) ดงภาพท 3.6 ซงถกเกบสะสมไวในกลามเนอและหวใจ
- เมไธโอนน ใชเปนสารตงตนในการสงเคราะหเอส-อะดโนซลเมไธโอนน ท าใหเกดการยายหมเมธลในชวสงเคราะหเมแทบอไลต
- ซสทอน ใชเปนสารตงตนในชวสงเคราะหกลทาไธโอน (Glutathione, 3.5) ดงภาพท 3.6 โดยมกลทามนและไกลซนท างานรวมดวย กลทาไธโอนเปนไทรเพปไทด (tripeptide) ท าหนาทขนสงกรดแอมโนผานผนงเซลล เปนโคเฟกเตอรของเอนไซมบางชนด และมผลใหเซลลเมดเลอดแดงคงสภาพอย (Minich, Smith, Brauner & Majerus, 1971, pp. 507-513)
นอกจากน ชวสงเคราะหแอลคาลอยด สวนมากจะใชกรดแอมโนเปนสารตงตน เชน ไลซน เปน
สารตงตนในชวสงเคราะหแอลคาลอยดกลมพเพอรดน (piperidine) กลมควโนลซดน (quinolizidine) และกลมอนโดลซดน (indolizidine) เปนตน ศกษาเพมเตมในบทท 6 ถงบทท 8
O
I
I I
CH2-CH-COOHNH2
I
Thyroxine hormone (3.3)
NH
NH2
HO
Serotonin (3.1)
NH
HN
H3CO
Melatonin (3.2)
CH3
ONCH3
H2N
NHOH
O
Creatine (3.4)
Glutathione (3.5)
HO NH
HN
O
NH2
O SH
OOH
O
ภาพท 3.6 โครงสรางสารทเกดจากชวสงเคราะหโดยกรดแอมโนเปนสารตงตน
การผลตกรดแอมโนในทางอตสาหกรรม
กรดแอมโนใชในอตสาหกรรมอาหารรอยละ 97 และประมาณรอยละ 3 ใชในอตสาหกรรมยา เครองส าอาง และใชเปนสารตงตนในอตสาหกรรมเคมสงเคราะห ปจจบน กรดแอมโนหลายชนด ถกผลตขนทงจากวธการสงเคราะหทางเคม (chemical synthesis) ไดแก ปฏกรยาของสเทรกเกอร (Strecker’s reaction) ปฏกรยาเฮลล โวลฮารด เซลนสก (Hell-Volhard-Zelinsky reaction) ปฏกรยาของแกเบรยล (Grabriel’s reaction) และปฏกรยาเคอรเทยสหรอฮอฟแมนนเดกราเดชน
75
(Curtius reaction or Hofmann degradation) เปนตน และการแยกสลายดวยน าในสภาวะกรดและเบส โดยเฉพาะการผลตจากจลนทรย ซงเปนวธทนยมทสด ตวอยางกรดแอมโนทถกผลตในทางอตสาหกรรม (ตารางท 3.2) ดงน ตารางท 3.2 ตวอยางกรดแอมโนทถกผลตขนในทางอตสาหกรรม
กรดแอมโน วธการผลต
การประยกตใช 1 2 3
แอล-อะลานน √ √ สารเพมกลนและรส (flavor enhancer) แอล-กรดแอสพารทก √ √ สารเพมกลนรส การบ าบด (therapy) และ
การผลตแอสพารแทม (Aspartame) แอล-อารจนน √ √ สวนประกอบในเครองส าอาง การบ าบดรกษาผปวย
โรคตบ และการฉดยาเขาเสนเลอด (infusion) ดแอล-อะลานน √ สารเพมกลนในอตสาหกรรมเครองดม แอล-แอสพารราจน √ √ การบ าบดรกษา แอล-ซสทอน √ การผลตขนมปง ตวตานออกซเดชน และการรกษา
โรคหลอดลมอกเสบ (bronchititis) แอล-กรดกลทามก √ สารเพมรสชาต (taste enhancer) ไกลซน √ สวนประกอบของสารใหความหวาน แอล-ไอโซลวซน √ การฉดยาเขาเสนเลอด แอล-ลวซน √ √ การฉดยาเขาเสนเลอด แอล-ฮสทดน √ √ การบ าบดโรคแผลเปอยในกระเพาะอาหาร (ulcer) แอล-ไลซน √ สารเตมแตงในอาหารและการฉดยาเขาเสนเลอด ดแอล-เมไธโอนน √ สารเตมแตงในอาหาร แอล-ฟนลอะลานน √ การฉดยาเขาเสนเลอด แอล-เซอรน √ สวนประกอบในเครองส าอาง แอล-เธรโอนน √ สารเตมแตงในอาหาร แอล-ไทโรซน √ √ สารละลายแชและสารตงตนของการสงเคราะห
แอล-โดปา (L-DOPA) แอล-ออรนทน √ การบ าบดหรอรกษาโรคตบ แอล-วาลน √ การฉดยาเขาเสนเลอด
หมายเหต วธการผลต 1 คอ การแยกสลายดวยน า 2 คอ การสงเคราะหทางเคม และ 3 คอ การผลตจากจลนทรย
ทมา (Bhat, Nagasampagi & Meenakshi, 2009, p. 5.12)
76
1. กรดกลทามก
ป ค.ศ. 1908 นกวจยชาวญปนชอศาสตราจารย ดร. คคนาเอะ อเคดะ แหงมหาวทยาลยโตเกยวอมพเรยล คนพบกรดกลทามกเปนครงแรกจากการสกดสาหรายทะเลชอคอมบ (Japonica laminaria) มคณสมบตเพมรสชาตใหอาหาร และในป ค.ศ. 1957 นกวจยชาวญปนเชนกน พบวากรดกลทามกสามารถผลตไดจากกระบวนการหมกดวยจลนทรยคอรนแบคทเรยมกลทามคม (Corynebacterium glutamicum) โดยเปลยนแอลฟา-กรดคโทกลทารก (-Ketoglutaric acid) เปนกรดกลทามกดวยเอนไซมกลทามกดไฮโดรจเนส (Glutamic dehydrogenase) (สถาบนพลศกษา วทยาเขตสพรรณบร, 2557, หนา 227) ดงสมการ (3.5) ซงในปจจบน เปนกรรมวธทนยมใชผลตผงชรสหรอมอโนโซเดยมกลทาเมต (Monosodium glutamate) แหลงวตถดบ ไดแก แปงมนส าปะหลง และกากน าตาล (molasses)
Glutamic dehydrogenaseHO OH
O
O
O-Ketoglutaric acid
+ NH3 + NADH
HO OH
O
NH2
O
+ NAD+ + H2O
Glutamic acid (3.5)
2. ไลซน
ไลซนเปนกรดแอมโนทจ าเปนส าหรบมนษยในการซอมแซมเนอเยอและชวยการเจรญเตบโต ซงรางกายสรางไลซนเองไมได จงจ าเปนตองไดรบจากอาหาร พบมากในเนอแดง ถว ไข เนย และนม เปนตน ในปจจบน การผลตไลซนทางอตสาหกรรม เพอเปนสวนผสมในอาหารเสรม ม 3 วธ (Bhat, Nagasampagi & Meenakshi, 2009, pp. 5.13-5.14) ดงน
2.1 กระบวนการหมกโดยอาศยแบคทเรย นยมใชเชอแบคทเรย 2 สปชส กลาวคอ เรมตนจากการหมกกากน าตาลดวยอโคไล (E. coli) ไดเปนกรดไดแอมโนพเมลก (diaminopimelic acid, DAP) ในน าหมก แลวเกดดคารบอกซลเลชนโดยเอนไซมดเอพดคารบอกซเลส (DAP decarboxylase) จากแบคทเรยแอโรแบกเตอรแอโรจเนส (Aerobacter aerogenes) ซงเปนเอนไซมสามารถเกดเฉพาะกบเมโซ-ดเอพ (meso-DAP) เทานน จะไดแอล-ไลซน ดงภาพท 3.7
77
COOHNH2
CH2CH2CH2
NH2COOH
COOHNH2
CH2CH2CH2CH2
DAP decarboxylase(from Aerobacter aerogenes)
Diamonipimelic acid (DAP) L-Lysine
+ CO2
or meso-DAP
NH2
ภาพท 3.7 การผลตแอล-ไลซนจากกระบวนการหมกดวยเชอแบคทเรย ทมา (การผลตไลซนดวยดเอพดคารบอกซเลส, 2557)
2.2 การเปลยนดแอล-แอมโนคาโพรแลกแทม สารตงตน ไดแก ไซโคลเฮกซน
(Cyclohexene) ส าหรบสงเคราะหดแอล-แอลฟา-แอมโน-เอปซลอน-คาโพรแลกแทม (DL--amino--caprolactam) กอน หลงจากนน น ามาหมกกบแบคทเรยอะโครโมแบกเตอรอะบ (Achromobacter abae) ซงจะเปลยนเฉพาะโครงแบบชนดด- เปนโครงแบบชนดแอล- ของแอลฟา-แอมโน-เอปซลอน- คาโพรแลกแทมเทานน โดยอาศยเอนไซมราซเมสเฉพาะ แลวเมอถกสลายดวยเอนไซมไฮโดรเลสจากราครปโทคอกคสลอเรนทออะบ (Cryptococcus laurentii abae) จะไดแอล-ไลซน (ภาพท 3.8)
2.3 กระบวนการหมกโดยตรง โดยกลโคสและเอธานอล (Ethanol) เปนแหลงอะตอมคารบอนและอาศยแบคทเรย เชน เบรวแบคทเรยมแลกโทเฟอรเมนทม (B. lactofermentum) คอรนแบคทเรยมกลทามคม (Corynebacterium glutamicum) หรอเบรวแบคทเรยมฟลาวม (Brevibacterium flavum) จะไดแอล-ไลซน
78
NOClON Cl
NH3HO-N NH2
H HN
ONH2
DL--Amino--caprolactam
hydrolase
HN
ONH2
+ L-Lysine
DL--Amino--caprolactam
Achromobacter abaeand racemase
L--Amino--caprolactam
L-Lysine
Cryptococcus laurentii abae
Cyclohexene
ภาพท 3.8 การผลตแอล-ไลซนจากการเปลยนดแอล-แอลฟา-แอมโนคาโพรแลกแทม ทมา (ดดแปลงจาก Bhat, Nagasampagi & Meenakshi, 2009, p. 5.14)
ปฏกรยาของกรดแอมโน
กรดแอมโนประกอบดวยหมท าหนาท ไดแก หมแอมโน และหมคารบอกซล รวมทงโซขางทต าแหนงบตา- ซงสามารถเกดปฏกรยาเคม ดงน
1. ปฏกรยาทหมแอมโน
การเกดปฏกรยาทหมแอมโนของกรดแอมโน (Bhat, Nagasampagi & Meenakshi, 2009, pp. 5.14-5.18) ดงน
1.1 การเกดแอไมดอนพนธ หมแอมโนของกรดแอมโนมคณสมบตเปนเบส เมอท าปฏกรยากบแอซดคลอไรด (acid chloride) เชน เบนซลออกซคารบอนลคลอไรด (Benzyloxycarbonyl chloride) จะไดแอไมดอนพนธ ดงสมการ (3.6) หรอแอซดคลอไรดท าหนาทเปนรเอเจนตปองกนอะตอมไนโตรเจน (N-protecting reagent) ดงภาพท 3.9 เพอปองกนไมใหอะตอมไนโตรเจนเกดปฏกรยากอน ท าใหไดผลตภณฑตามตองการและเกดผลไดเปนรอยละ (%yield) สง แตตอง
79
สามารถก าจดหมปองกน (protecting group) นนออกไดดวย เชน หมเบนซลออกซคารบอนลคลอไรดถกก าจดออกไดโดยรดกชนหรอการแยกสลายดวยน าในสภาวะกรด เปนตน
R OHNH2
O
+R OHHN
O
O
O
+ HCl
N-Acetylated derivative
(3.6)N-acetylation
O Cl
O
Benzyloxycarbonyl chlorideamino acid
H3C SO
OCl
p-Toluene sulfonylchloride
H3C SO
OCl
Mesityl sulfonylchloride
OO2N S
OCH3
p-Nitrobenzyl tosylateO
N
O
O
CH2-Cl
Phthalimidomethyl chloride
Cl
Benzyl chloride
F
NO2O2N
2,4-Dinitrofluorobenzene (DNFB)or Sanger's reagent
CH3
CH3
ภาพท 3.9 แสดงต าแหนง (- >) เขาท าปฏกรยาระหวางอะตอมไนโตรเจนของกรดแอมโนกบ รเอเจนตปองกนอะตอมไนโตรเจน ทมา (Bhat, Nagasampagi & Meenakshi, 2009, p. 5.16) เมอหมแอมโนของไกลซนเกดปฏกรยากบเบนโซเอต (Benzoate) จะเกดกรดฮปพรก (Hippuric acid) ดงสมการ (3.7) พบในน าปสสาวะ ซงเปนกระบวนการสรางและสลายกรดเบนโซอก (Benzoic acid) ในรางกายมนษย
H2N COOHO
O+
O
NH
COOH (3.7)
Hippuric acid
+ HCl
1.2 ปฏกรยากบกรดไนทรส เกดเฉพาะกบหมแอมโนปฐมภมเทานนทจะท าปฏกรยากบกรดไนทรส (Nitrous acid, HNO2) โดยเปลยนหมแอมโนเปนหมไฮดรอกซลและแกสไนโตรเจน ดงสมการ (3.8) โดยนกชวเคมชาวอเมรกน ชอ โดนลด เดกซเตอร แวน สไคก (Donald Dexter Van
80
Skyke) ไดประยกตใชปรมาณแกสไนโตรเจนทได จากนนน ามาค านวณหาจ านวนกรดแอมโนทมอยในโมเลกลของโปรตน เรยกการวเคราะหนวา วธแวนสไคก (Van Skyke method)
R OHNH2
O
+ HNO2 (3.8)R OHOH
O
+ N2 + H2O
1.3 การก าจดหมแอมโน เมอกรดแอมโนท าปฏกรยากบกรดไฮโดรไอโอดก (Hydroiodic acid, HI) ทอณหภม 200 องศาเซลเซยส ซงหมแอมโนจะถกก าจดออกในรปของแกสแอมโมเนย เกดเปนกรดคารบอกซลก ดงสมการ (3.9)
R OHNH2
O
(3.9)R OH
O
+ NH3 + I2HI, 200 oC
1.4 การเปลยนหมแอมโนเปนอะตอมคลอรน เมอกรดแอมโนท ากบไนโทรซลคลอไรด (Nitrosylchloride, NOCl) หรอไนโทรซลโบรไมด (Nitrosylbromide, NOBr) จะเปลยนหมแอมโนเปนอะตอมคลอรน ดงสมการ (3.10)
R OHNH2
O
+ NOCl (3.10)R OHCl
O
+ N2 + H2O
1.5 ปฏกรยากบรเอเจนตนนไฮดรน กรดแอมโนทกชนด ซงมหมแอมโน สามารถท าปฏกรยากบรเอเจนตนนไฮดรน (Ninhydrin reagent) ซงประกอบดวยไทรคโทไฮดรนดนไฮเดรต (triketohydrindene hydrate) ไดสารประกอบสมวง สชมพ หรอสน าเงน แกสคารบอนไดออกไซด และแอลดไฮดทมจ านวนอะตอมคารบอนนอยกวากรดแอมโนหนงตว ดงภาพท 3.10 ยกเวนกรดแอมโนบางชนด ไดแก โพรลน และไฮดรอกซโพรลน จะไดสเหลองแทน ซงวธนสามารถใชวเคราะหหาปรมาณไดอกดวย อยางไรกตาม แอมนปฐมภม (primary amine) และแกสแอมโมเนยสามารถท าปฏกรยากบรเอเจนตนนไฮดรนไดเชนเดยวกน แตผลจะไมเกดแกสคารบอนไดออกไซด
81
R-CH-NH2COOH
+ OH
OH
O
O
2
O
OH
N
O
O
+ CO2 + 3H2O
+R
O
H
Mechanism:
O
OH
N
O
O
+ CO2+R
O
H
OH
OH
O
O
R-CH-NH2COOH
+
O
O
NCOOH
RO
O
NH2-H2O
OHOH
O
O
ภาพท 3.10 ปฏกรยาของกรดแอมโนกบรเอเจนตนนไฮดรน ทมา (ดดแปลงจาก Bhat, Nagasampagi & Meenakshi, 2009, p. 5.18) 1.6 ปฏกรยากบรเอเจนตซงเกอร กรดแอมโนท าปฏกรยากบรเอเจนตซงเกอร (Singer reagent) ประกอบดวย 1-ฟลออโร-2,4-ไดไนโทรเบนซน (1-Fluoro-2,4-dinitrobenzene) เกดเปนสารประกอบสเหลองของแอมโนอนพนธ (ดาวลย ฉมภ, 2553, หนา 120) ดงสมการ (3.11)
R OHNH2
O
(3.11)F NO2+
1-Fluoro-2,4-dinitrobenzene
O2NHN NO2
O2N
CCOOH
RH
+ HF
2. ปฏกรยาทหมคารบอกซล
หมคารบอกซลของกรดแอมโนมความเปนกรด และมความเปนนวคลโอไฟล จงสามารถเกดปฏกรยา (Bhat, Nagasampagi & Meenakshi, 2009, p. 5.15; McMurry & Simanek, 2007, p. 310) ดงน 2.1 การเกดอนพนธของกรดคารบอกซลก เมอกรดแอมโนท าปฏกรยากบแอลกอฮอล จะไดเอสเทอร (ester) ดงสมการ (3.12) และท าปฏกรยากบแอมโมเนยหรออนพนธ ไดแอไมด ดงสมการ (3.13)
82
R
NH2
C-OHO
+ R'OH R
NH2
C-OR'O
+ H2O (3.12)
R
NH2
C-OHO
+ NH3R
NH2
C-NH2
O
+ H2O (3.13)
H+
heat
2.2 การรดวซดวยโลหะไฮไดรด ไดแก ลเทยมอะลมเนยมไฮไดรด (Litium aluminium hydride, LiAlH4) และโซเดยมโบโรไฮไดรด (Sodium borohydride, NaBH4) เมอท าปฏกรยากบ กรดแอมโน หมคารบอกซลจะถกรดวซเปนแอลกอฮอลปฐมภม (primary alcohol) ดงสมการ (3.14)
R
NH2
C-OHO
+ LiAlH4R
NH2
(3.14)OH
or NaBH4
2.3 ดคารบอกซลเลชน เปนการก าจดแกสคารบอนไดออกไซดของหมคารบอกซล โดยใหความรอนกบกรดแอมโนและแบเรยมออกไซด (Barium oxide, BaO) ซงหมแอมโนจะเปลยนเปนแอมนปฐมภม ดงสมการ (3.15)
R
NH2
C-OHO
+ BaO (3.15)R-CH2-NH2 + BaCO3
ฮสทามนซงถกสรางขนจากเซลลในปอดและเยอเมอก (mucus membrane) เกด
จากดคารบอกซลเลชนของฮสทดนโดยอาศย 1-ฮสทดนดคารบอกซเลส (Histamine decarboxylase) จากแบคทเรย (Lin, et al., 2012, pp. 723-727) (สมการ (3.16)) ถารางกายกระตนใหหลงฮสทามนมากเกนไป จะกอใหเกดโรคภมแพและโรคผวหนง
H2NHC
H2CCO2H
HN N
1-Histidine decarboxylase
decarboxylationHN N
H2N
Histidine Histamine
(3.16)
83
3. ปฏกรยาทโซขาง
กรดแอมโนบางชนดสามารถเกดปฏกรยาเฉพาะทหมแทนทหรอโซขางได จงใชบอกชนดของกรดแอมโน ดงน
3.1 โซขางมหมไธออล เมอซสเทอนท าปฏกรยากบเลด (II) แอซเทต (Pb(CH3COO)2) ในกรดแอซตก จะเกดตะกอนสด าของเลดซลไฟด (PbS) อกทงเมอออกซเดชนของหมไธออลของซสเทอน 2 โมล จะไดซสทน ซงยดเหนยวกนดวยพนธะไดซลไฟด (disulfide linkage) (McMurry & Simanek, 2007, p. 490) ดงสมการ (3.17)
HC CO2HCH2
(3.17)SH
COOHCH
CH2
SH
NH2
2H+ + 2e
2H+ + 2e
H2NHC CO2HCH2S
COOHCH
CH2
S
NH2
disulfide linkage
2 moles of Cysteine Cystine
NH2
ส าหรบการวเคราะหปรมาณหมไธออลในโปรตน อาศยเทคนคทางสเปกโทรสโกปได โดยซสทอนจะท าปฏกรยากบซลเวอร (I) ไอออน (Ag+) และรเอเจนตของเอลลแมน (Ellman’s reagent) เกดเปนสารประกอบทมส แลววดคาการดดกลนแสง (ดาวลย ฉมภ, 2553, หนา 120-121) ดงสมการ (3.18)
H2N CH2-SH
COOH+ Ag+
H2N CH2-S-Ag
COOH
Cysteine Cysteine silver mercaptide
S S NO2O2N
HOOC COOH
SH2N
HOOC
S + HS NO2
COOH
Ellman's reagent (3.18)
H2C
NH2
COOH
3.2 โซขางมวงแอโรแมตก ไดแก ฟนลอะลานน ไทโรซน และทรปโทแฟน เมอทดสอบกบปฏกรยาแซนโธโพรเทอก (Xanthoproteic reaction) ประกอบดวยกรดไนทรกเขมขน โดยจะเกดปฏกรยาไนเทรชน (nitration) ทวงแอโรแมตก ไดเปนสารประกอบไนโทรสเหลอง
84
3.3 โซขางเปนฟนอลก โดยมหมไฮดรอกซลเกาะอยบนวงแอโรแมตก ไดแก ไทโรซน ซงเมอทดสอบดวยปฏกรยามลลอน (Millon’s reaction) จะเกดปฏกรยาเมอรควเรชน (mercuration) และไนเทรชน ไดตะกอนสชมพ และจะคอย ๆ เปลยนเปนสแดง
เมแทบอลซมของกรดแอมโน
เมอรบประทานอาหารทมโปรตนมากเกนความจ าเปน หรอกรณรางกายขาดอาหาร หรอในผปวยโรคเบาหวาน รางกายจะใชกรดแอมโนเปนแหลงใหพลงงานและสงเคราะหสารตาง ๆ ทจ าเปนตอการด ารงชวต สวนกรดแอมโนทเหลอจะถกสลาย (catabolism of amino acids) ตอไป โดยอาศยวถ 2 แบบ ไดแก 1) วถไนโตรเจน (nitrogen pathway) ดวยทรานสแอมเนชน และดแอมเนชน และ 2) วถโครงคารบอน (carbon skeleton pathway) ซงอะตอมไนโตรเจนจะถกก าจดออกใน รปแกสแอมโมเนย แลวจะผานเขาสวฏจกรยเรย (Urea cycle) เพอใชสงเคราะหยเรยหรอกรดยรก (Uric acid) ตอไป
1. วถไนโตรเจน
การสลายกรดแอมโนผานวถไนโตรเจนมปฏกรยาทเกยวของ ดงน 1.1 ทรานสแอมเนชน เปนปฏกรยาหลกใชก าจดหมแอมโนของกรดแอมโน ยกเวน ไลซน
โพรลน และเธรโอนน โดยการถายโอนหมแอมโนของกรดแอมโนและกรดแอลฟาคโท ซงมเอนไซม ทรานสเฟอเรสหรอแอมโนทรานสเฟอเรส (amino transferase) ท าหนาทเปนตวเรงปฏกรยา และ ไพรดอกแซลฟอสเฟต เปนโคเอนไซม เกดเปนกรดแอมโนและกรดแอลฟาคโททมโครงสรางตางจากเดม ดงภาพท 3.11
โดยทวไป ทรานสแอมเนชนของกรดแอมโนตาง ๆ จะไดกรดกลทามกและกรดไพรวก
(Pyruvic acid) โดยมกรดแอลฟาคโทเปนตวรบ ไดแก แอลฟา-คโทกลทาเมต (α-keto glutamate) โดยท างานรวมกบกลทาเมตทรานสเฟอเรส (Glutamate transferase) หรอกรดไพรวกเปนตวรบรวมกบอะลานนทรานสเฟอเรส (Alanine transferase) ไดอะลานน ดงภาพท 3.12 กอนเขาสวฏจกรยเรยตอไป
85
amino acid 1 + keto acid 2 keto acid 1 + amino acid 2
NPO
CHNHLys-Enz
OH
CH3
amino acid 1
R1NH2
HCOOH
NPO
CHNH
OH
CH3
R1 COOH
NH
POCHN
OH
CH3
R1 COOH
Pyridoxal phosphate (PLP)
hydrolysis
NPO
CH2NH2
OH
CH3
Pyridoxamine (PMP)
+ keto acid 1
R2-CO-CO2Hketo acid 2
NPO
CHN
OH
CH3
R2 COOH
Lys-Enz
amino acid 2
R2NH2
HCOOH + PLP
ภาพท 3.11 กลไกแทรานสแอมเนชนของกรดแอมโนทวไป ทมา (ดดแปลงจาก สถาบนพลศกษา วทยาเขตสพรรณบร, 2557, หนา 225)
H3CNH3
HCOO +
O
OO
COO
Alanine -Ketoglutarate
Glutamatetransferase H3C
OCOO +
O
ONH3
COO
Pyruvate Glutamate
H3CNH3
HCOO +
O
OO
COO
Alanine -Ketoglutarate
AlaninetransferaseH3C
OCOO +
O
ONH3
COO
Pyruvate Glutamate
ภาพท 3.12 ทรานสแอมเนชนของอะลานนและกรดกลทามก ทมา (สถาบนพลศกษา วทยาเขตสพรรณบร, 2557, หนา 226)
1.2 ดแอมเนชน ปฏกรยาแบงเปน 2 ประเภท คอ 1.2.1 ปฏกรยาออกซเดทฟดแอมเนชน (oxidative deamination) เปนปฏกรยาท
อาศยเอนไซมและมโคเอนไซมในการถายทอดอเลกตรอน ทส าคญไดแก 1) เอนไซมกลทาเมตดไฮโดรจเนส (Glutamate dehydrogenase) เปน
เอนไซมทก าจดหมแอมโนของกรดกลทามก และท างานรวมกบโคเอนไซม ไดแก รปออกซไดสของ
86
กรดนโคทนก ถากระบวนการเกดทไซโทพลาสซม (Cytoplasm) ในตบ จะท างานโดยเอนเอด แตถากระบวนการเกดทไมโทคอนเดรยในตบและไต จะใชในรปฟอสเฟต ไดแก เอนเอดพ โดยหมแอมโนจะถกก าจดออกในรปของแกสแอมโมเนย ดงภาพท 3.13
NAD(P)+ NAD(P)H + H+
H3C
O
COOHPyruvic acid
NH2-CH2-COOH
Alanine
Glutamatetrasferase
COOH
O
-Keto glutaric acid
Transamination
Oxidative deamination
COOH
NH2
Glutamic acid
H2O
NH3Glutamate dehydrogenase
HOOC HOOC
ภาพท 3.13 การก าจดหมแอมโนของกรดกลทามกผานทรานสแอมเนชนและออกซเดทฟดแอมเนชน ทมา (สถาบนพลศกษา วทยาเขตสพรรณบร, 2557, หนา 228)
2) เอนไซมกรดแอมโนออกซเดส (amino acid oxidase) ม 2 ชนด ไดแก โครงแบบชนดด- และชนดแอล- พบไดในเซลลตบและไต ในรางกายสวนมากพบโครงแบบชนดแอล- โดยท างานรวมกบฟลาโวนโปรตน (flavone protein) ท าหนาทเปนโคเอนไซม กลาวคอ ด-กรดแอมโนออกซเดสจะท างานรวมกบเอฟเอด สวนแอล-กรดแอมโนออกซเดสจะท างานรวมกบฟลาวนมอโน- นวคลโอไทดหรอเอฟเอมเอน (Flavin mononucleotide, FMN) โดยเรงปฏกรยาการก าจดหมแอมโนออกในรปของแกสแอมโมเนย และแกสไฮโดรเจนเพอรออกไซด (H2O2) ซงมความเปนพษตอเซลล จะถกก าจดออกได โดยเปลยนเปนแกสออกซเจนและน า ซงอาศยเอนไซมแคทาเลส (catalase) ดงภาพท 3.14
87
H2N
R
COOH
L-amino acid FMN FMNH
O2H2O2
catalase
H2O + 1/2O2
L-amino acid oxidaseO
R
COOH
-keto acid
+ NH3
HN
N N
N CH3
CH3CH2
O
O
CCH2O-P
(H OH)3
Flavin mononucleotide (FMN)
ภาพท 3.14 ปฏกรยาออกซเดทฟดแอมเนชนดวยเอนไซมกรดแอมโนออกซเดส ทมา (สถาบนพลศกษา วทยาเขตสพรรณบร, 2557, หนา 229)
1.2.2 ปฏกรยานอน-ออกซเดทฟดแอมเนชน (non-oxidative deamination) ซง
ก าจดหมแอมโนออกในรปของแกสแอมโมเนย โดยใชเอนไซมจ าเพาะและไมผานออกซเดชน ไดแก เอนไซมแอมโนไลเอส (amino lyase) เชน หมแอมโนของกรดแอสพารทกถกก าจดออก ดวยเอนไซมแอสพารเทส (Aspartase) ไดฟมาเรต (Fumarate) และแกสแอมโมเนย เปนตน นอกจากน กรดแอมโนบางชนดตองใชเอนไซมจ าเพาะโดยท างานรวมกบไพรดอกแซลฟอสเฟตเปนโคเอนไซม เชน เธรโอนนไฮดราเทส (Threonine hydratase) เซอรนไฮดราเทส (Serine hydratase) และซสทอนดซลไฮเดรส (Cysteine desulhydrase) เปนตน
2 วถโครงคารบอน
วถโครงคารบอนเปนการสลายโครงคารบอนของกรดแอมโน โดยเปลยนเปนสารตงตน ไดแก ไพรเวต (Pyruvate) แอซทลโคเอ (Acetyl CoA) กรดแอลฟาคโท ซกซนลโคเอ (Succinyl CoA) และฟมาเรต แลวเขาสวฏจกรเครบส (Krebs’ cycle) หรอวฏจกรกรดซทรก (Citric acid cycle) ดงภาพท 3.15 ซงแอซทลโคเอจะสลาย ไดแกสคารบอนไดออกไซด และพลงงานเกบสะสมไวในรปของเอทพ เอนเอดเอช และเอฟเอดเอช
88
OxaloacetateCitrate
MalateIsocitrate
Fumarate -Ketoglutarate = Glu
Succinate
CO2
Acetyl CoA = Acetoacetate
PyruvateCO2
Ala, Cys, Gly, Ser, Thr, Trp
Ile, Leu, Lys, Phe, Trp, Tyr
Asn
Asp
Phe, Tyr
Ile, Met, Tyr, Val
GlnAsg, His, Pro
CH3-C-S-CoAO
OOCO
COO
CoA-SH
OOCOH
COOCOO
OOC COOCOOOH
H
OOC
O
COO
CoA-S
O
COOSuccinyl CoAOOC COO
OOC COO
OOC COOOH
NADH + H+NAD+
NADH + H+NAD+
GDPGTP
ADPATP
FAD
FADH2
NAD+
NADH + H+
H2O
Krebs' cycle
ภาพท 3.15 วถโครงคารบอนของกรดแอมโน ทมา (ดดแปลงจาก สถาบนพลศกษา วทยาเขตสพรรณบร, 2557, หนา 231)
พนธะเพปไทดและโปรตน
กรดแอมโนเชอมตอกนดวยพนธะแอไมดหรอพนธะเพปไทด (peptide bond) โดยหมแอมโนหรอปลายไนโตรเจน (N-terminal end) ของกรดแอมโนท าปฏกรยากบหมคารบอกซลหรอปลายคารบอน (C-terminal end) ไดเพปไทด (peptide) และน า (สมการ (3.19)) กรณกรดแอมโน 2 ชนด
89
เชอมตอกน เรยกโปรตนนนวา ไดเพปไทด (dipeptide) มพนธะเพปไทด 1 พนธะ หรอกรดแอมโน 3 ชนด เชอมตอกน เรยกวา ไทรเพปไทด มพนธะเพปไทด 2 พนธะ และกรดแอมโนตงแต 100 โมเลกลขนไป เชอมตอกนดวยพนธะเพปไทดเปนโซยาว เรยกวา พอลเพปไทด
H2N C
R1OH
O
H2N C
R2OH
O
+H2N
HN OH
R1
O R2
O
dipeptide
peptide bond
(3.19)
N-terminal C-terminal
+ H2O polypeptideor protein
..
โครงสรางโปรตน
การเขยนสตรโครงสรางของเพปไทด อาจใชอกษรยอตามมาตรฐานของกรดแอมโน (ตารางท 3.1) และเรยงตามล าดบ โดยเรมจากปลายไนโตรเจน อยดานขวามอ เชน กลทาไธโอน ท าหนาทเกยวกบออกซเดชนและรดกชนของเซลล สตรโครงสรางเปนไทรเพปไทด ประกอบดวยกรดกลทามก ซสทอน และไกลซนเชอมตอกนดวยพนธะเพปไทด ตามล าดบ จงเขยนแสดงดวย “Glu-Cys-Gly” แทนโครงสราง ดงภาพท 3.16 เปนตน
HN N
HCOO
O SH
O
Glutathione as a tripeptide
Glu Cys Gly
H3N
COO
ภาพท 3.16 โครงสรางกลทาไธโอน
การหาโครงสรางโปรตนมหลายวธ เชน วธของเอดแมน (Edman’s) วธของแซงเกอร (Sanger’s) และการใชเอนไซมคารบอกซเพปทเดส (carboxypeptidase) (สมพงศ จนทรโพธศร, 2552, หนา 280-289; Bhat, Nagasampagi & Meenakshi, 2009, pp. 5.24-5.25) เปนตน ซงลกษณะโครงสรางจะซบซอนมหลายระดบ ดงน
90
1. โครงสรางระดบปฐมภม (primary structure)
โครงสรางพนฐานของโปรตนทกชนดเปนระดบปฐมภม ซงถอวาเปนโครงสรางอยางงายของโปรตน เกดจากกรดแอมโนเชอมตอกนดวยพนธะเพปไทด แลวเรยงล าดบเปนโซ ก าหนดใหปลายไนโตรเจนของหมแอมโนอยดานซายและปลายคารบอนของหมคารบอกซลอยดานขวา กรณในโซของโปรตนพบซสทอนอยระหวางหรอภายในโซเดยวกน สามารถเชอมตอกนดวยพนธะไดซลไฟด เชน อนซลน ประกอบดวยเพปไทด 2 โซ พนธะไดซลไฟด 3 พนธะ ซงเชอมระหวางโซเพปไทด 2 พนธะ และภายในโซเดยวกน 1 พนธะ (ภาพท 3.17)
ภาพท 3.17 โครงสรางอนซลน ทมา (ดดแปลงจาก Bhat, Nagasampagi & Meenakshi, 2009, p. 5.21)
2. โครงสรางระดบทตยภม (secondary structure)
โซพอลเพปไทดสามารถบด (twist) หรอพบ (fold) ได เนองจากแรงยดเหนยวระหวางโซหรอภายในโซเดยวกน (Bhat, Nagasampagi & Meenakshi, 2009, pp. 5.27-5.28) ไดแก
1) พนธะไฮโดรเจน (hydrogen bonding) เปนแรงยดเหนยวระหวางโมเลกลโปรตนทส าคญ เกดจากอะตอมออกซเจนของหมคารบอนลกบอะตอมไฮโดรเจนของแอไมด (-NH-(C=O)-) ของพนธะเพปไทด และถงแมพนธะไฮโดรเจนจะมความแขงแรงนอยมาก ประมาณ 4.5 กโลแคลอรตอโมล แตเมอเกดพนธะไฮโดรเจนหลายท จะท าใหโครงสรางโปรตนมเสถยรภาพ
2) แรงไฟฟาสถต (electrostatic force) เกดจากหมแอมมเนยมไอออนเกดอนตรกรยา (interaction) กบหมคารบอกซเลตทปลายทงสองของเพปไทด เกดเปนแรงยดเหนยวทางไฟฟาสถตจากประจบวกและประจลบ โดยประจทเกดขนนน จะขนอยกบคาความเปนกรด-เบสของสารละลาย กรณประจเกดเหมอนกน และอยใกลกน จะท าใหโปรตนไมเสถยรภาพ
91
3) อนตรกรยาขวคกบขวค (dipole-dipole interaction) กรณโซขางของโปรตนมขว จะเกดโมเมนตขวค (dipole moment) และเกดอนตรกรยาระหวางหมทงสองดวย
4) แรงแวนเดอรวาลส (Van der Waals force) เปนแรงยดเหนยวระหวางอะตอมหรอโมเลกลไมมขวกบไมมขว หรอระหวางโมเลกลมขวกบไมมขว ซงเปนแรงทไมแขงแรง เมอเทยบกบแรงชนดอน
จากแรงยดเหนยวระหวางโมเลกลขางตน ท าใหโปรตนเกดโครงสรางระดบทตยภม ซง
สวนมากพบ 2 ชนด ดงน 2.1 แอลฟา-ฮลกซ (-Helix) ลกษณะโครงสรางเปนเกลยวเวยนขวา เรยกวา แอลฟา-
ฮลกซ ดงภาพท 3.18 ซงพบบอยกวาเกลยวเวยนซาย เกดจากสายโซพอลเพปไทดเกดพนธะไฮโดรเจนระหวางทกหมคารบอนลของกรดแอมโนล าดบททหนงกบแอไมดของกรดแอมโนล าดบทส ซงแตละเกลยวประกอบดวยกรดแอมโนจ านวน 37 หนวยตอรอบ โดยมระยะหางแตละหนวยประมาณ 0.15 นาโนเมตร และระยะระหวางเกลยว 0.5-0.55 นาโนเมตร (Bhat, Nagasampagi & Meenakshi, 2009, pp. 5.30-5.31) ตวอยางโปรตนทเปนแอลฟา-ฮลกซ ไดแก แอลฟา-เคราทน (-keratin) พบในเสนผม ขนสตว และเนอเยอชนนอกของเซลลของสตวเลอยคลานบางชนด ไดแก ง
ภาพท 3.18 แอลฟา-ฮลกซ
2.2 แผนพลตบตา (-pleated sheet) ลกษณะเปนแผนจบพบไปมา เน องจากเกดพนธะไฮโดรเจนระหวางพอลเพปไทด 2 โซ แผนพลตบตาม 2 ชนด คอ แบบขนาน (parallel) โดยเรมจากปลายคารบอนและปลายไนโตรเจนเหมอนกน และแบบสวนทาง (antiparallel) จะเกดการเรยงตวในทศทางตรงขามกน (ภาพท 3.19) ในธรรมชาตสวนใหญพบแบบสวนทาง ไดแก ไฟโบรอนในเสนไหม (silk fibroin)
92
N N N N NOH
H O
H O
H O
H O
R1
R2
R3
R4
R5
hydrogen bonding
NNNNNO H
HO
HO
HO
HO
R1
R2
R3
R4
R5
C-terminal N-terminal
C-terminalN-terminal
1) Parallel
2) Antiparallel
N N N N NOH
H O
H O
H O
H O
R1
R2
R3
R4
R5C-terminalN-terminal
N N N N NOH
H O
H O
H O
H O
R1
R2
R3
R4
R5
C-terminalN-terminal
ภาพท 3.19 แผนพลตบตา 1) แบบขนาน และ 2) แบบสวนทาง ทมา (Bhat, Nagasampagi & Meenakshi, 2009, p. 5.31)
3. โครงสรางระดบตตยภม (tertiary structure)
โซเพปไทดจะเกดการมวนตวเนองจากแรงยดเหนยวตาง ๆ ไดแก พนธะไฮโดรเจน พนธะ ไดซลไฟด แรงยดเหนยวไฟฟาสถต อนตรกรยาขวคกบขวค หรอแรงแวนเดอรวาลส ท าใหโปรตนเกดเปนโครงสรางระดบตตยภม ตวอยางไดแก
3.1 โปรตนเสนใยหรอไฟบรสโปรตน (fibrous protein) ลกษณะโครงสรางเปนฝอย เกดจากฮลกซหลายโซรวมกน แลวบดเปนเกลยว ดงภาพท 3.20 ไดโปรตนไมละลายในน าและตวท าละลายอนทรยทกชนด ยกเวน กรดแกและเบสแก โปรตนเสนใยมความแขงแรงและตานทานตอการแปลงสภาพ (denature) ไดแก คอลลาเจน แหลงพบทบรเวณเอนกลามเนอและเนอเยอเกยวพนในสตว แอลฟา-เคราทน พบในเสนผม ขนแกะ ขนนก และเลบ อลาสทน (Elastin) ไมโอซน (Myosin) ในกลามเนอ และไฟโบรอน (Fibroin) ซงเปนบตา-เคราทน พบในรงไหมของหนอนไหม (Bombyx mori) (Bhat, Nagasampagi & Meenakshi, 2009, p. 5.22) เปนตน
93
3.2 โปรตนกอนกลมหรอโกลบลารโปรตน (globular protein) โครงสรางซบซอนมากกวาโปรตนเสนใย ละลายไดในน าและสารละลายเจอจาง เกดการแปลงสภาพไดงายเมอเปลยนอณหภม ไดแก ไมโอโกลบน (Myoglobin) ท าหนาท เปนตวรบแกสออกซเจนจากเฮโมโกลบน (Hemoglobin) พบในเซลลกลามเนอและเนอเยออน ๆ เปนโปรตนทโครงสรางมธาตเหลก ซงเปนสารประกอบเชงซอนของพอรไฟรนทม Fe2+ อยตรงกลาง (ภาพท 3.20) ตวอยางอนของโปรตนกอนกลม ไดแก เอนไซมและสารภมตานทาน (antibody) โกลบลน (Globulin) โพรแทมน (Protamine) แอลบมน (Albumin) ในไขขาว ฮสโทน (Histone) และกลทาลน (Glutalin) เปนตน
ภาพท 3.20 โครงสรางระดบตตยภม 1) คอลลาเจน และ 2) ไมโอโกลบน
4. โครงสรางระดบจตรภม (quaternary structure)
โครงสรางเกดจากโปรตนกอนกลม เรยกวา หนวยยอย (subunit) จบกบโปรตนกอนกลมอกหนงชนดหรอมากกวา ดวยแรงยดเหนยวระหวางโมเลกลอยางออน เกดเปนโครงสรางทซบซอนมากขน ไดลกษณะเปนกอนกลม ไดแก เฮโมโกลบน มหนวยยอยลกษณะคลายไมโอโกลบน 4 หนวย ประกอบดวยชนดแอลฟา- 2 หนวย และชนดบตา- 2 หนวย โดยแตละหนวยยอยจบกบโมเลกลฮม ดงภาพท 3.21 หรอลกษณะเปนสาย ไดแก ทบลน (Tubulin)
94
ภาพท 3.21 โครงสรางระดบจตรภม 1) ฮโมโกลบน และ 2) ทบลน
ประเภทของโปรตน
การจ าแนกประเภทของโปรตน ดงน
1. แบงตามโครงสราง
โครงสรางโปรตนพบไดทงโปรตนเชงเดยว (simple proteins) ซงมเฉพาะกรดแอมโนเชอมตอกนดวยพนธะเพปไทดเทานน ไดแก โปรตนเสนใย และโปรตนกอนกลม และโปรตนสงยค (conjugated proteins) เกดจากหมทไมใชโปรตน เรยกวา หมพรอสเทตก เชอมตอพนธะกบโปรตน ดงตารางท 3.3 นอกจากน ยงพบโปรตนอนพนธ เกดจากโปรตนเชงเดยวหรอโปรตนสงยคสลายตวดวยเอนไซมหรอปฏกรยาเคม เชน เมอน าเจลาตน (gelatin) ไปตมดวยสารละลายกรด ไดคอลลาเจน เปนตน ซงสตรโครงสรางของโปรตนเหลานน แบงเปนหลายระดบ ไดแก ปฐมภม ทตยภม ตตยภม และจตรภม ดงรายละเอยดขางตน
2. แบงตามหนาททางชวภาพ
การเรยงล าดบและชนดกรดแอมโนในโซโปรตนทไมเหมอนกน สงผลใหมหนาททางชวภาพ ตางกนไปดวย ดงน
2.1 โปรตนโครงสราง (structural proteins) ท าหนาท ยดเหนยวสวนตาง ๆ ภายในเซลลและเนอเยอของสงมชวต เกดเปนโครงสราง เพมความแขงแรงและชวยปกปอง ตวอยางเชน
95
แอลฟา-เคราทน พบในเสนผม และเขาสตว คอลลาเจนและอลาสทน เปนองคประกอบพบทวไปทบรเวณภายนอกและในชองวางระหวางเซลล ไดแก เนอเยอเกยวพน และกระดกออน เปนตน
2.2 โปรตนขนสง (transport proteins) ท าหนาท ล าเลยงไอออนหรอโมเลกลทมขนาดเลกไปยงสวนตาง ๆ ของสงมชวต เชน แบกเทอรโอโรดอปซน (Bacteriorhodopsin) ชวยก าจดไฮโดรเจนไอออน ออกจากเซลลแบคทเรยหลงจากถกกระตนดวยแสง ซรมแอลบมน (Serum albumin) พบในเลอด ท าหนาทล าเลยงลพด และฮโมโกลบน ชวยล าเลยงแกสออกซเจนจากปอดไปสหวใจและเซลลตาง ๆ แลวล าเลยงแกสคารบอนไดออกไซดกลบไปฟอกยงปอดอกครง เปนตน ตารางท 3.3 ประเภทโปรตนสงยคจ าแนกตามหมพรอสเทตก
โปรตนสงยค หมพรอสเทตก ตวอยาง
นวคลโอโปรตน กรดนวคลอก โครโมโซม ลโพโปรตน ลพด พลาสมาโปรตน ฟอสโฟโปรตน ฟอสเฟต เคซน (Casein) ในน านม ไกลโคโปรตน คารโบไฮเดรต มวซน (Mucin) ในน าลาย เมแทลโลโปรตน ไอออนของโลหะ (เชน เหลก ทองแดง
แมกนเซยม และสงกะส เปนตน) เอนไซมแลกทกดไฮโดรจเนส ฮม
โครโมโปรตน โครโมฟอร (เชน ฮโมโกลบนหรอคลอโรฟลล เปนตน)
สารส
ทมา (Bhat, Nagasampagi & Meenakshi, 2009, p. 5.23; Hasnain, Gallagher, Grencis & Thornton, 2013, pp. 364-374)
2.3 โปรตนสะสม (storage proteins) ท าหนาท เกบสะสมสารเคมโมเลกลขนาดเลกหรอ
ไอออน เชน เฟอรรทน (Ferritin) เปนโปรตนทมรปรางกลม เปนแหลงสะสมธาตเหลกทส าคญ เคซนในน านม ใชเลยงตวออน พบเฉพาะในสตวเลยงลกดวยน านม และโอแวลบมน (Ovalbumin) ในไขขาว เปนแหลงของกรดแอมโน ใชพฒนาตวออนใหเจรญเปนตวเตมวย เปนตน
2.4 โปรตนเคลอนไหว (contractile proteins) ท าหนาท ชวยใหเกดการเคลอนไหวภายในเซลลและเนอเยอ ไดแก ไมโอซน และแอกทน (Actin) ในกลามเนอของรางกาย ไดเนอน (Dynein) ชวยท าใหซเลย (cilia) ในสงมชวตจ าพวกยคารโอต (eukaryote) และแฟลกเจลลา (flagella) โบกไปมา ดงภาพท 3.22
96
ภาพท 3.22 ซเลยและแฟกเจลลา
2.5 โปรตนปองกน (protective proteins) ท าหนาท ชวยปกปองและท าลาย สงแปลกปลอมจากภายนอกเซลลทเขาสภายในเซลลของสงมชวต เชน ไฟบรน (Fibrin) และธรอมบรน (Thrombin) ชวยใหเลอดเกดการแขงตว อมมโนโกลบลน (Immunoglobulin) เปนสารภมตานทาน เปนตน
2.6 เอนไซม (enzymes) ท าหนาท เรงปฏกรยาเคมจ าเพาะ โดยเฉพาะเมแทบอลซมในสงมชวต
2.7 โปรตนสงสญญาณ (signaling proteins) หรอฮอรโมน ท าหนาท ชวยสอสารใหเกดการท างานระหวางเซลลและอวยวะตาง ๆ ไดแก อนซลน ชวยควบคมระดบน าตาลในเลอด
2.8 โปรตนตวรบ (receptor proteins) ท าหนาท รบสงสญญาณไปยงบรเวณของเซลลทตอบสนองสญญาณได เชน โรดอปซน (Rhodopsin) พบบรเวณเรทนา (retina) ทดวงตา จะตอบสนองตอแสง และตวรบอนซลน (Insulin receptor) ชวยใหเซลลในตบตอบสนองตออนซลน เปนตน
2.9 โปรตนทควบคมการแสดงออกของจน (gene regulatory proteins) ท าหนาทเกยวของกบการแสดงออกของจน
2.10 โปรตนทเปนพษ (toxic proteins) เปนโปรตนทเปนพษ เชน พษจากเชออหวาตและพษง เปนตน
97
การตรวจสอบโปรตน
โครงสรางโปรตนประกอบดวยกรดแอมโนทเชอมตอกนดวยพนธะเพปไทด สวนมากปฏกรยาจะเกดทหมแอมโน ท าปฏกรยาการเกดส (color reactions) ไดสารละลายทมส โดยใชทดสอบโปรตนหรอพนธะเพปไทดได
1. ปฏกรยาไบยเรต (Biuret reaction)
รเอเจนต ประกอบดวยสารละลายคอปเพอรซลเฟต (Copper sulfate, CuSO4) เจอจาง ในสารละลายเบส เชน โซเดยมไฮดรอกไซด (Sodium hydroxide, NaOH) หรอโพแทสเซยมไฮดรอกไซด (Potassium hydroxide, KOH) ปรมาณมากเกนพอ เมอท าปฏกรยากบโปรตนซงมพนธะเพปไทด จะไดสารละลายสมวงแดงหรอสน าเงนมวง เนองจากเกดสารประกอบเชงซอนระหวางคอปเพอร (II) ไอออน (Cu2+) กบอะตอมไนโตรเจนของพนธะเพปไทดตงแต 2 พนธะขนไป ดงภาพท 3.23 วธนสามารถประยกตใชวเคราะหหาปรมาณโปรตนในสารละลายได วธทนยม ไดแก การหาปรมาณบซเอ (Bicinchoninic acid, BCA assay) (Bainor, et al., 2011, pp. 310-312) การหาปรมาณโดยโลวร (Lowry assay) (Sargent, 1987, pp. 476-481) และการหาปรมาณโดยแบรดฟอรด (Bradford assay) ซงวธดงกลาววเคราะหดวยเทคนคทางสเปกโทรสโกป โดยวดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 540 นาโนเมตร
NHO
RHN
O
RNH
O
NHO
RNH
OR
NHO
Cu2+
ภาพท 3.23 การเกดสารประกอบเชงซอนของโปรตนดวยปฏกรยาไบยเรต
2. ปฏกรยากบรเอเจนตนนไฮดรน (ninhydrin reagent)
นอกจากกรดแอมโนท าปฏกรยากบรเอเจนตนนไฮดรนแลว เพปไทดและโปรตนกสามารถท าปฏกรยาไดเชนด ยวกน โดยจะปรากฏสารละลายสมวง สชมพ หรอสน าเงน กลไกดงภาพท 3.10
98
3. ปฏกรยามลลอน (Millon’s reaction)
รเอเจนตมลลอน ประกอบดวยเมอรควรกไนเทรต (Mercuric nitrate) ในกรดไนทรก เปนปฏกรยาเกดเฉพาะกบฟนอลเทานน ดงนน โปรตนทมไทโรซนเปนองคประกอบ ปรอท (Hg2+) จะถกเตมเขาทต าแหนงออรโธ- (ortho-) ของหมไฮดรอกซลในไทโรซน เกดตะกอนสขาว แลวเปลยนเปน สแดงสมหลงจากใหความรอน
4. ปฏกรยาแซนโธโพรเทอก (Xanthoproteic reaction)
โปรตนทมองคประกอบของกรดแอมโนทเปนแอโรแมตก ไดแก ฟนลอะลานน ไทโรซน และทรปโทแฟน เมออนกบกรดไนทรกเขมขน จะเกดปฏกรยาไนเทรชน ไดเปนสารละลายสเหลอง และเมอปรบสารละลายใหเปนเบส แลวเปลยนเปนสารละลายสสม
5. การทดสอบวงของเฮลเลอร (Heller’s ring test)
วธนใชทดสอบแอลบมนในปสสาวะ โดยคอย ๆ เทกรดไนทรกเขมขนลงไปอยใตชนของสารละลายโปรตน จะท าใหโปรตนตกตะกอนเปนสขาวระหวางชน (University of Veterinary and Pharmaceutical Sciences Brno, 2014)
การแปลงสภาพของโปรตน
การคลายเกลยว (unfolding) ของโปรตน ท าใหหนาททางชวภาพบางประการของโปรตนเปลยนไป เกดการแขงตวและไมละลายน า เรยกวา การแปลงสภาพ เกดทงแบบถาวรหรอผนกลบได ซงปรากฏการณน พนธะเพปไทดจะไมถกท าลาย เชน การตมไข แอลบมนในไขขาวจะจบตวเปนกอน เปนตน ปจจยทมผลตอการตกตะกอนของโปรตน ดงน
1. การปรบสารละลายเปนคาพไอ โปรตนแตละชนดมคาพไอตางกน (ตารางท 3.4) เมอปรบคาความเปนกรด-เบสของสารละลายโปรตนใหเทากบคาพไอ โปรตนจะมการละลายนอยทสด วธนสามารถใชแยกโปรตนชนดหนงออกจากสารละลายผสมของโปรตนหลายชนดได โดยโปรตนทมคาพไอสงกวาหรอต ากวาจะยงคงสามารถละลายอยในสารละลายนน ๆ ได
2. การใชความรอน โดยทวไปการละลายของโปรตนจะลดลงเมออณหภมสงขน สงผลใหสมบตบางประการของโปรตนเปลยนแปลงไป เชน ไขขาวดบซงละลายน าได แตถาตมไขขาวใหสกแลว โปรตนในไขขาวจะแขงตว และไมละลายน า เปนตน การใชประโยชน เชน การท าความสะอาดเครองมอแพทยเพอฆาเชอโรค โดยใสในหมอนงอดความดนทอณหภม 120 องศาเซลเซยส ความรอนจะ
99
ท าใหโปรตนในแบคทเรยถกท าลาย หรอกรรมวธการท าโยเกรต โดยใหความรอนกบน านมทอณหภม 60 องศาเซลเซยส จะท าใหโปรตนในน านมแขงตว เปนตน
ตารางท 3.4 คาพไอของโปรตน
โปรตน คาพไอ โปรตน คาพไอ เพปซน <1.0 ซรมแอลบมน 4.9 อนซลน 5.1 โอแวลบมน 4.6 ไฟบรโนเจน 5.8 แกมมา-โกลบลน 6.6 คอลลาเจน 6.6 ฮโมโกลบน 7.1 ไรโบนวคลเอสเอ 7.8 ไลโซไซม 11.0 ไซโตโครมซ 10.6 ฮสโทน 10.8
ทมา (Bhat, Nagasampagi & Meenakshi, 2009, p. 5.27) 3. การใชตวท าละลายอนทรยทมพนธะไฮโดรเจน เชน เอธานอล และแอซโทน เปนตน กลไก
คาดวาเกดพนธะไฮโดรเจนระหวางตวท าละลายกบโปรตน ท าใหโปรตนเกดการแขงตว และละลายไดในน าลดลง การใชประโยชน เชน การเชดผวหนงดวยเอธานอลกอนฉดยา ซงเอธานอลจะท าใหโปรตนในแบคทเรยแปลงสภาพ เกดการแขงตว จงเปนการฆาเชอโรคได เปนตน
4. การใชแคตไอออน การตกตะกอนดวยแคตไอออนควรปรบคาความเปนกรด-เบสของสารละลายโปรตนใหสงกวาคาพไอกอน เพอใหโปรตนอยในรปไอออนลบ จากนนท าปฏกรยาตอกบแคตไอออน เกดเปนสารประกอบเชงซอนทไมละลายน าและตกตะกอนออกมา
5. การใชแอนไอออน การตกตะกอนดวยแอนไอออนควรปรบคาความเปนกรด-เบสของสารละลายโปรตนใหต ากวาคาพไอกอน เพอใหโปรตนอยในรปไอออนบวก ซงหลงจากท าปฏกรยากบแอนไอออน ท าใหโปตนมสภาพเปนกลางและตกตะกอนออกมา
6. การใชเกลอของโลหะหนก เชน ปรอท (Hg2+) ตะกว (Pb2+) แคดเมยม (Cd2+) และเงน (Ag+) เปนตน โดยไอออนเหลานจะท าปฏกรยากบหมคารบอกซเลตของโปรตน เกดเปนเกลอท ไมละลายน า ดงสมการ (3.20) ท าใหโปรตนตกตะกอน การใชประโยชน เชน การน าไขขาวดบเพอก าจดโลหะตะกวหรอปรอททเขาสรางกาย โดยการอาเจยนออกมา ซงเปนการปฐมพยาบาลเบองตนกอนน าไปพบแพทยตอไป
100
H3NHN O
O
R1
R2
O
Ag H3NHN O
O
R1
R2
O
Ag+ (3.20)
7. การใชสารละลายเกลอบางชนดทเขมขน เชน สารละลายเขมขนแอมโมเนยมซลเฟต
[Ammonium sulfate, (NH4)2SO4] ท าใหโปรตนละลายไดนอยลง เกดการตกตะกอน เพราะไอออนของเกลอจะก าจดน าออกจากโปรตน แตการเปลยนแปลงลกษณะเชนนไมจดเปนการแปลงสภาพโปรตน เพราะโปรตนสามารถคนสภาพเดมไดงาย และโครงสรางโปรตนไมเปลยนแปลงไปจากเดม
เมแทบอลซมของโปรตน
โปรตนจะถกยอยและแปลงสภาพในขนแรกทกระเพาะอาหารและในล าไสเลกสวนตน ดวยเอนไซมทมความจ าเพาะสง เชน เพปซน (Pepsin) ไคโมทรปซน (Chrymotrypsin) และทรปซน (Trypsin) เปนตน ไดเพปไทด และกรดแอมโน จากนนจะถกดดซมในล าไสเลก แลวเขาสกระแสเลอด โดยโปรตน 1 กรม เมอถกยอยจนสมบรณ จะไดพลงงาน 4 กโลแคลอร (สถาบนพลศกษา วทยาเขตสพรรณบร, 2557, หนา 222) และ 1 ใน 4 ของอาหารประเภทโปรตนเทานน ทรางกายไดรบในแตละวน จะถกเปลยนเปนกลโคส สวนทเหลอจะน าไปสงเคราะหกรดแอมโน โปรตน และโมเลกลชวภาพ ทจ าเปนตอการด ารงชวต รวมทงเกดการสลาย ไดเปนสารตงตนเขาสวฏจกรตาง ๆ ดงภาพท 3.24
101
ภาพท 3.24 ภาพรวมของเมแทบอลซมของกรดแอมโนและโปรตน ทมา (ดดแปลงจาก สถาบนพลศกษา วทยาเขตสพรรณบร, 2557, หนา 222)
บทสรป
กรดแอมโนประกอบดวยหมแอมโนต าแหนงแอลฟา- หมคารบอกซล และโซขาง โครงสรางพบโครงแบบชนดแอล- มากกวาชนดด- แบงเปน 3 กลม ไดแก กรดแอมโนเปนกรด กรดแอมโนเปนเบส และกรดแอมโนเปนกลาง ซงกรดแอมโนทจ าเปนมทงหมด 10 ชนด โครงสรางรปสวตเตอรไอออน มคณสมบตเปนไดทงกรดและเบส เรยกวา แอมโฟเทอรก ละลายน าได และเปนสารละลายบฟเฟอร แตเมอผลรวมของประจเปนศนย เรยกวา จดไอโซอเลกทรก คาความเปนกรด-เบสของสารละลายขณะนน เรยกวา คาพไอ ท าใหการละลายของโปรตนนอยลง จนเกดการตกตะกอน เรยกวา โปรตนถกแปลงสภาพ นอกจากน กรดแอมโนยงมคณสมบตการหมนเชงแสงและการดดกลนรงสยวเฉพาะ ปฏกรยาของกรดแอมโนเกดไดทหมแอมโน หมคารบอกซล และโซขาง เมอกรดแอมโนหลายชนดตอกนดวยพนธะเพปไทดเปนโซยาว จะไดพอลเพปไทดหรอโปรตน หลงจากโปรตนเกดเมแทบอลซมในรางกาย จนไดกรดแอมโนแลว จะถกสลายโดยอาศย 2 วถ ไดแก วถไนโตรเจน และวถโครงคารบอน โปรตนแบงตามลกษณะโครงสรางได 4 ระดบ ไดแก ระดบปฐมภม ซงเปนโซตรง ระดบทตยภม แบงเปน
102
แอลฟา-ฮลกซและแผนพลต-บตา ระดบตตยภม แบงเปนโปรตนเสนใยและโปรตนกอนกลม หรอเรยกวาโปรตนเชงเดยว และระดบจตรภม เนองจากเกดแรงยดเหนยวระหวางโมเลกล โดยเฉพาะพนธะไฮโดรเจน กรณโครงสรางโปรตนทเชอมพนธะกบสารอนทไมใชโปรตน เรยกวา หมพรอสเทตก จะเรยกโปรตนนนวา โปรตนสงยค โดยการเรยงล าดบและชนดของกรดแอมโนในโซโปรตน จะท าใหมหนาททางชวภาพตางกน วธการตรวจสอบโปรตนทนยม ไดแก ปฏกรยาไบยเรต เกดสารละลายสมวงแดง หรอสน าเงนมวง
103
ค าถามทายบท
1. ก าหนดโครงสราง สารใดไมใชกรดแอมโน
COOHNH2
NH
COOH
NH2 HNHO
COOHNH
COOH
2. กรดแอมโนทก าหนดใหมคณสมบตเปนกรด เบส หรอกลาง
H2N
HC
H2C
CO2H
HNN
H2N
HC
CH2CO2H
CO2H
H2NHC CO2H
(CH2)3-NH-C=NH
NH2
H2N
HC CO2H
CH2-C-NH2
O
H2N
HC CO2H
3. จงเขยนโครงสรางรปสวตเตอรไอออนของเซอรน 4. จงเขยนโครงสรางของกรดกลทามกเมออยในสารละลายกรดและสารละลายเบส 5. จงเขยนผลตภณฑทเกดขน
5.1 เมอฟนลอะลานนท าปฏกรยากบเบนซลคลอไรด (Benzyl chloride) 5.2 เมออารจนนท าปฏกรยากบกรดไนทรส
6. ถาโปรตนประกอบดวยซสทอน จะเกดแรงยดเหนยวระหวางโมเลกลอะไรบาง ทท าใหเกดโครงสรางระดบทตยภม
7. จงเขยนโครงสรางของโปรตนทมกรดแอมโนตอเรยงกน ดงน Ala-Thr-Leu-Gly 8. จากโครงสรางในขอ 7 มพนธะเพปไทดกท ใชลกศรชต าแหนงใหชดเจน 9. คาพไอของอนซลน เทากบ 5.1 หมายความวาอยางไร 10. ก าหนดโครงสราง เมอเกดการแยกสลายดวยน าอยางสมบรณ จงเขยนมอนอเมอรของกรดแอมโน
HO NH
HN
O
NH2
O SH
OOH
O
11. เมอหยดน าผงปรมาณหนงลงในน านมถวเหลอง ผลปรากฏวาเกดการตกตะกอน จงอธบาย 12. จากขอ 11 จงบอกผลการทดลอง เมอน าตะกอนทเกดขนไปท าปฏกรยากบไบยเรต 13. จงบอกปจจยทท าใหโปรตนเกดการแปลงสภาพ 14. จงบอกหนาททางชวภาพของโปรตนทก าหนดใหตอไปน
ไมโอซน ฮโมโกลบน อลาสทน ธรอมบน โรดอปซน และคอลลาเจน
104
15. น าไขขาวมาทดสอบกบรเอเจนตตาง ๆ ใหผลดงตาราง
การทดสอบ ผลการทดสอบ
กอนการแยกสลายดวยน า หลงการแยกสลายดวยน า
ปฏกรยาไบยเรต ไดสารละลายสมวง ไดสารละลายสฟา ปฏกรยามลลอน ไมเกดการเปลยนแปลง เกดตะกอนสขาวเลกนอย ปฏกรยาแซนโธโพรเทอก ไมเกดการเปลยนแปลง ไมเกดการเปลยนแปลง การทดสอบวงของเฮลเลอร เกดตะกอนระหวางชน สารละลายใสไมมส
จงตอบค าถามตอไปน 15.1 โปรตนในไขขาวเกดการแยกสลายดวยน าไดหรอไม เพราะเหตใด 15.2 ทานคดวามไทโรซนในสายโปรตนหรอไม จงอธบาย 15.3 ทานสามารถสรปผลการทดสอบไดอยางไร