บทท 3 กรดแอมโนและโปรตน

โปรตนเปนแหลงสะสมพลงงานทส าคญของเซลลและเปนโมเลกลชวภาพขนาดใหญ พบในสงมชวตทกชนด เชน เนอปลา พบรอยละ 13 น านม รอยละ 3 และถวเหลอง รอยละ 36 เปนตน หรอเปนองคประกอบในอวยวะของสงมชวต เชน เคราทน (Keratin) ในผวหนงและเลบ และคอลลาเจน (Collagen) ในกลามเนอ เปนตน โปรตนมหนาททางชวภาพ (biological function) แตกตางกน เชน เปนเอนไซมและฮอรโมนชวยเรงปฏกรยาการท างานภายในสงมชวต ชวยล าเลยงแกสออกซเจนจากปอดไปสหวใจและเซลลตาง ๆ และล าเลยงแกสคารบอนไดออกไซดจากเซลลกลบไปยงปอด ชวยท าใหกลามเนอยดหยนและเกดการเคลอนไหว เปนตน โดยคณสมบตตาง ๆ เหลานขนอยกบชนดและล าดบของกรดแอมโนในโซโปรตน ซงเปนหนวยยอยเลกทสดของโปรตน

แอลฟา-กรดแอมโน

ลกษณะสตรโครงสรางทวไปของกรดแอมโน ประกอบดวยหมแอมโนอยทต าแหนงแอลฟา- ของหมคารบอกซล ดงภาพท 3.1 จงเรยกวา แอลฟา-กรดแอมโน และโซขาง (side chain) หรอหมแทนท (R) ซงแตกตางกนในกรดแอมโนแตละชนด ในธรรมชาตสวนมากพบกรดแอมโนโครงแบบชนดแอล- โดยเทยบกบภาพฉายแบบฟสเชอรของเซอรน (Serine) มหมแอมโนอยดานซาย ซงมความสมพนธกบแอล-กลเซอแรลดไฮด ยกเวน ในแบคทเรยและแมลงบางชนดจะพบกรดแอมโนโครงแบบชนดด- มากกวา

H2N HCOOH

CH2OHHO H

CHO

CH2OH

L-Serine L-Glyceraldehyde

H2N HCOOH

R

-amino acid

carboxyl group

amino groupside chain

ภาพท 3.1 ภาพฉายแบบฟสเชอรของแอล-เซอรน เทยบกบแอล-กลเซอแรลดไฮด

66

การเรยกชอและการจ าแนกกรดแอมโน

รางกายของสงมชวตชนสงจะไมสามารถสงเคราะหกรดแอมโนไดเองทงหมด เพอใชสรางโปรตน แตสามารถไดจากการบรโภคอาหารเขาไป จงเรยกกรดแอมโนเหลานวา กรดแอมโนจ าเปน (essential amino acids) มทงหมด 10 ชนด ไดแก วาลน (Valine) ลวซน (Leucine) ไอโซลวซน (Isoleucine) ฮสทดน (Histidine) อารจนน (Arginine) เมไธโอนน (Methionine) ฟนลอะลานน (Phenylalanine) เธรโอนน (Threonine) ทรปโทแฟน (Tryptophan) และไลซน (Lysine) จากกรดแอมโนทงหมดในธรรมชาต สวนใหญโครงสรางพบหมแอมโนและหมคารบอกซลอยางละ 1 หม เรยกวา กรดแอมโนเปนกลาง (neutral amino acids) สวนกรดแอมโนบางชนดมหมแอมโน 1 หม และหมคารบอกซล 2 หม เรยกวา กรดแอมโนเปนกรด (acidic amino acids) และกรดแอมโน ทมหมแอมโนมากกวาหมคารบอกซล เรยกวา กรดแอมโนเปนเบส (basic amino acids) การเรยกชอกรดแอมโน นยมเรยกชอสามญ และสามารถเขยนค ายอ จากอกษรภาษาองกฤษ 3 พยางคแรก ยกเวน ทรปโทแฟน ยอเปน “Trp” ไอโซลวซน ยอเปน “Ile” แอสพาราจน (Asparagine) ยอเปน “Asn” ไฮดรอกซโพรลน (Hydroxyproline) ยอเปน “Hyp” หรอใชอกษรภาษาองกฤษพมพใหญตวเดยวแทนกรดแอมโนของแตละชนด ดงตารางท 3.1 ตารางท 3.1 แอล-กรดแอมโนสามญ

กรดแอมโน (ชอเตม/ค ายอ) โครงสราง

ชอแอมน , * พไอ pKa

-COOH -NH2 -R

กรดแอมโนเปนกรด แอล-กรดแอสพารทก (L-Aspartic acid/ Asp (D))

H2NHC

CH2CO2H

CO2H

บตา-อะลานน (-Alanine)

+6.7o 3.0 1.89 9.60 3.65

แอล-กรดกลทามก (L-Glutamic acid/ Glu (E))

H2NHC

CH2CH2CO2H

CO2H

แกมมา-อะมโนบวทรกแอซด (-Amino- butyric acid ,GABA)

+17.7o 3.2 2.19 9.67 4.25

กรดแอมโนเปนเบส แอล-ฮสทดน (L-Histidine/ His (H))

H2NHC

H2C

CO2H

HNN

ฮสทามน (Histamine) -59.8o 7.5 1.80 9.17 6.00

67

ตารางท 3.1 แอล-กรดแอมโนสามญ (ตอ)

กรดแอมโน (ชอเตม/ค ายอ) โครงสราง

ชอแอมน , * พไอ pKa

-COOH -NH2 -R

แอล-ไลซน (L-Lysine/ Lys (K))

H2NHC CO2H

CH2(CH2)3NH2

คาดาวรน-1.5-ไดแอม-โนเพนเทน(Cadaverine-1,5-diamino pentane)

+19.7o 9.6 2.18 8.95 10.52

แอล-อารจนน (L-Arginine, Arg (R))

H2NHC CO2H

(CH2)3-NH-C=NH

NH2

4-กวนโดบวทลแอมน (4-Guanido- butylamine)

+21.8o 11.2 2.17 9.04 12.48

กรดแอมโนเปนกลาง แอล-ซสทน (L-Cystine/ Cys)

CH2-CH-CO 2HS

NH2

CH2-CH-CO 2HS

NH2

- -509o (1 M HCl)

5.0

แอล-ซสทอน (L-Cysteine/ Cys (C))

H2NHC CO2H

CH2SH

2-เมอรแคปโทเอธล- แอมน (2-Mercapto- ethylamine)

-20.0o 5.1 1.96 8.18 10.29

แอล-แอสพาราจน (L-Asparagine/ Asn (N))

H2NHC CO2H

CH2-C-NH2

O

บตา-อะลานลแอมน (-Alanyl amine)

-7.4o 5.4 2.01 8.80

แอล-เธรโอนน (L-Theonine/ Thr (T))

H2NHC CO2H

CH3HO

2-ไฮดรอกซโพรพล- แอมน (2-Hydroxy- propyl amine)

-33.9o 5.6 2.11 9.62 13.60

แอล-เซอรน (L-Serine/ Ser (S))

H2NHC CO2H

CH2-OH

เอธานอลแอมน(Ethanolamine)

-7.9o 5.7 2.21 9.95 13.60

แอล-กลทามน (L-Glutamine/ Gln (Q))

H2NHC CO2H

CH2-CH2C-NH2

O

แกมมา-แอมโนบวทรา-

ไมด (-Amino- Butyramide)

+9.2o 5.7 2.17 9.13

68

ตารางท 3.1 แอล-กรดแอมโนสามญ (ตอ)

กรดแอมโน (ชอเตม/ค ายอ) โครงสราง

ชอแอมน , * พไอ pKa

-COOH -NH2 -R

แอล-เมไธโอนน (L-Methionine/ Met (H))

H2NHC CO2H

CH2-CH2-SCH3

3-เมธลเมอรแคปโท- โพรพลแอมน (3-Methylmercapto-propylamine)

-14.9o 5.7 2.28 9.20

แอล-ไทโรซน (L-Tyrosine/ Tyr (T))

H2NHC CO2H

OH

ไทแรมน (Tyramine) -18o 5.7 2.20 9.11 10.06

แอล-โพรลน (L-Proline/ Pro (P))

NH

CO2H

ไพรโรลดน (Pyrrolidine)

-99.2o 6.3 1.99 10.9

แอล-ไฮดรอกซโพรลน (L-Hydroxyproline/ Hyp)

NH

CO2H

HO

-99.6o 5.7

แอล-ทรปโทแฟน (L-Tryptophan/ Trp (W))

H2NHC CO2H

NH

ทรปแทมน (Tryptamine)

-68.8o 5.9 2.38 9.39

ไกลซน (Glycine/ Gly (G))

H2NH2C CO2H

6.0

แอล-อะลานน (L-Alanine/ Ala (A))

H2NHC

CH3

CO2H

เอธลแอมน(Ethylamine)

+1.6o 6.0 2.34 9.69

แอล-วาลน (L-Valine/ Val (V))

H2NHC CO2H

ไอโซบวทลแอมน (iso-Butylamine)

+6.6o 6.0 2.32 9.61

แอล-ลวซน (L-Leucine/ Leu (L))

H2NHC CO2H

3-เมธลบวทลแอมน (3-Methylbutyl- amine)

+14.4o 6.0 2.36 9.60

69

ตารางท 3.1 แอล-กรดแอมโนสามญ (ตอ)

กรดแอมโน (ชอเตม/ค ายอ) โครงสราง

ชอแอมน , * พไอ pKa

-COOH -NH2 -R

แอล-ไอโซลวซน (L-Isoleucine/ Ile (I))

H2NHC CO2H

2-เมธลบวทลแอมน (2-Methylbutyl- amine)

+16.3o 6.0 2.35 9.89

แอล-ฟนลอะลานน (L-Phenylalanine/ Phe (F))

H2NHC CO2H

ฟนลเอธลแอมน(Phenylethylamine)

-57.0o 5.5 1.83 9.12

*คาการหมนเชงแสงวดในสารละลายน าทความเขมขน 1-2 กรม ตอ 100 มลลลตร

ทมา (Bhat, Nagasampagi & Meenakshi, 2009, pp. 5.2-5.4; Dewick, 2006, pp. 500-501; Torssell, 1997, pp. 314-315)

อยางไรกตาม ในธรรมชาตอาจพบสตรโครงสรางทมลกษณะเหมอนกบกรดแอมโน แตไมใช

กรดแอมโนและไมเปนสวนประกอบในโปรตน ซงมประมาณ 300 ชนด เชน บตา-ไซยาโนอะลานน (-Cyanoalanine) และเบทาอน (Betaine) เปนตน ดงภาพท 3.2 ซงชวสงเคราะหของสารดงกลาว คาดวาเกดจากกรดแอมโนแทจรง (true amino acid) เปนสารตงตน ดงภาพท 3.3

Cyclopent-2-en-1-yl glycine

NC-CH2-CH-COOHNH2

-Cyanoalanine

(CH3)3N-CH2-COO

Betaine

COOH

NH2

Hypoglycine

NH

COOH

Azetidine

HO COOH

NH2

Homoserine

H3C

COOHH2N

ภาพท 3.2 ตวอยางสารทมลกษณะเหมอนกบแอลฟา-กรดแอมโน แตไมเปนแอลฟา-กรดแอมโน

70

NC-CH2-CH-COOHNH2

-Cyanoalanine

(CH3)3N-CH2-COO

Betaine

H2C CS

NH2

HCOOH PLP

(Pyridoxal phophate)

COOH

NCH

PLP

CN

H2O

NH2-CH2-COOH[CH3] NH-CH2-COOH

CH3

[CH3] N-CH2-COOHCH3

CH3 [CH3]

[O]

(CH3)3N-CH2-CH2OH1. [CH3]2. H2O

NH2-CH2-CH2OP1. ATP2. -CO2

HO-CH2-CH-COOHNH2

Serine

Glycine

Cycteine

Sarcosine Dimethylglycine

Choline-Aminoethylphosphate

H

ภาพท 3.3 ชวสงเคราะหบตา-ไซยาโนอะลานนและเบทาอน ทมา (ดดแปลงจาก Torssell, 1997, pp. 318-319) การแตกตวของกรดแอมโน

โครงสรางกรดแอมโนประกอบดวยหมแอมโนทมคณสมบตเปนเบส และหมคารบอกซลทมคณสมบตเปนกรด มลกษณะของไอออนขวค (dipolar ion) ในสถานะของแขงจะอยในรปสวตเตอรไอออน (zwitterionic form) โดยหมแอมโนจะรบโปรตอน (H+) จากหมคารบอกซล เกดแอมมเนยมไอออน (Amminium ion, NH3

+) และคารบอกซเลตไอออน ดงภาพท 3.4 ซงรปสวตเตอรไอออนจะเปลยนไป ขนอยกบความเปนกรด-เบสของสารละลาย

RHC

NH3

COO

ภาพท 3.4 รปสวตเตอรไอออนของกรดแอมโน

กรณในสภาวะกรด กรดแอมโนจะท าหนาทเปนเบส โดยคารบอกซเลตไอออนรบโปรตอนจากกรด ท าใหรปสวตเตอรไอออนของกรดแอมโนเปลยนเปนรปไอออนบวก (cationic form) ดงสมการ (3.1) แตในสภาวะเบส กรดแอมโนจะท าหนาทเปนกรด โดยแอมมเนยมไอออนจะใหโปรตอนแกเบส

71

ซงรปสวตเตอรไอออนจะเปลยนเปนรปไอออนลบ (anionic form) ดงนน กรดแอมโนจงเปนไดทงกรดและเบส เรยกสารหลานวา แอมโฟเทอรก (amphoteric) ดงสมการ (3.2)

R

HCNH3

COO + H R HCNH3

COOH (3.1)

RHCNH3

COO + OH RHCNH2

COO + H2O (3.2)

เมอกรดแอมโนมผลรวมประจเปนศนย เรยกวา จดไอโซอเลกทรก (Isoelectric point) ซง คาความเปนกรด-เบสของสารละลาย เรยกวา ไอโซอเลกทรกพเอชหรอพไอ (Isoelectric pH หรอ pI) ซงเปนคณสมบตเฉพาะของกรดแอมโนแตละชนด ดงตารางท 3.1 เชน ไกลซน มคาพไอ เทากบ 5.97 อยในรปสวตเตอรไอออน แตเมออยในสารละลายทมคาความเปนกรด-เบส เทากบ 2.34 จะท าใหเปลยนเปนรปไอออนบวก แตเมออยในสารละลายคาความเปนกรด-เบส เทากบ 9.60 จะเปลยนเปน รปไอออนลบ ดงสมการ (3.3) (Bhat, Nagasampagi & Meenakshi, 2009, p. 5.4)

CH3N COOHH

HCH3N COOH

HpKa1 CH2N COOH

HpKa2

2.34 + 9.602

pI =

= 5.97

pH 2.34 pH 9.60

(3.3)

กรดแอสพารทก ซงโครงสรางมหมคารบอกซลมากกวา 1 หม เมออยในสารละลายกรดแกทมคาความเปนกรด-เบส เทากบ 2.10 โครงสรางจะอยในรปไอออนบวกหนงประจ (monocationic form) ซงหมคารบอกซลทงสองหมจะไมเกดการแตกตวใหโปรตอนได จนกระทงมคาความเปน กรดเบส เทากบ 3.90 เนองจากหมคารบอกซลกทต าแหนงบตา- จะแตกตวใหโปรตอน ดงนน คาพไอของกรดแอสพารทก เทากบ 3.0 และเมอสารละลายมคาความเปนกรด-เบส เทากบ 10 จะท าใหอยในรปไอออนลบสองประจ (dianionic form) ดงสมการ (3.4) (Bhat, Nagasampagi & Meenakshi, 2009, p. 5.5)

72

CH3N COOHH

CH2COOHCH3N COOH

CH2COOHpKa1CH3N COOH

CH2COOpKa2

2.10 + 3.902

pI =

= 3.00

pH 2.10 pH 3.90

+ H

pKa3

CH2N COOH

CH2COO

pH 10.00

(3.4)

ส าหรบประโยชนของคาพไอ คอ การแยกสารผสมเชงซอนของกรดแอมโน โดยใชเทคนคซงเรยกวา การเคลอนสขวไฟฟา (electrophoresis)

คณสมบตของกรดแอมโน

กรดแอมโนมสถานะเปนของแขงไมมส มคณสมบตทวไป ดงน 1. จดหลอมเหลว กรดแอมโนมจดหลอมเหลวคอนขางสง จงอาจสลายตว (decomposed) ได

ขณะเกดการหลอม 2. การละลาย เมอกรดแอมโนละลายไดในน า จะแตกตวใหประจ หรอละลายในตวท าละลายอนทรยบางชนดทมขว ไดแก แอลกอฮอล 3. การดดกลนรงสยว กรดแอมโนสวนมากจะดดกลนแสงยวทความยาวคลน 220 นาโนเมตร ยกเวน โครงสรางทมวงแอโรแมตก ไดแก ไทโรซน ทรปโทแฟน และฟนลอะลานน จะดดกลนรงสยวในชวงความยาวคลน 260-280 นาโนเมตร ดงภาพท 3.5 (ดาวลย ฉมภ, 2553, หนา 112) ดงนน จงสามารถวเคราะหหาปรมาณกรดแอมโนในโปรตนได 4. การหมนเชงแสง กรดแอมโนทกชนดทโมเลกลเปนอสมมาตร (asymmetry) ยกเวน ไกลซน สามารถมคณสมบตการหมนเชงแสง [] เชนเดยวกบมอโนแซกคาไรด ซงขนกบคาความเปนกรด-เบสของสารละลายและโซขาง ถามทศทางหมนระนาบแสงไปทางขวา เรยกวา เดกซโทรโรทาทอร หรอ “d- หรอ (+)” เชน แอล-อารจนน คา [] เทากบ +21.8 องศา หรอกรณมทศทางการหมนไปทางซาย เรยกวา เลโวโรทาทอร หรอ “l- หรอ (-)” เชน แอล-ฟนลอะลานน คา [] เทากบ -57 องศา (Bhat, Nagasampagi & Meenakshi, 2009, pp. 5.2, 5.4) (ตารางท 3.1) แตถาเปนสารผสมของกรดแอมโน (+) และ (-) ในปรมาณโมลาร (molar) เทากน จะไมมคาการหมนเชงแสง

73

ภาพท 3.5 สเปกตรมการดดกลนแสงยวของทรปโทแฟน ไทโรซน และฟนลอะลานน ทมา (Malnasi-Csimadia, 2014) 5. บฟเฟอร (buffer) เมอกรดแอมโนละลายน า จะอยในรปสวตเตอรไอออน มทงประจบวกของแอมมเนยมไอออน ซงมคณสมบตเปนเบสออน และประจลบของคารบอกซเลตไออน เปนกรดออน ท าใหเปนสารละลายบฟเฟอร ทงนขนอยกบโซขางของกรดแอมโน ทส าคญ ไดแก หมอมดาโซล (imidazole) ของฮสทดน

หนาททางชวภาพของกรดแอมโน

กรดแอมโนชนดตาง ๆ พบในเซลลเนอเยอและของเหลว ไดแก เลอดของสงมชวต ซงมบทบาทหนาทส าคญตาง ๆ เชน เปนสารตงตนในการสงเคราะหพอลเพปไทด (polypeptide) หรอโปรตน ใหพลงงาน ชวยสงเคราะหกลโคส หรอเกบสะสมในรปของไขมน เปนตน นอกจากน ยงท าหนาท ทางชวภาพเฉพาะ ดงน

- ไกลซน เปนสารสอประสาท (neurotransmitter) เชนเดยวกบเซโรโทนน (Serotonin, 3.1) ดงภาพท 3.6 ซงเปนอนพนธของทรปโทแฟน โดยเซโรโทนนจะใชเปนสารตงตนเพอสงเคราะหฮอรโมนเมลาโทนน (Melatonin, 3.2) ท าหนาทเปนสารสอประสาท ถาถกกระตนใหหลงออกมามาก จะท าใหมความรสกตนตวลดลงหรอเฉอยชา (Coto-Montes, et al., 2012, pp. 12-13) นอกจากน ไกลซนยงใชเปนสารตงตนสงเคราะหโครงสรางทมธาตเหลก

- ไทโรซน เปนสารตงตนในการท าปฏกรยากบไอโอดน ไดฮอรโมนไธรอกซน (Thyroxine hormone, 3.3) หรอไทรอยดฮอรโมน ดงภาพท 3.6 ชวยควบคมการเจรญเตบโตและการเผาผลาญอาหารในรางกาย

74

- อารจนน เปนสารตงตนรวมกบไกลซนในชวสงเคราะหครเอทน (Creatine, 3.4) ดงภาพท 3.6 ซงถกเกบสะสมไวในกลามเนอและหวใจ

- เมไธโอนน ใชเปนสารตงตนในการสงเคราะหเอส-อะดโนซลเมไธโอนน ท าใหเกดการยายหมเมธลในชวสงเคราะหเมแทบอไลต

- ซสทอน ใชเปนสารตงตนในชวสงเคราะหกลทาไธโอน (Glutathione, 3.5) ดงภาพท 3.6 โดยมกลทามนและไกลซนท างานรวมดวย กลทาไธโอนเปนไทรเพปไทด (tripeptide) ท าหนาทขนสงกรดแอมโนผานผนงเซลล เปนโคเฟกเตอรของเอนไซมบางชนด และมผลใหเซลลเมดเลอดแดงคงสภาพอย (Minich, Smith, Brauner & Majerus, 1971, pp. 507-513)

นอกจากน ชวสงเคราะหแอลคาลอยด สวนมากจะใชกรดแอมโนเปนสารตงตน เชน ไลซน เปน

สารตงตนในชวสงเคราะหแอลคาลอยดกลมพเพอรดน (piperidine) กลมควโนลซดน (quinolizidine) และกลมอนโดลซดน (indolizidine) เปนตน ศกษาเพมเตมในบทท 6 ถงบทท 8

O

I

I I

CH2-CH-COOHNH2

I

Thyroxine hormone (3.3)

NH

NH2

HO

Serotonin (3.1)

NH

HN

H3CO

Melatonin (3.2)

CH3

ONCH3

H2N

NHOH

O

Creatine (3.4)

Glutathione (3.5)

HO NH

HN

O

NH2

O SH

OOH

O

ภาพท 3.6 โครงสรางสารทเกดจากชวสงเคราะหโดยกรดแอมโนเปนสารตงตน

การผลตกรดแอมโนในทางอตสาหกรรม

กรดแอมโนใชในอตสาหกรรมอาหารรอยละ 97 และประมาณรอยละ 3 ใชในอตสาหกรรมยา เครองส าอาง และใชเปนสารตงตนในอตสาหกรรมเคมสงเคราะห ปจจบน กรดแอมโนหลายชนด ถกผลตขนทงจากวธการสงเคราะหทางเคม (chemical synthesis) ไดแก ปฏกรยาของสเทรกเกอร (Strecker’s reaction) ปฏกรยาเฮลล โวลฮารด เซลนสก (Hell-Volhard-Zelinsky reaction) ปฏกรยาของแกเบรยล (Grabriel’s reaction) และปฏกรยาเคอรเทยสหรอฮอฟแมนนเดกราเดชน

75

(Curtius reaction or Hofmann degradation) เปนตน และการแยกสลายดวยน าในสภาวะกรดและเบส โดยเฉพาะการผลตจากจลนทรย ซงเปนวธทนยมทสด ตวอยางกรดแอมโนทถกผลตในทางอตสาหกรรม (ตารางท 3.2) ดงน ตารางท 3.2 ตวอยางกรดแอมโนทถกผลตขนในทางอตสาหกรรม

กรดแอมโน วธการผลต

การประยกตใช 1 2 3

แอล-อะลานน √ √ สารเพมกลนและรส (flavor enhancer) แอล-กรดแอสพารทก √ √ สารเพมกลนรส การบ าบด (therapy) และ

การผลตแอสพารแทม (Aspartame) แอล-อารจนน √ √ สวนประกอบในเครองส าอาง การบ าบดรกษาผปวย

โรคตบ และการฉดยาเขาเสนเลอด (infusion) ดแอล-อะลานน √ สารเพมกลนในอตสาหกรรมเครองดม แอล-แอสพารราจน √ √ การบ าบดรกษา แอล-ซสทอน √ การผลตขนมปง ตวตานออกซเดชน และการรกษา

โรคหลอดลมอกเสบ (bronchititis) แอล-กรดกลทามก √ สารเพมรสชาต (taste enhancer) ไกลซน √ สวนประกอบของสารใหความหวาน แอล-ไอโซลวซน √ การฉดยาเขาเสนเลอด แอล-ลวซน √ √ การฉดยาเขาเสนเลอด แอล-ฮสทดน √ √ การบ าบดโรคแผลเปอยในกระเพาะอาหาร (ulcer) แอล-ไลซน √ สารเตมแตงในอาหารและการฉดยาเขาเสนเลอด ดแอล-เมไธโอนน √ สารเตมแตงในอาหาร แอล-ฟนลอะลานน √ การฉดยาเขาเสนเลอด แอล-เซอรน √ สวนประกอบในเครองส าอาง แอล-เธรโอนน √ สารเตมแตงในอาหาร แอล-ไทโรซน √ √ สารละลายแชและสารตงตนของการสงเคราะห

แอล-โดปา (L-DOPA) แอล-ออรนทน √ การบ าบดหรอรกษาโรคตบ แอล-วาลน √ การฉดยาเขาเสนเลอด

หมายเหต วธการผลต 1 คอ การแยกสลายดวยน า 2 คอ การสงเคราะหทางเคม และ 3 คอ การผลตจากจลนทรย

ทมา (Bhat, Nagasampagi & Meenakshi, 2009, p. 5.12)

76

1. กรดกลทามก

ป ค.ศ. 1908 นกวจยชาวญปนชอศาสตราจารย ดร. คคนาเอะ อเคดะ แหงมหาวทยาลยโตเกยวอมพเรยล คนพบกรดกลทามกเปนครงแรกจากการสกดสาหรายทะเลชอคอมบ (Japonica laminaria) มคณสมบตเพมรสชาตใหอาหาร และในป ค.ศ. 1957 นกวจยชาวญปนเชนกน พบวากรดกลทามกสามารถผลตไดจากกระบวนการหมกดวยจลนทรยคอรนแบคทเรยมกลทามคม (Corynebacterium glutamicum) โดยเปลยนแอลฟา-กรดคโทกลทารก (-Ketoglutaric acid) เปนกรดกลทามกดวยเอนไซมกลทามกดไฮโดรจเนส (Glutamic dehydrogenase) (สถาบนพลศกษา วทยาเขตสพรรณบร, 2557, หนา 227) ดงสมการ (3.5) ซงในปจจบน เปนกรรมวธทนยมใชผลตผงชรสหรอมอโนโซเดยมกลทาเมต (Monosodium glutamate) แหลงวตถดบ ไดแก แปงมนส าปะหลง และกากน าตาล (molasses)

Glutamic dehydrogenaseHO OH

O

O

O-Ketoglutaric acid

+ NH3 + NADH

HO OH

O

NH2

O

+ NAD+ + H2O

Glutamic acid (3.5)

2. ไลซน

ไลซนเปนกรดแอมโนทจ าเปนส าหรบมนษยในการซอมแซมเนอเยอและชวยการเจรญเตบโต ซงรางกายสรางไลซนเองไมได จงจ าเปนตองไดรบจากอาหาร พบมากในเนอแดง ถว ไข เนย และนม เปนตน ในปจจบน การผลตไลซนทางอตสาหกรรม เพอเปนสวนผสมในอาหารเสรม ม 3 วธ (Bhat, Nagasampagi & Meenakshi, 2009, pp. 5.13-5.14) ดงน

2.1 กระบวนการหมกโดยอาศยแบคทเรย นยมใชเชอแบคทเรย 2 สปชส กลาวคอ เรมตนจากการหมกกากน าตาลดวยอโคไล (E. coli) ไดเปนกรดไดแอมโนพเมลก (diaminopimelic acid, DAP) ในน าหมก แลวเกดดคารบอกซลเลชนโดยเอนไซมดเอพดคารบอกซเลส (DAP decarboxylase) จากแบคทเรยแอโรแบกเตอรแอโรจเนส (Aerobacter aerogenes) ซงเปนเอนไซมสามารถเกดเฉพาะกบเมโซ-ดเอพ (meso-DAP) เทานน จะไดแอล-ไลซน ดงภาพท 3.7

77

COOHNH2

CH2CH2CH2

NH2COOH

COOHNH2

CH2CH2CH2CH2

DAP decarboxylase(from Aerobacter aerogenes)

Diamonipimelic acid (DAP) L-Lysine

+ CO2

or meso-DAP

NH2

ภาพท 3.7 การผลตแอล-ไลซนจากกระบวนการหมกดวยเชอแบคทเรย ทมา (การผลตไลซนดวยดเอพดคารบอกซเลส, 2557)

2.2 การเปลยนดแอล-แอมโนคาโพรแลกแทม สารตงตน ไดแก ไซโคลเฮกซน

(Cyclohexene) ส าหรบสงเคราะหดแอล-แอลฟา-แอมโน-เอปซลอน-คาโพรแลกแทม (DL--amino--caprolactam) กอน หลงจากนน น ามาหมกกบแบคทเรยอะโครโมแบกเตอรอะบ (Achromobacter abae) ซงจะเปลยนเฉพาะโครงแบบชนดด- เปนโครงแบบชนดแอล- ของแอลฟา-แอมโน-เอปซลอน- คาโพรแลกแทมเทานน โดยอาศยเอนไซมราซเมสเฉพาะ แลวเมอถกสลายดวยเอนไซมไฮโดรเลสจากราครปโทคอกคสลอเรนทออะบ (Cryptococcus laurentii abae) จะไดแอล-ไลซน (ภาพท 3.8)

2.3 กระบวนการหมกโดยตรง โดยกลโคสและเอธานอล (Ethanol) เปนแหลงอะตอมคารบอนและอาศยแบคทเรย เชน เบรวแบคทเรยมแลกโทเฟอรเมนทม (B. lactofermentum) คอรนแบคทเรยมกลทามคม (Corynebacterium glutamicum) หรอเบรวแบคทเรยมฟลาวม (Brevibacterium flavum) จะไดแอล-ไลซน

78

NOClON Cl

NH3HO-N NH2

H HN

ONH2

DL--Amino--caprolactam

hydrolase

HN

ONH2

+ L-Lysine

DL--Amino--caprolactam

Achromobacter abaeand racemase

L--Amino--caprolactam

L-Lysine

Cryptococcus laurentii abae

Cyclohexene

ภาพท 3.8 การผลตแอล-ไลซนจากการเปลยนดแอล-แอลฟา-แอมโนคาโพรแลกแทม ทมา (ดดแปลงจาก Bhat, Nagasampagi & Meenakshi, 2009, p. 5.14)

ปฏกรยาของกรดแอมโน

กรดแอมโนประกอบดวยหมท าหนาท ไดแก หมแอมโน และหมคารบอกซล รวมทงโซขางทต าแหนงบตา- ซงสามารถเกดปฏกรยาเคม ดงน

1. ปฏกรยาทหมแอมโน

การเกดปฏกรยาทหมแอมโนของกรดแอมโน (Bhat, Nagasampagi & Meenakshi, 2009, pp. 5.14-5.18) ดงน

1.1 การเกดแอไมดอนพนธ หมแอมโนของกรดแอมโนมคณสมบตเปนเบส เมอท าปฏกรยากบแอซดคลอไรด (acid chloride) เชน เบนซลออกซคารบอนลคลอไรด (Benzyloxycarbonyl chloride) จะไดแอไมดอนพนธ ดงสมการ (3.6) หรอแอซดคลอไรดท าหนาทเปนรเอเจนตปองกนอะตอมไนโตรเจน (N-protecting reagent) ดงภาพท 3.9 เพอปองกนไมใหอะตอมไนโตรเจนเกดปฏกรยากอน ท าใหไดผลตภณฑตามตองการและเกดผลไดเปนรอยละ (%yield) สง แตตอง

79

สามารถก าจดหมปองกน (protecting group) นนออกไดดวย เชน หมเบนซลออกซคารบอนลคลอไรดถกก าจดออกไดโดยรดกชนหรอการแยกสลายดวยน าในสภาวะกรด เปนตน

R OHNH2

O

+R OHHN

O

O

O

+ HCl

N-Acetylated derivative

(3.6)N-acetylation

O Cl

O

Benzyloxycarbonyl chlorideamino acid

H3C SO

OCl

p-Toluene sulfonylchloride

H3C SO

OCl

Mesityl sulfonylchloride

OO2N S

OCH3

p-Nitrobenzyl tosylateO

N

O

O

CH2-Cl

Phthalimidomethyl chloride

Cl

Benzyl chloride

F

NO2O2N

2,4-Dinitrofluorobenzene (DNFB)or Sanger's reagent

CH3

CH3

ภาพท 3.9 แสดงต าแหนง (- >) เขาท าปฏกรยาระหวางอะตอมไนโตรเจนของกรดแอมโนกบ รเอเจนตปองกนอะตอมไนโตรเจน ทมา (Bhat, Nagasampagi & Meenakshi, 2009, p. 5.16) เมอหมแอมโนของไกลซนเกดปฏกรยากบเบนโซเอต (Benzoate) จะเกดกรดฮปพรก (Hippuric acid) ดงสมการ (3.7) พบในน าปสสาวะ ซงเปนกระบวนการสรางและสลายกรดเบนโซอก (Benzoic acid) ในรางกายมนษย

H2N COOHO

O+

O

NH

COOH (3.7)

Hippuric acid

+ HCl

1.2 ปฏกรยากบกรดไนทรส เกดเฉพาะกบหมแอมโนปฐมภมเทานนทจะท าปฏกรยากบกรดไนทรส (Nitrous acid, HNO2) โดยเปลยนหมแอมโนเปนหมไฮดรอกซลและแกสไนโตรเจน ดงสมการ (3.8) โดยนกชวเคมชาวอเมรกน ชอ โดนลด เดกซเตอร แวน สไคก (Donald Dexter Van

80

Skyke) ไดประยกตใชปรมาณแกสไนโตรเจนทได จากนนน ามาค านวณหาจ านวนกรดแอมโนทมอยในโมเลกลของโปรตน เรยกการวเคราะหนวา วธแวนสไคก (Van Skyke method)

R OHNH2

O

+ HNO2 (3.8)R OHOH

O

+ N2 + H2O

1.3 การก าจดหมแอมโน เมอกรดแอมโนท าปฏกรยากบกรดไฮโดรไอโอดก (Hydroiodic acid, HI) ทอณหภม 200 องศาเซลเซยส ซงหมแอมโนจะถกก าจดออกในรปของแกสแอมโมเนย เกดเปนกรดคารบอกซลก ดงสมการ (3.9)

R OHNH2

O

(3.9)R OH

O

+ NH3 + I2HI, 200 oC

1.4 การเปลยนหมแอมโนเปนอะตอมคลอรน เมอกรดแอมโนท ากบไนโทรซลคลอไรด (Nitrosylchloride, NOCl) หรอไนโทรซลโบรไมด (Nitrosylbromide, NOBr) จะเปลยนหมแอมโนเปนอะตอมคลอรน ดงสมการ (3.10)

R OHNH2

O

+ NOCl (3.10)R OHCl

O

+ N2 + H2O

1.5 ปฏกรยากบรเอเจนตนนไฮดรน กรดแอมโนทกชนด ซงมหมแอมโน สามารถท าปฏกรยากบรเอเจนตนนไฮดรน (Ninhydrin reagent) ซงประกอบดวยไทรคโทไฮดรนดนไฮเดรต (triketohydrindene hydrate) ไดสารประกอบสมวง สชมพ หรอสน าเงน แกสคารบอนไดออกไซด และแอลดไฮดทมจ านวนอะตอมคารบอนนอยกวากรดแอมโนหนงตว ดงภาพท 3.10 ยกเวนกรดแอมโนบางชนด ไดแก โพรลน และไฮดรอกซโพรลน จะไดสเหลองแทน ซงวธนสามารถใชวเคราะหหาปรมาณไดอกดวย อยางไรกตาม แอมนปฐมภม (primary amine) และแกสแอมโมเนยสามารถท าปฏกรยากบรเอเจนตนนไฮดรนไดเชนเดยวกน แตผลจะไมเกดแกสคารบอนไดออกไซด

81

R-CH-NH2COOH

+ OH

OH

O

O

2

O

OH

N

O

O

+ CO2 + 3H2O

+R

O

H

Mechanism:

O

OH

N

O

O

+ CO2+R

O

H

OH

OH

O

O

R-CH-NH2COOH

+

O

O

NCOOH

RO

O

NH2-H2O

OHOH

O

O

ภาพท 3.10 ปฏกรยาของกรดแอมโนกบรเอเจนตนนไฮดรน ทมา (ดดแปลงจาก Bhat, Nagasampagi & Meenakshi, 2009, p. 5.18) 1.6 ปฏกรยากบรเอเจนตซงเกอร กรดแอมโนท าปฏกรยากบรเอเจนตซงเกอร (Singer reagent) ประกอบดวย 1-ฟลออโร-2,4-ไดไนโทรเบนซน (1-Fluoro-2,4-dinitrobenzene) เกดเปนสารประกอบสเหลองของแอมโนอนพนธ (ดาวลย ฉมภ, 2553, หนา 120) ดงสมการ (3.11)

R OHNH2

O

(3.11)F NO2+

1-Fluoro-2,4-dinitrobenzene

O2NHN NO2

O2N

CCOOH

RH

+ HF

2. ปฏกรยาทหมคารบอกซล

หมคารบอกซลของกรดแอมโนมความเปนกรด และมความเปนนวคลโอไฟล จงสามารถเกดปฏกรยา (Bhat, Nagasampagi & Meenakshi, 2009, p. 5.15; McMurry & Simanek, 2007, p. 310) ดงน 2.1 การเกดอนพนธของกรดคารบอกซลก เมอกรดแอมโนท าปฏกรยากบแอลกอฮอล จะไดเอสเทอร (ester) ดงสมการ (3.12) และท าปฏกรยากบแอมโมเนยหรออนพนธ ไดแอไมด ดงสมการ (3.13)

82

R

NH2

C-OHO

+ R'OH R

NH2

C-OR'O

+ H2O (3.12)

R

NH2

C-OHO

+ NH3R

NH2

C-NH2

O

+ H2O (3.13)

H+

heat

2.2 การรดวซดวยโลหะไฮไดรด ไดแก ลเทยมอะลมเนยมไฮไดรด (Litium aluminium hydride, LiAlH4) และโซเดยมโบโรไฮไดรด (Sodium borohydride, NaBH4) เมอท าปฏกรยากบ กรดแอมโน หมคารบอกซลจะถกรดวซเปนแอลกอฮอลปฐมภม (primary alcohol) ดงสมการ (3.14)

R

NH2

C-OHO

+ LiAlH4R

NH2

(3.14)OH

or NaBH4

2.3 ดคารบอกซลเลชน เปนการก าจดแกสคารบอนไดออกไซดของหมคารบอกซล โดยใหความรอนกบกรดแอมโนและแบเรยมออกไซด (Barium oxide, BaO) ซงหมแอมโนจะเปลยนเปนแอมนปฐมภม ดงสมการ (3.15)

R

NH2

C-OHO

+ BaO (3.15)R-CH2-NH2 + BaCO3

ฮสทามนซงถกสรางขนจากเซลลในปอดและเยอเมอก (mucus membrane) เกด

จากดคารบอกซลเลชนของฮสทดนโดยอาศย 1-ฮสทดนดคารบอกซเลส (Histamine decarboxylase) จากแบคทเรย (Lin, et al., 2012, pp. 723-727) (สมการ (3.16)) ถารางกายกระตนใหหลงฮสทามนมากเกนไป จะกอใหเกดโรคภมแพและโรคผวหนง

H2NHC

H2CCO2H

HN N

1-Histidine decarboxylase

decarboxylationHN N

H2N

Histidine Histamine

(3.16)

83

3. ปฏกรยาทโซขาง

กรดแอมโนบางชนดสามารถเกดปฏกรยาเฉพาะทหมแทนทหรอโซขางได จงใชบอกชนดของกรดแอมโน ดงน

3.1 โซขางมหมไธออล เมอซสเทอนท าปฏกรยากบเลด (II) แอซเทต (Pb(CH3COO)2) ในกรดแอซตก จะเกดตะกอนสด าของเลดซลไฟด (PbS) อกทงเมอออกซเดชนของหมไธออลของซสเทอน 2 โมล จะไดซสทน ซงยดเหนยวกนดวยพนธะไดซลไฟด (disulfide linkage) (McMurry & Simanek, 2007, p. 490) ดงสมการ (3.17)

HC CO2HCH2

(3.17)SH

COOHCH

CH2

SH

NH2

2H+ + 2e

2H+ + 2e

H2NHC CO2HCH2S

COOHCH

CH2

S

NH2

disulfide linkage

2 moles of Cysteine Cystine

NH2

ส าหรบการวเคราะหปรมาณหมไธออลในโปรตน อาศยเทคนคทางสเปกโทรสโกปได โดยซสทอนจะท าปฏกรยากบซลเวอร (I) ไอออน (Ag+) และรเอเจนตของเอลลแมน (Ellman’s reagent) เกดเปนสารประกอบทมส แลววดคาการดดกลนแสง (ดาวลย ฉมภ, 2553, หนา 120-121) ดงสมการ (3.18)

H2N CH2-SH

COOH+ Ag+

H2N CH2-S-Ag

COOH

Cysteine Cysteine silver mercaptide

S S NO2O2N

HOOC COOH

SH2N

HOOC

S + HS NO2

COOH

Ellman's reagent (3.18)

H2C

NH2

COOH

3.2 โซขางมวงแอโรแมตก ไดแก ฟนลอะลานน ไทโรซน และทรปโทแฟน เมอทดสอบกบปฏกรยาแซนโธโพรเทอก (Xanthoproteic reaction) ประกอบดวยกรดไนทรกเขมขน โดยจะเกดปฏกรยาไนเทรชน (nitration) ทวงแอโรแมตก ไดเปนสารประกอบไนโทรสเหลอง

84

3.3 โซขางเปนฟนอลก โดยมหมไฮดรอกซลเกาะอยบนวงแอโรแมตก ไดแก ไทโรซน ซงเมอทดสอบดวยปฏกรยามลลอน (Millon’s reaction) จะเกดปฏกรยาเมอรควเรชน (mercuration) และไนเทรชน ไดตะกอนสชมพ และจะคอย ๆ เปลยนเปนสแดง

เมแทบอลซมของกรดแอมโน

เมอรบประทานอาหารทมโปรตนมากเกนความจ าเปน หรอกรณรางกายขาดอาหาร หรอในผปวยโรคเบาหวาน รางกายจะใชกรดแอมโนเปนแหลงใหพลงงานและสงเคราะหสารตาง ๆ ทจ าเปนตอการด ารงชวต สวนกรดแอมโนทเหลอจะถกสลาย (catabolism of amino acids) ตอไป โดยอาศยวถ 2 แบบ ไดแก 1) วถไนโตรเจน (nitrogen pathway) ดวยทรานสแอมเนชน และดแอมเนชน และ 2) วถโครงคารบอน (carbon skeleton pathway) ซงอะตอมไนโตรเจนจะถกก าจดออกใน รปแกสแอมโมเนย แลวจะผานเขาสวฏจกรยเรย (Urea cycle) เพอใชสงเคราะหยเรยหรอกรดยรก (Uric acid) ตอไป

1. วถไนโตรเจน

การสลายกรดแอมโนผานวถไนโตรเจนมปฏกรยาทเกยวของ ดงน 1.1 ทรานสแอมเนชน เปนปฏกรยาหลกใชก าจดหมแอมโนของกรดแอมโน ยกเวน ไลซน

โพรลน และเธรโอนน โดยการถายโอนหมแอมโนของกรดแอมโนและกรดแอลฟาคโท ซงมเอนไซม ทรานสเฟอเรสหรอแอมโนทรานสเฟอเรส (amino transferase) ท าหนาทเปนตวเรงปฏกรยา และ ไพรดอกแซลฟอสเฟต เปนโคเอนไซม เกดเปนกรดแอมโนและกรดแอลฟาคโททมโครงสรางตางจากเดม ดงภาพท 3.11

โดยทวไป ทรานสแอมเนชนของกรดแอมโนตาง ๆ จะไดกรดกลทามกและกรดไพรวก

(Pyruvic acid) โดยมกรดแอลฟาคโทเปนตวรบ ไดแก แอลฟา-คโทกลทาเมต (α-keto glutamate) โดยท างานรวมกบกลทาเมตทรานสเฟอเรส (Glutamate transferase) หรอกรดไพรวกเปนตวรบรวมกบอะลานนทรานสเฟอเรส (Alanine transferase) ไดอะลานน ดงภาพท 3.12 กอนเขาสวฏจกรยเรยตอไป

85

amino acid 1 + keto acid 2 keto acid 1 + amino acid 2

NPO

CHNHLys-Enz

OH

CH3

amino acid 1

R1NH2

HCOOH

NPO

CHNH

OH

CH3

R1 COOH

NH

POCHN

OH

CH3

R1 COOH

Pyridoxal phosphate (PLP)

hydrolysis

NPO

CH2NH2

OH

CH3

Pyridoxamine (PMP)

+ keto acid 1

R2-CO-CO2Hketo acid 2

NPO

CHN

OH

CH3

R2 COOH

Lys-Enz

amino acid 2

R2NH2

HCOOH + PLP

ภาพท 3.11 กลไกแทรานสแอมเนชนของกรดแอมโนทวไป ทมา (ดดแปลงจาก สถาบนพลศกษา วทยาเขตสพรรณบร, 2557, หนา 225)

H3CNH3

HCOO +

O

OO

COO

Alanine -Ketoglutarate

Glutamatetransferase H3C

OCOO +

O

ONH3

COO

Pyruvate Glutamate

H3CNH3

HCOO +

O

OO

COO

Alanine -Ketoglutarate

AlaninetransferaseH3C

OCOO +

O

ONH3

COO

Pyruvate Glutamate

ภาพท 3.12 ทรานสแอมเนชนของอะลานนและกรดกลทามก ทมา (สถาบนพลศกษา วทยาเขตสพรรณบร, 2557, หนา 226)

1.2 ดแอมเนชน ปฏกรยาแบงเปน 2 ประเภท คอ 1.2.1 ปฏกรยาออกซเดทฟดแอมเนชน (oxidative deamination) เปนปฏกรยาท

อาศยเอนไซมและมโคเอนไซมในการถายทอดอเลกตรอน ทส าคญไดแก 1) เอนไซมกลทาเมตดไฮโดรจเนส (Glutamate dehydrogenase) เปน

เอนไซมทก าจดหมแอมโนของกรดกลทามก และท างานรวมกบโคเอนไซม ไดแก รปออกซไดสของ

86

กรดนโคทนก ถากระบวนการเกดทไซโทพลาสซม (Cytoplasm) ในตบ จะท างานโดยเอนเอด แตถากระบวนการเกดทไมโทคอนเดรยในตบและไต จะใชในรปฟอสเฟต ไดแก เอนเอดพ โดยหมแอมโนจะถกก าจดออกในรปของแกสแอมโมเนย ดงภาพท 3.13

NAD(P)+ NAD(P)H + H+

H3C

O

COOHPyruvic acid

NH2-CH2-COOH

Alanine

Glutamatetrasferase

COOH

O

-Keto glutaric acid

Transamination

Oxidative deamination

COOH

NH2

Glutamic acid

H2O

NH3Glutamate dehydrogenase

HOOC HOOC

ภาพท 3.13 การก าจดหมแอมโนของกรดกลทามกผานทรานสแอมเนชนและออกซเดทฟดแอมเนชน ทมา (สถาบนพลศกษา วทยาเขตสพรรณบร, 2557, หนา 228)

2) เอนไซมกรดแอมโนออกซเดส (amino acid oxidase) ม 2 ชนด ไดแก โครงแบบชนดด- และชนดแอล- พบไดในเซลลตบและไต ในรางกายสวนมากพบโครงแบบชนดแอล- โดยท างานรวมกบฟลาโวนโปรตน (flavone protein) ท าหนาทเปนโคเอนไซม กลาวคอ ด-กรดแอมโนออกซเดสจะท างานรวมกบเอฟเอด สวนแอล-กรดแอมโนออกซเดสจะท างานรวมกบฟลาวนมอโน- นวคลโอไทดหรอเอฟเอมเอน (Flavin mononucleotide, FMN) โดยเรงปฏกรยาการก าจดหมแอมโนออกในรปของแกสแอมโมเนย และแกสไฮโดรเจนเพอรออกไซด (H2O2) ซงมความเปนพษตอเซลล จะถกก าจดออกได โดยเปลยนเปนแกสออกซเจนและน า ซงอาศยเอนไซมแคทาเลส (catalase) ดงภาพท 3.14

87

H2N

R

COOH

L-amino acid FMN FMNH

O2H2O2

catalase

H2O + 1/2O2

L-amino acid oxidaseO

R

COOH

-keto acid

+ NH3

HN

N N

N CH3

CH3CH2

O

O

CCH2O-P

(H OH)3

Flavin mononucleotide (FMN)

ภาพท 3.14 ปฏกรยาออกซเดทฟดแอมเนชนดวยเอนไซมกรดแอมโนออกซเดส ทมา (สถาบนพลศกษา วทยาเขตสพรรณบร, 2557, หนา 229)

1.2.2 ปฏกรยานอน-ออกซเดทฟดแอมเนชน (non-oxidative deamination) ซง

ก าจดหมแอมโนออกในรปของแกสแอมโมเนย โดยใชเอนไซมจ าเพาะและไมผานออกซเดชน ไดแก เอนไซมแอมโนไลเอส (amino lyase) เชน หมแอมโนของกรดแอสพารทกถกก าจดออก ดวยเอนไซมแอสพารเทส (Aspartase) ไดฟมาเรต (Fumarate) และแกสแอมโมเนย เปนตน นอกจากน กรดแอมโนบางชนดตองใชเอนไซมจ าเพาะโดยท างานรวมกบไพรดอกแซลฟอสเฟตเปนโคเอนไซม เชน เธรโอนนไฮดราเทส (Threonine hydratase) เซอรนไฮดราเทส (Serine hydratase) และซสทอนดซลไฮเดรส (Cysteine desulhydrase) เปนตน

2 วถโครงคารบอน

วถโครงคารบอนเปนการสลายโครงคารบอนของกรดแอมโน โดยเปลยนเปนสารตงตน ไดแก ไพรเวต (Pyruvate) แอซทลโคเอ (Acetyl CoA) กรดแอลฟาคโท ซกซนลโคเอ (Succinyl CoA) และฟมาเรต แลวเขาสวฏจกรเครบส (Krebs’ cycle) หรอวฏจกรกรดซทรก (Citric acid cycle) ดงภาพท 3.15 ซงแอซทลโคเอจะสลาย ไดแกสคารบอนไดออกไซด และพลงงานเกบสะสมไวในรปของเอทพ เอนเอดเอช และเอฟเอดเอช

88

OxaloacetateCitrate

MalateIsocitrate

Fumarate -Ketoglutarate = Glu

Succinate

CO2

Acetyl CoA = Acetoacetate

PyruvateCO2

Ala, Cys, Gly, Ser, Thr, Trp

Ile, Leu, Lys, Phe, Trp, Tyr

Asn

Asp

Phe, Tyr

Ile, Met, Tyr, Val

GlnAsg, His, Pro

CH3-C-S-CoAO

OOCO

COO

CoA-SH

OOCOH

COOCOO

OOC COOCOOOH

H

OOC

O

COO

CoA-S

O

COOSuccinyl CoAOOC COO

OOC COO

OOC COOOH

NADH + H+NAD+

NADH + H+NAD+

GDPGTP

ADPATP

FAD

FADH2

NAD+

NADH + H+

H2O

Krebs' cycle

ภาพท 3.15 วถโครงคารบอนของกรดแอมโน ทมา (ดดแปลงจาก สถาบนพลศกษา วทยาเขตสพรรณบร, 2557, หนา 231)

พนธะเพปไทดและโปรตน

กรดแอมโนเชอมตอกนดวยพนธะแอไมดหรอพนธะเพปไทด (peptide bond) โดยหมแอมโนหรอปลายไนโตรเจน (N-terminal end) ของกรดแอมโนท าปฏกรยากบหมคารบอกซลหรอปลายคารบอน (C-terminal end) ไดเพปไทด (peptide) และน า (สมการ (3.19)) กรณกรดแอมโน 2 ชนด

89

เชอมตอกน เรยกโปรตนนนวา ไดเพปไทด (dipeptide) มพนธะเพปไทด 1 พนธะ หรอกรดแอมโน 3 ชนด เชอมตอกน เรยกวา ไทรเพปไทด มพนธะเพปไทด 2 พนธะ และกรดแอมโนตงแต 100 โมเลกลขนไป เชอมตอกนดวยพนธะเพปไทดเปนโซยาว เรยกวา พอลเพปไทด

H2N C

R1OH

O

H2N C

R2OH

O

+H2N

HN OH

R1

O R2

O

dipeptide

peptide bond

(3.19)

N-terminal C-terminal

+ H2O polypeptideor protein

..

โครงสรางโปรตน

การเขยนสตรโครงสรางของเพปไทด อาจใชอกษรยอตามมาตรฐานของกรดแอมโน (ตารางท 3.1) และเรยงตามล าดบ โดยเรมจากปลายไนโตรเจน อยดานขวามอ เชน กลทาไธโอน ท าหนาทเกยวกบออกซเดชนและรดกชนของเซลล สตรโครงสรางเปนไทรเพปไทด ประกอบดวยกรดกลทามก ซสทอน และไกลซนเชอมตอกนดวยพนธะเพปไทด ตามล าดบ จงเขยนแสดงดวย “Glu-Cys-Gly” แทนโครงสราง ดงภาพท 3.16 เปนตน

HN N

HCOO

O SH

O

Glutathione as a tripeptide

Glu Cys Gly

H3N

COO

ภาพท 3.16 โครงสรางกลทาไธโอน

การหาโครงสรางโปรตนมหลายวธ เชน วธของเอดแมน (Edman’s) วธของแซงเกอร (Sanger’s) และการใชเอนไซมคารบอกซเพปทเดส (carboxypeptidase) (สมพงศ จนทรโพธศร, 2552, หนา 280-289; Bhat, Nagasampagi & Meenakshi, 2009, pp. 5.24-5.25) เปนตน ซงลกษณะโครงสรางจะซบซอนมหลายระดบ ดงน

90

1. โครงสรางระดบปฐมภม (primary structure)

โครงสรางพนฐานของโปรตนทกชนดเปนระดบปฐมภม ซงถอวาเปนโครงสรางอยางงายของโปรตน เกดจากกรดแอมโนเชอมตอกนดวยพนธะเพปไทด แลวเรยงล าดบเปนโซ ก าหนดใหปลายไนโตรเจนของหมแอมโนอยดานซายและปลายคารบอนของหมคารบอกซลอยดานขวา กรณในโซของโปรตนพบซสทอนอยระหวางหรอภายในโซเดยวกน สามารถเชอมตอกนดวยพนธะไดซลไฟด เชน อนซลน ประกอบดวยเพปไทด 2 โซ พนธะไดซลไฟด 3 พนธะ ซงเชอมระหวางโซเพปไทด 2 พนธะ และภายในโซเดยวกน 1 พนธะ (ภาพท 3.17)

ภาพท 3.17 โครงสรางอนซลน ทมา (ดดแปลงจาก Bhat, Nagasampagi & Meenakshi, 2009, p. 5.21)

2. โครงสรางระดบทตยภม (secondary structure)

โซพอลเพปไทดสามารถบด (twist) หรอพบ (fold) ได เนองจากแรงยดเหนยวระหวางโซหรอภายในโซเดยวกน (Bhat, Nagasampagi & Meenakshi, 2009, pp. 5.27-5.28) ไดแก

1) พนธะไฮโดรเจน (hydrogen bonding) เปนแรงยดเหนยวระหวางโมเลกลโปรตนทส าคญ เกดจากอะตอมออกซเจนของหมคารบอนลกบอะตอมไฮโดรเจนของแอไมด (-NH-(C=O)-) ของพนธะเพปไทด และถงแมพนธะไฮโดรเจนจะมความแขงแรงนอยมาก ประมาณ 4.5 กโลแคลอรตอโมล แตเมอเกดพนธะไฮโดรเจนหลายท จะท าใหโครงสรางโปรตนมเสถยรภาพ

2) แรงไฟฟาสถต (electrostatic force) เกดจากหมแอมมเนยมไอออนเกดอนตรกรยา (interaction) กบหมคารบอกซเลตทปลายทงสองของเพปไทด เกดเปนแรงยดเหนยวทางไฟฟาสถตจากประจบวกและประจลบ โดยประจทเกดขนนน จะขนอยกบคาความเปนกรด-เบสของสารละลาย กรณประจเกดเหมอนกน และอยใกลกน จะท าใหโปรตนไมเสถยรภาพ

91

3) อนตรกรยาขวคกบขวค (dipole-dipole interaction) กรณโซขางของโปรตนมขว จะเกดโมเมนตขวค (dipole moment) และเกดอนตรกรยาระหวางหมทงสองดวย

4) แรงแวนเดอรวาลส (Van der Waals force) เปนแรงยดเหนยวระหวางอะตอมหรอโมเลกลไมมขวกบไมมขว หรอระหวางโมเลกลมขวกบไมมขว ซงเปนแรงทไมแขงแรง เมอเทยบกบแรงชนดอน

จากแรงยดเหนยวระหวางโมเลกลขางตน ท าใหโปรตนเกดโครงสรางระดบทตยภม ซง

สวนมากพบ 2 ชนด ดงน 2.1 แอลฟา-ฮลกซ (-Helix) ลกษณะโครงสรางเปนเกลยวเวยนขวา เรยกวา แอลฟา-

ฮลกซ ดงภาพท 3.18 ซงพบบอยกวาเกลยวเวยนซาย เกดจากสายโซพอลเพปไทดเกดพนธะไฮโดรเจนระหวางทกหมคารบอนลของกรดแอมโนล าดบททหนงกบแอไมดของกรดแอมโนล าดบทส ซงแตละเกลยวประกอบดวยกรดแอมโนจ านวน 37 หนวยตอรอบ โดยมระยะหางแตละหนวยประมาณ 0.15 นาโนเมตร และระยะระหวางเกลยว 0.5-0.55 นาโนเมตร (Bhat, Nagasampagi & Meenakshi, 2009, pp. 5.30-5.31) ตวอยางโปรตนทเปนแอลฟา-ฮลกซ ไดแก แอลฟา-เคราทน (-keratin) พบในเสนผม ขนสตว และเนอเยอชนนอกของเซลลของสตวเลอยคลานบางชนด ไดแก ง

ภาพท 3.18 แอลฟา-ฮลกซ

2.2 แผนพลตบตา (-pleated sheet) ลกษณะเปนแผนจบพบไปมา เน องจากเกดพนธะไฮโดรเจนระหวางพอลเพปไทด 2 โซ แผนพลตบตาม 2 ชนด คอ แบบขนาน (parallel) โดยเรมจากปลายคารบอนและปลายไนโตรเจนเหมอนกน และแบบสวนทาง (antiparallel) จะเกดการเรยงตวในทศทางตรงขามกน (ภาพท 3.19) ในธรรมชาตสวนใหญพบแบบสวนทาง ไดแก ไฟโบรอนในเสนไหม (silk fibroin)

92

N N N N NOH

H O

H O

H O

H O

R1

R2

R3

R4

R5

hydrogen bonding

NNNNNO H

HO

HO

HO

HO

R1

R2

R3

R4

R5

C-terminal N-terminal

C-terminalN-terminal

1) Parallel

2) Antiparallel

N N N N NOH

H O

H O

H O

H O

R1

R2

R3

R4

R5C-terminalN-terminal

N N N N NOH

H O

H O

H O

H O

R1

R2

R3

R4

R5

C-terminalN-terminal

ภาพท 3.19 แผนพลตบตา 1) แบบขนาน และ 2) แบบสวนทาง ทมา (Bhat, Nagasampagi & Meenakshi, 2009, p. 5.31)

3. โครงสรางระดบตตยภม (tertiary structure)

โซเพปไทดจะเกดการมวนตวเนองจากแรงยดเหนยวตาง ๆ ไดแก พนธะไฮโดรเจน พนธะ ไดซลไฟด แรงยดเหนยวไฟฟาสถต อนตรกรยาขวคกบขวค หรอแรงแวนเดอรวาลส ท าใหโปรตนเกดเปนโครงสรางระดบตตยภม ตวอยางไดแก

3.1 โปรตนเสนใยหรอไฟบรสโปรตน (fibrous protein) ลกษณะโครงสรางเปนฝอย เกดจากฮลกซหลายโซรวมกน แลวบดเปนเกลยว ดงภาพท 3.20 ไดโปรตนไมละลายในน าและตวท าละลายอนทรยทกชนด ยกเวน กรดแกและเบสแก โปรตนเสนใยมความแขงแรงและตานทานตอการแปลงสภาพ (denature) ไดแก คอลลาเจน แหลงพบทบรเวณเอนกลามเนอและเนอเยอเกยวพนในสตว แอลฟา-เคราทน พบในเสนผม ขนแกะ ขนนก และเลบ อลาสทน (Elastin) ไมโอซน (Myosin) ในกลามเนอ และไฟโบรอน (Fibroin) ซงเปนบตา-เคราทน พบในรงไหมของหนอนไหม (Bombyx mori) (Bhat, Nagasampagi & Meenakshi, 2009, p. 5.22) เปนตน

93

3.2 โปรตนกอนกลมหรอโกลบลารโปรตน (globular protein) โครงสรางซบซอนมากกวาโปรตนเสนใย ละลายไดในน าและสารละลายเจอจาง เกดการแปลงสภาพไดงายเมอเปลยนอณหภม ไดแก ไมโอโกลบน (Myoglobin) ท าหนาท เปนตวรบแกสออกซเจนจากเฮโมโกลบน (Hemoglobin) พบในเซลลกลามเนอและเนอเยออน ๆ เปนโปรตนทโครงสรางมธาตเหลก ซงเปนสารประกอบเชงซอนของพอรไฟรนทม Fe2+ อยตรงกลาง (ภาพท 3.20) ตวอยางอนของโปรตนกอนกลม ไดแก เอนไซมและสารภมตานทาน (antibody) โกลบลน (Globulin) โพรแทมน (Protamine) แอลบมน (Albumin) ในไขขาว ฮสโทน (Histone) และกลทาลน (Glutalin) เปนตน

ภาพท 3.20 โครงสรางระดบตตยภม 1) คอลลาเจน และ 2) ไมโอโกลบน

4. โครงสรางระดบจตรภม (quaternary structure)

โครงสรางเกดจากโปรตนกอนกลม เรยกวา หนวยยอย (subunit) จบกบโปรตนกอนกลมอกหนงชนดหรอมากกวา ดวยแรงยดเหนยวระหวางโมเลกลอยางออน เกดเปนโครงสรางทซบซอนมากขน ไดลกษณะเปนกอนกลม ไดแก เฮโมโกลบน มหนวยยอยลกษณะคลายไมโอโกลบน 4 หนวย ประกอบดวยชนดแอลฟา- 2 หนวย และชนดบตา- 2 หนวย โดยแตละหนวยยอยจบกบโมเลกลฮม ดงภาพท 3.21 หรอลกษณะเปนสาย ไดแก ทบลน (Tubulin)

94

ภาพท 3.21 โครงสรางระดบจตรภม 1) ฮโมโกลบน และ 2) ทบลน

ประเภทของโปรตน

การจ าแนกประเภทของโปรตน ดงน

1. แบงตามโครงสราง

โครงสรางโปรตนพบไดทงโปรตนเชงเดยว (simple proteins) ซงมเฉพาะกรดแอมโนเชอมตอกนดวยพนธะเพปไทดเทานน ไดแก โปรตนเสนใย และโปรตนกอนกลม และโปรตนสงยค (conjugated proteins) เกดจากหมทไมใชโปรตน เรยกวา หมพรอสเทตก เชอมตอพนธะกบโปรตน ดงตารางท 3.3 นอกจากน ยงพบโปรตนอนพนธ เกดจากโปรตนเชงเดยวหรอโปรตนสงยคสลายตวดวยเอนไซมหรอปฏกรยาเคม เชน เมอน าเจลาตน (gelatin) ไปตมดวยสารละลายกรด ไดคอลลาเจน เปนตน ซงสตรโครงสรางของโปรตนเหลานน แบงเปนหลายระดบ ไดแก ปฐมภม ทตยภม ตตยภม และจตรภม ดงรายละเอยดขางตน

2. แบงตามหนาททางชวภาพ

การเรยงล าดบและชนดกรดแอมโนในโซโปรตนทไมเหมอนกน สงผลใหมหนาททางชวภาพ ตางกนไปดวย ดงน

2.1 โปรตนโครงสราง (structural proteins) ท าหนาท ยดเหนยวสวนตาง ๆ ภายในเซลลและเนอเยอของสงมชวต เกดเปนโครงสราง เพมความแขงแรงและชวยปกปอง ตวอยางเชน

95

แอลฟา-เคราทน พบในเสนผม และเขาสตว คอลลาเจนและอลาสทน เปนองคประกอบพบทวไปทบรเวณภายนอกและในชองวางระหวางเซลล ไดแก เนอเยอเกยวพน และกระดกออน เปนตน

2.2 โปรตนขนสง (transport proteins) ท าหนาท ล าเลยงไอออนหรอโมเลกลทมขนาดเลกไปยงสวนตาง ๆ ของสงมชวต เชน แบกเทอรโอโรดอปซน (Bacteriorhodopsin) ชวยก าจดไฮโดรเจนไอออน ออกจากเซลลแบคทเรยหลงจากถกกระตนดวยแสง ซรมแอลบมน (Serum albumin) พบในเลอด ท าหนาทล าเลยงลพด และฮโมโกลบน ชวยล าเลยงแกสออกซเจนจากปอดไปสหวใจและเซลลตาง ๆ แลวล าเลยงแกสคารบอนไดออกไซดกลบไปฟอกยงปอดอกครง เปนตน ตารางท 3.3 ประเภทโปรตนสงยคจ าแนกตามหมพรอสเทตก

โปรตนสงยค หมพรอสเทตก ตวอยาง

นวคลโอโปรตน กรดนวคลอก โครโมโซม ลโพโปรตน ลพด พลาสมาโปรตน ฟอสโฟโปรตน ฟอสเฟต เคซน (Casein) ในน านม ไกลโคโปรตน คารโบไฮเดรต มวซน (Mucin) ในน าลาย เมแทลโลโปรตน ไอออนของโลหะ (เชน เหลก ทองแดง

แมกนเซยม และสงกะส เปนตน) เอนไซมแลกทกดไฮโดรจเนส ฮม

โครโมโปรตน โครโมฟอร (เชน ฮโมโกลบนหรอคลอโรฟลล เปนตน)

สารส

ทมา (Bhat, Nagasampagi & Meenakshi, 2009, p. 5.23; Hasnain, Gallagher, Grencis & Thornton, 2013, pp. 364-374)

2.3 โปรตนสะสม (storage proteins) ท าหนาท เกบสะสมสารเคมโมเลกลขนาดเลกหรอ

ไอออน เชน เฟอรรทน (Ferritin) เปนโปรตนทมรปรางกลม เปนแหลงสะสมธาตเหลกทส าคญ เคซนในน านม ใชเลยงตวออน พบเฉพาะในสตวเลยงลกดวยน านม และโอแวลบมน (Ovalbumin) ในไขขาว เปนแหลงของกรดแอมโน ใชพฒนาตวออนใหเจรญเปนตวเตมวย เปนตน

2.4 โปรตนเคลอนไหว (contractile proteins) ท าหนาท ชวยใหเกดการเคลอนไหวภายในเซลลและเนอเยอ ไดแก ไมโอซน และแอกทน (Actin) ในกลามเนอของรางกาย ไดเนอน (Dynein) ชวยท าใหซเลย (cilia) ในสงมชวตจ าพวกยคารโอต (eukaryote) และแฟลกเจลลา (flagella) โบกไปมา ดงภาพท 3.22

96

ภาพท 3.22 ซเลยและแฟกเจลลา

2.5 โปรตนปองกน (protective proteins) ท าหนาท ชวยปกปองและท าลาย สงแปลกปลอมจากภายนอกเซลลทเขาสภายในเซลลของสงมชวต เชน ไฟบรน (Fibrin) และธรอมบรน (Thrombin) ชวยใหเลอดเกดการแขงตว อมมโนโกลบลน (Immunoglobulin) เปนสารภมตานทาน เปนตน

2.6 เอนไซม (enzymes) ท าหนาท เรงปฏกรยาเคมจ าเพาะ โดยเฉพาะเมแทบอลซมในสงมชวต

2.7 โปรตนสงสญญาณ (signaling proteins) หรอฮอรโมน ท าหนาท ชวยสอสารใหเกดการท างานระหวางเซลลและอวยวะตาง ๆ ไดแก อนซลน ชวยควบคมระดบน าตาลในเลอด

2.8 โปรตนตวรบ (receptor proteins) ท าหนาท รบสงสญญาณไปยงบรเวณของเซลลทตอบสนองสญญาณได เชน โรดอปซน (Rhodopsin) พบบรเวณเรทนา (retina) ทดวงตา จะตอบสนองตอแสง และตวรบอนซลน (Insulin receptor) ชวยใหเซลลในตบตอบสนองตออนซลน เปนตน

2.9 โปรตนทควบคมการแสดงออกของจน (gene regulatory proteins) ท าหนาทเกยวของกบการแสดงออกของจน

2.10 โปรตนทเปนพษ (toxic proteins) เปนโปรตนทเปนพษ เชน พษจากเชออหวาตและพษง เปนตน

97

การตรวจสอบโปรตน

โครงสรางโปรตนประกอบดวยกรดแอมโนทเชอมตอกนดวยพนธะเพปไทด สวนมากปฏกรยาจะเกดทหมแอมโน ท าปฏกรยาการเกดส (color reactions) ไดสารละลายทมส โดยใชทดสอบโปรตนหรอพนธะเพปไทดได

1. ปฏกรยาไบยเรต (Biuret reaction)

รเอเจนต ประกอบดวยสารละลายคอปเพอรซลเฟต (Copper sulfate, CuSO4) เจอจาง ในสารละลายเบส เชน โซเดยมไฮดรอกไซด (Sodium hydroxide, NaOH) หรอโพแทสเซยมไฮดรอกไซด (Potassium hydroxide, KOH) ปรมาณมากเกนพอ เมอท าปฏกรยากบโปรตนซงมพนธะเพปไทด จะไดสารละลายสมวงแดงหรอสน าเงนมวง เนองจากเกดสารประกอบเชงซอนระหวางคอปเพอร (II) ไอออน (Cu2+) กบอะตอมไนโตรเจนของพนธะเพปไทดตงแต 2 พนธะขนไป ดงภาพท 3.23 วธนสามารถประยกตใชวเคราะหหาปรมาณโปรตนในสารละลายได วธทนยม ไดแก การหาปรมาณบซเอ (Bicinchoninic acid, BCA assay) (Bainor, et al., 2011, pp. 310-312) การหาปรมาณโดยโลวร (Lowry assay) (Sargent, 1987, pp. 476-481) และการหาปรมาณโดยแบรดฟอรด (Bradford assay) ซงวธดงกลาววเคราะหดวยเทคนคทางสเปกโทรสโกป โดยวดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 540 นาโนเมตร

NHO

RHN

O

RNH

O

NHO

RNH

OR

NHO

Cu2+

ภาพท 3.23 การเกดสารประกอบเชงซอนของโปรตนดวยปฏกรยาไบยเรต

2. ปฏกรยากบรเอเจนตนนไฮดรน (ninhydrin reagent)

นอกจากกรดแอมโนท าปฏกรยากบรเอเจนตนนไฮดรนแลว เพปไทดและโปรตนกสามารถท าปฏกรยาไดเชนด ยวกน โดยจะปรากฏสารละลายสมวง สชมพ หรอสน าเงน กลไกดงภาพท 3.10

98

3. ปฏกรยามลลอน (Millon’s reaction)

รเอเจนตมลลอน ประกอบดวยเมอรควรกไนเทรต (Mercuric nitrate) ในกรดไนทรก เปนปฏกรยาเกดเฉพาะกบฟนอลเทานน ดงนน โปรตนทมไทโรซนเปนองคประกอบ ปรอท (Hg2+) จะถกเตมเขาทต าแหนงออรโธ- (ortho-) ของหมไฮดรอกซลในไทโรซน เกดตะกอนสขาว แลวเปลยนเปน สแดงสมหลงจากใหความรอน

4. ปฏกรยาแซนโธโพรเทอก (Xanthoproteic reaction)

โปรตนทมองคประกอบของกรดแอมโนทเปนแอโรแมตก ไดแก ฟนลอะลานน ไทโรซน และทรปโทแฟน เมออนกบกรดไนทรกเขมขน จะเกดปฏกรยาไนเทรชน ไดเปนสารละลายสเหลอง และเมอปรบสารละลายใหเปนเบส แลวเปลยนเปนสารละลายสสม

5. การทดสอบวงของเฮลเลอร (Heller’s ring test)

วธนใชทดสอบแอลบมนในปสสาวะ โดยคอย ๆ เทกรดไนทรกเขมขนลงไปอยใตชนของสารละลายโปรตน จะท าใหโปรตนตกตะกอนเปนสขาวระหวางชน (University of Veterinary and Pharmaceutical Sciences Brno, 2014)

การแปลงสภาพของโปรตน

การคลายเกลยว (unfolding) ของโปรตน ท าใหหนาททางชวภาพบางประการของโปรตนเปลยนไป เกดการแขงตวและไมละลายน า เรยกวา การแปลงสภาพ เกดทงแบบถาวรหรอผนกลบได ซงปรากฏการณน พนธะเพปไทดจะไมถกท าลาย เชน การตมไข แอลบมนในไขขาวจะจบตวเปนกอน เปนตน ปจจยทมผลตอการตกตะกอนของโปรตน ดงน

1. การปรบสารละลายเปนคาพไอ โปรตนแตละชนดมคาพไอตางกน (ตารางท 3.4) เมอปรบคาความเปนกรด-เบสของสารละลายโปรตนใหเทากบคาพไอ โปรตนจะมการละลายนอยทสด วธนสามารถใชแยกโปรตนชนดหนงออกจากสารละลายผสมของโปรตนหลายชนดได โดยโปรตนทมคาพไอสงกวาหรอต ากวาจะยงคงสามารถละลายอยในสารละลายนน ๆ ได

2. การใชความรอน โดยทวไปการละลายของโปรตนจะลดลงเมออณหภมสงขน สงผลใหสมบตบางประการของโปรตนเปลยนแปลงไป เชน ไขขาวดบซงละลายน าได แตถาตมไขขาวใหสกแลว โปรตนในไขขาวจะแขงตว และไมละลายน า เปนตน การใชประโยชน เชน การท าความสะอาดเครองมอแพทยเพอฆาเชอโรค โดยใสในหมอนงอดความดนทอณหภม 120 องศาเซลเซยส ความรอนจะ

99

ท าใหโปรตนในแบคทเรยถกท าลาย หรอกรรมวธการท าโยเกรต โดยใหความรอนกบน านมทอณหภม 60 องศาเซลเซยส จะท าใหโปรตนในน านมแขงตว เปนตน

ตารางท 3.4 คาพไอของโปรตน

โปรตน คาพไอ โปรตน คาพไอ เพปซน <1.0 ซรมแอลบมน 4.9 อนซลน 5.1 โอแวลบมน 4.6 ไฟบรโนเจน 5.8 แกมมา-โกลบลน 6.6 คอลลาเจน 6.6 ฮโมโกลบน 7.1 ไรโบนวคลเอสเอ 7.8 ไลโซไซม 11.0 ไซโตโครมซ 10.6 ฮสโทน 10.8

ทมา (Bhat, Nagasampagi & Meenakshi, 2009, p. 5.27) 3. การใชตวท าละลายอนทรยทมพนธะไฮโดรเจน เชน เอธานอล และแอซโทน เปนตน กลไก

คาดวาเกดพนธะไฮโดรเจนระหวางตวท าละลายกบโปรตน ท าใหโปรตนเกดการแขงตว และละลายไดในน าลดลง การใชประโยชน เชน การเชดผวหนงดวยเอธานอลกอนฉดยา ซงเอธานอลจะท าใหโปรตนในแบคทเรยแปลงสภาพ เกดการแขงตว จงเปนการฆาเชอโรคได เปนตน

4. การใชแคตไอออน การตกตะกอนดวยแคตไอออนควรปรบคาความเปนกรด-เบสของสารละลายโปรตนใหสงกวาคาพไอกอน เพอใหโปรตนอยในรปไอออนลบ จากนนท าปฏกรยาตอกบแคตไอออน เกดเปนสารประกอบเชงซอนทไมละลายน าและตกตะกอนออกมา

5. การใชแอนไอออน การตกตะกอนดวยแอนไอออนควรปรบคาความเปนกรด-เบสของสารละลายโปรตนใหต ากวาคาพไอกอน เพอใหโปรตนอยในรปไอออนบวก ซงหลงจากท าปฏกรยากบแอนไอออน ท าใหโปตนมสภาพเปนกลางและตกตะกอนออกมา

6. การใชเกลอของโลหะหนก เชน ปรอท (Hg2+) ตะกว (Pb2+) แคดเมยม (Cd2+) และเงน (Ag+) เปนตน โดยไอออนเหลานจะท าปฏกรยากบหมคารบอกซเลตของโปรตน เกดเปนเกลอท ไมละลายน า ดงสมการ (3.20) ท าใหโปรตนตกตะกอน การใชประโยชน เชน การน าไขขาวดบเพอก าจดโลหะตะกวหรอปรอททเขาสรางกาย โดยการอาเจยนออกมา ซงเปนการปฐมพยาบาลเบองตนกอนน าไปพบแพทยตอไป

100

H3NHN O

O

R1

R2

O

Ag H3NHN O

O

R1

R2

O

Ag+ (3.20)

7. การใชสารละลายเกลอบางชนดทเขมขน เชน สารละลายเขมขนแอมโมเนยมซลเฟต

[Ammonium sulfate, (NH4)2SO4] ท าใหโปรตนละลายไดนอยลง เกดการตกตะกอน เพราะไอออนของเกลอจะก าจดน าออกจากโปรตน แตการเปลยนแปลงลกษณะเชนนไมจดเปนการแปลงสภาพโปรตน เพราะโปรตนสามารถคนสภาพเดมไดงาย และโครงสรางโปรตนไมเปลยนแปลงไปจากเดม

เมแทบอลซมของโปรตน

โปรตนจะถกยอยและแปลงสภาพในขนแรกทกระเพาะอาหารและในล าไสเลกสวนตน ดวยเอนไซมทมความจ าเพาะสง เชน เพปซน (Pepsin) ไคโมทรปซน (Chrymotrypsin) และทรปซน (Trypsin) เปนตน ไดเพปไทด และกรดแอมโน จากนนจะถกดดซมในล าไสเลก แลวเขาสกระแสเลอด โดยโปรตน 1 กรม เมอถกยอยจนสมบรณ จะไดพลงงาน 4 กโลแคลอร (สถาบนพลศกษา วทยาเขตสพรรณบร, 2557, หนา 222) และ 1 ใน 4 ของอาหารประเภทโปรตนเทานน ทรางกายไดรบในแตละวน จะถกเปลยนเปนกลโคส สวนทเหลอจะน าไปสงเคราะหกรดแอมโน โปรตน และโมเลกลชวภาพ ทจ าเปนตอการด ารงชวต รวมทงเกดการสลาย ไดเปนสารตงตนเขาสวฏจกรตาง ๆ ดงภาพท 3.24

101

ภาพท 3.24 ภาพรวมของเมแทบอลซมของกรดแอมโนและโปรตน ทมา (ดดแปลงจาก สถาบนพลศกษา วทยาเขตสพรรณบร, 2557, หนา 222)

บทสรป

กรดแอมโนประกอบดวยหมแอมโนต าแหนงแอลฟา- หมคารบอกซล และโซขาง โครงสรางพบโครงแบบชนดแอล- มากกวาชนดด- แบงเปน 3 กลม ไดแก กรดแอมโนเปนกรด กรดแอมโนเปนเบส และกรดแอมโนเปนกลาง ซงกรดแอมโนทจ าเปนมทงหมด 10 ชนด โครงสรางรปสวตเตอรไอออน มคณสมบตเปนไดทงกรดและเบส เรยกวา แอมโฟเทอรก ละลายน าได และเปนสารละลายบฟเฟอร แตเมอผลรวมของประจเปนศนย เรยกวา จดไอโซอเลกทรก คาความเปนกรด-เบสของสารละลายขณะนน เรยกวา คาพไอ ท าใหการละลายของโปรตนนอยลง จนเกดการตกตะกอน เรยกวา โปรตนถกแปลงสภาพ นอกจากน กรดแอมโนยงมคณสมบตการหมนเชงแสงและการดดกลนรงสยวเฉพาะ ปฏกรยาของกรดแอมโนเกดไดทหมแอมโน หมคารบอกซล และโซขาง เมอกรดแอมโนหลายชนดตอกนดวยพนธะเพปไทดเปนโซยาว จะไดพอลเพปไทดหรอโปรตน หลงจากโปรตนเกดเมแทบอลซมในรางกาย จนไดกรดแอมโนแลว จะถกสลายโดยอาศย 2 วถ ไดแก วถไนโตรเจน และวถโครงคารบอน โปรตนแบงตามลกษณะโครงสรางได 4 ระดบ ไดแก ระดบปฐมภม ซงเปนโซตรง ระดบทตยภม แบงเปน

102

แอลฟา-ฮลกซและแผนพลต-บตา ระดบตตยภม แบงเปนโปรตนเสนใยและโปรตนกอนกลม หรอเรยกวาโปรตนเชงเดยว และระดบจตรภม เนองจากเกดแรงยดเหนยวระหวางโมเลกล โดยเฉพาะพนธะไฮโดรเจน กรณโครงสรางโปรตนทเชอมพนธะกบสารอนทไมใชโปรตน เรยกวา หมพรอสเทตก จะเรยกโปรตนนนวา โปรตนสงยค โดยการเรยงล าดบและชนดของกรดแอมโนในโซโปรตน จะท าใหมหนาททางชวภาพตางกน วธการตรวจสอบโปรตนทนยม ไดแก ปฏกรยาไบยเรต เกดสารละลายสมวงแดง หรอสน าเงนมวง

103

ค าถามทายบท

1. ก าหนดโครงสราง สารใดไมใชกรดแอมโน

COOHNH2

NH

COOH

NH2 HNHO

COOHNH

COOH

2. กรดแอมโนทก าหนดใหมคณสมบตเปนกรด เบส หรอกลาง

H2N

HC

H2C

CO2H

HNN

H2N

HC

CH2CO2H

CO2H

H2NHC CO2H

(CH2)3-NH-C=NH

NH2

H2N

HC CO2H

CH2-C-NH2

O

H2N

HC CO2H

3. จงเขยนโครงสรางรปสวตเตอรไอออนของเซอรน 4. จงเขยนโครงสรางของกรดกลทามกเมออยในสารละลายกรดและสารละลายเบส 5. จงเขยนผลตภณฑทเกดขน

5.1 เมอฟนลอะลานนท าปฏกรยากบเบนซลคลอไรด (Benzyl chloride) 5.2 เมออารจนนท าปฏกรยากบกรดไนทรส

6. ถาโปรตนประกอบดวยซสทอน จะเกดแรงยดเหนยวระหวางโมเลกลอะไรบาง ทท าใหเกดโครงสรางระดบทตยภม

7. จงเขยนโครงสรางของโปรตนทมกรดแอมโนตอเรยงกน ดงน Ala-Thr-Leu-Gly 8. จากโครงสรางในขอ 7 มพนธะเพปไทดกท ใชลกศรชต าแหนงใหชดเจน 9. คาพไอของอนซลน เทากบ 5.1 หมายความวาอยางไร 10. ก าหนดโครงสราง เมอเกดการแยกสลายดวยน าอยางสมบรณ จงเขยนมอนอเมอรของกรดแอมโน

HO NH

HN

O

NH2

O SH

OOH

O

11. เมอหยดน าผงปรมาณหนงลงในน านมถวเหลอง ผลปรากฏวาเกดการตกตะกอน จงอธบาย 12. จากขอ 11 จงบอกผลการทดลอง เมอน าตะกอนทเกดขนไปท าปฏกรยากบไบยเรต 13. จงบอกปจจยทท าใหโปรตนเกดการแปลงสภาพ 14. จงบอกหนาททางชวภาพของโปรตนทก าหนดใหตอไปน

ไมโอซน ฮโมโกลบน อลาสทน ธรอมบน โรดอปซน และคอลลาเจน

104

15. น าไขขาวมาทดสอบกบรเอเจนตตาง ๆ ใหผลดงตาราง

การทดสอบ ผลการทดสอบ

กอนการแยกสลายดวยน า หลงการแยกสลายดวยน า

ปฏกรยาไบยเรต ไดสารละลายสมวง ไดสารละลายสฟา ปฏกรยามลลอน ไมเกดการเปลยนแปลง เกดตะกอนสขาวเลกนอย ปฏกรยาแซนโธโพรเทอก ไมเกดการเปลยนแปลง ไมเกดการเปลยนแปลง การทดสอบวงของเฮลเลอร เกดตะกอนระหวางชน สารละลายใสไมมส

จงตอบค าถามตอไปน 15.1 โปรตนในไขขาวเกดการแยกสลายดวยน าไดหรอไม เพราะเหตใด 15.2 ทานคดวามไทโรซนในสายโปรตนหรอไม จงอธบาย 15.3 ทานสามารถสรปผลการทดสอบไดอยางไร