MIKROBIOLOGIA w medycynie, przemyśle

i ochronie środowiska

II edycja

Łódź 2011

2

Książka konferencyjna

Mikrobiologia w Medycynie, Przemyśle i Ochronie Środowiska, II edycja

Organizator

Instytut Mikrobiologii, Biotechnologii i Immunologii

Wydział Biologii i Ochrony Środowiska, Uniwersytet Łódzki

ul. Banacha 12/16, 90-237 Łódź

tel.: +42 635 44 63, fax: +42 665 58 18

inmik@biol.uni.lodz.pl, http://biol.uni.lodz.pl/

Współorganizatorzy

Komitet Mikrobiologii Polskiej Akademii Nauk

Polskie Towarzystwo Mikrobiologów

Komitet Organizacyjny

prof. dr hab. Barbara Różalska

mgr Aleksandra Budzyńska

mgr Marcin Grzybowski

mgr Kinga Ostrowska

mgr Małgorzata Paszkiewicz

mgr Karolina Rudnicka

mgr Piotr Szpakowski

mgr Marcin Włodarczyk

studenci zrzeszeni w Sekcji Mikrobiologicznej SKNB UŁ

Komitet Naukowy

prof. dr hab. Wiesława Rudnicka

prof. dr hab. Henryka Długońska

prof. dr hab. Jerzy Długoński

prof. dr hab. Jarosław Dziadek

prof. dr hab. Adam Jaworski

prof. dr hab. Magdalena Mikołajczyk-Chmiela

prof. dr hab. Barbara Różalska

prof. dr hab. Antoni Różalski

Skład i projekt okładki

mgr Marcin Grzybowski

Druk

Drukarnia Uniwersytetu Łódzkiego

3

Podziękowania

Składamy serdeczne wyrazy wdzięczności Sponsorom za wsparcie finansowe, bez którego

niniejsza konferencja nie mogłaby zostać zrealizowana.

Pragniemy podziękować również Patronom Medialnym i Partnerom za profesjonalną współ-

pracę przy promocji konferencji.

Serdecznie Państwu dziękujemy,

Komitet Organizacyjny

Sponsor główny

BRUKER Polska Sp. z o.o.

Sponsor strategiczny

MAXIMUS, Polskie Agarozy

Pozostali sponsorzy

ABE-IPS sp. z o.o.

A.G.A. Analytical

Alab Sp. z o.o.

BIOCORP Polska Sp. z o.o.

GRASO Biotech

PZ HTL S.A.

Olympus Polska sp. z o.o.

PZO Sp. z o.o.

Patronat honorowy

Urząd Marszałkowski w Łodzi

Patroni medialni

Biotechnolog.pl

Biotechnologia.pl

Biolog.pl

Mikrobiolodzy.pl

LAB-ALL.COM

Czasopismo LAB

Laboratorium – Przegląd Ogólnopolski

LSI – Laboratoryjny Serwis Informacyjny

INVESTIN

Kombinatorium

Fundacja Zaawansowanych Technologii

Partnerzy

MERCK

Grafika Multimedia Internet www.mariuszoracz.pl

4

5

Spis treści

Harmonogram konferencji 6

Streszczenia prezentowanych prac

Sesja I

Nowe metody diagnostyki chorób zakaźnych człowieka

i zwierząt. Metody badawcze

9

Sesja II

Zakażenia bakteryjne, czynniki patogenności drobnoustrojów

oraz nowe metody leczenia zakażeń

29

Sesja III

Wyzwania, nadzieje i nowe kierunki w biotechnologii

i mikrobiologii środowiskowej

65

Sesja IV

Nowe zagadnienia z zakresu genetyki, biochemii i biologii

molekularnej mikroorganizmów

101

Alfabetyczny indeks autorów 121

6

Harmonogram konferencji

Dzień I (sobota, 22 X 2011)

08.00 – 10.00 Rejestracja uczestników

10.00 – 10.30 Uroczyste otwarcie konferencji

Sesja I

Nowe metody diagnostyki chorób zakaźnych człowieka i zwierząt. Metody badawcze

(prowadzący: prof. Magdalena Mikołajczyk-Chmiela, Bartłomiej Micota)

10.30 – 11.15 Wykład plenarny: Metody immunologiczne w diagnostyce infekcji wiru-

sowych i pasożytniczych, prof. H. Długońska

11.15 – 11.45 Prezentacja firmy BRUKER Polska Sp. z o.o.: MALDI Biotyper – Micro-

bial Identification for the 21st Century, dr Guido Mix

11.45 – 12.15 Przerwa kawowa

12.15 – 12.30 Metoda gradientowo-dyfuzyjna w modyfikacji własnej. Ocena synergi-

zmu leków przeciwgrzybiczych i olejków eterycznych, mgr A. Budzyńska

12.30 – 12.45 Wykrywanie obecności pałeczek Salmonella sp. w mięsie z zastosowa-

niem immunoenzymatycznej metody VIDAS® Salmonella Xpress,

mgr inż. W. Chajęcka-Wierzchowska

12.45 – 13.00 OMP-34 – białko błony zewnętrznej Shigella flexneri 3a jako uniwersal-

ny marker diagnostyczny zakażeń pokarmowych, mgr A. Jarząb

13.00 – 13.15 Nowoczesna metoda diagnostyki ukrytego zakażenia wirusa wątroby

typu B, N. Kurantowicz

13.15 – 14.30 Przerwa obiadowa

14.30 – 15.15 Sesja plakatowa (wspólna dla sesji I i II)

Sesja II

Zakażenia bakteryjne, czynniki patogenności drobroustrojów oraz nowe metody leczenia

zakażeń (prowadzący: prof. Henryka Długońska, Artur Ruszczak)

15.15 – 16.00 Wykład plenarny: Patogeneza zakażeń z udziałem biofilmów – możli-

wości interwencji, dr hab. B. Sadowska

16.00 – 16.30 Przerwa kawowa

16.30 – 16.45 Rola oksydazy cholesterolowej Mycobacterium tuberculosis w infekcji

ludzkich makrofagów prątkami gruźlicy, mgr M. Brzezińska

16.45 – 17.00 Formy morfologiczne H. pylori i ich przypuszczalna rola w transmisji

zakażeń, M. Graczykowski

17.00 – 17.15 Izolacja i charakterystyka środowiskowych bakteriofagów wykazujących

aktywność lityczną wobec wielolekoopornych szczepów Klebsiella sp.,

mgr A. Kęsik-Szeloch

7

17.15 – 17.30 Poszukiwanie zwierzęcego rezerwuaru enterokrwotocznych szczepów

E. coli (EHEC), A. Solecka

17.30 – 17.45 Podsumowanie pierwszego dnia konferencji

20.00 Impreza integracyjna

Dzień II (niedziela, 23 X 2011)

Sesja III

Wyzwania, nadzieje i nowe kierunki w biotechnologii i mikrobiologii środowiskowej

(prowadzący: dr hab. Katarzyna Lisowska, Adam Janowski)

09.00 – 09.45 Wykład plenarny: Pozytywne i negatywne skutki aktywności degrada-

cyjnej drobnoustrojów w środowisku, prof. J. Długoński

09.45 – 10.15 Przerwa kawowa

10.15 – 10.30 Nanosrebro w kosmetykach i produktach chemii gospodarczej – fakt

czy chwyt marketingowy?, K. Juś

10.30 – 10.45 Wpływ czynników Nod na kiełkowanie i wzrost wyki oraz wydajność

symbiozy w układzie Rhizobium leguminosarum bv. viciae – Vicia villo-

sa cv. Wista, mgr D. Kidaj

10.45 – 11.00 Biosynteza nanocząstek srebra z wykorzystaniem grzybów w warun-

kach in vitro, mgr A. Ogar

11.00 – 11.15 Zastosowanie wielowarstwowych nanorurek węglowych do ekstrakcji

patuliny z soków jabłkowych metodą SPE, mgr inż. A. Śliwińska

11.15 – 12.00 Sesja plakatowa (wspólna dla sesji III i IV)

12.00 – 13.15 Przerwa obiadowa

Sesja IV

Nowe zagadnienia z zakresu genetyki, biochemii i biologii molekularnej mikroorganizmów

(prowadzący: dr hab. Paweł Stączek, mgr Aleksandra Strzelczyk)

13.15 – 14.00 Wykład plenarny: Poszukiwania nowych „tarcz” dla leków przeciwdrob-

noustrojowych, prof. J. Dziadek

14.00 – 14.15 Kasety DIY – podstawa do konstrukcji nowych narzędzi genetycznych

dla Alphaproteobacteria, mgr M. Adamczuk

14.15 – 14.30 Zastosowanie metody RAPD w oparciu o sekwencje mikrosatelitarne do

różnicowania szczepów M. canis izolowanych od ludzi i zwierząt

w Polsce, mgr J. Dębska

14.30 – 14.45 Charakterystyka mykobakterialnej primazy DnaG jako miejsca docelo-

wego dla nowych leków przeciwgruźliczych, mgr A. Kuroń

14.45 – 15.00 Izolacja aktywności przeciwdrożdżowych i przeciwprątkowych z endo-

symbiotycznych dla dżdżownicy Dendrobaena veneta bakterii Raoultel-

la ornithinolytica, K. Pernach

15.00 – 15.45 Uroczyste zamknięcie konferencji oraz wręczenie nagród i wyróźnień

8

9

Sesja I

Nowe metody diagnostyki chorób

zakaźnych człowieka i zwierząt.

Metody badawcze

10

11

Wykład plenarny

Metody immunologiczne w diagnostyce infekcji wirusowych i pasożytniczych

Długońska H.

Katedra Immunologii i Biologii Infekcyjnej, Uniwersytet Łódzki

e-mail: hdlugo@biol.uni.lodz.pl

Laboratoryjna diagnostyka chorób wirusowych i pasożytniczych obejmuje szeroką paletę metod, wśród

których bardzo znaczącą rolę odgrywają metody immunologiczne. Metody te mają charakter uniwersalny,

bowiem mogą służyć do wykrywania zarówno czynnika infekcyjnego, jak i produktów wzbudzonej przez

niego nabytej odpowiedzi immunologicznej: humoralnej (swoistych przeciwciał) oraz komórkowej (swoi-

stych limfocytów T). W postępowaniu diagnostycznym wykorzystuje się najczęściej oznaczanie obecno-

ści i poziomu swoistych przeciwciał przeciw wirusom oraz pasożytom w surowicy krwi badanej osoby lub

zwierzęcia. Metody te jako pośrednie obarczone są z natury pewnymi ułomnościami, dlatego też interpre-

tacja otrzymanych wyników powinna być rozważna, a zatem wymaga dobrze wykształconego i doświad-

czonego personelu laboratoryjnego.

Niektóre ze stosowanych obecnie w laboratoriach wirusologicznych i parazytologicznych metod im-

munodiagnostycznych są używane w prawie niezmienionej formie od kilkudziesięciu lat (np. odczyn

neutralizacji wirusów w diagnostyce wścieklizny czy odczyn cytolizy Sabina-Feldmana w diagnostyce

toksoplazmozy). Inne metody, jak np. liczne techniki immunochromatografii, zostały opracowane i wpro-

wadzone w ostatnich latach. Cieszą się one dużym powodzeniem głównie dlatego, że spełniają kryteria

tzw. szybkiej diagnostyki, w której otrzymuje się na wynik w ciągu kilku-kilkunastu minut.

Idealny test diagnostyczny powinien być nieinwazyjny dla pacjenta, czuły, swoisty, tani, nieuciążliwy

dla diagnostów i szybki. Powinien precyzyjnie odpowiadać na postawione cele badania, wnosząc m.in.

informacje, co do fazy infekcji, profilu wytworzonej odpowiedzi immunologicznej (wskaźnika istnienia lub

braku ochronnej odporności) i skuteczności zastosowanej terapii. Stałe udoskonalanie i wprowadzanie do

praktyki nowych testów świadczy o dążeniu do opracowania metod zbliżonych do ideału.

Wśród różnorodnych metod immunologicznych pierwszoplanowy udział mają techniki immunoenzyma-

tyczne, używane z reguły do wykrywania swoistych przeciwciał w surowicy pacjenta, rzadziej do wykry-

wania antygenów wirusów lub pasożytów i rzadko – do wykazania obecności swoistych kompleksów

antygen-przeciwciało. Dominująca w tej grupie metod technika ELISA jest prosta, tania, może być

zastosowana niemal w każdym laboratorium, poddaje się automatyzacji i nadaje do badań przesiewo-

wych, ale wiele testów komercyjnych ELISA odznacza się niezadowalającą czułością i swoistością.

Celem wykładu jest przedstawienie technik immunologicznych na przykładzie diagnostyki kilku wybra-

nych infekcji wirusowych i inwazji pasożytniczych. Metody te mają różną wartość diagnostyczną, dlatego

czasem wymagają łącznego zastosowania, a z pewnością zawsze – krytycznej interpretacji wyników

przez personel laboratorium.

12

Nadesłane streszczenia

I-1 P | Antygeny ESAT-6 i CFP 10 w rozpoznaniu zakażenia Mycobacterium tuberculosis

Borkowska D., Zwolska Z., Augustynowicz-Kopeć E.

Zakład Mikrobiologii, Instytut Gruźlicy i Chorób Płuc, Warszawa

e-mail: d.borkowska@igichp.edu.pl

Wstęp: Ogromny postęp w dziedzinie genetyki umożliwił otrzymanie w formie rekombinowanej dwóch

specyficznych antygenów prątka gruźlicy ESAT-6 i CFP 10. Białka te kodowane są przez region RD-1

genomu Mycobacterium tuberculosis, którego brak w genomie Mycobacterium bovis BCG i większości

prątków środowiskowych. Nowe metody diagnostyczne umożliwiające rozpoznanie zakażenia prątkiem

gruźlicy oparte są na specyficznych antygenach, dzięki którym możliwe jest wyeliminowanie reakcji

krzyżowej z szczepionką BCG i prątkami niegruźliczymi MOTT. Obecnie na rynku są dostępne dwa,

komercyjne testy IGRA (interferon-γ release assay): QuantiFERON-TbGold i T-SPOT.TB. Cel: Celem

pracy była ocena przydatność diagnostycznej nowego testu IGRA T-SPOT.TB w rozpoznaniu zakażenia

prątkiem gruźlicy. Metody: Zakażenie prątkiem gruźlicy diagnozowano przy użyciu próby tuberkulinowej

i testu T-SPOT.TB wykorzystującego metodę ELISpot. Test IGRA wykonano z krwi obwodowej oceniając

liczbę limfocytów T, które po stymulacji antygenami ESAT-6 i CFP 10 wydzielały IFN-γ. Wyniki:

W badaniach wykazano częściową rozbieżność wyników uzyskanych za pomocą próby tuberkulinowej

i testu IGRA. Niezgodność typu TST(dodatni)/T.SPOT.TB(ujemny) mogła być związana z krzyżową

reakcją ze szczepieniem BCG lub zakażeniem prątkami MOTT. Drugi typ niezgodności TST(ujemny)/T-

SPOT.TB(dodatni) stwierdzono u pacjentów w podeszłym wieku i złym stanie zdrowia, co mogło być

przyczyną braku reakcji skórnej na tuberkulinę. Stwierdzono, że liczba pozytywnych wyników testów

IGRA wzrastała wraz ze wzrastającą wartością średnicy nacieku odczynu tuberkulinowego. Wnioski:

Zaletą testu T-SPOT.TB (Oxford Immunotec, Wielka Brytania) jest wykorzystanie specyficznych antyge-

nów ESAT-6 i CFP 10 kodowanych przez region RD1 genomu prątka gruźlicy. Dzięki ich zastosowaniu

T-SPOT.TB jest obarczony mniejszym błędem w kierunku rozpoznania zakażenia M. tuberculosis.

W naszej ocenie test IGRA T-SPOT.TB może być stosowany obok próby tuberkulinowej i testu Quanti-

FERON-TbGold jako test pomocniczy w rozpoznaniu zakażenia prątkiem gruźlicy.

I-2 P/O | Metoda gradientowo-dyfuzyjna w modyfikacji własnej. Ocena synergizmu leków

przeciwgrzybiczych i olejków eterycznych

Budzyńska A., Różalska B.

Instytut Mikrobiologii, Immunologii i Biotechnologii, Uniwersytet Łódzki

e-mail: albudzal@biol.uni.lodz.pl

Wstęp: W świetle faktu narastania lekooporności grzybów i częstego braku skuteczności wdrożonej

chemioterapii zakażeń, lecznicze wykorzystanie fitozwiązków ma aktualnie coraz większe znaczenie. Ich

poszukiwanie obejmuje identyfikację preparatów o bezpośrednim działaniu grzybobójczym, modulujących

lekooporność lub działających synergistycznie albo addytywnie do klasycznych leków. Zachodzi więc

potrzeba dysponowania prostą metodą skryningową służącą do znalezienia związków naturalnych

o takich pożądanych cechach. Cel: Ocena wrażliwości drożdżaków z rodzaju Candida na wybrane leki

przeciwgrzybicze, w ich połączeniu z olejkami eterycznymi. Ustalenie parametrów metodycznych bada-

nia. Metody: Badano synergizm działania worykonazolu oraz flukonazolu z olejkiem geraniowym, goź-

dzikowym i ze składnikami olejków: cytronelalem i cytralem, wobec C. albicans ATCC 10231 i C. glabrata

G1 (szczep kliniczny). Fitozwiązki użyto w ich stężeniach subinhibicyjnych - w fazie nielotnej (metoda

rozcieńczeń w agarze Sabouraud’a) i w fazie lotnej (kontrolowana ilościowo mikroatmosfera nad podło-

13

żem z posiewem powierzchniowym). Synergizm oceniano stosując komercyjny test paskowy MIC Test

Strip (LiofilChem, Włochy). Wyniki: Wykazano przydatność powyższej zmodyfikowanej metody w ocenie

synergizmu leków przeciwgrzybiczych i olejków eterycznych oraz ich składników. Z uwagi na zastoso-

wanie standardowych pasków z gradientem stężeń chemioterapeutyku, zaproponowana metodyka

pozwala w sposób wiarygodny zauważyć nawet niewielką zmianę wartości MIC, odzwierciedlającą efekt

synergizmu. W metodzie rozcieńczeń w agarze, subinhibicyjne stężenie olejku geraniowego spowodowa-

ło 20-25 krotny spadek wartości MIC obu leków wobec C. albicans. Podobny stopień redukcji MIC leków

uzyskano w badaniu wrażliwości C. glabrata. Cytronelal i cytral użyte w stężeniach ½ MIC również

działały skutecznie, choć słabiej. Olejki eteryczne/składniki zastosowane w fazie lotnej wykazywały też

działanie synergistyczne - uzyskany efekt był nieco niższy, jednakże znaczący. Wnioski: Zastosowana

metodyka skryningowego badania synergizmu może być równie użyteczna w ocenie skuteczności

połączeń dowolnych antybiotyków, antyseptyków i nowych związków o potencjalnej aktywności wobec

grzybów i bakterii.

I-3 P | Ocena działania wybranych olejków eterycznych, w fazie nielotnej/lotnej, na hodowle

biofilmowe Candida albicans i Staphylococcus aureus. Własne rozwiązania metodyczne

Budzyńska A., Sadowska B., Paszkiewicz M., Różalska B.

Instytut Mikrobiologii, Immunologii i Biotechnologii, Uniwersytet Łódzki

e-mail: albudzal@biol.uni.lodz.pl

Wstęp: Z uwagi na znaną wysoką lekooporność biofilmów, wypracowanie standardów alternatywnego

leczenia zakażeń przebiegających z ich udziałem jest wyzwaniem nowoczesnej mikrobiologii i medycyny.

Stąd, wzrasta zainteresowanie badaniem skuteczności bezpośredniej różnych czynników biobójczych

pochodzenia naturalnego lub ich połączeń z antybiotykami. W celu ewaluacji efektu ich działania na

biomasę drobnoustrojów stosuje się różnorodne techniki barwienia - polimeru pozakomórkowego biofilmu

albo samych komórek. Istnieje jednak wciąż potrzeba opracowania nowych lub modyfikacji znanych

testów oceny żywotności biofilmu. Powinny one być dostosowane do charakteru fizyko-chemicznego

badanych związków a jednocześnie oparte o prostą procedurę, minimalizującą ryzyko uszkodzenia

biofilmu podczas barwienia. Cel: Opracowanie testu oceny efektu działania olejków eterycznych na

biofilm bakterii i grzybów. Metody: Na insertach umieszczonych w 24-studzienkowej płytce hodowlanej

zakładano biofilmy S. aureus ATCC 6538 i C. albicans ATCC 10231 (24-godzinne). Następnie poddano

je bezpośredniemu działaniu olejku goździkowego (przez zanurzenie insertu w roztworze olejku) lub

działaniu frakcji lotnej olejku (bez kontaktu bezpośredniego faz). Po 4-ro godzinnej inkubacji, biofilmy

drobnoustrojów na insertach barwiono MTT (ocena ilościowa - odczyt spektrofotometryczny), wyznacza-

jąc stężenie powodujące co najmniej 50% redukcję aktywności metabolicznej drobnoustrojów (MBEC50).

Wyniki: Stwierdzono, że olejek goździkowy, jak również jego lotne składniki, wykazują aktywność

przeciwbiofilmową. MBEC50 fazy płynnej olejku wobec biofilmu S. aureus ATCC 6538 i C. albicans ATCC

10231 utworzonego na membranie insertów wynosiło 31 l ml-1, natomiast aktywność frakcji lotnej - 31 l

ml-1 dla biofilmu S. aureus i 62 l ml-1 dla biofilmu C. albicans. W kolejno wykonanych doświadczeniach

uzyskano wysoką powtarzalność wyników, tym samym uznano opracowaną metodykę za przydatną

w dalszych planowanych badaniach z tego zakresu. Wnioski: Proponowany model oceny in vitro efek-

tywności przeciwbiofilmowej olejków, z zastosowaniem membranowych insertów do płytek hodowlanych,

zapewnia minimalne naruszenie jego integralności podczas badania. Pozwala na łatwe zbadanie aktyw-

ności frakcji lotnej tych preparatów, ułatwia ustalenie kinetyki ich działania oraz umożliwia analizę jako-

ściową i ilościową produktów metabolizmu populacji biofilmowej, uwalnianych do podłoża wzrostu.

14

I-4 P/O | Wykrywanie obecności pałeczek Salmonella sp. w mięsie z zastosowaniem

immunoenzymatycznej metody VIDAS® Salmonella Xpress

Chajęcka-Wierzchowska W., Zadernowska A., Kłębukowska L., Łaniewska-Trokenheim Ł.

Katedra Mikrobiologii Przemysłowej i Żywności, Wydział Nauki o Żywności,

Uniwersytet Warmińsko-Mazurski w Olsztynie

e-mail: wioleta.chajecka@uwm.edu.pl

Wstęp: Celem przyspieszenia wykrywania drobnoustrojów patogennych w żywności jako alternatywę

czasochłonnych badań opracowuje się nowe szybkie metody. Stosuje się metody hybrydyzacji, reakcje

łańcuchowe polimerazy i wiele metod opartych na reakcjach immunoenzymatycznych m. in. system mini

VIDAS (bioMérieux). Testy VIDAS® Salmonella Xpress (SLMX) opierają się na wykrywaniu w badanej

próbce specyficznych antygenów, wykorzystując reakcję typu ELFA z końcowym odczytem fluorescencji.

Cel: Celem badań było określenie przydatności metody do oznaczania obecności pałeczek Salmonella

sp. w mięsie drobiowym (mimo braku walidacji na tego rodzaju matryce) z wykorzystaniem procedury

opracowanej w laboratorium Katedry Mikrobiologii Przemysłowej i Żywności. Metody: W badaniu zasto-

sowano wyizolowane z drobiu szczepy Salmonella Typhimurium oraz Salmonella Enteritidis. Materiałem

do badań było mięso drobiu rzeźnego: kaczek, indyków, gęsi oraz kurcząt zakupione w sieci detalicznej.

Mięso kontaminowano pałeczkami, tak aby uzyskać trzy poziomy zanieczyszczenia: wysoki (rzędu 1000

kom/25g), średni (rzędu 100 kom/25g) oraz niski (rzędu 10 kom/25g). Jednocześnie określano tzw.

matrycę produktu oznaczając ogólną liczbę bakterii mezofilnych tlenowych oraz pałeczek z rodziny

Enterobacteriaceae. Po kontaminacji próbek pałeczkami Salmonella, przeprowadzano analizę z użyciem

aparatu mini Vidas i równolegle dalsze etapy badań zgodnie z PN-ISO-6579:2003. Wyniki: Wyniki

zarówno w metodzie hodowlanej jak i przy użyciu aparatu były zależne od rodzaju badanego mięsa oraz

od mikrobiologicznego zanieczyszczenia surowca. Testy zdecydowanie lepiej sprawdzały się dla mięsa

o niższej matrycy tj. mięsa kaczki i gęsi. W pozostałych próbach obecność mikroflory towarzyszącej

stanowiła konkurencję dla wprowadzanych do próbki pałeczek Salmonella. W takich przypadkach aparat

wskazywał na wyniki fałszywie dodatnie. Wnioski: Czas trwania analizy przy użyciu urządzenia mini-

VIDAS był zdecydowanie krótszy niż w przypadku procedury ISO 6579. Analiza, bez konieczności

wykonywania potwierdzeń zajmowała 20-26 godzin. Badania wykazały 100% czułość testów VIDAS®

Salmonella Xpress (SLMX) dla wszystkich rodzajów badanego mięsa. Względna specyficzność oraz

dokładność metody zależne były od rodzaju badanego mięsa oraz od mikrobiologicznego zanieczysz-

czenia surowca.

I-5 P | Żywność, jako potencjalne źródło występowania opornych na antybiotyki szczepów

Enterococcus ssp. i Staphylococcus ssp.

Chajęcka-Wierzchowska W.*, Sierpińska M., Łaniewska-Trokenheim Ł.

Katedra Mikrobiologii Przemysłowej i Żywności, Wydział Nauki o Żywności,

Uniwersytet Warmińsko-Mazurski w Olsztynie

e-mail: wioleta.chajecka@uwm.edu.pl

Wstęp: W ostatnich latach obserwowany jest systematyczny wzrost liczby szczepów opornych na

antybiotyki w otoczeniu człowieka. Podejrzewa się, że żywność może pełnić znaczącą rolę w rozprze-

strzenianiu drobnoustrojów opornych. Dotychczas prace z tego zakresu dotyczyły występowania szcze-

pów opornych na antybiotyki w surowcach zarówno pochodzenia zwierzęcego jak i roślinnego. Niewiele

istnieje publikacji dotyczących występowania szczepów opornych na antybiotyki w żywności gotowej do

spożycia. Cel: Celem badań było określenie oporności na antybiotyki szczepów Enterococcus ssp

i Staphylococcus ssp izolowanych z żywności gotowej do bezpośredniego spożycia oferowanej

w sprzedaży detalicznej, spełniającej wymagania jakościowe. Materiał i metody: Próbki żywności: sery

15

dojrzewające, wędliny, ryby po wstępnym namnożeniu na podłożu bulionowym z glukozą, przesiewano

na podłoża: RPF (izolacja Staphylococcus ssp) i Slanetz’a (Enterococcus ssp). Inkubację prowadzono

w temperaturze 37oC przez 24 godz. Oporność na antybiotyki wyizolowanych szczepów określono

zgodnie z wytycznymi NCCLS ( National Committee for Clinical Laboratory Standars). Do określenia

oporności stosowano standardowe podłoże Müellera-Hintona. Antybiogram szczepów z rodzaju Entero-

coccus ssp. obejmował 16 antybiotyków: penicylinę, ampicylinę, streptomycynę, gentamicynę, tetracykli-

nę, tigecyklinę, wankomycynę, teikoplaninę, ciprofloksacynę, norfloksacynę, lewofloksacynę, linezolid,

chloramfenikol, rifampicynę, nitrofurantoinę, fosfomycynę, chinupristynę/dalfopristynę. Antybiogram

szczepów z rodzaju Staphylococcus ssp. obejmował 14 antybiotyków: erytromycynę, klindamycynę,

cefoksytynę, norfloksacynę, nitrofurantoinę, trimetoprim/sulfaketoksazol, tetracyklinę, chloramfenikol,

ciprofloksacynę, rifampicylinę, gentamycynę, linezolid, oraz qinaprystynę/dalfoprystynę. Wyniki: Ze 169

próbek żywności pochodzenia zwierzęcego: sery dojrzewające (82 próbki), wędliny (58 próbek), ryby

i wyroby z ryb (29 próbek), wyizolowano 115 szczepów Enterococcus ssp oraz 42 szczepy Staphylococ-

cus ssp. Szczepy z rodzaju Enterococcus ssp. były oporne na tetracykliny (tetracyklina, tigecyklina),

wysokie stężenia aminoglikozydów (szczególnie na streptomycynę), fosfomycynę, rifampicynę oraz

chinupristynę/dalfopristynę. Pojedyńcze szczepy były oporne na linezolid, chloramfenikol, nitrofurantoinę,

rifampicynę i teikoplaninę. Wszystkie badane szczepy były wrażliwe na wankomycynę i ciprofloksacynę.

Szczepy z rodzaju Staphylococcus ssp. były oporne na klindamycynę, cefoksytynę, trimeto-

prim/sulfaketoksazol, norfloksacynę oraz chloramfenikol. Wśród izolatów wstępowały szczepy wieloopor-

ne.

____________________ *Autor otrzymał stypendium współfinansowane przez Unię Europejską w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego.

Badania były współfinansowane przez grant Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego (N N312 236138).

I-6 P | Liczebność bakterii z rodzajów Clostridium, Lactobacillus i Enterococcus (typ Firmicutes)

w kale dzieci w wieku od 5 do 14 lat

Gajek A., Lewandowska M.

Instytut Technologii Fermentacji i Mikrobiologii, Wydział Biotechnologii i Nauk o Żywności,

Politechnika Łódzka

e-mail: anna.gajek@edu.p.lodz.pl, malgorzata.lewandowska@edu.p.lodz.pl

Wstęp: W zespole mikroorganizmów jelitowych zdrowego, dorosłego człowieka dominującymi są gatunki

bakterii należące do typów Firmicutes i Bacteroidetes, które stanowią ponad 90% całej flory jelitowej

człowieka. Skład mikroflory jelitowej zależy od wielu czynników, m.in. wieku, diety, przebytych chorób.

Liczebność bakterii z rodzaju Bifidobacterium oraz Clostridium jest większa w jelitach dzieci niż u doro-

słych. Ponieważ 80% bakterii tworzących mikroflorę jelitową to mikroorganizmy niehodowlane, dlatego

obok metod hodowlanych stosuje się metody biologii molekularnej, takie jak fluorescencyjna hybrydyza-

cja in situ (FISH). Cel pracy: Celem pracy jest zbadanie liczebności bakterii z rodzajów Clostridium,

Lactobacillus i Enterococcus w kale dzieci w wieku 5-14 lat. Metody: Materiałem badanym był kał nie-

mrożony, 48h po pobraniu, pochodzący od 10 zdrowych dzieci w wieku 5-14 lat. Analizę przeprowadzono

metodami hodowlanymi, stosując selektywnie namnażające podłoża: DRCM dla Clostridium, Rogosa dla

Lactobacillus i agar z żółcią, eskuliną i azydkiem dla Enterococcus. Próby kału rozcieńczano w zbuforo-

wanej wodzie peptonowej. Równolegle liczebność bakterii określono metodą fluorescencyjnej hybrydyza-

cji in situ (FISH) z wykorzystaniem dwóch sond molekularnych - dla Clostridium (Erec 484) i Lactobacil-

lus-Enterococcus (Lab 158). Wyniki: Liczba Clostridium w kale dzieci w wieku 5-14 lat określona meto-

dami hodowlanymi wynosiła 107-108 jtk/g mokrej masy, natomiast liczba bakterii z rodzajów Lactobacillus

i Enterococcus wynosiła 105-109 jtk/g mokrej masy i nie była zależna od wieku dzieci. Liczba Clostridium

określona metodą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ była dwa rzędy wielkości wyższa i wynosiła 109-

16

1010 kom/g mokrej masy kału. Liczba Lactobacillus i Enterococcus określona tą samą metodą wynosiła

1010-1011 kom/g. Również analiza metodą FISH nie wykazała zależności liczebności bakterii od wieku.

Wnioski: U dzieci w grupie 5-14 lat wiek nie wpływa na liczebność bakterii z rodzajów Clostridium,

Lactobacillus i Enterococcus w kale. Metoda fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ pozwala na oznaczenie

od 102 do 105 razy większej liczby bakterii.

I-7 P | Wpływ dezynfektantów na właściwości chemiczne komórek bakterii

Gernand A., Żakowska Z.

Katedra Mikrobiologii Technicznej, Instytut Technologii Fermentacji i Mikrobiologii,

Politechnika Łódzka

e-mail: anna.gernand@edu.p.lodz.pl

Wstęp: Tworzenie biofilmów jako wynik adhezji komórek do powierzchni jest szeroko opisane oraz

poznane. Nie jest ono jednak dostatecznie wyjaśnione pod kątem zmian zachodzących pod wpływem

używania środków dezynfekcyjnych powszechnych w przemyśle spożywczym. Jedną z przyczyn po-

wstawania biofilmów wg danych literaturowych może być zmienność charakteru chemicznego zewnętrz-

nych struktur powierzchni komórek oraz zmiana powierzchni produkcyjnych wywołana stosowanymi na

co dzień środkami chemicznymi. Cel pracy: Badania maja na celu wyjaśnienie czy środki dezynfekcyjne

o różnym charakterze chemicznym stosowane w przemyśle zmieniają charakter chemiczny zewnętrz-

nych struktur komórkowych, wpływając na proces ich adhezji do polimerowych powierzchni instalacji

produkcyjnych. Metody: W celu zbadania tego zjawiska użyte są środki stosowane w przemyśle browar-

niczym oraz winiarskim. Badania będą przeprowadzone z użyciem bakterii wyizolowanych z powierzchni

urządzeń produkcyjnych po procesie mycia, które wykazują oporność na stosowane środki chemiczne.

W celu zidentyfikowania tych oddziaływań zbadane zostały komórki bakteryjne pod kątem ich hydrofo-

bowości/hydrofilowości za pomocą metody BATH (bacterial adhesion to hydrocarbons). Wyniki: Komórki

bakterii wyizolowanych ze środowiska produkcyjnego były zbadane za pomocą metody BATH. Metoda ta

wykazała dużą wrażliwość na śladowe ilości środków dezynfekcyjnych zawartych w badanych zawiesi-

nach komórek. Wyniki zebrane za pomocą tej metody są trudne do zinterpretowania. Konieczne jest

zastosowanie alternatywnej metody badawczej dla tego typu oddziaływań. Wnioski: Niezbędna jest

wiedza dotycząca zwilżalności powierzchni komórek, ponieważ ich charakter decyduje o pierwszym

etapie adhezji. Bardziej hydrofobowy charakter będzie sprzyjał tworzeniu się powłoki bakteryjnej, nato-

miast hydrofilowy charakter nie jest sprzyjający dla tego rodzaju procesu. W późniejszym etapie prac

porównane zostaną właściwości komórek, które nie były wcześniej poddawane wpływowi środków

dezynfekcyjnych z tymi, które zmieniły swój charakter pod wpływem substancji chemicznych i jaki to ma

wpływ na proces adhezji. Badania te pomogą wskazać, jakiego rodzaju środki chemiczne będą bardziej

efektywnie zapobiegać tworzeniu się biofilmów.

I-8 P/O | OMP-34 – białko błony zewnętrznej Shigella flexneri 3a jako uniwersalny marker

diagnostyczny zakażeń pokarmowych

Jarząb A.1, Witkowska D.1, Szostko B.1, Szkudlarek J.1, Hirnle L.2, Gamian A.1

1 Instytut Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN, Wrocław, 2 Akademia Medyczna im. Piastów Śląskich, Wrocław

e-mail: anna.jarzab@iitd.pan.wroc.pl

Wstęp: Gram-ujemne pałeczki należące do rodziny Enterobacteriaceae są jednym z czynników etiolo-

gicznych zakażeń pokarmowych, które są przyczyną śmierci 1,9 miliona osób rocznie i pod względem

śmiertelności zajmują trzecie miejsce wśród chorób trapiących ludzi na całym świecie. Ważnym aspek-

17

tem w zapobieganiu zakażeniom pokarmowym jest nie tylko zachowanie odpowiedniej higieny sanitarnej

i skierowanie uwagi na badania dotyczące nowych leków i skutecznych szczepionek, lecz także opraco-

wanie odpowiednich markerów umożliwiających szybką diagnostykę i monitorowanie zakażeń. Obecnie

nie jest dostępny żaden test diagnostyczny, gwarantujący szybką identyfikację patogenu stanowiącego

czynnik etiologiczny zatrucia, co warunkuje podjęcie skutecznego leczenia. Białko OMP-34 izolowane

z błony zewnętrznej ściany komórkowej pałeczek Shigella flexneri 3a jest brane pod uwagę, jako poten-

cjalny marker diagnostyczny, umożliwiający szybką identyfikację patogenu w próbkach biologicznych.

Cel pracy: Produkcja przeciwciał monoklonalnych skierowanych na epitopy białka OMP-34 znajdujące

się na powierzchni komórki bakterii S. flexneri 3a i wykorzystanie ich do opracowania testu diagnostycz-

nego. Metody: Białka błony zewnętrznej (OMPs) pałeczek S. flexneri 3a wyizolowano przy użyciu

szybkiej i wydajnej metody ekstrakcji z użyciem kwasu walerianowego. Myszy BALB/c immunizowano

trzykrotnie preparatem OMPs w określonych odstępach czasu. Po izolacji komórek śledziony immunizo-

wanej myszy przeprowadzono ich fuzję z komórkami plazmocytoma SP 2/0. Przeszukiwanie biblioteki

uzyskanych klonów przeprowadzono z wykorzystaniem zarówno testu ELISA, w którym jako antygenu do

opłaszczania płytek używano komórek bakteryjnych S. flexneri 3a, a także testu Western blot z wykorzy-

staniem preparatów białek błony zewnętrznej z różnych gatunków bakterii należących do rodziny Entero-

bacteriaceae oraz innych gatunków reprezentujących zarówno drobnoustroje Gram-ujemne jak i Gram-

dodatnie. Wyniki: Badania wykazały, że otrzymane przeciwciało monoklonalne jest skierowane na epitop

białka OMP-34, eksponowany na powierzchni komórki bakteryjnej S. flexneri 3a, z której zostało wyizo-

lowane. Testy dodatkowe pozwoliły na sformułowanie hipotezy, że epitop ten występuje także na po-

wierzchni białek błonowych E. coli, gatunku należącego do rodziny Enterobacteriaceae, blisko spokrew-

nionego z S. flexneri. Wnioski: Uzyskanie swoistego przeciwciała monoklonalnego, rozpoznającego

unikalne epitopy białek błonowych zlokalizowanych w błonie zewnętrznej bakterii z gatunków należących

do Enterobacteriaceae, co stwarza realne szanse na opracowanie testu umożliwiającego szybką identyfi-

kację tych patogenów w próbkach materiału biologicznego.

I-9 P | Markery stresu oksydacyjnego w osoczu pacjentów ze stwardnieniem rozsianym

Kontek B.1, Kulifer A.1, Miller E.2, Wachowicz B.1

1 Katedra Biochemii Ogólnej, Uniwersytet Łódzki, Pomorska 141/3, 90-236 Łódź, Polska, 2 III Szpital Miejski im. K. Jonschera w Łodzi, Oddział Rehabilitacji, Milionowa 14, 93-113 Łódź, Polska

e-mail: kontekb@biol.uni.lodz.pl

Wstęp: Stwardnienie rozsiane (MS) jest zapalno – demielinizacyjną chorobą ośrodkowego układu nerwo-

wego, która na skutek zniszczenia osłonki mielinowej zaburza komunikację pomiędzy mózgiem a całym

organizmem. Przyczyn upatruje się w czynnikach genetycznych, infekcyjnych, sposobie odżywiania

(dostarczanie egzogennych antyoksydantów) oraz stresie oksydacyjnym towarzyszącym tej chorobie.

Zachwianie równowagi redox i nadprodukcja reaktywnych form tlenu i azotu (RFT i RFA) prowadzi do

zniszczenia kluczowych dla organizmu struktur komórkowych neuronów oraz zaburzeń w przekaźnictwie

sygnałów. Cel pracy: Celem pracy było oznaczenie w osoczu chorych na stwardnienie rozsiane poziomu

biomarkerów stresu oksydacyjnego – peroksydacji lipidów określanych poprzez stężenie związków

reagujących z kwasem tiobarbiturowym (TBARS), 3-nitrotyrozyny (3-NT) oraz grup karbonylowych

w białkach osocza. Metody: Stres oksydacyjny badano poprzez pomiar stężenia grup karbonylowych

w białkach przy zastosowaniu dwóch metod immunoenzymatycznych (testu ELISA i konkurencyjnego

testu ELISA) oraz stężenia produktów peroksydacji lipidów - TBARS w osoczu. Wyniki: Przeprowadzone

badania wykazały, że u chorych na stwardnienie rozsiane ma miejsce podwyższona peroksydacja lipidów

(w porównaniu do poziomu TBARS w osoczu osób zdrowych). Oznaczanie stężenia grup karbonylowych

osocza, wykazało, że w remisyjno-nawracającej postaci stwardnienia rozsianego występuje najwyższe

stężenie grup karbonylowych w białkach osocza. W białkach osocza chorych na stwardnienie rozsiane

18

zanotowano także znaczny wzrost powstawania 3-NT. Wykazano również, że nadtlenoazotyn powoduje

w sposób istotny statystycznie (p < 0,01) zwiększoną karbonylację i nitrowanie białek osocza osób

chorych na MS w porównaniu do osób zdrowych. Wnioski: 1. Przeprowadzone badania potwierdziły

udział stresu oksydacyjnego w powstawaniu zaburzeń jakie występują w poszczególnych postaciach

stwardnienia rozsianego. 2. Dochodzi do oksydacyjno-nitracyjnych modyfikacji białek osocza i peroksy-

dacji lipidów.

____________________

Praca finansowana z działalności statutowej UŁ nr 506/810.

I-10 P | Oznaczanie parametrów stresu oksydacyjnego w osoczu chorych na raka piersi

Kontek B.1, Kędzierska M.1, Sekret J.1, Olas B.1, Wachowicz B.1, Czernek U.2, Szydłowska-Pazera K.2, Potemski P.2, Piekarski J.3, Jeziorski A.3

1 Katedra Biochemii Ogólnej, Uniwersytet Łódzki, Pomorska 141/3, 90-236 Łódź, Polska 2 Klinika Chemioterapii Nowotworów Katedry Onkologii, Uniwersytet Medyczny, Wojewódzki Szpital Specjalistyczny im. M. Kopernika w Łodzi, Pabianicka 62, 93-513 Łódź, Polska 3 Klinika Chirurgii Onkologicznej Katedry Onkologii, Uniwersytet Medyczny, Wojewódzki Szpital Specjalistyczny im. M. Kopernika w Łodzi, Pabianicka 62, 93-513 Łódź, Polska

e-mail: kontekb@biol.uni.lodz.pl

Wstęp: Stres oksydacyjny towarzyszy różnorodnym schorzeniom, m.in. chorobom układu krążenia,

nowotworom (rak piersi) czy chorobom neurodegeneracyjnym. Podczas stresu oksydacyjnego dochodzi

do znacznego wzrostu reaktywnych form tlenu (RFT), a to w konsekwencji powoduje zniszczenie klu-

czowych dla organizmu struktur komórkowych. Niekontrolowany wzrost stężenia RFT inicjuje łańcuchową

reakcję wolnorodnikową, w wyniku której uszkadzane są białka, lipidy, cukrowce jak również kwasy

nukleinowe. Negatywne działanie stresu oksydacyjnego niejednokrotnie wyprzedza zjawiska toksyczno-

ści hematologicznej i niehematologicznej u chorych z rakiem piersi. Cel pracy: W niniejszej pracy

określono poziom wybranych biomarkerów stresu oksydacyjnego w osoczu chorych na raka piersi przed

i po zabiegu operacyjnym oraz podczas chemioterapii (doksorubicyna + cyklofosfamid). Uzyskane wyniki

porównano z grupą kontrolną złożoną ze zdrowych kobiet. Metody: Stres oksydacyjny badano poprzez

pomiar stężenia wybranych markerów: grup karbonylowych w białkach osocza metodą ELISA, oraz

produktów peroksydacji lipidów - TBARS w osoczu. Wyniki: Uzyskane wyniki wykazały wzrost (ok. 20%)

poziomu TBARS u kobiet chorych na raka piersi po zabiegu operacyjnym w porównaniu do osób zdro-

wych. Poziom grup karbonylowych w białkach osocza kobiet chorych na nowotwór piersi po zabiegu

operacyjnym był także wyższy w porównaniu do białek osocza kobiet zdrowych. Wnioski: Otrzymane

wstępne wyniki potwierdzają istnienie stresu oksydacyjnego u kobiet cierpiących na raka piersi. Świadczy

o tym podwyższone stężenie substancji reagujących z kwasem tiobarbiturowym - TBARS oraz poziom

grup karbonylowych w białkach osocza. Stres oksydacyjny jest spotęgowany przez zabieg chirurgiczny

oraz stosowaną chemioterapię.

____________________

Praca finansowana z działalności statutowej UŁ nr 506/810.

I-11 P | Czystość mikrobiologiczna powierzchni użytkowych oraz materiałów biologicznych

Kubala N., Szczęsna E., Stańczyk J., Malinowska M., Stanuch M., Agier J., Ibran J., Mazurczyk M.,

Pali M., Mądrzak K., Micota B., Moryl M., Sadowska B.

Studenckie Koło Naukowe Biologów – Sekcja Mikrobiologiczna, Uniwersytet Łódzki

e-mail: nkl@poczta.fm

Wstęp: Przedmioty codziennego użytku mogą być rezerwuarem drobnoustrojów stanowiących zagroże-

nie dla człowieka. Znane są przypadki ludzi, którzy chwytają klamki jedynie przez chusteczkę. Osoby

19

cierpiące na mizofobię chorobliwie unikają zabrudzenia, często mają przy tym natręctwo kompulsywnego

mycia rąk. Drobnoustroje nie żyją jedynie na powierzchniach sztucznych, ale przede wszystkim na

materiałach biologicznych. Dłonie poprzez ciągły kontakt ze środowiskiem a także sprzyjające warunki na

powierzchni skóry sprawiają, że są one dogodną niszą dla ich bytowania. Cel pracy: W niniejszej pracy

oceniono czystość mikrobiologiczną przedmiotów codziennego użytku. Obliczono także ilość drobnou-

strojów na dłoniach biorąc pod uwagę płeć oraz wiek ochotników. Metody: Zarówno powierzchnie jak

i dłonie badano metodą płytek kontaktowych. Powierzchnie użykowe badano płytkami z trzema rodzajami

podłóż tj. Sabourauda w kierunku grzybów, TSA aby wyznaczyć ogólną liczbę bakterii i Chapmana

w kierunku gronkowców. Każdą płytkę trzymano 6 sekund na każdej z powierzchni następnie inkubowa-

no 24h w 37 stopniach Celsjusza. Dłonie ochotników badano płytkami z podłożem TSA przytrzymując

każdą przez 3 sekundy na 3 środkowych palcach. Wyniki: W przypadku powierzchni codziennego użytku

najwięcej drobnoustrojów wyizolowano z klamki w męskiej toalecie. W przypadku dłoni natomiast zaob-

serwowano duże zróżnicowanie jeżeli chodzi o ogólną liczbę drobnoustrojów. Liczba drobnoustrojów na

dłoniach jest cecha osobniczą i nie zależy ani od wieku ani od płci badanego. Wnioski: Drobnoustroje są

obecne w naszym życiu codziennym, czy to na naszych dłoniach, czy też na powierzchniach, z którymi

się codziennie stykamy. Następuje ciągła wymiana mikroflory pomiędzy środowiskiem nieożywionym

i ożywionym. Obawa przed podaniem ręki czy dotknięciem klamki może wydawać się uzasadniona.

I-12 P | Markery endotoksyny w materiale biologicznym - zastosowanie chromatografii gazowej

sprzężonej z tandemową spektrometrią mas

Kuder P.1, Szponar B.2

1 Politechnika Wrocławska, Wydział Chemiczny, kierunek Biotechnologia 2 Instytut Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN we Wrocławiu

e-mail: szponar@iitd.pan.wroc.pl

Wstęp: Zastosowanie 3-hydroksylowych kwasów tłuszczowych (3-OH FAs) jako markerów endotoksyny

daje unikalną możliwość analitycznego, ilościowego oznaczania LPSu za pomocą GC-MSMS (chromato-

grafii gazowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas) w próbkach różnego pochodzenia, w tym

biologicznych. Istotą metody jest ilościowe oznaczanie na specyficznych 3-OH FAs – kwasy tłuszczowe

tego typu występują wyłącznie w lipopolisacharydach, u bakterii Gram-ujemnych. Cel pracy: Dostoso-

wanie metodyki oznaczania 3-OH FAs jako ilościowych markerów endotoksyny, do rodzaju badań

i materiału, w którym są one oznaczane, tj. ustalenie warunków rozdziału chromatograficznego i detekcji

w zakresie gradientu temperatur oraz doboru stężenia standardu wewnętrznego. Metody: Analiza

standardów 3-OH FAs (C10-C18) w chromatografii gazowej sprzężonej ze spektrometrią mas, za pomo-

cą aparatu TSQ Quantum (Thermo), wyposażonego w kolumnę kapilarną Restek Rxi-5ms oraz detektor

z potrójnym kwadrupolem. Wyniki: Optymalizacja warunków analizy markerów endotoksyny została

osiągnięta, wyniki dla zastosowanych standardów zewnętrznych skorelowano ze stężeniem standardu

wewnętrznego. Wnioski: Wartość diagnostyczną chemicznych markerów endotoksyny wykazano

w posocznicy (na modelu zwierzęcym)1,2 oraz w monitorowaniu bakteriemii/endotoksemii u pacjentów

poddawanych zabiegom kardiochirurgicznym3. Oryginalnym podejściem diagnostycznym było zastoso-

wanie 3-hydroksylowych kwasów tłuszczowych jako markerów zapalenia przyzębia (periodontitis) ozna-

czanych w ślinie pacjentów4 oraz u chorych cierpiących na przewlekłe zapalenia jelita grubego (inflam-

matory bowel diseases, IBD), u których profil 3-OH FAs w stolcu okazał się charakterystyczny dla róż-

nych wariantów choroby, ale także wskazywał na korelację między stanem flory jelitowej, określanym

przez profil 3-OH FAs, a stanem klinicznym pacjentów5. Uzyskane wyniki pozwolą na dalsze zastosowa-

nia metody, m.in. w ustaleniu wzorca profilu 3-OH FAs bakteryjnego konsorcjum jelitowego u noworod-

ków w celu monitorowania zmian mikroflory w odniesieniu do rozwoju alergii i chorób autoimmunologicz-

nych.

20

I-13 P/O | Nowoczesna metoda diagnostyki ukrytego zakażenia wirusa wątroby typu B

Kurantowicz N.

Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego, Wydział Rolnictwa i Biologii, Warszawa

Instytut Hematologii i Transfuzjologii, Pracownia Biologii Molekularnej Wirusów, Zakład Wirusologii,

Warszawa

e-mail: natalia.kurantowicz@gmail.com

Wstęp: Wirus zapalenia wątroby typu B (HBV) jest niezwykle istotnym i rozpowszechnionym na świecie

patogenem człowieka. Około jedna trzecia ludzkości została zainfekowana HBV, a w Azji i w Afryce

ciągle odnotowywane są epidemie. W Polsce 15-20% ludzi przebyło to zakażenie w przeszłości, a 2%

jest chronicznie chora. Ukryte zakażenie wirusem HB (OBI, ang., occult HBV infection) jest definiowane

obecnie jako: „obecność DNA HBV w wątrobie, przy wykrywalnym lub nie HBV DNA w osoczu, oraz

niewykrywalnym antygenie HBs za pomocą dostępnych metod serologicznych, nie przekraczająca

wartości 200 IU/ml”. OBI jest szczególnym przypadkiem zakażenia HBV, którego reaktywacja może

w skrajnych przypadkach doprowadzić między innymi do marskości wątroby. Cel pracy: Opracowanie

ultraczułej metody diagnostyki OBI przy bardzo niskim stężeniu DNA wirusa za pomocą real-time PCR

z osocza. Metody: Osocze było preinkubowane z buforem zawierającym protezę, a następnie izolowano

z niego DNA w urządzeniu wykorzystującym złoże krzemionkowe (EasyMag, Biomerieux). Detekcja DNA

HBV przeprowadzana była za pomocą real-time PCR (Rotor Gene 3000, Corbett Research). Wyniki:

Otrzymana metoda diagnostyki OBI posiada wysoką czułość detekcji DNA HBV, która wynosi 100% na

poziomie 5 IU/ml i 75% na poziomie 2,5IU/ml. Wnioski: Metoda ta pozwala nam na wykrywanie bardzo

niskich stężeń DNA HBV, z którymi mamy do czynienia w przypadku OBI. Jest to wysoce specyficzny

test diagnostyczny o unikalnej kombinacji sekwencji sondy i primerów zdegenerowanych, która umożliwia

wykrywanie 7 genotypów HIV.

I-14 P | Surowica monowalentna przeciwko mutantowi Rc Yersinia enterocolitica O:3 jako

narzędzie do badania ECA-immunogenności

Rabsztyn K.1,2, Łukasik M.1, Kasperkiewicz K.1, Li C-M.2, Duda K.A.3, Radziejewska-Lebrecht J.1,

Skurnik M.2

1 Department of Microbiology, University of Silesia, Katowice, Poland 2 Haartman Institute, University of Helsinki, Helsinki, Finland 3 Research Center Borstel, Division of Structural Biochemistry, Borstel, Germany

e-mail: magdalena.lukasik@us.edu.pl

Wstęp: Wspólny Enterobakteryjny Antygen (ECA) jest obok lipopolisacharydu (LPS) ważnym składni-

kiem powierzchniowym błony zewnętrznej bakterii z rodziny Enterobacteriaceae. Sugerowano, że eks-

presja ECA w pałeczkach Yersinia enterocolitica O:3 (YeO3) jest regulowana temperaturą. Badania

z wykorzystaniem surowic monowalentnvch bogatych w przeciwciała specyficzne dla ECA, otrzymanych

dla mutantów Rc YeO3 hodowanych w 22°C i 37°C, umożliwiłyby ustalenie zależności ekspresji ECA od

temperatury hodowli pałeczek YeO3. Cel pracy: Usunięcie przeciwciał anty-LPS z poliwalentnych

surowic odpornościowych przeciwko YeO3-c-trs8-R (z 22°C i 37°C) poprzez absorpcję martwymi

i żywymi bakteriami ECA-ujemnymi, celem uzyskania surowic monowalentnvch bogatych w przeciwciała

specyficzne dla ECA. Metody: W pilotowym doświadczeniu do absorpcji użyto bakterie ECA-ujemne,

które gotowano przez 2,5 h. W kolejnej analizie wykorzystano do absorpcji żywe komórki. Nieabsorbo-

wane i dwukrotnie absorbowane surowice analizowano techniką Western blot z preparatem standardo-

wym ECAPG S. Montevideo SH94, preparatami LPSPCP i lizatami komórkowymi szczepów Yersinia entero-

colitica O:3 oraz S. Montevideo SH94. Wyniki: Surowicę przeciwko YeO3-c-trs8-R absorbowaną mar-

twymi bakteriami ECA-ujemnymi analizowano techniką Western blot z preparatem standardowym ECAPG

21

i preparatami LPSPCP szczepów Ye75S, Ye75R i YeO3-c-trs8-R. Standard ECAPG silnie reagował

w postaci charakterystycznego dla ECA profilu drabinkowego z nieabsorbowaną surowicą anty-YeO3-c-

trs8-R. Dla dwukrotnie absorbowanej surowicy obserwowano słabe immunobarwienie ze standardem

ECAPG. Preparaty LPSPCP wykazały silną reakcję w wysokim i niskim regionie cząsteczkowym zarówno

z surowicą poliwalentną, jak i surowicą absorbowaną. Otrzymane wyniki sugerowały, że zastosowana

metoda absorpcji nie pozwoliła na efektywne usunięcie przeciwciał anty-LPS z badanej surowicy poliwa-

lentnej. Stąd, do kolejnej analizy Western blot wykorzystano surowicę absorbowaną żywymi ECA-

ujemnymi bakteriami. Jako antygenów użyto LPSPCP YeO3-c-trs8-R i lizatów komórkowych szczepów:

YeO3-c-trs8-R, YeO3-c-OCR-ECA, S. Montevideo SH94. Nieabsorbowana surowica anty-YeO3-c-trs8-R

zawierała przeciwciała przeciwko wszystkim w/w antygenom. Surowica absorbowana nie reagowała

z lizatem ECA-ujemnego szczepu, co sugerowało usunięcie przeciwciał anty-LPS z surowicy poliwalent-

nej. Wnioski: Otrzymane wyniki sugerują, że absorpcja żywymi bakteriami ECA-ujemnymi pozwoliła na

bardziej efektywne usunięcie przeciwciał anty-LPS z poliwalentnej surowicy przeciwko YeO3-c-trs8-R niż

absorpcja martwymi komórkami.

I-15 P | Aktywność β-glukuronidazy i β-glukozydazy Escherichia coli izolowanych z kału ludzi ze

zdiagnozowanymi chorobami jelita grubego oraz ludzi zdrowych

Mroczyńska M.1, Lubudzisz Z.1, Gałęcka M.2, Szachta P.2, Cichy W.3, Roszak D.3

1 Politechnika Łódzka, Instytut Technologii Fermentacji i Mikrobiologii, Łódź 2 Instytut Mikroekologii w Poznaniu, Poznań 3 Klinika Gastroenterologii Dziecięcej i Chorób Metabolicznych Uniwersytetu Medycznego w Poznaniu

e-mail: mmroczynska@interia.pl

Wstęp: Nieswoiste zapalenia jelit (IBD, ang.: inflammatory bowel diseases) to choroby, których etiologia

nie została ostatecznie wyjaśniona. Najczęściej występują w postaci choroby Leśniowskiego - Crohna

(ang.: Crohn Diseases) oraz wrzodziejącego zapalenia jelita grubego (łac.: colitis ulcerosa). Prawdopo-

dobnie istotną rolę w patogenezie choroby odgrywa czynnik mikrobiologiczny, który w połączeniu

z defektem układu immunologicznego i podatnością genetyczną pacjenta przyczynia się do rozwoju

i podtrzymania stanu zapalnego. Nieswoiste choroby zapalne jelit predysponują do rozwoju nowotworów

przewodu pokarmowego. Obecnie około 25 – 40% przypadków IBD diagnozuje się u osób poniżej 20

roku życia i liczba ta ciągle rośnie. U zdrowego człowieka układ jakościowy i ilościowy mikroflory jelitowej

zawiera dominującą przewagę mikroorganizmów korzystnych dla zdrowia. Jednak nadmierna aktywność

enzymów bakterii dominujących w jelicie grubym może doprowadzić do generowania wielu produktów

genotoksycznych, mutagennych i karcynogennych. Cel: Celem badań było określenie aktywności

β-glukuronidazy i β-glukozydazy bakterii Escherichia coli wyizolowanych z kału ludzi ze zdiagnozowany-

mi nieswoistymi chorobami zapalnymi jelit, w wieku od 3 do 57 lat oraz zdrowych osób, w wieku od

jednego roku do 30 lat. Metody: Analizie poddano 9 izolatów Escherichia coli pochodzących od osób

chorych oraz 30 szczepów wyizolowanych od zdrowych osób. Aktywność enzymów oznaczono spektro-

fotometrycznie, stosując właściwe substraty do oznaczanych enzymów. Za jednostkę aktywność przyjęto

taką ilość fenoloftaleiny (dla -glukuronidazy) oraz p-nitrofenolu (-glukozydazy) wyrażoną w mM, która

została uwolniona podczas reakcji w czasie 1 godz. w przeliczeniu na mg białka. Wyniki: Badania

dowiodły, że aktywność β-glukuronidazy szczepów Escherichia coli pochodzących od młodych osób

chorych (do 15 roku życia) mieściła się w przedziale 0,047-6,587 mM/h/mg białka, natomiast od zdro-

wych osób (do 30 roku życia), 0,053-2,589 mM/h/mg białka. Aktywność β-glukozydazy szczepów Esche-

richia coli wyizolowanych od osób ze zdiagnozowanymi chorobami jelita grubego mieściła się w przedzia-

le 0,001-0,01mM/h/mg białka natomiast aktywność izolatów pochodzących od zdrowych osób

0-0,012mM/h/mg białka. Stwierdzono, że aktywność β-glukozydazy szczepów E.coli wyizolowanych od

ludzi młodych z chorobami jelita grubego była dwukrotnie wyższa od aktywności izolatów uzyskanych od

22

osób zdrowych. Wnioski: Stwierdzono, że aktywność β-glukozydazy szczepów E.coli wyizolowanych od

ludzi młodych z chorobami jelita grubego była dwukrotnie wyższa od aktywności izolatów uzyskanych od

osób zdrowych. Aktywność β-glukuronidazy izolatów pochodzących od ludzi chorych była o 28% wyższa

od aktywności izolatów pochodzących od zdrowych osób.

I-16 P | Ocena obecności genów warunkujących produkcję enterotoksyny niehemolitycznej NHE

u emetycznych szczepów z grupy Bacillus cereus

Seifert K., Bednarczyk-Drąg A., Daczkowska-Kozon E.G., Dąbrowski W.

Katedra Mikrobiologii i Biotechnologii Stosowanej, Wydział Nauk o Żywności i Rybactwa,

Zachodniopomorski Uniwersytet Technologiczny w Szczecinie

e-mail: agnieszka.bednarczyk@zut.edu.pl; seifert.katarzyna@gmail.com

Wstęp: Grupa Bacillus cereus obejmuje sześć gatunków. Są one szeroko rozprzestrzenione w środowi-

sku, w tym w żywności. Jedną z głównych przyczyn wywołujących zatrucia pokarmowe typu biegunko-

wego na tle B.cereus są enterotoksyny, w tym enterotoksyna niehemolityczna NHE. Budują ją 3 jednost-

ki, a mianowicie NheA, NheB, NheC. Są one kodowane przez geny (odpowiednio) nheA, nheB oraz

nheC. Do wywołania reakcji chorobowej konieczne jest wystąpienie 3 jednostek toksyny jednocześnie.

Dotychczas sądzono, iż ten typ zatruć mogą wywoływać jedynie szczepy enterotoksyczne. Cel: Za cel

pracy postawiono sobie ocenę potencjału emetycznych szczepów B. cereus wyizolowanych z produktów

żywnościowych do produkcji enterotoksyny hehemolitycznej (NHE), tj. oceny występowania genów

kodujących trzy komponenty tej toksyny (nheA, nheB oraz nheC) u grupy wymiotnych bakterii B.cereus.

Metody: Materiał badawczy wyizolowany został z produktów żywnościowych (artykułów zbożowych).

Ekstrakcję bakteryjnego przeprowadzono DNA metodą kolumienkową. Badane szczepy wcześniej

zaklasyfikowano do grupy B.cereus oraz określono ich zdolność do produkcji toksyny emetycznej.

Obecność trzech fragmentów genów oznaczano techniką jakościowej Real-Time PCR. Wyniki weryfiko-

wano analizując profile topnienia amplikonów oraz przy pomocy elektroforezy w żelu agarozowym,

porównując rezultaty z tymi uzyskanymi dla szczepów referencyjnych.Wyniki: Na podstawie przeprowa-

dzonych analiz Real-Time PCR stwierdzono, że 100% badanych szczepów było nośnikami fragmentu

genu nheA oraz nheB, natomiast 87% szczepów posiadało także gen nheC. Należy uznać, iż 87%

przebadanych szczepów wymiotnych miało potencjał wywoływania także zatrucia typu biegunkowego.

Wnioski: Badania wykazały, iż emetyczne szczepy mogą być nośnikami genów kodujących enterotoksy-

nę niehemolityczną NHE. We wszystkich próbach oznaczono jednocześnie obecność fragmentów nheA

oraz nheB, a dodatkowo nheC wystąpił aż w 87% prób. Na podstawie przebadanego materiału stwier-

dzono łączne występowanie u emetycznych B. cereus genów nheA i nheB, przy obecności lub braku

genu nheC. Stwierdzono zatem, że emetyczne B.cereus posiadają wyższy potencjał chorobotwórczy niż

dotychczas sądzono.

____________________

Badania były finansowane z projektu badawczego MNiSW N N312 234538.

I-17 P | Ocena stanu zdrowia pacjentów z podejrzeniem alergii pokarmowej w kontekście składu

mikroflory jelitowej.

Wróblewska B.1.; Ogrodowczyk A.1, Kaliszewska A.1.; Wasilewska E.1., Zakrzewska M.2

1 Instytut Rozrodu Zwierząt i Badań Żywności, Polska Akademia Nauk , Olsztyn 2 Niepubliczny Zakład Opieki Zdrowotnej Poradnia Alergologiczna Allergica w Olsztynie

e-mail: a.ogrodowczyk@pan.olsztyn.pl

Wstęp: Badania potwierdzają, że zaburzenia składu mikroflory jelitowej odgrywają kluczową rolę w etio-

patogenezie chorób alergicznych. Śluzówka przewodu pokarmowego pozostaje w stałym kontakcie

23

z pożywieniem. Fizjologia układ pokarmowego zapewnia równowagę pomiędzy immunologiczną funkcją

obronną błony śluzowej, a tolerancją ogólnoustrojową. W przebiegu alergii pokarmowej równowaga ta

jest zachwiana. Nie rozwija się wystarczająca tolerancja organizmu na przenikające z pożywieniem do

organizmu alergeny. Potwierdzono, że obecność w diecie bakterii probiotycznych np. Lactobacillus casei

sps. Rhamnosus stymuluje produkcję TGF-beta, hamującego reakcję alergiczną zależną od limfocytów

Th2. Cel: W pracy wykonano analizę porównawczą składu mikroflory jelitowej u osób ze zdiagnozowaną

alergią pokarmową oraz u osób zdrowych w celu oceny obecności w mikrobiocie gatunków bakterii

decydujących o pojawieniu się stanu nadwrażliwości. Metody: Oszacowano częstość występowania

reakcji IgE-zależnych wśród pacjentów zgłaszających się do lekarzy alergologów z podejrzeniem polia-

lergii. Wstępna diagnostyka obejmowała szczegółową ankietę oraz test screeningowy Euroimmun,

pozwalający na prześledzenie obecności przeciwciał IgE skierowanych do 20-27 alergenów podczas

jednej analizy. Wykorzystano również współczesne techniki immunofluorescencyjne, dające możliwość

precyzyjnego pomiaru nawet bardzo nieznacznie podwyższonego poziomu przeciwciał specyficznych

w klasie E (IgE) z wykorzystaniem aparatu ImmunoCAP 100. Na badania uzyskano zgodę Komisji

Bioetycznej UWM w Olsztynie. Następnie wykorzystano standardowe metody posiewowe na podłożach

w celu prześledzenia różnic w składzie mikroflory jelitowej badanych populacji. Wyniki: Badania wykaza-

ły, że u wielu pacjentów z objawami wskazującymi na alergię pokarmową, nie stwierdzono podwyższo-

nego miana ogólnej IgE. Problemy zdrowotne mogły być wynikiem podwyższonej specyficznej IgE dla

alergnów wziewnych (trawy mix-gx, brzozy-t3, Dermatophagoides pter-d1 i kota e1). W nielicznych

przypadkach stwierdzono podwyższone IgE (do 3,5 kU/I) na soję –f14, orzechy ziemne-f13 i orzechy

laskowe-f17. Badana mikroflora w zakresie Lactobacilus, Bifidobacterium, enterokoki, enterobakterie oraz

drożdże nie wykazała istotnego zróżnicowania. Wnioski: Diagnoza pacjentów w kierunku obecności

ogólnej i specyficznej IgE wykazała, że w wielu przypadkach alergia jest stwierdzana na podstawie

wywiadu z pacjentem, co nie zawsze jest potwierdzane analitycznie. Wskazuje to na nadinterpretowal-

ność stanu pacjentów w kierunku alergii. Można przypuszczać, że istnieje korelacja pomiędzy składem

mikroflory jelit, a częstością pojawiania się stanu nadwrażliwości np. na alergeny obecne w żywności,

aczkolwiek niezbędne są badania na większej grupie pacjentów.

____________________

Autor otrzymał stypendium współfinansowane przez Unię Europejską w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego.

I-18 P | Analiza płynu stawowego oraz surowicy krwi żylnej w aspekcie procesów zapalnych

prowadzących do destabilizacji endoprotezy stawu biodrowego

Strzelec-Nowak D., Kozioł-Montewka M., Niedźwiadek J., Bogut A., Sikora A.

Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej Uniwersytetu Medycznego w Lublinie

email: dagmara.strzelec@gmail.com

Wstęp: Mimo rozwoju technik operacyjnych oraz różnorodności biomateriałów obluzowanie implantu

stawu biodrowego to nadal główny problem chirurgii ortopedycznej uniemożliwiający prawidłowe funkcjo-

nowanie wszczepu. W ostatnich latach coraz więcej uwagi poświęca się na poszukiwaniu markerów

pozwalających na szybkie wykrycie oraz zróżnicowanie typu obluzowania. Cel: Celem pracy była mikro-

biologiczna oraz immunologiczna ocena płynu stawowego oraz surowicy krwi żylnej u 30 pacjentek

poddanych rewizji z powodu klinicznie stwierdzonego aseptycznego obluzowania implantu stawu biodro-

wego. Metodyka: Metody badawcze płynu stawowego obejmowały mikroskopową ocenę zawartości

leukocytów oraz procentowego udziału wśród nich granulocytów obojętnochłonnych zestawioną tradycyj-

24

ną hodowlą bakteriologiczną płynu na podłożach mikrobiologicznych oraz analizą immunoenzymatyczną

zawartości osteoprotegeryny (OPG). Analiza surowicy krwi obejmowała oznaczenie podstawowych

parametrów jak OB, CRP, prokalcytonina, WBC, RBC, białko całkowite a także stężenia OPG. Wyniki:

Podwyższoną ilość leukocytów, w tym granulocytów obojętnochłonnych w płynie stawowym, przewyższa-

jącą punkt odcięcia charakterystyczny dla obluzowania septycznego (1,75x109 kom/l oraz >65% neutrofi-

li) zaobserwowano u 7 pacjentek zakwalifikowanych do operacji jako obluzowanie aseptyczne. Obluzo-

wanie septyczne u tych pacjentek potwierdzono dodatnią hodowlą bakteriologiczną. Zaobserwowano

również podwyższoną wartość OPG oraz OB u pacjentek septycznych w porównaniu do grupy w której

wynik hodowli był ujemny. Badanie stężenia osteoprotegeryny w surowicy i płynie stawowym wykazała

istotną wartość diagnostyczno-prognostyczną stężeń w płynie stawowym. Wnioski: Płyn stawowy jest

dobrym materiałem do oceny procesów zapalnych toczących się w obrębie implantu w zakresie liczby

leukocytów i stężenia OPG. Pełne różnicowanie obluzowania septycznego od aseptycznego endoprotezy

wymaga kompleksowej analizy materiałów poprzez identyfikację bakteriologiczną, immunologiczną

i molekularną.

I-19 P | Wykorzystanie metod fenotypowych i genotypowych do wykrywania metalo-beta-laktamaz

u szczepów Acinetobacter baumannii opornych na karbapenemy

Szejbach A., Mikucka A.

Katedra i Zakład Mikrobiologii Collegium Medicum im. Ludwika Rydygiera w Bydgoszczy,

Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu

e-mail: aleksandraszejbach@wp.pl

Wstęp: Pałeczki Acinetobacter baumannii są ważnym czynnikiem etiologicznym zakażeń szpitalnych.

W ostatnich latach obserwuje się wzrost liczby szczepów A. baumannii opornych na karbapenemy.

Oporność na karbapenemy może wynikać m.in. z wytwarzania metalo-beta-laktamaz (MBL) hydrolizują-

cych prawie wszystkie antybiotyki beta-laktamowe. Szczepy A. baumannii wytwarzające MBL stanowią

poważny problem terapeutyczny ze względu na trudności w leczeniu spowodowane opornością na wiele

grup antybiotyków. Cel: W niniejszej pracy dokonano oceny wartości MIC karbapenemów, oceny podo-

bieństwa genetycznego badanych szczepów za pomocą metody PCR-RAPD oraz oceny wytwarzania

MBL z wykorzystaniem różnych metod fenotypowych i techniki PCR. Materiały i metody: Badaniem

objęto 78 szczepów A. baumannii opornych na co najmniej jeden z karbapenemów. Do oceny wrażliwo-

ści na karbapenemy zastosowano metodę Etestu (bioMérieux). Do oceny wytwarzania MBL za pomocą

metod fenotypowych użyto krążki z imipenemem (10 µg), meropenemem (10 µg) i ceftazydymem (30

µg), inhibitory MBL - EDTA i kwas 2-merkaptopropionowy (2-MPA) oraz Etest MBL. Do wykrywania MBL

zastosowano także metodę dupleks-PCR. Wyniki: Wśród badanych szczepów 89,7% było opornych na

imipenem, 94,9% na meropenem i 88,5% na doripenem. Przeprowadzona analiza PCR-RAPD wykazała

istnienie 18 wzorów PCR-RAPD, w tym 5 wzorów odmiennych oraz 13 wzorów do których przyporząd-

kowano dwa lub więcej szczepów. Z grupy 18 szczepów rożniących się wzorami PCR-RAPD 66,7%

szczepów było MBL(+) w metodzie z użyciem ceftazydymu, imipenemu oraz meropenemu z EDTA.

W analogicznej metodzie z 2-MPA 88,9% szczepów wykazywało fenotyp MBL(+). W metodzie porówna-

nia średnic stref zahamowania wzrostu dla 94,4% szczepów stwierdzono fenotyp MBL(+). W metodzie

Etest MBL stwierdzono 88,9% szczepów MBL(+). Spośród szczepów MBL(+) w metodach fenotypowego

wykrywania MBL u ośmiu szczepów potwierdzono wytwarzanie genów kodujących MBL. U tych 8 szcze-

pów stwierdzono obecność genu blaIMP-1. Wnioski: Wykazanie metodą dupleks-PCR obecności genu

blaIMP-1 u ośmiu szczepów potwierdza, że jest to jeden z głównych mechanizmów oporności na karba-

penemy wśród badanych szczepów A. baumannii.

25

I-20 P | Cząsteczka CD14 jako potencjalny biomarker w diagnostyce gruźlicy

Włodarczyk M.1, Druszczyńska M.1, Drobińska-Janiszewska B.2, Zawadzka J.2, Kielnierowski G.2, Rudnicka W.1

1 Katedra Immunologii i Biologii Infekcyjnej, Uniwersytet Łódzki, 2 Specjalistyczny Szpital Gruźlicy, Chorób Płuc i Rehabilitacji w Tuszynie

e-mail: martini.w@wp.pl

Wstęp: Gruźlica pozostaje wciąż olbrzymim problemem nie tylko w krajach afrykańskich, lecz również w rozwijających się państwach. Według doniesień WHO 1/3 populacji świata jest zakażona prątkami Mycobacterium tuberculosis. Rocznie odnotowuje się ok. 2 mln zgonów oraz 9,5 mln nowych przypadków gruźlicy. Diagnostyka tej choroby opiera się na zdjęciu RTG klatki piersiowej, bakterioskopii, posiewie, tuberkulinowym teście skórnym oraz zaaprobowanych przez WHO testach interferonowych: Quan-ti®FERON-TB Gold (Cellestis) oraz TB.SPOT (Oxford Immunotec). Ten szeroki wachlarz narzędzi w diagnostyce gruźlicy bywa niekiedy zawodny. Wychodząc naprzeciw światowym zapotrzebowaniom w projekcie podjęto próbę znalezienia immunologicznych parametrów, które mogłyby być pomocne w diagnozowaniu gruźlicy. Jako pierwsza linia obrony nieswoistej (wrodzonej) monocyty/makrofagi odbywają kluczową rolę w zakażeniu drobnoustrojami, w tym prątkami gruźlicy. Za pomocą receptorów PRR (pattern recognition receptors) rozpoznają one konserwatywne struktury drobnoustrojów zwane PAMP (pathogen associated molecular patterns). Do receptorów tych należy między innymi cząsteczka CD14. Występuje ona w dwóch formach – rozpuszczalnej (sCD14) w surowicy oraz związanej z błoną komórkową (mCD14) fagocytów. Receptor ten uczestniczy w rozpoznawaniu wielu ligandów, w tym lipoarabinomannanu (LAM) M. tuberculosis. Cel pracy: W projekcie oceniono wykorzystanie receptora CD14 jako markera infekcji prątkami gruźlicy. W tym celu przebadano 165 ochotników szczepionych BCG: 35 pacjentów z gruźlicą potwierdzoną klasycznymi metodami diagnostycznymi, 40 pacjentów z innymi niż gruźlica chorobami płuc (zapalenia płuc, nowotwory, POCHP), 50 zdrowych osób pozostają-cych w kontakcie z chorymi na gruźlicę (personel medyczny, rodziny chorych) oraz 40 osób zdrowych, nie mających kontaktu z chorymi na gruźlicę. Metody: Na monocytach krwi obwodowej analizowano metodą cytometrii przepływowej ekspresję receptora mCD14. Rozpuszczalny wariant tej molekuły (sCD14) oznaczono metodą immunoenzymatyczną ELISA (R&D System). Polimorfizm genu cząsteczki CD14 oceniono techniką PCR. Wyniki: Zaobserwowano znamienny wzrost ekspresji mCD14 (p < 0,003) oraz podwyższone stężenie sCD14 w surowicy (p < 0,001) pacjentów z aktywną gruźlicą (potwierdzoną mikrobiologicznie) w porównaniu do osób z pozostałych grup badanych. Nie wykazano korelacji pomię-dzy polimorfizmem genu CD14 a ekspresją mCD14 czy poziomem sCD14.Wnioski: Wzmożona ekspre-sja receptora mCD14 oraz podwyższony poziom surowiczego sCD14 mogą sugerować aktywną postać gruźlicy. ____________________

Projekt pt. „Doktoranci – Regionalna Inwestycja w Młodych naukowców – Akronim D-RIM” jest współfinansowany przez Unię Europejską ze środków Europejskiego Funduszu Społecznego w ramach Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki, Priorytet VIII, Poddziałanie 8.2.1.

Praca finansowana ze środków pochodzących z grantu Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego o nr N402 098 539.

I-21 P/O | Ocena adhezji mikroorganizmów do nici chirurgicznych, wykonanych z różnych

materiałów

Własak A., Fijałkowski K., Nawrotek P.

Studenckie Koło Naukowe Mikrobiologów, Katedra Immunologii, Mikrobiologii i Chemii Fizjologicznej,

Zachodniopomorski Uniwersytet Technologiczny w Szczecinie,Szczecin

e-mail: mikrobiolodzy@zut.edu.pl

Wstęp: Jedną z częstych przyczyn powikłań pooperacyjnych jest zapalenie miejsca cięcia chirurgiczne-

go, spowodowane infekcją bakteryjną lub grzybiczą. Powikłania te przedłużają czas i koszty leczenia

26

pacjenta, a niekiedy powodują nawet jego śmierć. Istotną rolę odgrywa tu adhezja chorobotwórczych

mikroorganizmów, która zależy od właściwości fizycznych i chemicznych nici. Coraz częściej na rynku

medycznym pojawiają się nici chirurgiczne o właściwościach antybakteryjnych z dodatkiem antybiotyków

lub innych środków, których celem jest zminimalizowanie infekcji. Cel pracy: Celem niniejszej pracy było

określenie stopnia adhezji mikroorganizmów chorobotwórczych do powierzchni naturalnych i sztucznych

nici chirurgicznych. Materiał i metody: W badaniu wykorzystano pięć mikroorganizmów testowych:

Acinetobacter baumannii, Staphylococcus aureus, Streptococcus mutans, Pseudomonas aeruginosa

oraz Candida albicans. Adhezje badano na różnych typach nici chirurgicznych w rozmiarze 3-0, wykona-

nych z różnych materiałów (kolagen, nylon, polipropylen, poliglaktyna 910, poliester, polidioxanon, kwas

poliglikolowy, jedwab, politereftalan etylowy oraz nici pokrytej powłoką antybakteryjną). Stopień adhezji

mikroorganizmów ustalono, za pomocą testów redukcji MTT, AlamarBlue, barwienia safraniną a także

przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego, (barwienie oranżem akrydyny oraz fluoresceiną). Wyniki:

Zaobserwowano znaczące różnice powinowactwa mikroorganizmów do badanych nici chirurgicznych,

w zależności od rodzaju materiału z jakiego były one wykonane. Badania wykazały, że różny stopień

adhezji mikroorganizmów zależy od parametrów chemicznych i fizycznych nici chirurgicznych oraz

rodzaju mikroorganizmów zastosowanych w teście. Ponadto stwierdzono, iż liczba komórek mikroorgani-

zmów ulegających adhezji, jest zależna od czasu i warunków inkubacji. Wnioski: Na podstawie uzyska-

nych wyników można stwierdzić, że rodzaj materiału z którego wykonana jest nić chirurgiczna w zasadni-

czy sposób wpływa na stopień rozwoju flory mikrobiologicznej na jej powierzchni, co może mieć ścisły

związek z liczbą powikłań pooperacyjnych.

I-22 P | Analiza i ocena metod badania adhezji bakterii do powierzchni metalowych o różnym

składzie pierwiastkowym

Żywicka A., Fijałkowski K., Nawrotek P.

Studenckie Koło Naukowe Mikrobiologów, Katedra Immunologii, Mikrobiologii i Chemii Fizjologicznej,

Zachodniopomorski Uniwersytet Technologiczny w Szczecinie, Szczecin

e-mail: mikrobiolodzy@zut.edu.pl

Wstęp: Wiele drobnoustrojów posiada zdolność do adhezji do powierzchni metalowych. We współczesnej

inżynierii coraz częściej poszukuje się stopów metali, które wykazują właściwości antyadhezyjne wobec

mikroorganizmów. Jednakże, badania adhezji na powierzchniach metalowych, ze względu na ich właści-

wości fizykochemiczne są często utrudnione. Cel pracy: Celem pracy była analiza i ocena metod bada-

nia stopnia adhezji bakterii do metalowych powierzchni o różnym składzie pierwiastkowym. Materiał

i metody: Materiał do badań stanowiło 12 płytek metalowych o różnym składzie pierwiastkowym. Adhe-

zja oceniana była po inkubacji bakterii (Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, i Acinetobac-

ter baumannii) z badanymi próbami metali. Do oceny stopnia adhezji wykorzystano następujące metody:

test redukcji MTT, test AlamarBlue (test bezpośredni i pośredni), barwienie safraniną oraz posiewy

powierzchniowe po inkubacji prób badanych w roztworze saponiny. Ponadto, ocenę liczebności bakterii

na powierzchni prób dokonano przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego. Wyniki: Badania wykazały, że

pierwiastki wchodzące w skład powierzchni metalowych mogą reagować ze składnikami testów Alamar-

Blue i MTT dając reakcję podobną bądź taką samą jak żywe komórki bakterii. Największą reaktywnością

charakteryzowały się próby, w których skład wchodził cynk. Dodatkowo próby w skład, których wchodził

ten pierwiastek cechowały się wysoką reaktywnością z kwasem octowym wykorzystywanym w teście

barwienia safraniną. Testy MTT i AlamarBlue dawały pozytywne rezultaty tylko w przypadku wykonywa-

nia testu pośredniego. Na uzyskiwane wyniki, oprócz składu, wpływ miała również struktura próby – przy

zastosowaniu mikroskopu fluorescencyjnego nie było możliwe oznaczenie stopnia adhezji w próbach

o zróżnicowanej powierzchni. Wnioski: Na podstawie badań można stwierdzić, że przy doborze metody

badania adhezji do powierzchni metalowych należy kierować się ich składem, strukturą, zabarwieniem,

27

stopniem utlenialności, wrażliwością na zmiany pH, a także reaktywnością z poszczególnymi składnikami

wykorzystywanych w badaniach testów.

28

29

Sesja II

Zakażenia bakteryjne, czynniki patogenności drobnoustrojów, nowe metody leczenia zakażeń

30

31

Wykład plenarny

Patogeneza zakażeń z udziałem biofilmów – możliwości interwencji

Sadowska B., Różalska B.

Katedra Immunologii i Biologii Infekcyjnej, Uniwersytet Łódzki, Łódź, Polska

e-mail: bsad@biol.uni.lodz.pl

Biofilmy drobnoustrojów – przestrzenne struktury utworzone z mikrokolonii zanurzonych w zewnątrz-

komórkowej substancji polimerowej (EPS, ang. extracellular polymer), stanowią jedną z dwóch podsta-

wowych form bytowania mikroorganizmów. Powszechnie występują zarówno w środowisku naturalnym,

jak i w różnych miejscach anatomicznych organizmów wyższych (np. jama ustna, jelita, górne drogi

oddechowe, dolne odcinki układu moczowo-płciowego). Wiadomo, iż populacja biofilmu jako całość

cechuje się wielokrotnie większą opornością na działanie czynników środowiskowych, włączając w to

humoralne i komórkowe mechanizmy układu odpornościowego gospodarza czy terapeutyki stosowane

w leczeniu zakażeń. Wynika to zarówno ze złożonej struktury biofilmu, odmiennej niż w hodowlach

planktonowych ekspresji genów (w tym genów oporności czy genów warunkujących działanie systemów

naprawczych), jak i z heterogenności (głównie metabolicznej) grup drobnoustrojów wchodzących w skład

biofilmu. W obrębie jednej populacji biofilmowej zwykle można wyróżnić komórki aktywne metabolicznie

(szybko rozwijające się), komórki o zahamowanym metabolizmie (wolno rozwijające się) oraz komórki

wykazujące tolerancję w stosunku do wyższych stężeń chemioterapeutyków – określane mianem „persi-

sters”. Tym samym tworzenie biofilmów przez patogeny wydaje się być zjawiskiem niezwykle dla nich

korzystnym i powinno być postrzegane jako najbardziej wyspecjalizowana obronna strategia ich przeży-

cia w stresogennych warunkach in vivo.

Początkowo osiadłe populacje drobnoustrojów wiązano tylko z zakażeniami towarzyszącymi stosowa-

niu inwazyjnych technik medycznych z zastosowaniem biomateriałów (cewników, drenów, implantów itp.)

– tzw. BAI (ang. biomaterial-associated infections). Obecnie podłoża biofilmowego upatruje się we

wszelkiego typu trudnych do eradykacji infekcjach o charakterze przewlekłym, nawracającym, jak:

infekcje dolnych dróg oddechowych u osób chorych na mukowiscydozę, przewlekłe zakażenia ran (np.

pooperacyjnych, oparzeniowych, będących następstwem zmian metabolicznych u diabetyków – tzw.

„stopa cukrzycowa”), infekcje otolaryngologiczne, zakażenia układu moczowo-płciowego. Uważa się

również, że tworzenie in vivo biofilmów „patologicznych” może, zwłaszcza na etapie dyspersji (uwalniania

z biofilmu pojedynczych komórek lub ich grup), sprzyjać uogólnieniu się infekcji i rozwojowi sepsy

u zakażonego osobnika.

Specyfika infekcji o podłożu biofilmowym wymusza poszukiwanie nowych strategii leczenia tego typu

zakażeń. Skutecznie udało się zmniejszyć ryzyko wystąpienia BAI przez wprowadzenie nowych technik

zakładania biomateriałów oraz stosowanie rygorystycznych procedur profilaktyki i opieki nad miejscem

ich założenia (ograniczenie dostępu potencjalnie patogennych mikrobiontów lub patogenów pochodzą-

cych ze środowiska zewnętrznego). Ważny jest również postęp w metodach modyfikacji samych materia-

łów, z których produkowane są przyrządy medyczne, tak aby były mniej podatne na zasiedlanie (zmiana

cech fizykochemicznych powierzchni biomateriału, np. zmiana ładunku powierzchniowego, hydrofobowo-

ści, opłaszczanie lub włączanie w strukturę czynników antyadhezyjnych, biostatycznych/biobójczych).

Biorąc pod uwagę podwyższoną oporność biofilmów próbuje się również stosować leczenie „pulsacyjne”

zakażeń z ich udziałem (kilka następujących po sobie serii podawania chemioterapeutyków). Jednakże

podstawowym wydaje się zrozumienie mechanizmów powstawania tego typu powikłań, ponieważ tylko

wciąż pogłębiana wiedza na temat fizjologii tworzenia biofilmu i jego małej podatności na eradykację

pozwoli na ustalenie efektywnego sposobu terapii.

32

Nadesłane streszczenia

II-1 P | Escherichia coli – przyjaciela nie należy się bać

Adamczyk M., Gorzkiewicz M.

Studenckie Koło Naukowe Biotechnologów "Ferment"

Wydział Biotechnologii i Nauk o Żywności, Politechnika Łódzka, Łódź

e-mail: adamczyk_marianna@o2.pl, gorzkiewicz.michal@gmail.com

Wstęp: Pałeczka okrężnicy (łac. Escherichia coli) to gram-ujemna bakteria należąca do rodziny Entero-

bacteriaceae. Wchodzi w skład fizjologicznej flory bakteryjnej jelita grubego człowieka oraz zwierząt

stałocieplnych. Uczestniczy w rozkładzie pokarmu i w produkcji witamin z grupy B i K. Pałeczka okrężnicy

w określonych warunkach wykazuje chorobotwórczość dla człowieka, wywołując głównie schorzenia

układu pokarmowego i moczowego. Bakteria ta zawładnęła niedawno mediami w całej Europie. Zdomi-

nowała programy informacyjne, wpłynęła ujemnie na sprzedaż warzyw. Czy naprawdę jest się czego

bać? Cel: Plakat jest odpowiedzią na ostatnie doniesienia mediów dotyczące licznych zachorowań

i zgonów wywołanych spożyciem warzyw skażonych zmutowanym szczepem E.coli. Jego głównym

celem jest wnikliwa charakterystyka bakterii oraz przedstawienie sposobów profilaktyki i leczenia chorób

przez nią wywoływanych. Charakterystyka: Escherichia coli jest względnie tlenową pałeczką o długości

około 2 μm i średnicy około 0,8 μm. Wewnątrz komórki tej bakterii znajduje się 1-4 identycznych łańcu-

chów DNA (w zależności od aktywności podziałowej) oraz do 30.000 rybosomów. Ważne klinicznie geny

oporności zlokalizowane są na plazmidach, co sprzyja ich poziomemu przekazywaniu. Podział komórek

w sprzyjających warunkach trwa około 20 minut. Pałeczka okrężnicy ginie po 20 minutach ogrzewania

w temperaturze 60°C, jest wrażliwa na dezynfektanty. Wykorzystanie i znaczenie: E. coli należy do

organizmów modelowych. Jej budowa i metabolizm są bardzo dobrze poznane, dzięki czemu pałeczka

okrężnicy jest powszechnie wykorzystywana w badaniach genetycznych. Dzięki E. coli zrozumiano takie

procesy replikacja DNA czy regulacja transkrypcji. Bakteria ta znalazła również zastosowanie w modyfi-

kacjach genetycznych do celów przemysłowych, na przykład do produkcji ludzkiego hormonu – insuliny.

Chorobotwórczość: Bakterie E. coli, nieszkodliwe w jelicie, mogą powodować liczne schorzenia, takie

jak: zakażenia dróg moczowych, zapalenia opon mózgowych u noworodków, zatrucia pokarmowe,

zapalenia płuc czy sepsa. Profilaktyka: Pomimo licznych chorób wywoływanych przez E.coli i często

ciężkiego ich przebiegu, można stosunkowo łatwo się przed nimi obronić. Profilaktyka opiera się głównie

na utrzymywaniu czystości (np. mycie rąk), oddzielaniu ugotowanej żywności od surowej, utrzymywaniu

żywności w odpowiedniej temperaturze i korzystaniu z bezpiecznej wody.

II-2 P | Zjawisko apoptozy granulocytów i limfocytów krwi obwodowej królików zakażonych

wirusem RHD (Rabbit Haemorrhagic Disease)

Adamiak M., Kubiś M., Trzeciak-Ryczek A., Działo J., Tokarz-Deptuła B.

Katedra Mikrobiologii i Immunologii, Uniwersytet Szczeciński

email: kurp13@univ.szczecin.pl

Wstęp: Wirus RHD jest etiologicznym czynnikiem wysoce zakaźnej krwotocznej choroby królików VHD

(viral haemorrhagic disease), w Polsce zwanej pomorem królików. Wśród elementów patogennego

działania RHDV wymienia się między innymi jego zdolność do indukcji apoptozy komórek układu odpor-

nościowego gospodarza. Jak dotychczas badania dotyczące wirusa RHD, wykazały aktywność kaspaz

powodującą indukcję apoptozy granulocytów i limfocytów po zakażeniu królików niehemaglutynogennym

szczepem BS89, Vt97, Pv97, Triptis, Hagenow, Frankfurt, Hartmannsdorf, Rainham, 9905 i Asturias tego

wirusa. Cel pracy: Ocena zjawiska apoptozy granulocytów i limfocytów we krwi obwodowej królików

33

eksperymentalnie zakażonych węgierskimi szczepami (24V/89 i 1147V/94) RHDV. Metody: Detekcję

aktywności ogólnej puli kaspaz: 1,2,3,4,5,6,7,8 i 9 w granulocytach i limfocytach krwi królików wykonano

metodą cytometrii przepływowej z zastosowaniem zestawu odczynników FAM Caspase Activity Kit

w godzinach 0,8,12,24 i 36 po zakażeniu królików RHDV. Wyniki: W zakresie % apoptycznych granulo-

cytów, wartości dla szczepu 24V/89 wynosiły od 19,40 do 93,70, a ich dynamika wykazała wyraźną

tendencję wzrostową przez cały okres badania, istotny statystycznie wzrost zarejestrowano w 12 i 24h po

zakażeniu królików RHDV. Natomiast dla szczepu 1147V/94, wartość % apoptycznych granulocytów

oscylowała między 14,65 a 73,30 i manifestowała się tendencją wzrostową, a statystycznie istotny wzrost

występował w 8 i 12h badania. W zakresie % apoptycznych limfocytów wartości dla szczepu 24V/89

wahały się między 20,58 a 51,96 i wykazywały głównie tendencję wzrostową w godzinach od 8 do 24

w której zarejestrowano spadek wartości tych komórek, zaś dla szczepu 1147V/94 wynosiły one od 25,48

do 65,08, z wyraźną tendencją wzrostową od 12 do 24h badań. Podsumowanie: Zakażenie królików

dwoma szczepami węgierskimi wirusa RHD (24V/89 i 1147V/94) powoduje włączenie apoptozy tak

w granulocytach jak i w limfocytach, z tym że przy szczepie 24V/89 zjawisko to jest intensywniejsze

w granulocytach, a przy szczepie 1147V/94 w limfocytach. Obraz tych zmian wskazuje, że włączenie

i trwanie apoptozy w granulocytach i limfocytach jest związane z rodzajem szczepu wirusa RHD.

II-3 P | Rola cholesterolu w makrofagach ludzkich w pochłanianiu Mycobacterium tuberculosis

Blus E., Klink M., Brzostek A., Kiełbik M., Sułowska Z., Dziadek J.

Instytut Biologii Medycznej Polskiej Akademii Nauk

e-mail: eblus@cbm.pan.pl

Wstęp: Prątki gruźlicy, oprócz wiązania się ze specyficznymi receptorami makrofagów, mogą również

oddziaływać ze zlokalizowanym w błonie komórkowej cholesterolem. Uważa się zatem, że cholesterol

może odgrywać ważną rolę we wnikaniu mykobakterii do makrofagów oraz w procesie dojrzewania

fagosomu. Kluczowym enzymem bakteryjnym biorącym udział w metabolizmie cholesterolu jest oksyda-

za cholesterolowa (ChoD). Cel: Celem pracy była ocena czy usunięcie cholesterolu z makrofagów

osłabia zdolność fagocytów do pochłaniana Mycobacterium tuberculosis (Mtb) szczepu dzikiego H37Rv

(MtbH37Rv) i szczepu pozbawionego funkcjonalnego genu kodującego ChoD (Mtb∆ChoD). Oceniano

również, czy cholesterol bierze udział we wnikaniu prątków gruźlicy do makrofagów spoczynkowych

(początkowa faza infekcji) czy makrofagów aktywowanych interferonem-γ - INF-γ (chroniczna faza

infekcji). Metody: Komórki ludzkiej linii monocytarno-makrofagowej (THP1) różnicowano do makrofagów

stymulując je PMA, a następnie aktywowano lub nie IFN-γ. Z aktywowanych i nieaktywowanych makro-

fagów usuwano cholesterol przy użyciu β-cyklodekstryny. Szczep M. tuberculosis ∆ChoD, bez funkcjo-

nalnego genu kodującego ChoD, uzyskano metodą inaktywacji genu opartą na rekombinacji homologicz-

nej. Oceniano zdolność makrofagów pozbawionych cholesterolu do pochłaniania nieopsonizowanych

i opsonizowanych ludzką surowicą AB prątków: MtbH37Rv i Mtb∆ChoD. Wyniki: Usunięcie z makrofa-

gów 80% cholesterolu wymaga 4-godzinnej inkubacji fagocytów z β-cyklodekstryną. Wykazano, że

pozbawienie makrofagów cholesterolu nie wpływa na ich aktywność metaboliczną, co oceniono testem

redukcji MTT. Nie stwierdzono statystycznie znamiennych różnic w odsetku aktywowanych i nieaktywo-

wanych makrofagów pochłaniających MtbH37Rv i Mtb∆ChoD, odpowiednio, z i bez cholesterolu. Podob-

nie liczba pochłanianych prątków obu szczepów przez badane makrofagi była zbliżona. Wniosek:

Uzyskane wyniki nie potwierdziły doniesień literaturowych odnośnie istotnej roli cholesterolu w pochła-

nianiu M. tuberculosis.

____________________

Źródła finansowania: „Badania mechanizmów molekularnych na styku organizm ludzki – patogen – czynniki środowiska”

(InterMolMed), POIG.01.01.02-10-107/09.

34

II-4 P | Proteomiczna identyfikacja czynników wirulencji bakterii z rodzaju Staphylococcus

Bonar E., Władyka B., Dubin A.

Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii, Uniwersytet Jagielloński

e-mail: emilia.bonar@uj.edu.pl

Wstęp: Gronkowiec złocisty (Staphylococcus aureus) to groźny, oportunistyczny patogen, wykazujący

ogromne fenotypowe i genotypowe zróżnicowanie, szczególną wirulencję i gwałtownie rosnącą lekoopor-

ność stanowiącą poważne zagrożenie zakażeń i chorób jego gospodarzy - ludzi i zwierząt. Oddziaływa-

nie patogennych bakterii na organizm gospodarza, kolonizacja i chorobotwórczość zachodzi poprzez tzw.

specyficzne czynniki wirulencji zlokalizowane na powierzchni komórek bakteryjnych lub wydzielane poza

komórkę do środowiska. Jak dotąd podjęto niewiele prób identyfikacji czynników wirulencji i charaktery-

styki roli składowych proteomu i jego zmian w procesie kolonizacji i wirulencji. Cel pracy: Założonym

zadaniem jest poznanie zewnątrzkomórkowego proteomu wybranych szczepów S. aureus w celu

porównania ekspresji białek wydzielniczych szczepów bakterii scharakteryzowanych pod względem

genotypowym i fenotypowym, wirulentnych i komensalnych oraz identyfikacja białkowych, gronkowco-

wych potencjalnych czynników odpowiedzialnych za właściwości wirulentne szczepu. Metody: Techniką

elektroforezy dwuwymiarowej zobrazowano zewnątrzkomórkowy proteom wybranych szczepów

S. aureus i wykonano analizę porównawczą profili białek. W porównywane pary dobierano szczepy

o możliwie najbardziej podobnym i scharakteryzowanym genotypie, częściowo scharakteryzowane

fenotypowo, ale różniące się wirulencją w modelu doświadczalnym. Różnicujące białka w porównywa-

nych parach poddano analizie techniką spektrometrii mas. Wyniki: Otrzymane elektroforogramy wykaza-

ły zróżnicowanie wydzielniczego profilu białkowego badanych szczepów. Analiza jakościowych i ilościo-

wych różnic produkowanych białek pozwoliła zidentyfikować białka o udokumentowanej roli w wirulencji

gronkowców jak również wskazała nowych kandydatów mogących mieć udział w tym procesie. Wnioski:

Wirulentny lub niewirulentny fenotyp gronkowca odzwierciedla się w profilu proteomu zewnątrzkomórko-

wego. Wyniki prowadzonych badań mogą stanowić pierwszy krok na drodze poznania koniecznych

i wystarczających białkowych efektorów determinujących wirulencję szczepów S. aureus.

____________________

Badania częściowo finansowane z projektu: N N303 813340.

II-5 P/O | Rola oksydazy cholesterolowej Mycobacterium tuberculosis w infekcji ludzkich

makrofagów prątkami gruźlicy

Brzezińska M., Klink M., Brzostek A., Kiełbik M., Szulc I., Sułowska Z., Dziadek J.

Instytut Biologii Medycznej Polskiej Akademii Nauk

e-mail: mklink@cbm.pan.pl

Wstęp: Prątki gruźlicy (Mycobacterium tuberculosis) metabolizując cholesterol obecny w komórkach

gospodarza mogą wykorzystywać go jako źródło węgla i energii. Istnieją również przesłanki, iż choleste-

rol ułatwia zakażenie makrofagów przez prątki w infekcji pierwotnej. Kluczowym enzymem bakteryjnym

biorącym udział w metabolizmie cholesterolu jest oksydaza cholesterolowa (ChoD). Cel pracy: Celem

pracy była ocena czy szczep M. tuberculosis H37Rv ze zinaktywowanym genem kodującym ChoD różni

się w zdolności do infekcji makrofagów ludzkich w porównaniu do szczepu dzikiego H37Rv. Metody:

Szczep M. tuberculosis ∆ChoD, bez funkcjonalnego genu kodującego ChoD, uzyskano metodą inakty-

wacji genu opartą na rekombinacji homologicznej. Oceniano zdolność do fagocytozy i wewnątrzkomór-

kowego zabijania prątków H37Rv i mutanta ∆ChoD (nieopsonizowanych lub opsonizowanych ludzką

surowicą AB) przez nieaktywowane lub aktywowane interferonem-γ makrofagi ludzkiej linii THP1. Oce-

niano również produkcję tlenku azotu (NO), reaktywnych form tlenu (RFT) i czynnika martwicy nowotworu

(TNF-α) przez makrofagi zakażone badanymi prątkami gruźlicy. Wyniki: Nie zaobserwowano różnic

35

w liczbie pochłoniętych prątków gruźlicy mutanta ∆ChoD i szczepu dzikiego H37Rv przez aktywowane

i nieaktywowane makrofagi. Aktywność bójcza aktywowanych makrofagów w stosunku do szczepu

dzikiego i jego mutanta była podobna. Zaobserwowano natomiast, że nieopsonizowany mutant ∆ChoD

jest efektywniej zabijany przez makrofagi nieaktywowane w porównaniu do nieopsonizowanego szczepu

dzikiego. Aktywowane makrofagi produkują zbliżone ilości NO w odpowiedzi na zakażenie opsonizowa-

nym i nieopsonizowanym szczepem dzikim i mutantem ∆ChoD. Jedynie nieopsonizowany mutant

∆ChoD pobudza nieaktywowane makrofagi do produkcji NO. Wykazano, że szczepy H37Rv i ∆ChoD

podobnie hamują produkcję RFT w aktywowanych makrofagach. Nieopsonizowany mutant ∆ChoD

znamiennie słabiej hamuje produkcję RFT przez nieaktywowane makrofagi w porównaniu do nieopsoni-

zowanego szczepu dzikiego. Nie zaobserwowano różnic w zdolności aktywowanych makrofagów do

produkcji TNF-α w odpowiedzi na zakażenie obydwoma szczepami. Wnioski: Uzyskane wyniki sugerują,

że pozbawienie M. tuberculosis funkcjonalnego genu kodującego ChoD osłabia zdolność tej bakterii do

infekcji nieaktywowanych makrofagów.

____________________

Źródła finansowania: „Badania mechanizmów molekularnych na styku organizm ludzki – patogen – czynniki środowiska”

(InterMolMed), POIG.01.01.02-10-107/09.

II-6 P | Aktywność biologiczna nowosyntezowanych związków z grupy α-metylideno--laktonów

Budzyńska A.1, Więckowska-Szakiel M.1, Modranka J.2, Janecki T. 2, Różalski M. 3, Krajewska U. 3,

Różalska B. 1

1 Instytut Mikrobiologii, Biotechnologii i Immunologii, Uniwersytet Łódzki 2 Instytut Chemii Organicznej, Politechnika Łódzka 3 Zakład Biochemii Farmaceutycznej, Uniwersytet Medyczny w Łodzi

e-mail: albudzal@biol.uni.lodz.pl

Wstęp: Grupa α-metylideno--laktonów, do których należą badane preparaty, zawiera w strukturze

aktywny biologicznie fragment α,β-nienasyconego związku karbonylowego. Substancje o takiej budowie

występują naturalnie w roślinach jako ich metabolity wtórne o aktywności fitoaleksyn (są to np. seskwiter-

peny – wernolepina i wernomenina). Znane są liczne właściwości lecznicze tego typu związków: np.

przeciwnowotworowe, przeciwzapalne i przeciwdrobnoustrojowe. Są więc one ciekawym obiektem

badań, stanowiąc wzorzec do syntezy pochodnych o potencjalnym zastosowaniu terapeutycznym. Cel:

Ocena aktywności biologicznej dwu nowosyntezowanych związków z grupy α-metylideno--laktonów

(Modranka i wsp. 2011). Metody: Badane preparaty: 1-butylo-2-metylideno-1H-benzo[f]chromen-3(2H)-

on (1) i 4-butylo-7-metoksy-3-metylidenochroman-2-on (2); mikroorganizmy docelowe – S. aureus ATCC

6538, kliniczne szczepy S. aureus o fenotypie MRSA (D5, A7, A3), E. faecalis ATCC 29212, E. coli

NCTC 8196, P. aeruginosa NCTC 6749 oraz C. albicans ATCC 10231. Aktywność biostatyczną (MIC)

i biobójczą (MBC) związków badano metodą mikrorozcieńczeń w bulionie (wg rekomendacji CLSI).

Działanie cytotoksyczne związków wobec linii komórek nowotworowych - białaczek ludzkich HL-60

i NALM-6 oraz wobec prawidłowych komórek śródbłonka naczyń krwionośnych - HUVEC, badano testem

redukcji MTT i wyrażano jako współczynnik IC50. Wyniki: Wykazano wysoką aktywność obu związków

wobec bakterii Gram(+) - zakres MIC (1): 3,125-25,0 µg/ml (11,7-93,9 µM), (2): 50,0-200,0 µg/ml (203,0-

812 µM.). Bakterie Gram(-) i grzyby wykazywały oporność na ich działanie (MIC>400 µg/ml). Związek (1)

działał bakteriostatycznie i bakteriobójczo zarówno na gronkowce MSSA, jak i MRSA (MBC ≥ MIC -

2xMIC). Udokumentowano względnie wysoką aktywność cytotoksyczną związku (1) wobec linii komórek

białaczki HL-60 (IC50 wynosił 0,72±0,04 µM) i nieco niższą wobec pozostałych linii (NALM-6 - 2,10±0,03

µM i HUVEC - 3,83±0,27 µM). Wartości IC50 w przypadku (2) wynosiły: 5,39±1,0 µM (HL-60), 6,16±1,15

µM (NALM-6) i 5,10±0,52 µM (HUVEC). Wnioski: Na podstawie uzyskanych wyników można wniosko-

wać, iż te nowosyntezowane związki z grupy α-metylideno--laktonów są obiecujące terapeutycznie

36

z uwagi na wysoką aktywność cytotoksyczną wobec komórek nowotworowych i znaczącą skuteczność

przeciwbakteryjną. W kontekście działania przeciwdrobnoustrojowego ważny jest fakt ich działania

bójczego na wielolekooporne szczepy gronkowców MRSA. Mogą być więc rozważane jako potencjalne

produkty terapeutyczne, być może wspomagające działanie antybiotyków. Obecność bardziej rozbudo-

wanego fragmentu aromatycznego związku (1) i prawdopodobnie wyższa lipofilowość tłumaczyć może

jego większą aktywność biologiczną, zarówno w stosunku do mikroorganizmów, jak i do komórek euka-

riotycznych.

II-7 P | Skryning mikrobiologiczny olejków eterycznych i ich składników

Budzyńska A., Gibus D., Nowak M., Różalska B.

Instytut Mikrobiologii, Biotechnologii i Immunologii, Uniwersytet Łódzki

e-mail: albudzal@biol.uni.lodz.pl

Wstęp: Wzrastająca oporność bakterii i grzybów chorobotwórczych dla człowieka na obecnie stosowane

leki sprawia, iż coraz bardziej pilne jest poszukiwanie nowych opcji terapeutycznych. Jedną z nich może

być próba zastosowania olejków eterycznych - naturalnych związków obronnych wytwarzanych przez

rośliny aromatyczne. Ich przydatność w leczeniu przewlekłych zakażeń ran i owrzodzeń, może stać się

nieoceniona. Biorąc pod uwagę, iż terpeny olejków eterycznych wykazują szeroki zakres aktywności

biologicznej, to oprócz efektów przeciwdrobnoustrojowych, można oczekiwać też ich działania przeciw-

zapalnego i przeciwbólowego. Cel: Ocena aktywności 15 wybranych komercyjnych olejków eterycznych

i 10 składników wobec przedstawicieli 3 grup drobnoustrojów. Metody: Mikroorganizmy docelowe:

Staphylococcus aureus ATCC 6538, Escherichia coli NCTC 8196, Candida albicans ATCC 10231. Olejki

z: Lavandula angustifolia, Melaleuca alternifolia, Citrus limon, Cymbopogon citratus, Pimpinella anisum,

Pelargonium graveolens, Eugenia caryophyllata, Hyssopus officinalis, Pinus sylvestris, Melissa officinalis,

Mentha piperita, Anthemis nobilis, Thymus vulgaris, Ribes nigrum, Rosmarinus officinalis; składniki:

linalol, octan linalylu, alfa-terpineol, terpinen-4-ol, 1,8- cyneol, cytronelal, cytral, alfa-pinen, alfa/beta-tujon

oraz tymol. Wartość MIC/MBC ustalono zgodnie z rekomendacjami CLSI posługując się standardową

metodą mikrorozcieńczeń w bulionie, w modyfikacji własnej. Wyniki i Wnioski: Badania wykazały

skuteczność wszystkich olejków eterycznych oraz ich składników wobec zarówno bakterii, jak i grzybów

Candida, chociaż aktywność tych preparatów była zróżnicowana. Większość badanych olej-

ków/składników działała bójczo w stężeniu nie przekraczającym powszechnie przyjętego kryterium

wartości - nie większej niż 4xMIC. Najsilniejszą aktywność bakteriostatyczną i zarazem bójczą wykazały

olejki: geraniowy, cytronelowy i z mięty pieprzowej (zakres stężeń 0,024 - 0,19% v/v) oraz alfa-terpineol

i cytral (zakres stężeń 0,048% - 0,78% v/v). Bakterie Gram-dodatnie S. aureus ATCC 6538 i przedstawi-

ciel grzybów drożdżopodobnych C. albicans ATCC 10231 były bardziej wrażliwe niż Gram-ujemne E. coli

NCTC 8196. Uzyskane wyniki zachęcają do prowadzenia dalszych badań nad działaniem najbardziej

aktywnych olejków eterycznych, z uwzględnieniem większej grupy bakterii oraz grzybów izolowanych

z materiałów klinicznych i wykazujących różny fenotyp wrażliwości na konwencjonalne chemioterapeuty-

ki. Można sądzić, iż zastosowanie w przyszłości olejków/składników w pomocniczej terapii zakażeń

grzybiczych lub bakteryjnych oraz zakażeń o etiologii mieszanej - grzybowo-bakteryjnej, przyniesie

spodziewany efekt leczniczy.

37

II-8 P | Aktywność wybranych olejków eterycznych wobec klinicznych izolatów Candida spp.

Budzyńska A.1, Lipowczan G.2, Nowak M. 1, Gibus D. 1, Macura A.3, Różalska B. 1

1 Instytut Mikrobiologii, Biotechnologii i Immunologii, Uniwersytet Łódzki 2 Pracownia Mikologii, Szpital im. Biegańskiego w Łodzi 3 Zakład Mikologii Collegium Medicum, Uniwersytet Jagielloński, Kraków

e-mail: albudzal@biol.uni.lodz.pl

Wstęp: Pomimo ogromnego postępu w medycynie, zakażenia wywoływane przez grzyby z rodzaju

Candida są wciąż poważnym problemem epidemiologicznym. Coraz częściej dochodzi do ciężkich

zakażeń nie tylko o etiologii C. albicans, ale też gatunkami z grupy Candida non-albicans. Dodatkowo

pojawia się coraz więcej doniesień o rosnącej oporności tych grzybów na powszechnie stosowane leki.

Znany impas antybiotykoterapii tłumaczy skierowanie uwagi na alternatywne sposoby zwalczania „trud-

nych” zakażeń. Dlatego coraz intensywniej bada się możliwość wykorzystania terapeutycznego natural-

nych produktów, np. olejków eterycznych wchodzących w skład układu obronnego roślin, poszukując

takich produktów, które wykazują działanie bójcze i/lub synergizm z chemioterapeutykami. Cel: Ocena

wrażliwości klinicznych szczepów Candida spp. na wybrane olejki eteryczne. Metody: Na podstawie

wcześniejszych badań skryningowych do badań przeznaczono 5 najbardziej aktywnych olejków: goździ-

kowy, geraniowy, cytronelowy, lawendowy i melisowy oraz 5 składników: alfa-terpineol, terpinen-4-ol,

cytral, cytronelal i linalol. Badaniu poddano łącznie 50 klinicznych izolatów: C. albicans (n=20),

C. glabrata (n=14), C. tropicalis (n=6), C. krusei (n=5), C. parapsilosis (n=5). MIC/MBC fitozwiązków

ustalono metodą mikrorozcieńczeń w bulionie (wg. rekomendacji CLSI) w modyfikacji własnej. Wyniki:

Potwierdzono wysoką aktywność grzybostatyczną i grzybobójczą badanych preparatów, uzyskując

podobny zakres wartości MIC/MBC dla szczepów C. albicans, niezależnie od ich profilu lekowrażliwości

i nieco niższą aktywność wobec gatunków C. krusei, C. glabrata, C. tropicalis i C. parapsilosis. Zakres

stężeń olejków eterycznych hamujących wzrost Candida spp. wynosił 0,006%-1,56% v/v, natomiast ich

składników - 0,003%-0,78% v/v. Najwyższą aktywność wykazały olejki geraniowy i melisowy oraz skład-

niki: terpinen-4-ol, alfa-terpineol i cytral. Szczepy C. albicans oraz większość szczepów C. glabrata były

najbardziej podatne na działanie olejku geraniowego (MIC, odpowiednio: 0,012 - 0,048 % i 0,006 - 0,097

%). Średnią wrażliwością charakteryzowały się C. parapsilosis (MIC 0,048 - 0,19 %) i C. tropicalis (MIC

0,024 - 0,048 %), natomiast najbardziej oporne były szczepy kliniczne C. krusei, MIC ≥ 0,097 %. Warto-

ści MBC badanych fitozwiązków były zazwyczaj równe MIC lub dwukrotnie wyższe. Wnioski: Można

sądzić, iż olejki eteryczne znajdą zastosowanie w medycynie jako pomocnicze czynniki w leczeniu

grzybic, szczególnie tych o charakterze przewlekłych zakażeń miejscowych wywoływanych przez Candi-

da spp. (stopa cukrzycowa, owrzodzenia nowotworowe itp.).

II-9 P | Wpływ inwazji Toxoplasma gondii do ośrodkowego układu nerwowego na zachowanie

myszy

Gatkowska J.1, Wieczorek M.2, Dziadek B.1, Dzitko K.1, Długońska H.1

1 Zakład Immunoparazytologii, Uniwersytet Łódzki, 90-237 Łódź, Banacha 12/16, 2 Zakład Neurofizjologii, Uniwersytet Łódzki, 90-236 Łódź, Pomorska 141/143,

e-mail: gatjus@biol.uni.lodz.pl

Wstęp: Toxoplasma gondii to kosmopolityczny pierwotniak atakujący wiele gatunków zwierząt endoter-

micznych, w tym także człowieka. Szacuje się, że toksoplazmoza jest jedną z najczęściej występujących

na świecie parazytoz, a zarażenie może dotyczyć nawet 1/3 populacji ludzi. Obecnie coraz częściej

postuluje się istnienie związku pomiędzy nosicielstwem pierwotniaka w ośrodkowym układzie nerwowym

(OUN) a zwiększonym ryzykiem rozwoju poważnych chorób o podłożu nerwowym takich jak schizofrenia

czy choroba Parkinsona. Ponadto stwierdzono, iż pierwotniak wywiera ukierunkowany wpływ na zacho-

38

wanie żywiciela, aby zwiększyć swoje szanse na transmisję w środowisku. Cel pracy: W pracy podjęto

próbę określenia liczby cyst T. gondii obecnych w hipokampie i ciałach migdałowatych, strukturach

zaangażowanych w kontrolę zachowania i przetwarzanie emocji oraz zbadania wpływu inwazji pasożyta

do OUN na zachowanie. Metody: Badania wykonano u myszy laboratoryjnych z ostrą i przewlekłą

toksoplazmozą. Określone struktury mózgowia homogenizowano, a liczbę obecnych w nich cyst wyraża-

no na 1 mg tkanki, natomiast zachowanie zwierząt oceniano w teście otwartego pola (OF).Wyniki:

Stwierdzono, że pasożyt zasiedla obie objęte badaniem struktury mózgowia niezależnie od fazy inwazji.

Zanotowano także istotne zmiany w zachowaniu zarażonych zwierząt, w porównaniu do grupy kontrolnej,

obejmujące aktywność lokomotoryczną i eksploracyjną oraz stan emocjonalny. Wnioski: Inwazja

T. gondii skutkuje nosicielstwem pasożyta w OUN i widocznymi zmianami w zachowaniu zwierząt.

____________________

Praca dofinansowana przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego (grant N N302 636340) oraz Uniwersytet

Łódzki (grant 545/211).

II-10 P/O | Formy morfologiczne H. pylori i ich przypuszczalna rola w transmisji zakażeń

Graczykowski M., Rudnicka K., Chmiela M.

Katedra Immunologii i Biologii Infekcyjnej, Uniwersytet Łódzki

e-mail: rudnicka@biol.uni.lodz.pl

Wstęp: Ponad połowa światowej populacji ludzkiej jest zakażona Gram ujemną pałeczką Helicobacter

pylori – zasiedlającą żołądek i dwunastnicę człowieka. Międzynarodowa Agencja Badań nad Rakiem

(IARC) zalicza H. pylori do karcinogenów klasy I, tj. do czynników indukujących powstawanie nowotwo-

rów u człowieka. Jednakże, pomimo trzech dekad badań, nadal nie udokumentowano przeżywalności

H. pylori poza błoną śluzową żołądka. Potencjalną, choć nadal nieudokumentowaną drogą transmisji

H.pylori jest spożycie skażonej fekaliami wody. Cel pracy: Celem niniejsze pracy jest porównanie form

morflogicznych H. pylori, ocena ich właściwości antygenowych oraz zakaźnych, jak również ukazanie

wyników najnowszych badań zmierzających do wykazania lub wykluczenia tezy o przeżywalności form

ziarniakowatych H. pylori poza błona śluzową żołądka człowieka. Wyniki: dwie podstawowe formy

morfologiczne H. pylori to forma pałeczkowa i forma ziarniakowata. Ta ostatnia może przyjmować dwie

postaci: żywą lecz nie hodowalną, tzw. VBnC (ang. viable but non culturable) lub postać degeneratywną

czyli pośmiertną formę resztkową bakterii. Wyniki licznych badań wskazują na brak istnienia białka

charakterystycznego wyłącznie dla danej postaci morfologicznej, jednak wykazano różnice w intensyw-

ności ekspresji różnych białek pomiędzy formami morfologicznymi np. ureazy, CagA, Hsp. Poza formami

pojedynczymi, H. pylori posiada zdolność tworzenia społeczności bakteryjnych o charakterze jedno-, lub

wielogatunkowym. Biofilmy H. pylori wyizolowano m.in. z powierzchni rur PCV, stali nierdzewnej i szkła.

Co ciekawe większość bakterii wchodzących w skład takich biofilmów to formy ziarniakowa te. Spekuluje

się że zdolność tworzenia biofilmu środowiskowego w połączeniu z hipotetyczną możliwością przejścia

w stan kokoidalny (i powrotu do formy spiralnej) tłumaczyłaby wysoki odsetek osób zakażonych wśród

osób korzystających z nieuzdatnionej wody pochodzącej ze studni, rzek. Wnioski: Podczas poszukiwań

literaturowych nie znaleziono pracy, bezsprzecznie stwierdzającej możliwość transformacji formy kokoi-

dalnej w formę spiralną. Z próbek wody zawierających formy kokoidalne H. pylori, nie wyhodowano

żywych bakterii. Na modelach zwierzęcych wykazano rozwój reakcji zapalnej w błonie śluzowej żołądka

myszy szczepionych formami kokoidalnymi H. pylori. Nie wyklucza się jednak obecności odsetka formy

spiralnej w inokulum, stosowanym do szczepienia zwierząt. W celu wykazania lub wykluczenia przeży-

walności form kokoidalnych w wodzie pitnej oraz ich zdolności zakaźnych niezbędne są kolejne badania,

a przede wszystkim odpowiednia metodyka i zastosowanie najnowszych osiągnięć z dziedziny epide-

miologii, genetyki i mikrobiologii.

39

II-11 P | Rola Fas/FasL w regulacji stanu zapalnego błony śluzowej pochwy w przebiegu zakażenia

HSV-2

Gregorczyk K., Grochowska A., Krzyżowska M.

Zakład Immunologii, Katedra Nauk Przedklinicznych, Wydział Medycyny Weterynaryjnej,

Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie

e-mail: karolina.gregorczyk@tlen.pl

Wstęp: Zakażenie wirusem herpes simplex typu 2 (HSV-2), wywołujące tzw. opryszczkę narządów

płciowych stanowi jedną z najczęstszych chorób przenoszonych drogą płciową. Szacuje się, że latentne

zakażenie wirusowe dotyczy 50% populacji kobiet na całym świecie. Wykazano, iż apoptoza odgrywa

istotną rolę w utrzymaniu homeostazy błon śluzowych, a w szczególności szlak zależny od receptorów

Fas/FasL. Niewiele wiadomo o roli apoptozy i szlaku Fas/FasL w powstawaniu miejscowych zmian

w obrębie nabłonka błony śluzowej pochwy w przebiegu opryszczki narządów płciowych. Cel pracy: Do

określenia roli Fas i FasL Fas/FasL w patogenezie zmian błony śluzowej pochwy oraz w regulacji stanu

zapalnego w przebiegu zakażenia HSV-2 posłużono się mysim modelem herpes genitalis. Przebieg

zakażenia u myszy dzikiego szczepu C57BL porównywano z zakażeniem u myszy z knock-outem genu

Fas i FasL. Metody: Szczepy myszy z mutacją w genie Fas (lpr) i w FasL (gld) oraz szczep dziki C57BL6

zakażano dopochwowo HSV-2 w dawce 104 PFU/mysz. Kontrolę stanowiły myszy niezakażone. Tkankę

pochwy oraz węzły chłonne w 3 i 7 dniu zakażenia wykorzystywano do przygotowania zawiesiny

pojedynczych komórek oraz preparatów histologicznych, które następnie poddawano wykrywaniu komó-

rek apoptotycznych (komórki z aktywną kaspazą 3) oraz immunofenotypowaniu (neutrofile, monocyty).

Dodatkowo, sprawdzano ekspresję białka Bcl-2 oraz Bax. Wyniki: Komórki nabłonka pochwy myszy

dzikich zakażone HSV-2 wykazywały wysoki poziom ekspresji Fas, FasL oraz Bcl-2 i nie ulegały apop-

tozie, natomiast komórki nabłonka sąsiadujące z miejscami zakażenia charakteryzowały się zwiększoną

ekspresją Fas i ulegały apoptozie. Zakażenie HSV-2 myszy z mutacją Fas i FasL powodowało wzrost

apoptozy komórek zakażonych, ale również silny naciek komórek odpowiedzialnych za stan zapalny

(neutrofilów, monocytów oraz komórek dendrytycznych). Nie stwierdzono różnic w ekspresji Bcl-2 myszy

dzikich oraz myszy z knock-outem Fas lub FasL. Wnioski: Szlak Fas/FasL uczestniczy w rozwoju stanu

zapalnego błony śluzowej pochwy w początkowej fazie zakażenia HSV-2.

____________________

Pracę sfinansowano z grantu MNiSW nr N N401 178839.

II-12 P/O | Izolacja i charakterystyka środowiskowych bakteriofagów wykazujących aktywność

lityczną wobec wielolekoopornych szczepów Klebsiella sp.

Kęsik-Szeloch A.1, Drulis-Kawa Z.1, Kassner J.1, Weber-Dąbrowska B.2

1 Instytut Genetyki i Mikrobiologii, Uniwersytet Wrocławski, Wrocław 2 Instytut Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN im. L. Hirszfelda, Wrocław

e-mail: agata.kesik@microb.uni.wroc.pl

Wstęp: Bakteriofagi (nazywane także fagami) to wirusy zakażające komórki bakteryjne. Występują one

w wodzie, glebie, powietrzu a także są składnikiem mikroflory jelitowej ludzi i zwierząt. Bakteriofagi

charakteryzują się wysoką swoistością w stosunku do komórek gospodarza. Swoistość ta powoduje, iż

konkretne fagi wykazują aktywność lityczną tylko do określonych gatunków bakterii, czy wręcz do po-

szczególnych szczepów danego gatunku. Cecha ta jest wykorzystywana w celach eliminacji konkretnych

szczepów bakteryjnych (fagoterapia) oraz w typowaniu bakterii w obrębie gatunku (fagotypia), mającego

duże zastosowanie w epidemiologii. Cel pracy: Przedmiotem niniejszej pracy była izolacja i charaktery-

styka bakteriofagów wykazujących aktywność wobec szczepów Klebsiella pneumoniae ESBL(+) w celu

wykorzystania ich w terapii fagowej w przypadku zakażeń wywołanych przez wielolekooporne szczepy

40

bakteryjne. Metody: Nowowyizolowane bakteriofagi scharakteryzowano na podstawie morfologii wirio-

nów i łysinek oraz zakresu gospodarzy. Morfologię bakteriofagów określono przy wykorzystaniu mikro-

skopu elektronowego transmisyjnego (TEM). Morfologię łysinek fagowych ustalono z użyciem metody

płytek dwuwarstwowych. Aktywność lityczną wyizolowanych fagów przetestowano wobec 168 szczepów

Klebsiella pneumoniae i 54 szczepów Klebsiella oxytoca z wykorzystaniem metody „spot-test”. Wyniki:

Z ośmiu próbek wód wyizolowano 34 bakteriofagi namnożone na 11 szczepach K. pneumoniae ESBL(+).

Pod względem cech morfologicznych ustalono ich przynależność do trzech rodzin: Myoviridae, Siphoviri-

dae i Podoviridae. Zaobserwowano również istotne różnice w morfologii łysinek fagowych. Ponadto

badania wykazały, że bakteriofagi należące do rodziny Myoviridae cechowały się wyższą skutecznością

i względnie szerszym zakresem aktywności w obrębie szczepów Klebsiella sp. (aktywność wobec 22%

szczepów K. pneumoniae oraz 37% szczepów K. oxytoca). Wnioski: Wyizolowane bakteriofagi wykazują

aktywność bakteriobójczą względem dużej liczby klinicznych wielolekoopornych szczepów K. pneumo-

niae i K. oxytoca. Przekłada się to na możliwość ich zastosowania w bezpośredniej terapii fagowej jak

i w typowaniu bakterii izolowanych od chorych.

II-13 P | Rola witaminy C w modyfikacji białek błon erytrocytów przeznaczonych do transfuzji

Kontek B., Antosik A., Żbikowska H.M.

Katedra Biochemii Ogólnej, Uniwersytet Łódzki, Pomorska 141/3, 90-236 Łódź, Polska

e-mail: kontekb@biol.uni.lodz.pl

Wstęp: Napromienianie krwi i jej komponentów przed transfuzją jest jedyną skuteczną metodą zapobie-

gającą reakcji przeszczep przeciwko gospodarzowi (transfusion-associated grft versus host disease; TA-

GVHD) występującą u pacjentów z obniżoną odpornością immunologiczną. Uszkodzenia limfocytów,

odpowiedzialnych za TA-GVHD przez promieniowanie jonizujące jest powodowane przede wszystkim

przez reaktywne formy tlenu pochodzące z radiolizy wody, głównie rodnik hydroksylowy. Odpowiedź

mniej wrażliwych na promieniowanie jonizujące erytrocytów w postaci peroksydacji i/lub uszkodzenia

struktury białek zależy od stosowanej dawki promieniowania. Antyoksydanty dodawane do płynów

uzupełniających, w których przechowuje się erytrocyty mogą chronić je przed uszkodzeniami poradiacyj-

nymi. Cel pracy: Prezentowana praca miała na celu zbadanie stopnia uszkodzenia oksydacyjnego białek

błon erytrocytów napromienionych dawkami 50 i 100 Gy oraz określenie wpływu witaminy C na te zmia-

ny. Metody: Zmiany oksydacyjne w białkach określono na podstawie pomiaru ilości grup –SH w napro-

mienionych błonach erytrocytów. Wyniki: Wykazano, że promieniowanie gamma powoduje wzrost ilości

grup –SH w białkach błon erytrocytów (o około 58% i 67%) odpowiednio przy dawce 50 i 100 Gy

w stosunku do prób nienapromienionych, co może świadczyć o częściowej fragmentacji i/lub denaturacji

białek. Zaobserwowano również istotne statystycznie zmniejszenie ilości grup –SH w błonach napromie-

nionych w obecności witaminy C, niezależnie od stosowanego stężenia (5-125 µM), w porównaniu

z błonami napromienionymi bez antyoksydanta. Przy dawkach promieniowania 50 i 100 Gy spadek ilości

grup –SH w próbkach napromienionych w obecności witaminy C wynosił odpowiednio 65% i 50%.

Wnioski: Na podstawie uzyskanych wyników można wnioskować, że witamina C skutecznie hamuje

procesy oksydacyjne w białkach błon erytrocytów powodowane przez promieniowanie jonizujące

o dawce, stosowanej w transfuzjologii.

____________________

Praca finansowana z działalności statutowej UŁ nr 506/810.

41

II-14 P | Ocena właściwości antyoksydacyjnych koniugatów polifenolowo-polisacharydowych

wybranych roślin rodziny Rosaceae

Kontek B.1, Wlazłowicz E.1, Saluk J.1,2, Wachowicz B.1,2, Pawlaczyk I.2,3, Gancarz R.2,3

1 Katedra Biochemii Ogólnej, Uniwersytet Łódzki, Pomorska 141/143, 90-236 Łódź, Polska, 2 Wojewódzki Szpital Specjalistyczny, Zintegrowane Centrum Medycyny Sercowo-Naczyniowej,

Kamińskiego 73a, 51-124 Wrocław, Polska 3 Zakład Chemii Medycznej i Mikrobiologii, Politechnika Wrocławska, Łukasiewicza 2, 50-371 Wrocław,

Polska

e-mail: kontekb@biol.uni.lodz.pl

Wstęp: Jednym z głównych endogennych czynników wywołujących stres oksydacyjny w układzie krąże-

nia jest nadtlenoazotyn (ONOO-). Powstaje w wyniku gwałtownej reakcji pomiędzy tlenkiem azotu (NO·)

a anionorodnikiem ponadtlenkowym (O2·-). Jest bardzo silnym antyoksydantem. Wywołuje oksydację

wielu biomolekuł komórkowych, m.in. prowadzi do zmian strukturalnych białek (np. nitrowanie reszt

tyrozynowych czy tworzenie grup karbonylowych), co z reguły skutkuje utratą lub zmianą ich funkcji.

Znanych jest już wiele związków polifenolowych obecnych w ekstraktach uzyskanych z roślin leczni-

czych, które wpływają na zahamowanie wytwarzania czy działania nadtlenoazotynu. Istnieją jednak

rośliny, których wpływ na układ krążenia nie został jeszcze poznany. Cel pracy: Celem pracy była ocena

i porównanie wpływu in vitro ekstraktów polifenolowo-polisacharydowych uzyskanych z roślin należących

do rodziny Rosaceae, tj. jeżyny fałdowanej (Rubus plicatus) oraz krwiściągu lekarskiego (Sanguisorba

officinalis), w stężeniach 50, 100, 200 i 300 µg/ml, na zmiany oksydacyjne białek płytek krwi wywołane

działaniem nadtlenoazotynu. Metody: Stopień zmian w białkach płytek krwi inkubowanych z nadtlenoa-

zotynem w obecności badanych ekstraktów oznaczano poprzez pomiar stężenia 3-nitrotyrozyny (3-NT)

oraz poziomu grup karbonylowych. Wyniki: Ekstrakty polifenolowo-polisacharydowe z badanych roślin

obniżają stężenie 3-NT; już najniższe stężenie – 50 µg/ml spowodowało zahamowanie tworzenia się 3-

NT o prawie 50%. Wzrost stężenia ekstraktów – 100, 200 i 300 µg/ml – nie wpływał na dalsze hamowa-

nie tworzenia 3-NT. W białkach płytek krwi po inkubacji z różnymi stężeniami badanych ekstraktów

roślinnych nie zaobserwowano zmian w wytwarzaniu grup karbonylowych wywołanych nadtlenoazoty-

nem. Wnioski: Polifenolowe ekstrakty z jeżyny fałdowanej i krwiściąga lekarskiego mają działanie

antyoksydacyjne. Chronią płytki krwi przed zmianami wywołanymi nadtlenoazotynem, który powstaje

w dużych ilościach w układzie krążenia w stanach zapalnych. Mechanizm ochronnego działania nie jest

znany.

____________________

Praca współfinansowana z działalności statutowej UŁ nr 506/810 oraz projektu WROVASC – Zintegrowane Centrum

Medycyny Sercowo-Naczyniowej Programu Operacyjnego Innowacyjna Gospodarka 2007-2013.

II-15 P | Aktywność kwasu oleanolowego i kwasu ursolowego w kombinacji wybranymi

antybiotykami przeciwko biofilmom bakteryjnym

Kurek A., Wolska K.I.

Zakład Genetyki Bakterii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski

e-mail: annakurek@biol.uw.edu.pl

Wstęp: Narastająca oporność bakterii na antybiotyki jest powodem prowadzenia intensywnych poszuki-

wań potencjalnych terapeutyków, mogących wspomagać działanie stosowanych powszechnie antybioty-

ków. Dotychczasowe badania prowadzone w naszym zakładzie wykazały antybakteryjne działanie dwóch

związków pochodzenia roślinnego – kwasu oleanolowego (OA) i kwasu ursolowego (UA), szczególnie

silne wobec bakterii gramdodatnich. Oba badane triterpenoidy pentacykliczne zmieniają morfologię

42

komórek bakteryjnych, indukują ich autolizę, hamują obrót metaboliczny i zmieniają usieciowanie pepty-

doglikanu [1,2], a więc celem działania tych związków są osłony bakteryjne. Cel pracy: Celem niniejszej

pracy było zbadanie wpływu OA i UA w kombinacji z wybranymi antybiotykami na zdolność do adhezji

i tworzenia biofilmu. Metody: Stosowane szczepy: S. aureus ATCC29213 i S. aureus A3 (MRSA),

S. epidermidis ATCC12228 i S. epidermidis 6756/99 (MRSE), L. monocytogenes PCM2191, P. aerugino-

sa ATCC10145 and E. coli ATCC23546. Stosowane związki: OA, UA, penicylina G, ampicylina, oksacyli-

na, streptomycyna, rifampicyna. Wyznaczono wartości MIC oraz minimalne stężenie hamujące biofilm

(MBIC). Wpływ OA i UA na hydrofobowość powierzchni osłon oznaczono metodą oddziaływania

z p-ksylenem (BATH). Adhezję i formowanie biofilmu oznaczono poprzez barwienie biomasy biofilmu

fioletem krystalicznym, a żywotność komórek oznaczono barwiąc żywe komórki za pomocą MTT.

Zaburzenia w formowaniu biofilmu na fragmentach cewników zobrazowano barwiąc biomateriały TTC.

Wyniki: Wartości MIC i MBIC dla OA/UA wynosiły odpowiednio 10 – 35 µg/ml i 20 – 70 µg/ml. Wykaza-

no istnienie oddziaływań synergistycznych i addytywnych między OA i UA a antybiotykami. Na szczegól-

ną uwagę zasługuje synergizm między antybiotykami β-laktamowymi i OA/UA w działaniu na szczepy

S. aureus i S. epidermidis zwłaszcza wobec biofilmu. Zaobserwowano ok. 4-krotne zmniejszenie MBIC

dla wybranych antybiotyków w obecności OA/UA. Triterpenoidy stosowane samodzielnie zmieniają

stopień hydrofobowości komórek bakteryjnych, wpływając tym samym na poziom adhezji. Wnioski: OA

i UA wykazują antybiofilmową aktywność oraz współdziałają z antybiotykami.

II-16 P | Właściwości adhezyjne bakterii z rodzaju Asaia

Kur-Kowalska K., Kręgiel D.

Instytut Technologii Fermentacji i Mikrobiologii, Politechnika Łódzka

e-mail: kk_lodz@onet.eu

Wstęp: Bakterie z rodzaju Asaia należą do rodziny bakterii octowych - Acetobacteraceae. Pierwotnym

źródłem izolacji bakterii Asaia sp. są kwiaty i owoce roślin tropikalnych. Izolowane są również w wód

mineralnych z naturalnym aromatem owocowym oraz z linii produkcyjnych do produkcji tych napojów,

gdzie mogą tworzyć biofilmy. Bakterie z rodzaju Asaia należą do pierwszej grupy zagrożenia, mimo to,

mogą wywoływać bakteremie u osób o znacznie obniżonej odporności organizmu. Cel pracy: Celem

pracy była ocena zdolności adhezyjnych bakterii z rodzaju Asaia z uwzględnieniem wybranych warun-

ków środowiskowych i różnych nośników abiotycznych. Metody: Badano dwa szczepy: FMW1 - Asaia

lannaensis, oraz FMW2 - Asaia sp. Z hodowli płynnych zaszczepiano pożywki hodowlane (pożywkę

minimalną, wzbogacona oraz wodę mineralną z aromatem truskawkowym). Zastosowane nośniki: (szkło,

PET, PP) stanowią przykład typowych materiałów opakowaniowych i zostały dopuszczone do kontaktu

z żywnością. Inkubacje prowadzono na wytrząsarce, w temperaturze 23°C, 7 lub 14 dni. W czasie

hodowli oraz po jej zakończeniu wykonano następujące analizy: pomiar luminometryczny, wysiewy

ilościowe oraz analizę mikroskopową nośnika. Monitorowano zarówno wzrostu szczepów w zawiesinie

hodowlanej jak i zdolności adhezyjne do powierzchni nośników. Wyniki: Komórki bakterii z rodzaju Asaia

w zależności od składu pożywki hodowlanej wykazywały zróżnicowane kształty – od owalnych, prawie

kulistych do bardzo wydłużonych. Bakterie z rodzaju Asaia charakteryzowały się silnymi właściwościami

adhezyjnymi, zależnie od dostępu składników pokarmowych i rodzaju powierzchni. Najwyższy poziom

adhezji uzyskano dla szczepu Asaia sp. FMW2 w pożywkach z glukozą i sacharozą jako źródło węgla.

Dodatkowo w obrazach mikroskopowych nośników zaobserwowano obecność zewnątrzkomórkowej

substancji, szczególnie w pożywkach z sacharozą. Spośród badanych nośników, najwyższy współczyn-

nik adhezji odnotowano do powierzchni PET. Wnioski: Bakterie z rodzaju Asaia wykazują zdolność

adhezji do powierzchni ciał stałych, charakteryzują się pleomorfizmem. Stopień adhezji zależy zarówno

od rodzaju pożywki, jak i zastosowanego nośnika. Napięcie powierzchniowe na granicy faz: ciecz-

powietrze może sprzyjać przyleganiu bakterii Asaia sp. do powierzchni nośnika.

43

II-17 P | Wpływ warunków wzrostu na powstawanie komórek typu „persisters” w hodowlach

stacjonarnych E. coli

Leszczyńska D., Matuszewska E., Szczepaniak P., Kuczyńska-Wiśnik D., Laskowska E.

Katedra Biochemii, Wydział Biologii, Uniwersytet Gdański

e-mail: daria.leszczynska@biotech.ug.gda.pl

Wstęp: Komórki typu „persisters”, które stanowią niewielką część populacji bakteryjnych, charakteryzują

się brakiem wzrostu i tolerancją na działanie czynników antybakteryjnych. Z tego powodu obecność

„persisters” może być poważnym problemem w trakcie zwalczania infekcji bakteryjnych. Bakterie mogą

przechodzić z fazy „persisters” do fazy szybkiego wzrostu i stawać się wrażliwe na antybiotyki. Mechani-

zmy, które indukują powstanie „persisters” oraz powodują oporność tych komórek na antybiotyki nie są

do końca poznane. „Persisters” mogą pojawiać się zarówno w biofilmie jak i w hodowlach planktonowych,

przede wszystkim podczas stacjonarnej fazy wzrostu. Cel pracy: W prezentowanej pracy badano wpływ

warunków wzrostu na poziom komórek „persisters” w stacjonarnych hodowlach szczepu laboratoryjnego

E. coli MC4100. Metody: W celu izolacji komórek „persisters” hodowle E. coli rozcieńczano (107 CFU/ml)

w pożywce LB (Luria broth) z dodatkiem ampicyliny (200 g/ml) i inkubowano w 30°C przez 6 godzin.

Agregaty białkowe izolowano stosując ultrawirowanie ekstraktów bakteryjnych traktowanych 2% Tritonem

X100 w gradiencie gęstości sacharozy. Wyniki: Prowadzone przez nas badania wykazały, że dostęp-

ność tlenu i glukozy w pożywce mają wpływ na poziom „persisters” w stacjonarnych hodowlach szczepu

laboratoryjnego E. coli MC4100. W warunkach tlenowych obecność glukozy w pożywce LB znacznie

obniżała liczbę „persisters”. Odwrotny efekt obserwowaliśmy w przypadku stacjonarnych hodowli beztle-

nowych, w których glukoza powodowała wzrost poziomu „persisters”. Nasze wcześniejsze doświadczenia

wykazały, że w hodowlach stacjonarnych (tlenowych bez glukozy i beztlenowych z glukozą), w których

stwierdziliśmy podwyższony poziom „persisters”, znajdują się wewnątrzkomórkowe agregaty białek.

Agregaty te zawierają białka, które biorą udział w różnych szlakach metabolicznych (glikoliza, przemiany

puryn i pirymidyn, synteza aminokwasów), białka rybosomalne, stresowe i uczestniczące w translacji.

Przypuszczamy, że agregacja białek utrudnia prawidłowe funkcjonowanie komórek i powoduje zahamo-

wanie ich wzrostu w późnej fazie stacjonarnej. Interesującym było stwierdzenie, że uzupełnienie pożywki

40 mM buforem MOPS pH 7,4 hamowało tworzenie agregatów białkowych i jednocześnie obniżało

poziom komórek „persisters” w hodowlach. Wnioski: Można przypuszczać, że agregacja białek lub

czynnik, który ją wywołuje, indukuje powstawanie komórek „persisters” w hodowlach stacjonarnych

E. coli. Warunki umożliwiające zahamowanie agregacji białek mogą obniżyć poziom „persisters” w

hodowli.

II-18 P | Potencjalna rola przeciwciał przeciwko białkom szoku cieplnego w rozwoju choroby niedokrwiennej serca

Matusiak A.1, Rechciński T.2, Miszczyk E.1, Rudnicka K.1, Walencka M.1, Rudnicka W.1, Chmiela M.1

1 Katedra Immunologii i Biologii Infekcyjnej, Uniwersytet Łódzki, Łódź, Polska 2 II Klinika Kardiologii, Uniwersytet Medyczny w Łodzi, Łódź, Polska

e-mail: aga.matus@wp.pl

Wstęp: Przypuszcza się, iż konserwatywne bakteryjne białka szoku cieplnego inicjujące powstawanie przeciwciał krzyżowo reagujących z białkami szoku cieplnego gospodarza mogą przyczyniać się do podtrzymywania reakcji zapalnej u pacjentów z chorobą niedokrwienną serca, ze współistniejącym zakażeniem Helicobacter pylori, przyczyniając się do nasilenia procesów patologicznych w środowisku naczyniowym. Cel: W pracy oceniono częstość i intensywność wytwarzania przeciwciał klasy IgG prze-ciwko wzorcowemu bakteryjnemu białku grupy Hsp60, jakim jest białko Hsp65 M. bovis (MbHsp65), a także przeciwko białku Hsp60 H. pylori (HspB) oraz ludzkiemu białku Hsp60 (hHsp60). Metody:

44

Analizie poddano 159 surowic pacjentów z chorobą niedokrwienna serca (ChNS) oraz 55 surowic osób zdrowych. Częstość i intensywność wytwarzania przeciwciał IgG przeciwko Hsp65 M. bovis oceniono stosując laboratoryjny test immunoenzymatyczny ELISA, w którym użyto wzorcowe białko szoku cieplne-go M. bovis o masie 65 kDa. Częstość i intensywność wytwarzania IgG przeciwko ludzkiemu białku Hsp60 oceniono z zastosowaniem handlowego testu „Anti-human Hsp60” (Stressgen), w którym do opłaszczenia nośnika użyto rekombinowane ludzkie białko Hsp60 (rhHsp60). Częstość wytwarzania przeciwciał klasy IgG przeciwko białku HspB H. pylori oceniono z zastosowaniem handlowego zestawu Western blot (Viro-Immun Labor-Diagnostika GmbH). Wyniki: Przeciwciała IgG anty-MbHsp65 i anty-HspB wykrywane były istotnie częściej w surowicach pacjentów z ChNS niż u osób zdrowych, odpowied-nio 89% i 65% oraz 86% i 68%, p<0,05. IgG anty-rhHsp60 obecne były we wszystkich surowicach badanych. Absorpcja surowic badanych inaktywowanymi termicznie pałeczkami H. pylori spowodowała znaczne obniżenie poziomu IgG anty-MbHsp65 i anty-rhHsp60. Wnioski: Zakażenia H. pylori mogą stanowić istotny czynnik ryzyka choroby niedokrwiennej serca, obok czynników klasycznych, na co może wskazywać indukowanie przez białko HspB H. pylori przeciwciał krzyżowo reagujących z ludzkim biał-kiem Hsp60, którego poziom u pacjentów z chorobą wieńcową jest istotnie podwyższony, co stwarza ryzyko patologicznych zmian o podłożu autoimmunologicznym. ____________________

Praca finansowana z grantu MNiSW nr N401 015 136.

II-19 P | Pierwszy przypadek zakażenia psa metycylino-opornym szczepem Staphylococcus

pseudintermedius (MRSP) po zabiegu chirurgicznym

Międzobrodzki J.1 , Polakowska K.1, Kasprowicz A.2, Białecka A.2, Jaworska O.3, Władyka B.4, Dubin A.4

1 Zakład Mikrobiologii, Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii, Uniwersytet Jagielloński 2 Centrum Badań Mikrobiologicznych i Autoszczepionek im. Dra J. Bobra, Kraków 3 Klinika Weterynaryjna „ALVET”, Kraków 4 Zakład Biochemii Analitycznej, Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii, Uniwersytet Jagielloński

e-mail: jacek.miedzobrodzki@uj.edu.pl

Wstęp: Biochemiczna charakterystyka izolatów wyprowadzonych z zakażeń jest podstawą diagnostyki,

a w szczególnych przypadkach konieczna jest także analiza genetyczna. Postępowanie takie miało

miejsce w przypadku zakażenia rany u psa po operacji wstawienia endoprotezy stawu. Była to bardzo

rzadko wykonywana operacja u zwierząt. Powodem jej była postępująca dysplazja stawu u psa rasy

Bergamasco. Cztery dni po operacji rana obficie ropiała. Cel pracy: Celem pracy była biochemiczna

i genetyczna identyfikacja szczepów bakteryjnych powodujących ropne zakażenie rany u psa po zabiegu

chirurgicznym. Metody: Materiał do analizy mikrobiologicznej pobrano trzykrotnie. Analizy mikrobiolo-

giczne wykonane z użyciem standardowych metod wykazały obecność Staphylococcus intermedius,

uzupełniające badania molekularne techniką PCR-RFLP, ocena sekwencji fragmentów 16S rRNA i genu

rpoB wskazały na gatunek S. pseudintermedius oraz obecność jednego, tego samego szczepu we

wszystkich trzech pobranych próbach. Na podstawie wyników pierwszego badania i antybiogramu

zastosowano linezolid (zywoxid). W drugim i trzecim pobraniu materiału uzyskano wzrost pojedynczych

kolonii, po czym nastąpiło wygojenie rany. Zabieg chirurgiczny wraz z celowaną chemioterapią dały

pozytywny wynik. Chemioterapia oparta była na antybiogramie wykonanym techniką E-testu (AB BIOD-

ISC) zgodnie z zaleceniami NCCLS. Wyniki: Wyosobniony patogen zakwalifikowano do gatunku Staphy-

lococcus pseudintermedius. Był on oporny na grupy antybiotyków: makrolidy, linkozamidy, streptogrami-

ny B i wszystkie beta-laktamowe. Oporność na antybiotyki beta-laktamowe kodowana była na chromo-

somowej kasecie SCCmec typu III, co stwierdzono metodą MULTIPLEX PCR oraz porównano ze szcze-

pami standardowymi. Wnioski: Wyosobnienie z rany psa szczepu MRSP z kasetą genową typową dla

szpitalnych szczepów S. aureus – MRSA jest niepokojącą informacją. Zjawisko dowodzi transferu genów

oporności pomiędzy szczepami różnych gatunków gronkowców, dodatkowo kolonizujących różne gatunki

gospodarza i może w przyszłości powodować niebezpieczne następstwa kliniczne. Do określenia MRSP

45

konieczne jest stwierdzenie obecności genu mecA. Należy także przypuszczać, że w przyszłości będą

się częściej pojawiać rany pourazowe zakażone wieloopornymi szczepami gronkowców. Wprowadzenie

nowych procedur i schematów diagnostycznych będzie konieczne zarówno w mikrobiologii zakażeń

człowieka jak i w weterynarii.

____________________

Badania finansowane z projektów badawczych MNiSW nr N N303 813340 (B.W.) i N N401 017740 (J.M.).

II-20 P | Specyfika wiązania LPS H. pylori z receptorem DC-SIGN

Miszczyk E., Rudnicka K., Matusiak A., Walencka M., Chmiela M.

Katedra Immunologii i Biologii Infekcyjnej, Uniwersytet Łódzki

e-mail: elizamis88@gmail.com

Wstęp: Główną przyczyną patogenności Gram-ujemnych pałeczek Helicobacter pylori jest zdolność do

wywołania przewlekłego i długotrwałego zakażenia. Prawdopodobnie bakterie te wykształciły w toku

ewolucji mechanizmy, które pozwalają im na unikanie oraz modulowanie odpowiedzi immunologicznej

gospodarza. Właściwości immunomodulacyjne wykazuje lipopolisacharyd H. pylori. Obecność determi-

nantów Lewis w części O-swoistej LPS, pozwala prawdopodobnie na unikanie przez te bakterie odpo-

wiedzi immunologicznej, co wynika ze zjawiska mimikry antygenowej. W modulacji odpowiedzi immuno-

logicznej gospodarza mogą brać także udział komponenty H. pylori wiązane przez komórki dendrytyczne

przez receptor DC-SIGN. Interakcje takie mogą decydować o ukierunkowaniu adaptacyjnej odpowiedzi

immunologicznej. Cel pracy: Celem pracy była ocena wiązania LPS H. pylori z (Lexy+) lub bez (Lexy-)

determinantów antygenowych Lewis z rekombinowanym receptorem DC-SIGN komórek dendrytycznych.

Podjęto również próbę opracowania modelu komórkowego do badań interakcji pałeczek H. pylori, różnią-

cych się ekspresją antygenów typu Lewis, z receptorem DC-SIGN, z wykorzystaniem stabilnej linii

ludzkich monocytów – THP-1. Metody: Specyfika wiązania LPS H. pylori Lexy+ lub Lexy- z rekombinowa-

nym receptorem DC-SIGN komórek dendrytycznych była oceniana za pomocą testu ELISA, z użyciem

następujących inhibitorów: monoklonalnych przeciwciał anty-Lewisx/y, białka wiążącego LPS (LBP),

surowicy odpornościowej skierowanej przeciwko części rdzeniowej LPS oraz galaktozy. Natomiast

ekspresję receptora DC-SIGN-podobnego na powierzchni komórek THP-1 uzyskiwano poprzez stymula-

cję komórek PMA, IL-4 i GM-CSF oraz oceniano ją metodą immunocytochemiczną, z wykorzystaniem

monoklonalnych przeciwciał anty-DC-SIGN. Wyniki: Badania wykazały, że zarówno LPS H. pylori z, jak

i bez determinantów antygenowych Lex/y pośredniczy w wiązaniu bakterii z rekombinowanym receptorem

DC-SIGN komórek dendrytycznych. Wykazano, iż za specyficzność wiązania odpowiedzialne są reszty

fukozy obecne w determinantach antygenowych Lex lub Ley, a także reszty galaktozy obecne w LPS typu

GalE, bez takich determinantów. Stymulacja komórek THP-1 PMA oraz IL-4 i GM-CSF warunkowała

obecność receptora DC-SIGN-podobnego na ich powierzchni. Wnioski: Zaobserwowana interakcja

pałeczek H. pylori z receptorem DC-SIGN może być wykorzystana przez bakterie w warunkach in vivo do

modulowania odpowiedzi immunologicznej gospodarza. Natomiast opracowany model hodowli komórek

THP-1, warunkujący ekspresję receptora DC-SIGN-podobnego, może posłużyć do oceny skutków

interakcji pałeczek H. pylori za pośrednictwem tego receptora.

____________________

Praca finansowana ze środków pochodzących z grantu Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego o nr N401 015 136.

46

II-21 P | Ocena wpływu wyselekcjonowanej grupy antybiotyków zarówno na proces formowania

jak i na dojrzały 24 godzinny biofilm klinicznych szczepów Providencia stuartii

Ostrowska K., Różalski A.

Zakład Immunobiologii Bakterii, Uniwersytet Łódzki

e-mail: ostrowska.uni.lodz@wp.pl

Wstęp: Providencia stuartii jest Gram - ujemną, perytrychalnie urzęsioną pałeczką będącą fakultatywnym

patogenem człowieka. Zainteresowanie tym patogenem stale wzrasta, zwłaszcza w kontekście szpital-

nych zakażeń układu moczowego (ZUM). Wielolekooporność i zdolność do wzrostu tego mikroorgani-

zmu, w postaci niezwykle złożonej, mającej dualistyczny charakter strukturze biofilmu stanowi ogromne

wyzwanie dla współczesnej farmakoterapii. Ponadto mechanizm obrony przed penetracją molekuł

chemioterapeutyków w głąb struktury biofilmu wciąż pozostaje nie do końca wyjaśniony. Cel pracy:

W niniejszej pracy ocenie poddano wpływ grupy sześciu wyselekcjonowanych antybiotyków w zakresie

stężeń 2048 μg/ml - 2μg/ml, zarówno na proces formowania jak i na dojrzały 24 godzinny biofilm, kolekcji

20 szczepów klinicznych Providencia stuartii. Metody: Oceny stopnia wrażliwości na antybiotyki dokony-

wano na 96 dołkowych płytkach polistyrenowych typu F, dla dwóch układów badawczych : I - formowanie

biofilmu – antybiotyk w określonym stężeniu wraz z zawiesina bakteryjną o odpowiedniej gęstości

dodawano jednocześnie. II - 24 godzinny biofilm – na uprzednio wyhodowany 24 godzinny biofilm bakte-

ryjny nanoszono odpowiednie stężenia antybiotyków. Do wizualizacji uzyskanych wyników zastosowano

metodę barwienia, bazującą na wykorzystaniu 1% wodnego roztworu fioletu krystalicznego. Z uwagi na

nieselektywne działanie tego barwnika dodatkowo wykorzystano metodę z użyciem MTT [3-(4,5-

dimetylotiazol-2-yl-)-2,5-difenylobromek tetrazoliny]. Wyniki: W przypadku obu układów badawczych

największą skuteczność odnotowano przy zastosowaniu gatifloksacyny oraz ceftriaksonu, które zaapli-

kowane w stężeniu 256 μg/ml spowodowały ubytek absorbancji ≥ 75% u 50% przebadanych szczepów.

Użycie amikacyny, cefepimu oraz cefotaksymu w badanym zakresie stężeń dla większości przebada-

nych szczepów, okazało się nie wystarczające do osiągnięcia wymiernych rezultatów. Stężenia hamujące

tworzenie biofilmu, były ponad 2000 razy wyższe niż wartości MIC. Ponadto w przypadku cefaleksyny

odnotowano stymulujący wpływ tego farmaceutyku na proces formowania biofilmu. Wnioski: Biofilmy

wszystkich badanych szczepów Providencia stuartii, okazały się wysoce oporne na zastosowane prepa-

raty. Stężenia działające bójczo, są zbyt wysokie aby mogły być zastosowane in vivo. Prawdopodobnie

jest to związane z licznymi mechanizmami warunkującymi oporność biofilmu na czynniki antybakteryjne.

II-22 P | Aktywność hemolityczna hodowli biofilmowej Staphylococcus aureus

Pakulska J., Pawełkiewicz A., Sadowska B.

Katedra Immunologii i Biologii Infekcyjnej, Uniwersytet Łódzki, Łódź, Polska

e-mail: asia875@onet.pl

Wstęp: Biofilmy drobnoustrojów – wielokomórkowe, przestrzenne struktury, zanurzone w substancji

polimerowej (EPS), stanowią jedną z dwóch podstawowych form bytowania mikroorganizmów. Coraz

bardziej powszechny staje się pogląd, iż biofilmy, pierwotnie uznawane za formy „przetrwałe”, ściśle

odizolowane od środowiska zewnętrznego, wykazują aktywność metaboliczną i uwalniają produkty, które

mogą wchodzić w interakcje z mechanizmami obronnymi makroorganizmu. Cel pracy: Udowodnienie

aktywności metabolicznej hodowli biofilmowych Staphylococcus aureus na podstawie oceny właściwości

hemolitycznych pohodowlanych przesączy tych drobnoustrojów. Metody: Badaniami objęto przesącza

uzyskane po 4 i 24 godz. od wymiany podłoża w prowadzonych in vitro hodowlach biofilmowych (B)

i planktonowych (HP) szczepów referencyjnych S. aureus (8325-4 i Wood 46) oraz szczepów klinicznych

(α11 i α21). Aktywność hemolityczną przesączy oraz możliwość jej blokowania z użyciem swoistych

47

przeciwciał monoklonalnych przeciwko hemolizynie (HLA) oceniano metodą spektrofotometryczną

z użyciem erytrocytów owcy. Obecność HLA w badanych przesączach potwierdzano metodą Western

Blot. Wyniki: Wykazano aktywność hemolityczną przesączy uzyskanych z hodowli biofilmowych

S. aureus na poziomie podobnym, a w części układów badanych nawet przewyższającym aktywność

odpowiadających im przesączy z hodowli planktonowych tych drobnoustrojów. Przykładowo dla szcze-

pów laboratoryjnych wartość hemolizy indukowanej 24-godz. przesączami HP mieściła się w zakresie

40,4-94,5%, podczas gdy hemoliza erytrocytów pod wpływem adekwatnych przesączy B osiągnęła

wartości w granicach 43,4-95,0%. Warto podkreślić, iż obserwowana aktywność hemolityczna przesączy

zależała przede wszystkim od rodzaju szczepu i czasu prowadzenia hodowli, w mniejszym zaś stopniu

od jej typu (hodowla planktonowa/biofilmowa). Możliwość blokowania aktywności hemolitycznej przesą-

czy za pomocą swoistych przeciwciał oraz detekcja HLA z zastosowaniem metody Western Blot, wskaza-

ły na hemolizynę jako główny czynnik hemolityczny w badanych przesączach. Wnioski: Dostarczenie

bezpośrednich dowodów na obecność hemolizyny w przesączach pohodowlanych gronkowców

pozostających w formie biofilmu wskazuje nie tylko na aktywność metaboliczną przynajmniej części

komórek bakteryjnych tworzących formy osiadłe, ale także dowodzi możliwości przenikania metabolitów

drobnoustrojów przez fizyczną barierę EPS. Z uwagi na znaną aktywność modulacyjną wielu składn i-

ków/metabolitów gronkowców (także badanej hemolizyny) można zakładać interakcję in vivo biofilmów

tych drobnoustrojów z komórkami eukariotycznymi gospodarza. Zatem próby modulacji aktywności

„wydzielniczej” biofilmów bakteryjnych mogą w przyszłości stanowić uzupełniające opcje terapeutyczne

przewlekłych i trudnych do wyleczenia zakażeń z ich udziałem.

II-23 P | Wpływ polifenoli roślinnych na adhezję i tworzenie biofilmu przez szczepy

Staphylococcus aureus

Paszkiewicz M., Sadowska B., Różalska B.

Katedra Immunologii i Biologii Infekcyjnej, Uniwersytet Łódzki

e-mail: mpaszkiewicz7@gmail.com

Wstęp: Staphylococcus aureus należy do najbardziej rozpowszechnionych patogenów człowieka,

powodujących szereg zmian patologicznych o różnym stopniu ciężkości. Poważne, trudne do wyleczenia

przypadki były do niedawna głównie problemem placówek medycznych (szczepy HA-MRSA), jednak

obecnie obserwuje się niepokojącą tendencję do pojawiania się szczepów MRSA w środowiskach

pozaszpitalnych (CA-MRSA, FA-MRSA). Niezwykła lekooporność szczepów tego gatunku i trudności

w uzyskaniu trwałej eradykacji u osób zakażonych mogą być częściowo wyjaśnione jego zdolnością do

tworzenia biofilmu. Te złożone struktury wykazują wielokrotnie wyższą oporność na niesprzyjające

czynniki zewnętrzne (w tym stosowane antybiotyki) w porównaniu z formą planktonową. Koniecznym

staje się więc poszukiwanie nowych źródeł leków wspomagających klasyczną antybiotykoterapię. Cel

pracy: Analiza wpływu wybranych związków należących do polifenoli roślinnych na zdolność szczepów

S. aureus do adhezji i tworzenia biofilmu. Metody: Do badania wybrano dwa izolaty kliniczne S. aureus

MRSA (E4, 948/05) oraz szczep referencyjny ATTC 29213 (MSSA) charakteryzujące się zróżnicowaną

produkcją zewnątrzkomórkowego śluzu (test oceny morfologii kolonii na podłożu Congo Red Agar), co

częściowo determinuje ich zdolność do tworzenia biofilmu. Badania wykonano na trzech związkach

komercyjnych (kwas galusowy, tymol, kwas ursolowy) należących do polifenoli roślinnych, wykazujących

silne działanie bakteriostatyczne (niska wartość MIC) i bakteriobójcze (MBC) wobec danych szczepów

drobnoustrojów. Stopień osłabienia adhezji (1 h) i zahamowania tworzenia biofilmu (24 h i 48 h) oceniono

dla stężeń preparatów równych MIC, ½ MIC oraz ¼ MIC, stosując metodę redukcji MTT. Wyniki: Wyka-

zano, iż przebadane związki polifenolowe osłabiały zdolność drobnoustrojów do adhezji we wszystkich

zastosowanych stężeniach. Najsilniejsze działanie wobec wybranych szczepów S. aureus wykazał kwas

48

ursolowy. Tymol działał silniej niż kwas galusowy w przypadku szczepu E4, tymczasem działanie obu

związków wobec szczepów 948/05 i ATCC 29213 było podobne. Natomiast nie zaobserwowano wpływu

wybranych preparatów komercyjnych (w stężeniach sub-MIC) na tworzenie biofilmu przez dane szczepy

S. aureus. Wnioski: Roślinne związki fenolowe wybrane do badania wykazały zdolność osłabiania

adhezji bakterii z gatunku S. aureus, nie wpłynęło to jednak znacząco na tworzenie przez te drobnoustro-

je biofilmu. Substancje te mimo to stanowią obiecującą grupę alternatywnych czynników przeciwdrobno-

ustrojowych, które przez potencjalny wpływ na właściwości komórek mikroorganizmów mogą zwiększać

efektywność klasycznych antybiotyków.

II-24 P | Immunomodulacyjne właściwości LPS H. pylori w odniesieniu do produkcji cytokin przez leukocyty osób zakażonych i niezakażonych tymi bakteriami

Rudnicka K., Miszczyk E. , Włodarczyk M. , Matusiak A., Walencka M., Chmiela M.

Katedra Immunologii i Biologii Infekcyjnej, Uniwersytet Łódzki

e-mail: rudnicka@biol.uni.lodz.pl

Wstęp: Helicobacter pylori jest głównym czynnikiem etiologicznym choroby wrzodowej żołądka. U ok. 15% zakażonych dochodzi do stanu zapalnego błony śluzowej żołądka, nacieku leukocytarnego oraz produkcji cytokin typu Th1 (IL-2, IL-12, IL-18, TNF-α i IFN-γ). Nadal nie poznano mechanizmów umożli-wiających pałeczkom H.pylori na długotrwałe utrzymywanie się w nabłonku żołądka. Możliwe, że w przewlekłej fazie zakażenia, antygeny bakteryjne modulują odpowiedź immunologiczną prowadząc do jej wyciszenia. Cel pracy: Celem niniejszej pracy była ocena aktywności sekrecyjnej leukocytów krwi obwodowej osób zakażonych: H.pylori(Hp+) i niezakażonych: H.pylori(Hp-), w zakresie produkcji: IFN-γ, IL-12, IL-2 oraz IL-10, po stymulacji lipopolisacharydem (LPS) H. pylori, w odniesieniu do hodowli nie-stymulowanych lub stymulowanych standardowym LPS E. coli. Metody: 44 ochotników objętych bada-niem diagnozowano pod kątem zakażenia H. pylori potwierdzając jego obecność lub brak testem UBT oraz testem ELISA na obecność przeciwciał IgG anty-H. pylori. Leukocyty krwi obwodowej izolowano (Histopaque 1077), stymulowano przez 24 godz. LPS H. pylori typu LeXY(+) lub standardowym LPS E. coli (O55:B5, Sigma). Supernatanty pohodowlane zbadano na obecność cytokin przy użyciu handlo-wych testów ELISA: IFN-γ i IL-2 (Quantikine ELISA, RnD Systems), IL-12 (Human p70 IL-12 Platinum ELISA, eBioscience), IL-10 (EliPair Gen Probe, Diaclone). Wyniki: Stężenie IFN-γ w supernatantach z hodowli prowadzonych w obecności LPS H.pylori było istotnie niże niż w hodowlach niestymulowanych [Hp+(p=0.00003); Hp-(p=0.00006)] lub stymulowanych LPS E.coli [Hp+(p=0.0002); Hp-(p=0.0002)]. IL-2 nie wykryto ani w hodowlach niestymulowanych, ani po stymulacji LPS H.pylori. Natomiast średni poziom IL-2 w hodowlach leukocytów stymulowanych LPS E.coli wynosił odpowiednio: Hp+(271 pg/ml) i Hp-(223 pg/ml). W hodowlach stymulowanych LPS H.pylori, wykryto istotnie więcej IL-10 niż w hodowlach niesty-mulowanych [Hp+(p=0.003); Hp-(p=0.003)] lub stymulowanych LPS E.coli. W żadnej hodowli nie wykryto IL-12. Nie wykazano różnic istotnych statystycznie w poziomie produkcji badanych cytokin pomiędzy supernatantami z hodowlami leukocytów osób Hp+ i Hp-. Wnioski: Wyniki uzyskanych badań mogą sugerować że LPS H.pylori moduluje negatywnie produkcję IL-2 i IFN-γ i nie pobudza produkcji IL-12. Z drugiej strony stymuluje produkcję IL-10-cytokiny o typowym działaniu przeciwzapalnym. Nie można wykluczyć, iż właściwości immunomodulujące LPS H.pylori w zakresie wytwarzania cytokin ważnych dla kształtowania procesów odpornościowych mogą przyczyniać się do ich wyciszenia. ____________________

Praca finansowana ze środków grantu Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego o nr N401 015 136.

49

II-25 P | Ocena ryzyka zakażenia Legionella pneumophila u pacjentów z immunosupresją

Sikora A.1, Kozioł-Montewka M.1,Książek A.2, Grzebalska A.2, Steć A.2, Rudzki S.3, Furmaga J.3,

Paluch-Oleś J.1, Magryś A.1, Wójtowicz M.1, Strzelec-Nowak D.1

1 Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej, Uniwersytet Medyczny w Lublinie 2 Katedra i Klinika Nefrologii, Uniwersytet Medyczny w Lublinie 3 I Katedra i Klinika Chirurgii Ogólnej, Transplantacyjnej i Leczenia Żywieniowego,

Uniwersytet Medyczny w Lublinie

e-mail: agnieszka.sikora24@wp.pl

Wstęp: Pacjenci z przewlekłą niewydolnością nerek i pacjenci po transplantacji nerki charakteryzują się

upośledzeniem kluczowych mechanizmów immunologicznych biorących udział w odpowiedzi na zakaże-

nie bakteriami z rodzaju Legionella. Wynika to z obecności toksyn mocznicowych, które ulegają akumu-

lacji w organizmie w miarę progresji niewydolności nerek oraz leczenia immunosupresyjnego. Ryzyko

zakażenia Legionella w tej grupie pacjentów będzie również w znacznym stopniu determinowane przez

charakter i zakres narażenia środowiskowego. W związku z powyższym pacjenci dializowani oraz po

transplantacji nerki zaliczani są do grupy wysokiego ryzyka zakażenia Legionella. Cel pracy: Celem

pracy było zbadanie częstości występowania przeciwciał przeciwko Legionella pneumophila serogrupy

(SG) 1-7 (IgG, IgM) oraz SG 1 (IgG) u pacjentów dializowanych i pacjentów po transplantacji nerki,

a także analiza powszechnie uznanych czynników ryzyka zakażenia u pacjentów z dodatnimi wynikami.

Materiał i metody: Materiałem do badań były próbki surowicy pobrane od 212 pacjentów dializowanych

i 68 pacjentów po transplantacji nerki oraz od 100 zdrowych osób (grupa kontrolna). Obecność specy-

ficznych przeciwciał klasy IgM i IgG określono metodą immunoenzymatyczną z wykorzystaniem komer-

cyjnych zestawów firmy EUROIMMUN i VIRCELLMICROBIOLOGISTS. Wyniki: W badanej grupie dodatnie

wyniki przeciwciał uzyskano u 20 pacjentów (7.14%). Wśród pacjentów dializowanych przeciwciała

przeciwko L. pneumophila SG 1-7 wykryto u 17 badanych (8.01%), z kolei u chorych po transplantacji

nerki u 3 (4,41%). Przeciwciała klasy IgM stwierdzono u 5 pacjentów dializowanych (3.12%). Dwie klasy

przeciwciał IgM i IgG stwierdzono u jednego pacjenta. Również u jednego pacjenta zostały wykryte

przeciwciała przeciwko SG 1. W wyniku przeprowadzonej analizy statystycznej nie stwierdzono istotnych

różnic miedzy pacjentami a grupa kontrolą w zakresie częstości występowania przeciwciał (p=0.54) oraz

między pacjentami z dodatnimi wynikami i potencjalnymi czynnikami ryzyka. Wnioski: 1) dodatnie wyniki

poziomu przeciwciał u badanych chorych wskazują na kontakt z L. pneumophila w tym SG 1 i zdolność

do odpowiedzi immunologicznej, co w tych przypadkach uchroniło pacjentów przed rozwojem legionello-

zy; 2) biorąc pod uwagę ciężki przebieg i wysoką śmiertelność w chorobie legionistów dodatnie wyniki

przeciwciał, a szczególnie SG 1 powinny skłaniać do poszukiwania źródeł zakażenia w środowisku

pacjentów oraz wykonanie badań określających zdolność do swoistej odpowiedzi komórkowej.

II-26 P | Charakterystyka biochemiczna, biologiczna oraz serologiczna 4 szczepów klinicznych

Proteus sp.

Siwińska M., Sidorczyk Z.

Zakład Mikrobiologii Ogólnej, Uniwersytet Łódzki

e-mail: malgosiw@biol.uni.lodz.pl

Wstęp: Pałeczki Proteus sp., powodują, w sprzyjających warunkach, różnego rodzaju infekcje, głównie

dróg moczowych oraz ran. Najczęściej izolowanym gatunkiem jest P. mirabilis, rzadziej P. vulgaris oraz

P. penneri. Charakterystyczną ich cechą jest zdolność do wzrostu rozpełzłego, która ułatwia bakteriom

kolonizację nowych miejsc. Jednym z istotnych czynników chorobotwórczości tych patogenów jest

lipopolisacharyd. Bakterie posiadające długołańcuchową część O-swoistą LPS uznaje się za bardziej

zjadliwe. Różnorodność budowy struktury łańcucha O-swoistego stanowi podstawę klasyfikacji serolo-

50

gicznej Proteus sp. i obecnie obejmuje 79 serogrup O. Cel pracy: Celem pracy było określenie przyna-

leżności gatunkowej szczepów Proteus sp., zbadanie czy izolaty są formami S czy R, czy mają zdolność

do wzrostu rozpełzłego oraz ustalenie ich przynależności serologicznej do istniejących serogrup O

rodzaju Proteus bądź utworzenie nowych. Metody: Przeprowadzono badania biochemiczne szczepów

przy użyciu testu diagnostycznego API 20E. Wykonano testy S/R - odczyn pseudoaglutynacji w 0,85%

NaCl, test na termostabilność oraz barwienie srebrem po rozdziale w żelu poliakrylamidowym. Zbadano

zdolność badanych szczepów do wzrostu rozpełzłego na stałym podłożu L-bulionowym z dodatkiem

1,5% agaru. Dla wytypowanych do badań serologicznych szczepów otrzymywano LPS, którego reaktyw-

ność sprawdzano za pomocą ELISA z zestawem króliczych surowic odpornościowych, skierowanych

przeciwko szczepom, reprezentującym wszystkie opisane dotychczas serogrupy O Proteus sp. Uzyskane

silne reakcje (powyżej miana 1:32.000) potwierdzano wykonując test Western-blot oraz adsorpcję suro-

wic komórkami bakterii, a następnie sprawdzenie ich reaktywności w ELISA. Wyniki: Określono przyna-

leżność wszystkich badanych szczepów do gatunku P. penneri. Spośród 4 izolatów, 2 okazały się być

formami S, a 2 formami R, co udowodniono wykonując testy S/R. 2 szczepy, które uznano za formy R,

nie wykazały zdolności do wzrostu rozpełzłego, natomiast szczepy, będące formami S, silnie pełzały po

podłożu stałym, dając wzrost na płytce w postaci 6-8 koncentrycznych kręgów. Formy R zostały wyłączo-

ne z dalszych badań, obejmujących typowanie serologiczne, gdyż klasyfikacja serologiczna opiera się na

budowie O-PS, której te izolaty nie posiadają. 2 pozostałe szczepy (S) po przeprowadzeniu szczegóło-

wych badań serologicznych zostały zaklasyfikowane kolejno do serogrupy O17 i O67 rodzaju Proteus.

Wnioski: Serogrupa O17 Proteus sp. jest serogrupą, zawierającą zarówno szczepy P. mirabilis,

P. vulgaris i P. penneri. Serogrupę O67 reprezentują jedynie szczepy należące do gatunku P. penneri.

W skład ich łańcucha O-swoistego LPS wchodzi fosfoetanolamina, której występowanie w tej części LPS

jest unikalne dla rodzaju Proteus.

II-27 P | Występowanie genu kodującego otoczkę alginianową oraz lekowrażliwość szczepów

Pseudomonas aeruginosa opornych na karbapenemy

Bogiel T., Skalski T., Gospodarek E.

Katedra i Zakład Mikrobiologii Collegium Medicum im. Ludwika Rydygiera w Bydgoszczy

Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu

e-mail: tomekchemik@o2.pl

Wstęp: Pałeczki Pseudomonas aeruginosa należą do jednych z najczęściej izolowanych bakterii

z przypadków zakażeń szpitalnych. Naturalna oporność na leki przeciwdrobnoustrojowe oraz nabywanie

oporności na antybiotyki (w tym karbapenemy stosowane jako leki ostatniego rzutu) implikują zaliczenie

tych pałeczek do patogenów alarmowych. W piśmiennictwie pojawiają się informacje o obniżonej zjadli-

wości szczepów tego gatunku opornych na antybiotyki. Jednym z czynników wirulencji jest otoczka

alginianowa kodowana przez geny w większości zlokalizowane w pozycji 3962825–3964135 operonu

algD chromosomu szczepu P. aeruginosa PAO1. Podstawową jej funkcją jest ochrona komórki przed

fagocytozą. Wykazuje ona szczególne powinowactwo do komórek nabłonkowych płuc i ułatwia szczepom

tworzenie biofilmu. Cel pracy: Ocena lekowrażliwości i częstości występowania genu kodującego otocz-

kę alginianową u szczepów P. aeruginosa opornych na karbapenemy oraz porównanie częstości jego

występowania u szczepów izolowanych z różnego materiału klinicznego. Materiał i metody: Badaniem

objęto 120 szczepów P. aeruginosa opornych na karbapenemy. Ich lekowrażliwość oceniano i interpre-

towano zgodnie z zaleceniami KORLD i CLSI, stosując szczep wzorcowy P. aeruginosa ATCC 27853.

W reakcji amplifikacji stosowano DNA wyizolowane z użyciem zestawu Genomic Mini (A&A Biotechno-

logy), zestaw z polimerazą Taq (Solis Biodyne) oraz startery (Integrated DNA Technologies) o sekwen-

cjach 5’→3’, odpowiednio: algD F - ATG CGA ATC AGC ATC TTT GGT - i algD R - CTA CCA GCA GAT

GCC CTC GGC -. Produkty rozdzielano w żelu agarozowym, wybarwiano bromkiem etydyny i oglądano

51

w świetle UV, uznając za wynik dodatni występowanie fragmentu DNA wielkości 1310 pz. Analizę staty-

styczną częstości wystepowania genu algD u szczepów izolowanych z różnego materiału klinicznego

wykonano testem χ2. Za istotne statystycznie uznano różnice występujące przy poziomie istotności

α≤0,05. Wyniki: Wszystkie szczepy były wrażliwe na kolistynę. Najwyższe odsetki szczepów opornych

stwierdzono wobec karbenicyliny (90,0%), tikarcyliny (89,2%) oraz tikarcyliny z kwasem klawulanowym

(86,7%). Występowanie genu algD wykazano ogółem u 112 (93,9%) badanych szczepów. Notowane

różnice w częstości występowania genu u szczepów izolowanych z różnego materiału klinicznego nie

były istotne statystycznie. Wnioski: Nie wszystkie szczepy P. aeruginosa oporne na karbapenemy

posiadają geny kodujące otoczkę alginianową, przez co nie wszystkie mają możliwość jej wytwarzania.

Różnice w częstości występowania genu algD u pałeczek P. aeruginosa izolowanych z różnego materia-

łu klinicznego nie są istotne statystycznie. W leczeniu zakażeń o etiologii tych drobnoustrojów lekiem

z wyboru może być kolistyna.

II-28 | Badanie przeciwbakteryjnych właściwości wybranych rodzajów miodów pszczelich

Sobczak K., Wieczorkiewicz A., Konieczna O.

Sekcja Mikrobiologiczna Studenckiego Koła Naukowego Biologów, Uniwersytet Łódzki, Łódź

sobczakkar@gmail.com

Wstęp: Substancje naturalne od wieków stosowano w medycynie ludowej jako środki lecznicze przeciw-

ko różnym schorzeniom, również o podłożu bakteryjnym. Także dziś ekstrakty z roślin wykorzystuje się

do produkcji leków, suplementów diety czy kosmetyków. Jedną z takich substancji jest miód, który ma

wysoce cenione właściwości lecznicze. Cel pracy: Celem niniejszego projektu jest zbadanie bakteriosta-

tycznej i bakteriobójczej aktywności różnych rodzajów miodów pszczelich. Metody: W badaniach wyko-

rzystano 6 rodzajów miodów pszczelich: z kwiatu pomarańczy, leśny, sosnowy, gryczany, domowy,

naturalny. Zbadano wrażliwość dla 5 gatunków bakterii: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa,

Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Staphylococcus epidermidis. Do porównania właściwości

antybakteryjnych miodów stosowano test mikrorozcieńczeń w bulionie, za pomocą którego oceniamy

MIC miodu (minimalne stężenie hamujące wzrost bakterii). Badanie polegało na zmieszaniu na płytce

polistyrenowej w równej objętości zawiesiny bakteryjnej w podłożu Müellera –Hintona (gęstość 5*105

CFU/ ml) i roztworów miodów rozcieńczonych w różnych stężeniach (v/v) - od 64 % do 0,5 %. Za MIC

uznawano pierwsze stężenie miodu przy którym nie obserwowano wzrostu bakterii. Test umożliwił

również określenie MBC (bakteriobójcze stężenie miodu). Podłoże ze stężeniem MIC i dwa następne

rozcieńczenia przenoszono do podłoża TSB. Po 24 godzinach odczytywano MBC – pierwsze stężenie,

przy którym nie obserwowano wzrostu bakterii. Wyniki: Przeprowadzone badania wykazały, że prawie

wszystkie miody mają właściwości przeciwbakteryjne. Uzyskane wyniki pokazują, że MIC dla 5 z nich

mieści się w granicach 64% - 32%. Najsłabszą aktywność posiada miód z kwiatu pomarańczy, ponieważ

żaden z wykorzystanych w doświadczeniu drobnoustrojów nie był na niego wrażliwy. Spośród badanych

gatunków bakterii to Staphylococcus epidermidis okazał się najbardziej wrażliwy na badane miody. Miód

gryczany okazał się być dla niego najskuteczniejszy - miał właściwości bójcze już w stężeniu 16 µg/ml.

Wnioski: Uzyskane wyniki potwierdzają, iż miód pszczeli posiada składniki wykazujące aktywność

antybakteryjną. Ten fakt ma swoje szerokie zastosowanie w apiterapii, dziedzinie medycyny zajmującej

się leczeniem i profilaktyką schorzeń za pomocą produktów pszczelich.

52

II-29 P/O | Poszukiwanie zwierzęcego rezerwuaru enterokrwotocznych szczepów E. coli (EHEC)

Solecka A., Michałek E., Nawrotek P., Spiżak A., Mól M., Augustyniak A., Fijałkowski K.

Studenckie Koło Naukowe Mikrobiologów, Katedra Immunologii, Mikrobiologii i Chemii Fizjologicznej,

Zachodniopomorski Uniwersytet Technologiczny w Szczecinie

e-mail: mikrobiolodzy@zut.edu.pl

Wstęp: Pałeczki okrężnicy (Escherichia coli) są stałym, naturalnym składnikiem mikroflory jelit ptaków

i ssaków. To pożądane symbionty, współdziałające w utrzymywaniu biologicznej równowagi mikroflory

przewodu pokarmowego. Jednocześnie niektóre spośród nich wywołują schorzenia biegunkowe –

kolibakteriozy. Ze względu na różne mechanizmy zjadliwości związane głównie ze zdolnością do wytwa-

rzania toksyn, patogenne pałeczki E. coli podzielono na grupy, takie jak m.in. enterotoksyczne (ETEC),

enteroagregacyjne (EAEC), czy (jedne z najniebezpieczniejszych) enterokrwotoczne szczepy E. coli

(EHEC), izolowane od zwierząt i ludzi lub z produktów odzwierzęcych. Często też wyosabniane są od

bezobjawowo zakażonych zwierząt. Cel pracy: Celem badań była diagnostyka molekularna ukierunko-

wana na identyfikację wybranych genetycznych markerów zjadliwości charakterystycznych dla chorobo-

twórczych pałeczek okrężnicy, ze szczególnym uwzględnieniem patogenów z grupy EHEC. Materiał

i metody: Materiał badawczy stanowiło 45 szczepów E. coli wyizolowanych od 25 kur z kolibakteriozą

oraz 20 zdrowych owiec. Do oznaczenia wybranych markerów charakterystycznych dla analizowanych

pałeczek, zastosowano testy oparte na metodzie multipleks PCR, PCR-RFLP oraz RAPD-PCR. Wyniki:

W następstwie reakcji amplifikacji zbadano występowanie genów enterotoksyn (LTI, STII) i genu entero-

agregacyjnej toksyny EAST1 oraz dodatkowo genu uspA kodującego uniwersalne białko stresowe

specyficzne dla gatunku E. coli, potwierdzając jednocześnie jego obecność w przypadku wszystkich

badanych szczepów. Geny eltI i estII występowały w DNA 22 szczepów wyizolowanych od kur, natomiast

u 14 wykryto geny astA. Z kolei, obecność genów shigatoksyn (slt) oznaczono w genomie ośmiu

izolatów pochodzących od zdrowych owiec, natomiast w oparciu o metodę PCR-RFLP zróżnicowano te

geny, a tym samym określono ich potencjalną chorobotwórczość dla człowieka. Ponadto, przeprowadzo-

no analizę filogenetyczną zidentyfikowanych pałeczek EHEC slt (+), metodą RAPD-PCR, ustalając

bliższe relacje klonalne jedynie w przypadku czterech szczepów. Wnioski: Zdrowe klinicznie owce mogą

stanowić ważny rezerwuar szczepów EHEC, natomiast pałeczki ETEC i EAEC czynnik etiologiczny

kolibakteriozy kur. Badania z użyciem metod molekularnych znacznie ułatwiają identyfikację i analizę

zjadliwości szczepów E. coli izolowanych od zwierzęcych nosicieli.

II-30 P | Ocena immunomodulacyjnych właściwości Mycobacterium bovis BCG na modelu świnek

morskich zakażonych Helicobacter pylori

Walencka M., Stobieniecka D., Kasińska P., Krupińska A., Matusiak A., Rudnicka K., Chmiela M.,

Rudnicka W.

Instytut Mikrobiologii, Biotechnologii i Immunologii, Uniwersytet Łódzki, Łódź, Polska

e-mail:marwal@biol.uni.lodz.pl

Wstęp: H.pylori jest powszechnym patogenem człowieka występującym u ludzi na całym świecie. Odse-

tek zakażeń spowodowanych przez ten patogen w krajach rozwiniętych sięga 20-40%, a w krajach

rozwijających nawet 80-100%. Obecnie w celu eradykacji patogenu stosuje się inhibitory pompy proto-

nowej w połączeniu z dwoma antybiotykami. Jednak przy tak wysokiej częstości występowania zakażeń

H.pylori, cały czas poszukuje się nowych metod leczenia z zastosowaniem preparatów modulujących

odpowiedź immunologiczną gospodarza, które mogłyby wspomagać antybiotykoterapię lub całkowicie ją

zastąpić. Cel pracy: Celem pracy była ocena właściwości immunomodulujących preparatu Mycobacte-

rium bovis BCG Onko (BCG Onko), stosowanego u pacjentów z nowotworem pęcherza na modelu

53

świnek morskich zakażonych pałeczkami Helicobacter pylori. Oceniono kolonizację błony śluzowej

żołądka świnek morskich szczepionych per os H.pylori oraz BCG-Onko i H.pylori. Metody: Spośród

metod zastosowanych do oceny kolonizacji nabłonka żołądka przez pałeczki H. pylori najskuteczniejsze

okazały się metody za pomocą, których oceniano aktywność enzymów: ureazy, oksydazy i katalazy

wytwarzanych przez ten patogen, barwienie preparatów histologicznych śluzówki żołądka z zastosowa-

niem pierwszorzędowych przeciwciał anty-CagA H.pylori i drugorzędowych przeciwciał znakowanych

HRP oraz chromogenu DAB, a także barwienie pałeczek H.pylori w preparatach tkankowych metodą

pośrednią, z zastosowaniem pierwszorzędowych przeciwciał anty-CagA H.pylori oraz drugorzędowych

przeciwciał znakowanych izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC). W celu stwierdzenia stanu zapalnego

błony śluzowej żołądka badanych zwierząt, wykonywano preparaty cytowirówkowe z treści żołądka

i zeskrobin błony śluzowej żołądka oraz tkankowe preparaty cienkowarstwowe barwione hematoksyliną

Mayera i eozyną. Wyniki: Wykazano obecność pałeczek H.pylori oraz stan zapalny błony śluzowej

żołądka zarówno u zwierząt zakażanych per os H pylori oraz otrzymujących BCG Onko i H. pylori.

Jednakże wykazano, że podanie zwierzętom, przed zakażeniem ich H.pylori, szczepionki BCG-Onko,

spowodowało osłabienie kolonizacji nabłonka żołądka przez pałeczki H.pylori. U takich zwierząt zaob-

serwowano także mniejsze uszkodzenie nabłonka żołądka wskutek rozwoju reakcji zapalnej. Wnioski:

Opracowano model zwierzęcy, który można zastosować w ocenie właściwości immunomodulacyjnych

preparatu M. bovis BCG Onko, w przebiegu zakażenia H.pylori.

____________________

Praca wykona w ramach Grantu KBN nr NN 303451738.

II-31 P | Apoptoza i autofagia – mechanizmy i metody detekcji

Szczęsna E., Rudnicka K., Miszczyk E., Mikołajczyk-Chmiela M.

Katedra Immunologii i Biologii Infekcyjnej, Zakład Gastroimmunologii, Uniwersytet Łódzki

e-mail: ewelina_0709@wp.pl

Wstęp: Apoptoza, przez dekady uważana za jedyny rodzaj programowanej śmierci komórki, pełni

kluczową rolę w utrzymaniu homeostazy organizmu. Wyniki badań, prowadzonych w ostatnich latach,

dowodzą, że w zależności od typu komórki, rodzaju czynnika szkodliwego i jego intensywności komórka

może być kierowana na drogę apoptozy lub ulegać innym, stosunkowo niedawno poznanym typom

programowanej śmierci, np. autofagii. Cel pracy: W oparciu o przegląd najnowszego piśmiennictwa

naukowego z tego zakresu, w niniejszej pracy przedstawiono krótką charakterystykę typów programowa-

nej śmierci komórkowej, ze szczególnym uwzględnieniem apoptozy i autofagii. Analizie poddano mecha-

nizmy oraz metody detekcji tych procesów. Rozpatrzono także potencjalne powiązania pomiędzy pro-

gramowaną i nieprogramowaną śmiercią komórki. Wyniki: Zgodnie z wytycznymi Komitetu do spraw

Nazewnictwa Śmierci Komórkowej – NCCD (Nomenclature Committee on Cell Death), wśród mechani-

zmów obumierania komórek, poza apoptozą, wyróżniono między innymi autofagię, katastrofę mitotyczną,

anoikozę, paraptozę, degenerację Walleriana, entozę oraz keratynizację. Apoptoza to proces zależny od

kaspaz, charakteryzujący się fragmentacją DNA oraz powstawaniem ciałek apoptotycznych. W warun-

kach ograniczonej dostępności substancji pokarmowych autofagia funkcjonuje jako mechanizm prze-

trwania komórki, jednak w wyniku nasilenia warunków stresowych, proces ten może funkcjonować jako

mechanizm śmierci komórki. Autofagia jest z reguły procesem niezależnym od kaspaz, charakteryzują-

cym się powstawaniem autofagosomów. Metodyka wykrywania typów śmierci komórkowej opiera się na

technikach mikroskopowych, służących do obserwacji charakterystycznych zmian morfologicznych oraz

na metodach genetycznych i biochemicznych, umożliwiających wykrycie odpowiednio genetycznych lub

białkowych markerów zewnątrz- i wewnątrzkomórkowych. Wnioski: Pomimo dostępności licznych metod

badawczych, rozróżnienie poszczególnych rodzajów śmierci komórkowej zarówno programowanej, jak

i nieprogramowanej, nadal przysparza trudności. NCCD zaleca stosowanie co najmniej dwóch metod

54

identyfikacji obumarłych komórek, np. mikroskopii i metod biochemicznych, umożliwiających ocenę

różnych markerów danego procesu.

II-32 P | Genotypowanie i identyfikacja czynników wirulencji uropatogennych szczepów

Escherichia coli

Szemiako K., Krawczyk. B.

Katedra Mikrobiologii, Wydział Chemiczny, Politechnika Gdańska, Gdańsk

e-mail: kasjan.sz@wp.pl

Wstęp: Escherichia coli są czynnikiem etiologicznym częstych infekcji pozajelitowych. Ponad 80% z nich

jest wywoływana przez uropatogenne szczepy Escherichia coli (UPEC), które mogą doprowadzić do

bakteriemii bądź sepsy. Cel pracy: Charakterystyka genetyczna szczepów E.coli izolowanych od

pacjentów z urosepsą pod względem występowania czynników wirulencji: fimbrie typu: P, S, 1, Dr,

cytotoksyczny czynnik nekrotyzujący (CNF1), bakteriocyna Usp, α hemolizyna w celu określenia ich

patogenności oraz typowanie genetyczne izolatów w celu zbadania ich transmisji z moczu do łożyska

krwionośnego. Metody: Przebadano pulę 111 izolatów E. coli pochodzących od 29 pacjentów

Gdańskiego Uniwersytetu Medycznego, hospitalizowanych w Klinice Nefrologii, Transplantologii i Chorób

Wewnętrznych oraz Poradni Nefrologicznej. U pacjentów tych stwierdzono sepsę o etiologii E.coli. Izolaty

były pozyskiwane z moczu oraz z łożyska krwionośnego pacjentów. Badania prowadzono

z wykorzystaniem nowoczesnych metod biologii molekularnej opartych o amplifikację techniką PCR

w układzie pojedynczej („simplex PCR”) i złożonej reakcji PCR („multiplex PCR”). Przeprowadzono

również genotypowanie izolatów pochodzących od indywidualnych pacjentów za pomocą techniki PCR

MP (ang. Melting Profile) w celu określenia ich klonalnej dyspersji z moczu do łożyska krwionośnego.

Unikalne wzory „fingerprinting” posłużyły do określenia prawdopodobnego źródła pochodzenia sepsy.

Wyniki: Wszystkie izolaty pochodzące od jednego pacjenta posiadały identyczny wzór „fingerprinting”.

U ponad 94% wszystkich izolatów występował, co najmniej jeden czynnik wirulencji. Najwięcej z nich

posiadało geny odpowiedzialne za produkcję bakteriocyny Usp (80,18 %), najmniej zaś zdolnych było do

syntezy cytotoksycznego czynnika nekrotyzującego (36,94%). U pacjentów po przeszczepie nerki

stwierdzono, że wszystkie izolaty posiadały takie czynniki wirulencji jak: fimbrie typu P i S oraz

bakteriocynę Usp. Izolaty, które zostały określone jednym genotypem (wśród izolatów pochodzących od

jednego pacjenta) w większości przypadków charakteryzowały się identycznym profilem czynników

wirulencji. Wnioski: U wszystkich pacjentów za wyjątkiem jednego doszło do transmisji bakterii z układu

moczowego do krwi. Analizowane czynniki wirulencji są charakterystyczne dla szczepów UPEC,

ponieważ ponad 90% z nich posiadało przynajmniej jeden z badanych czynników. Najczęściej

występującym czynnikiem wirulencji była bakteriocyna Usp, zaś czynnik nekrotyzujący CNF1 występował

w najmniejszej populacji izolatów. Nie można natomiast znaleźć wyraźnych korelacji pomiędzy odsetkiem

występowania poszczególnych czynników wirulencji u kobiet i mężczyzn oraz pomiędzy izolatami

pochodzącymi z krwi oraz z moczu.

II-33 P | Rola systemów naprawy DNA Mycobacterium tuberculosis w infekcji ludzkich

makrofagów prątkami gruźlicy

Szulc I., Klink M., Brzostek A., Kiełbik M., Brzezińska M., Sułowska Z., Dziadek J.

Instytut Biologii Medycznej Polskiej Akademii Nauk

e-mail:iszulc@cbm.pan.pl

Wstęp: Podwójne pęknięcia nici DNA są niebezpieczne dla integralności genomu i jeśli nie są naprawio-

ne prowadzą do śmierci komórki. W naprawach podwójnych pęknięć DNA głównie zaangażowane są

55

dwa systemy: łączenie niehomologicznych końców DNA (NHEJ – non-homological end jojning) oraz

rekombinacja homologiczna. Podstawowymi białkami systemu NHEJ są białko Ku i ligaza D. W rekom-

binacji homologicznej kluczową rolę odgrywa białko RecA. Cel pracy: Celem pracy była ocena czy

mutant (∆KuDRec) z nieaktywnym systemem naprawy podwójnych pęknięć nici DNA różni się w zdolno-

ści do infekcji ludzkich makrofagów w porównaniu do szczepu dzikiego Mycobacterium tuberculosis

H37Rv. Metody: Przygotowano szczep M. tuberculosis H37Rv ze zinaktywowanymi genami kodującymi

białka Ku, LigD i RecA z wykorzystaniem rekombinacji homologicznej polegającej na wymianie natywne-

go genu na gen zmutowany. Komórki linii monocytarno-makrofagowej (THP1), nieaktywowane lub

aktywowane interferonem-γ, zakażano prątkami gruźlicy szczepu dzikiego H37Rv lub jego mutantem

∆KuDRec (nieopsonizowanymi lub opsonizowanymi ludzką surowicą AB). Oceniano fagocytozę i we-

wnątrzkomórkowe zabijanie bakterii oraz produkcję tlenku azotu (NO), reaktywnych form tlenu (RFT)

i czynnika martwicy nowotworu (TNF-α) przez makrofagi. Wyniki: Aktywowane i nieaktywowane makro-

fagi znamiennie mniej pochłaniają mutanta ∆KuDRec w porównaniu do szczepu dzikiego zarówno

w przypadku bakterii opsonizowanych jak i nieopsonizowanych. Wykazano również, że mutant ∆KuDRec

jest efektywniej niż szczep dziki zabijany przez makrofagi. Opsonizowany i nieopsonizowany mutant

∆KuDRec, podobnie jak szczep dziki, stymuluje aktywowane i nieaktywowane makrofagi do produkcji

NO. Zaobserwowano, że badane szczepy hamują produkcję RFT w aktywowanych makrofagach na

zbliżonym poziomie. Wykazano natomiast, że nieopsonizowany mutant ∆KuDRec znamiennie słabiej

hamuje produkcję RFT przez nieaktywowane makrofagi w porównaniu do nieopsonizowanego szczepu

dzikiego. Nie zaobserwowano różnic w zdolności aktywowanych makrofagów do produkcji TNF-α

w odpowiedzi na zakażenie szczepem dzikim i jego mutantem. ∆KuDRec znamiennie słabiej stymulował

nieaktywowane makrofagi do produkcji TNF-α w porównaniu do H37Rv. Wnioski: Uzyskane wyniki

sugerują, że M. tuberculosis z nieaktywnym systemem naprawy podwójnych pęknięć DNA ma osłabioną

zdolność infekcji makrofagów ludzkich.

____________________

Źródła finansowania: „Badania mechanizmów molekularnych na styku organizm ludzki – patogen – czynniki środowiska

(InterMolMed)”, POIG.01.01.02-10-107/09.

II-34 P | Limfocyty T regulatorowe w przebiegu zakażenia ECTV-MOS u myszy BALB/c

Szulc L., Martyniszyn L., Boratyńska A., Niemiałtowski M.

Zakład Immunologii, Katedra Nauk Przedklinicznych, Wydział Medycyny Weterynaryjnej,

Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie

e-mail: lidiaszulc@gmail.com; marek_niemialtowski@sggw.pl

Wstęp: Limfocyty T regulatorowe (Treg) są niejednorodną fenotypowo grupą komórek, odgrywającą

kluczową rolę w supresji i modulacji mechanizmów odpowiedzi immunologicznej. Wykazują ekspresję

cząsteczek CD25, CD122, CD27, a przede wszystkim czynnika transkrypcyjnego FoxP3 (forkhead box

3), który reguluje transkrypcję genów związanych z aktywnością immunoregulacyjną limfocytów. U myszy

czynnik FoxP3 występuje w limfocytach Treg CD4+ i CD8+. Stymulowanie wytwarzania Treg obserwuje

się w licznych zakażeniach wirusowych, np. wirusem krowianki (VACV) oraz wirusem grypy typu A,

w wyniku czego dochodzi do hamowania aktywności cytotoksycznej limfocytów T CD8+. Cel pracy:

Celem niniejszej pracy była ocena udziału limfocytów Treg o fenotypie CD4+CD25+FoxP3+

i CD8+CD25+FoxP3+ w supresji komórkowych mechanizmów efektorowych u myszy BALB/c (H-2d)

podczas zakażenia szczepem Moscow wirusa ektromelii (ECTV-MOS). Metody: Myszy BALB/c zakaża-

no dostopowo wysoce patogennym ECTV-MOS w dawce 50 PFU (jednostek łysinkotwórczych)/mysz.

W 7, 14 i 21 dniu po zakażeniu (d.p.z.) pobierano od myszy drenujące węzły chłonne (DLN) oraz śledzio-

ny i przygotowywano zawiesinę pojedynczych komórek. Do wykrywania czynnika transkrypcyjnego

FoxP3 w limfocytach T CD4+ i T CD8+ użyto zestawu Mouse FoxP3 Buffer Set (BD Pharmingen) zgodnie

56

z zaleceniami producenta. Komórki znakowano fluorescencyjnie za pomocą przeciwciał anty-CD4-FITC

lub anty-CD8-FITC, anty-CD25-PerCP-Cy5.5 oraz anty-FoxP3-PE, zaś trójkolorową analizę przeprowa-

dzono przy użyciu cytometru przepływowego FacsCalibur (Becton Dickinson). Wyniki: W 7 d.p.z. ECTV-

MOS nie obserwowano statystycznie istotnych różnic w odsetku komórek T CD4+ i T CD8+ wykazujących

ekspresję CD25+FoxP3+ w DLN oraz śledzionie myszy BALB/c w porównaniu do wartości uzyskanych

u niezakażonych zwierząt kontrolnych. W 14 d.p.z. odnotowano statystycznie istotne (p ≤ 0,05) zmniej-

szenie odsetka komórek CD25+FoxP3+ w populacji komórek T CD4+ izolowanych z DLN oraz śledzion

myszy BALB/c (odpowiednio 5,62% i 5,47%) w porównaniu do wartości kontrolnych (odpowiednio 7,27%

i 7,71%). Wnioski: We wczesnej fazie zakażenia ECTV-MOS myszy BALB/c limfocyty Treg nie uczestni-

czą w supresji swoistej odpowiedzi komórkowej, co wskazuje na możliwość istnienia innego mechanizmu

regulacyjnego.

II-35 P | Aktywność cytotoksyczna i przeciwwirusowa olejków eterycznych: goździkowego,

jałowcowego, tymiankowego i herbacianego

Kamińska T.1, Paduch R.1, Szuster-Ciesielska A.1, Kandefer-Szerszeń M.1, Żurek A.1, Woźniak A.2

1 Zakład Wirusologii i Immunologii UMCS, Lublin 2 Katedra i Klinika Okulistyki Uniwersytetu Medycznego w Lublinie

e-mail: szustera@hektor.umcs.lublin.pl

Wstęp: Ciągłe zagrożenia chorobami wirusowymi, pojawianie się opornych szczepów wirusowych,

a także nieliczna grupa substancji przeciwwirusowych, zwykle o wąskim spektrum działania, powodują że

wciąż poszukuje się nowych leków przeciwwirusowych. Jeden nurt badań obejmuje syntezę nowych

chemioterapeutyków lub pochodnych już istniejących leków; drugi - to badanie związków pochodzenia

naturalnego, uzyskiwanych głównie z roślin. Cel pracy: Ocena aktywności cytotoksycznej i przeciwwiru-

sowej olejków eterycznych: goździkowego, jałowcowego, tymiankowego i z drzewa herbacianego wobec

wirusów: HHV-1 (Human Herpes Virus-1), VSV (Vesicular Stomatitis Virus) i EMCV (Encephalomyocar-

ditis Virus). Metody: Ocenę toksyczności różnych stężeń olejków eterycznych wykonano metodami MTT

oraz NR (Neutral Red). Badania przeprowadzono na komórkach ludzkiej rogówki (pRSV-T) (ATCC No.

CRL-11515). Wirusobójczą aktywność nietoksycznych stężeń olejków badano metodą in vitro w hodow-

lach ludzkich fibroblastów, w ludzkiej nowotworowej linii SiHa ( EEAA ) oraz komórkach linii L929. Wyni-

ki: Zastosowano stężenia olejków od 0,001% do 2%. Stwierdzono, że olejek z drzewa herbacianego

(IC50=0,46 – MTT; IC50=0,24 – NR) był najmniej toksyczny dla komórek. Wyższą toksyczność wykazał

olejek goździkowy (IC50=0,019 – MTT; IC50=0,013 – NR), zaś najbardziej toksyczny dla badanych komó-

rek był olejek tymiankowy (IC50=0,0047 – MTT; IC50=0,0095 – NR).Aktywność wirusobójcza badanych

olejków zależna jest od ich stężenia. Najsilniejsze działanie wirusobójcze wobec HHV-1 i VSV wykazy-

wał olejek goździkowy, który w stężeniu 1% i 0,5% inaktywował je całkowicie w ciągu jednej godziny

inkubacji w temperaturze pokojowej. Żaden z badanych olejków nie inaktywował EMCV (wirus bez

osłonki); natomiast wszystkie olejki działały w różnym stopniu, zależnym od stężenia, na wirusy osłonko-

we HHV-1 i VSV. Wnioski. Przypuszczamy, że substancje wchodzące w skład badanych olejków ete-

rycznych inaktywują wirusy w wyniku oddziaływania na ich osłonki.

57

II-36 P | Aktywności alpha amylazy pochodzenia grzybowego w przewodzie pokarmowym

młodych świń z zewnątrzwydzielniczą niewydolnością trzustki

Szwiec K.1, Świeboda P.1, Kruszewska D.2,3

1 Wydział Biologii Uniwersytetu Lund, Szwecja 2 Katolicki Uniwersytet Lubelski imienia Jana Pawła II, Lublin, Polska 3 Instytut Medycyny Wsi, Lublin, Polska

e-mail: katarzyna.szwiec@cob.lu.se

Wstęp: Alpha amylaza jest jednym z najważniejszych enzymów trawiennych. Naturalnie występuje

oprócz pokarmu w ślinie, a najwięcej enzymu jest wydzielane przez trzustkę do światła dwunastnicy,

gdzie alfa amylaza osiąga maksymalną aktywność. W przypadku braku lub upośledzonej aktywności alfa

amylazy następuje zaburzenie trawienia węglowodanów. Cel: Celem pracy było określenie odzysku

wprowadzonej doustnie alpha amylazy izolowanej z Aspergillus oryzae (AoA) w próbkach treści przewo-

du pokarmowego świń z chirurgicznie wywołaną zewnątrzwydzielniczą niewydolnością trzustki (EPI).

Metody: Do badań użyto 6 EPI świń oraz 2 zdrowych zwierząt. Wszystkim zwierzętom wprowadzono

kaniule do przetok utworzonych w dnie żołądka, dwunastnicy, jelicie czczym oraz jelicie biodrowym.

Zwierzęta karmiono przez tydzień 2 razy dziennie paszą podstawową wzbogaconą tłuszczem. Ósmego

dnia z kaniul pobrano próbki treści, a następnie podano AoA w paszy wyłącznie EPI świniom, zdrowe

prosiaki karmiono bez dodatku enzymu. Po 5 minutach po podaniu paszy, pobrano drugą próbkę treści

od wszystkich zwierząt, trzecią próbkę natomiast po pół godzinie od rozpoczęcia karmienia. Pozostałe

6 próbek treści pobierano w odstępach godzinnych. W próbkach określano aktywność alfa amylazy

metodą Younga. Wyniki: Najwyższą aktywność alfa amylazy wykryto u EPI zwierząt w próbce z dwu-

nastnicy i żołądka po 5 min od podania AoA z paszą. Po 4 godzinach po karmieniu zaobserwowano

znaczący wzrost aktywności alfa amylazy w próbkach z jelita biodrowego, co świadczy o stabilności AoA.

U zwierząt zdrowych wysoką aktywność alfa amylazy stwierdzono w dwunastnicy po 5 minutach od

rozpoczęcia karmienia świń. W pozostałych segmentach przewodu pokarmowego wykryto niewielką

aktywność enzymu. Wnioski: Zaobserwowano wysoką aktywność AoA w dwunastnicy, obszarze działa-

nia trzustkowej alfa amylazy. AoA wykazała wysoką stabilność i aktywność, w zróżnicowanym co do

odczynu, środowisku przewodu pokarmowego. Proponowany model z użyciem enzymu pochodzenia

grzybowego może być wykorzystany do testowania potencjalnych preparatów w zastępczej EPI terapii.

II-37 P | Wstępna ocena czystości mikrobiologicznej miodów pszczelich dostępnych na rynku

polskim, europejskim i światowym

Śliwińska A., Przybylska A., Bazylak G.

Katedra i Zakład Bromatologii, Wydział Farmaceutyczny, Collegium Medicum im. Ludwika Rydygiera

w Bydgoszczy, Uniwersytet Mikołaja Kopernika, Jagiellońska 13, 85-067 Bydgoszcz

e-mail: gbazylak@cm.umk.pl

Wstęp: Profil mikrobiologiczny stanowi ważne kryterium oceny jakości miodu pszczelego. Pierwotnie

w miodzie występują drożdże i spory bakterii przetrwalnikujących, należących głównie do rodzaju Bacillus

i Clostridium. W miodzie mogą się również znajdować zarodniki grzybów pleśniowych tj.: Aspergillus czy

Penicillium. Źródłem pierwotnych zanieczyszczeń mikrobiologicznych są przede wszystkim pszczoły,

pyłek kwiatowy i nektar. Miód może także zostać zanieczyszczony drobnoustrojami na etapie jego

odbierania i przetwarzania, a nieprzestrzeganie odpowiednich warunków sanitarnych może być przyczy-

ną kontaminacji miodu m.in. bakteriami z rodzaju Escherichia czy Salmonella. Cel pracy: Celem podję-

tych przez nas badań była wstępna ocena jakości mikrobiologicznej wybranych miodów pszczelich

dostępnych na rynku polskim, która obejmowała oznaczenie liczby drobnoustrojów tlenowych (LDT) oraz

liczby drożdży i pleśni (LiDP). Celem pracy było także porównanie wyników badań własnych z publiko-

58

wanymi dotychczas wynikami analiz mikrobiologicznych miodu dostępnego na rynku polskim, europej-

skim i światowym. Metody: Liczbę drobnoustrojów tlenowych oznaczono poprzez posiew na jałowe płytki

Petriego zawiesiny próbek miodu oraz jej dziesięciokrotnych rozcieńczeń. Płytki zalano agarem PCA

i inkubowano w temperaturze 30ºC przez 72 h. W celu oznaczenia liczby drożdży i pleśni wykonano

posiew powierzchniowy zawiesiny wyjściowej i jej dziesięciokrotnych rozcieńczeń na podłoże DG. Płytki

inkubowano w 25ºC przez 120 h. Wyniki: Wykazano, że LDT wahała się od <10 jtk/g w przypadku miodu

spadziowego i faceliowego do 7,0×102 jtk/g w przypadku miodu wielokwiatowego. Według danych

literaturowych wartość LDT wynosiła od <10 jtk/g (portugalski miód kwiatowy) do 4,6×105 jtk/g (miód

akacjowy). Oznaczona LiDP była niewielka i stanowiła mniej niż 10 jtk/g, a w przypadku miodów opisa-

nych w literaturze od <10 jtk/g do 9,0×102 jtk/g (miód rzepakowy). Wnioski: Na podstawie uzyskanych

danych można przypuszczać, że jakość mikrobiologiczna analizowanych miodów dostępnych w Polsce

jest zadowalająca. Problem ten wymaga wykonania dalszych szczegółowych i selektywnych analiz,

szczególnie dotyczących bakterii rodzaju Bacillus i Clostridium, które pozwolą na pełną ocenę profilu

mikrobiologicznego badanych miodów.

II-38 P | Badania rozwoju hiperoksalurii z możliwością zatrzymania i odwrócenia procesu powsta-

wania kamienia zakażonego w nowym modelu zwierzęcym

Świeboda P.1, Szwiec K.1, Rola B.1, Kruszewska D.2

1 Wydział Biologii, Uniwersytet w Lund, Szwecja 2 Wydział Matematyczno Przyrodniczy, Katolicki Uniwersytet Lubelski, Polska

e-mail: paulinaswieboda@op.pl

Wstęp: Jedną z najczęstszych przyczyn infekcji układu moczowego są zakażenia bakteryjne wywołane

głównie przez bakterie ureolityczne. W wyniku zakażenia może dochodzić do przesycenia moczu szcza-

wianami, fosforanami, moczanami i rozwoju kamicy nerkowej. Cel pracy: Celem badań było ustalenie

modelu powstawania odwracalnej hiperoksalurii u rosnących świń w wyniku stosowania diety wzbogaco-

nej w hydroksyprolinę. Użyta do badań trans-4-hydroksy-prolina (HP) jest fizjologicznym prekursorem

szczawianów, pochodną proliny i składnikiem kolagenu. Metody: Dwunastu świniom podawano HP

w diecie w zróżnicowanych dawkach, w stosunku do dziennej porcji paszy. Przez pierwsze 5 dni świnie

otrzymywały HP w stężeniu od 1 do 3%. Następnie przez kolejne 7 dni ich dieta zawierała 4 % HP. W 13

dniu badania zwierzęta podzielono na dwie grupy. Jedna z nich indukowana była nadal przez kolejne

dwa tygodnie 4% HP. Pozostałym sześciu świniom zaprzestano podawania HP.W trakcie doświadczenia

określono poziom szczawianów w moczu i we krwi świń, przy użyciu testu Trinity Biotech (Irlandia)

według Robertson, 1965. Wyniki: W grupie stale karmionej dodatkiem HP wykazano narastanie poziomu

szczawianów w moczu w przebiegu badań. Najwyższe stężenie szczawianów 135 ± 74 mg/24 h wykryto

w moczu w 27 dniu doświadczenia. W grupie świń, której od 13 dnia doświadczenia usunięto HP z diety

odnotowano od tego dnia spadek poziomu szczawianów w moczu. Poziom szczawianów w osoczu był

stabilny i nie różnił się istotnie u zwierząt obydwu grup doświadczalnych. W grupie zwierząt stale induko-

wanych HP wykryto przekrwienia i jamistości w miąższu nerek oraz stwierdzono obecność piasku

i kamieni o zróżnicowanej wielkości. Wnioski: W nowym modelu odwracalnej hyperoksalurii 7 dniowa

ekspozycja zwierząt na 4 % HP nie powoduje trwałych zmian w budowie i aktywności nerki, ponieważ

kolejne dwutygodniowe zaprzestanie podawania HP hamuje i cofa proces dysfunkcji nerki. Ustalenie

nowego modelu odwracalnego rozwoju hiperoksalurii z możliwością zatrzymania i odwrócenia procesu

powstawania kamienia zakażonego może być przydatne do oceny terapii przeciwzakaźnej.

59

II-39 P | Badanie wybranych cech biologicznych kolekcji szczepów klinicznych z rodzaju Proteus

Stańczyk J., Olek J., Konieczna E., Bawej E., Zabłotni A., Siwińska M., Drzewiecka D.

Zakład Mikrobiologii Ogólnej Instytutu Mikrobiologii, Biotechnologii i Immunologii UŁ

e-mail: malgosiw@biol.uni.lodz.pl

Wstęp: Bakterie z rodzaju Proteus zaliczane są do rodziny Enterobacteriaceae – pałeczek jelitowych. Te

Gram-ujemne bakterie są drobnoustrojami warunkowo chorobotwórczymi. P. mirabilis jest gatunkiem

najczęściej izolowanym z zakażeń wywoływanych przez rodzaj Proteus (70-90% infekcji). Bakterie te

najczęściej wywołują zakażenia dróg moczowych, zakażenia uszu, oczu, ran pooperacyjnych i poopa-

rzeniowych. Bakterie z rodzaju Proteus wykształciły różne czynniki chorobotwórczości, dzięki którym

kolonizują wyższy organizm i wywołują w dalszej kolejności proces chorobowy. Do jednych z najważniej-

szych czynników należą m. in. rzęski oraz lipopolisacharyd. Cel pracy: W pracy oceniano zdolność do

wzrostu rozpełzłego oraz częstość występowania formy R i S wśród 165 klinicznych szczepów z rodzaju

Proteus, izolowanych od chorych z regionu łódzkiego. Metody: Zdolność do wzrostu rozpełzłego ocenia-

no na płytkach L-bulionowych z dodatkiem 1,5 % agaru. Płytki posiewano centralnie, płynną hodowlą

szczepu i mierzono promień wzrostu. Formy S i R oceniono na podstawie pseudoaglutynacji w soli

fizjologicznej i testu termostabilności w temp. 100˚C w czasie 2,5 h. Wyniki: Analiza źródła izolacji

badanych szczepów klinicznych z rodzaju Proteus wykazała, że izolowano je głównie z moczu – 44,2%

(73 osoby) oraz ran – 13,3% (22 osoby), rzadziej z ucha, nosa, ujścia z cewnika, odbytu, odleżyn,

nasienia, pochwy czy ran martwiczych stopy. Częściej, bo w 58,9% (96 osób) izolowano te drobnoustroje

od kobiet. Mężczyźni stanowili 41,1% (67 osób) pacjentów. Wśród badanych chorych było 95 osób

powyżej 50 lat i 29 dzieci do 18 roku życia. Gatunkiem najczęściej izolowanym był P. mirabilis – 89,6%

(147 osób), znacznie rzadziej izolowano gatunki P. vulgaris – 4,9% (8 osób) i P. genomospecies 5,5% (9

osób). Wśród badanych szczepów bardzo dobrze pełzało 129 szczepów, słabiej 30 szczepów, a brak

wzrostu rozpełzłego odnotowano u 6 badanych szczepów. Formy S stanowiły 97% (160 szczepów),

formy R tylko 1,2% (2 szczepy), formy „R-wątpliwe” – 1,8% (3 szczepy). Wnioski: Zdecydowana więk-

szość przebadanych szczepów wykazywała intensywny wzrost rozpełzły, cechę charakterystyczną dla

drobnoustrojów z rodzaju Proteus. W większości szczepy te także wytwarzają LPS z rozbudowaną

częścią O-swoistą.

II-40 P | Lekooporne szczepy w mikroflorze odchodów kolonii gawronów

Turska-Szewczuk A.1, Urbanik-Sypniewska T.1, Palusińska-Szysz M.1, Kutkowska J.1, Kucharczyk H.2,

Wasyluk A.1, Zalewska J.1

1 Zakład Genetyki i Mikrobiologii, Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej 2 Zakład Zoologii, Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej

e-mail: aturska@hektor.umcs.lublin.pl

Wstęp: Dziko żyjące ptaki stanowią rezerwuar mikroorganizmów potencjalnie chorobotwórczych dla

ludzi. Największe zagrożenie epidemiologiczne jest związane z ich odchodami, w których przeżywają

bakterie wywołujące schorzenia układu pokarmowego. Ostatnio zaobserwowano wzrost liczby przypad-

ków zakażeń o ciężkim przebiegu, wywołanych lekoopornymi szczepami enterokoków, w których geny

warunkujące wieloraką oporność na antybiotyki są zlokalizowane w integronach. Zagrożenie transmisji

wśród ludności wydaje się realne z uwagi na udowodnioną możliwość przenoszenia tych bakterii między

ptactwem a ludźmi. Cel pracy: W pracy przeprowadzono identyfikację bakterii w odchodach gawronów

(Corvus frugilegus) żerujących na terenie Lublina i 6 innych miejscowości. Badano czy w próbkach

odchodów gawronów pobranych w miejscach zanieczyszczonych odpadkami komunalnymi oraz poza

obszarami synantropijnymi występują szczepy potencjalnie chorobotwórcze i/lub noszące geny lekoopor-

ności. Metody: do selekcji użyto podłoża: Hektoen – różnicujące Enterobacteriaceae, HiCrome i Slanetz-

60

Bartley wybiórcze dla Enterococcus, Chapman - różnicujące dla Staphylococcus oraz Campylosel –

selektywne dla Campylobacter. Do określania fenotypu oporności na metycylinę, wankomycynę oraz

teikoplaninę zastosowano test dyfuzji krążkowej. Wybrane na podstawie fenotypowania szczepy gron-

kowców oporne na metycylinę oraz enterokoków opornych na jeden lub oba antybiotyki glikopeptydowe

badano metodą PCR ze starterami specyficznymi dla genów: mecA (produkty 527 i 310 pz), vanA

(produkt 732 pz) oraz vanB (produkt 647 pz). Wyniki: Badania wykazały, że mikroflora odchodów gawro-

nów jest niezwykle różnorodna. W próbkach najczęściej identyfikowano bakterie z rodzajów Campylobac-

ter, Enterococcus, E. coli i koliformy. W ponad 95% izolatów Staphylococcus opornych na metycylinę

wykryto produkty PCR dla genu mecA. Tak dużej korelacji nie stwierdzono dla glikopeptydoopornych

enterokoków ze względu na większą zmienność genów van. W 130 próbkach pobranych z kolonii lęgo-

wych gawronów identyfikowano w zależności od miejsca od 10 do 30% szczepów gronkowców i entero-

koków opornych na metycylinę lub wankomycynę/teikoplaninę. Wnioski: Odchody powstające w kolo-

niach gawronów żerujących na obszarach zaludnionych i poza nimi są potencjalnym zagrożeniem

oportunistycznymi patogenami bakteryjnymi ze znacznym udziałem szczepów noszących geny wielora-

kiej oporności na antybiotyki aminoglikozydowe i glikopeptydowe.

II-41 P | Wytwarzanie biofilmu przez wieloleokooporne i wielolekowrażliwe szczepy Proteus

mirabilis

Wiśniewska M., Więckowska E., Kwiecińska-Piróg J., Jachna-Sawicka K., Gospodarek E.

Katedra i Zakład Mikrobiologii Collegium Medicum im. L. Rydygiera w Bydgoszczy, Uniwersytet Mikołaja

Kopernika w Toruniu

e-mail: j.kwiecinska@cm.umk.pl

Wstęp: Pałeczki Proteus mirabilis należą do oportunistycznych patogenów człowieka. Są odpowiedzialne

za zakażenia przede wszystkim w obrębie układu moczowego. Dysponują wieloma czynnikami wirulencji,

m. in. zdolnością tworzenia biofilmu. Biofilm baterii ureazo-dodatnich ma specyficzną strukturę, gdyż

zawiera kryształy struwitu. Film bakteryjny uformowany na biomateriałach wprowadzonych do dróg

moczowych może doprowadzić do zamknięcia światła cewnika, czego konsekwencją jest zastój moczu,

sprzyjający groźnym powikłaniom u chorego. U wielu gatunków drobnoustrojów stwierdzono różnice

w tworzeniu biofilmu pomiędzy szczepami wielolekowrażliwymi (MDS) i wielolekoopornymi (MDR).

Natomiast niewiele jest informacji na temat biofilmu P. mirabilis. Cel pracy: Celem pracy było porówna-

nie tworzenia biofilmu przez MDS i MDR szczepy P. mirabilis. Metody: Materiał do badań stanowiło 50

szczepów P. mirabilis z kolekcji Katedry i Zakładu Mikrobiologii Collegium Medicum im. L. Rydygiera

w Bydgoszczy Uniwersytetu Mikołaja Kopernika w Toruniu. Lekowrażliwość oznaczono zgodnie z reko-

mendacjami KORLD i CLSI. Szczepy oporne na trzy lub więcej grup leków przeciwdrobnoustrojowych

włączono do grupy MDR. Biofilm P. mirabilis tworzono w 96-dołkowych płytkach polistyrenowych. W celu

oceny ilościowej zastosowano wybarwianie chlorkiem trifenylotetrazoliowym (TTC), który jest metaboli-

zowany do barwnego formazanu. Natężenie barwy formazanu oceniano spektrofotometrycznie przy

długości fali 490 nm. Dla każdego szczepu wykonano 6 powtórzeń. Kontrolę dodatnią stanowił szczep

Escherichia coli ATTC 25922. Otrzymane wyniki zakwalifikowano do jednej z pięciu kategorii: brak

tworzenia biofilmu, słabe, średnie, silne i bardzo silne tworzenie biofilmu. Przedziały pomiędzy katego-

riami wyznaczono na podstawie średniej dla próby ślepej wraz z odchyleniami standardowymi oraz

wielokrotności otrzymanej wartości. Wyniki: Wszystkie szczepy MDS tworzyły biofilm. Bardzo silne

tworzenie biofilmu wykazano u 21 szczepów MDS i 5 MDR. Spośród 25 szczepów MDR, trzy nie tworzyły

biofilmu. Wykazano istotną statystycznie różnicę w tworzeniu biofilmu między szczepami MDS a MDR

(p=0,0002). Wnioski: Szczepy P. mirabilis MDS silniej tworzą biofilm w porównaniu do szczepów MDR.

61

II-42 P | Działanie bójcze wybranych związków polifenolowych

Więckowska-Szakiel M., Sadowska B., Bartnicka M., Budzyńska A., Różalska B.

Katedra Immunologii i Biologii Infekcyjnej, Uniwersytet Łódzki

e-mail: bsad@biol.uni.lodz.pl

Wstęp: Polifenole to klasa związków posiadających w cząsteczce jeden lub wiele pierścieni aromatycz-

nych, zawierających liczne grupy hydroksylowe. Związki o takiej budowie występują powszechnie jako

metabolity wtórne roślin o znaczeniu ochronnym. Wśród nich ważną grupę stanowią produkty o charakte-

rze fenoli, fenolokwasów oraz flawonoidy. Wiele z nich posiada właściwości antyoksydacyjne, przeciwza-

palne i przeciwdrobnoustrojowe. Założono w niniejszych badaniach wyszukanie wśród dostępnych

komercyjnie preparatów reprezentujących różne klasy polifenoli tych o największej aktywności mikrobój-

czej. Cel pracy: Ocena aktywności przeciwdrobnoustrojowej wybranych polifenolowych preparatów

komercyjnych wobec bakterii: Staphylococcus aureus ATCC 6538, Escherichia coli NCTC 8196 i grzy-

bów Candida albicans ATCC 10231. Weryfikacja parametrów metodycznych. Metody: Wybrane związki

(n=14) poddano skryningowi mikrobiologicznemu, równolegle trzema metodami jakościowo-ilościowymi:

„spot”, dyfuzyjno-krążkową oraz metodą mikrorozcieńczeń w bulionie, wg rekomendacji CLSI. Każdą

z powyższych metod wcześniej zmodyfikowano w celu dostosowania jej parametrów do charakteru

fizyko-chemicznego fitozwiązków. Wyniki: Z grupy badanych preparatów największą aktywnością

stwierdzoną w metodzie dyfuzyjno-krążkowej charakteryzowały się tymol i karwakrol (w stęż. 20, 10

mg/ml strefa zahamowania wzrostu > 30 mm). Kemferol, chlorek pelargonidyny, naringenina, kwas

rozmarynowy, resweratrol wykazywały średniowysoką lub niską aktywność jedynie w stężeniu 20 mg/ml.

W ocenie aktywności biostatycznej fitozwiązków metodą mikrorozcieńczeń w bulionie najsilniejszą

aktywność wykazały kemferol, kwas oleanolowy, kwas ursolowy, karwakrol i tymol. Zakres ich stężeń

skutecznych przeciwdrobnoustrojowo (MIC) wynosił 31,2 -150 g/ml. Wnioski: Spośród badanych

związków najsilniejsze działanie przeciwdrobnoustrojowe wobec szczepów referencyjnych, oceniane

zarówno metodą jakościową (dyfuzji, „spot”), jak i metodą mikrorozcieńczeń, wykazywały kwas ursolowy,

kwas oleanolowy, kemferol, tymol, karwakrol. Część z tych związków skierowano do dalszych badań

mikrobiologicznych mających na celu ocenę aktywności przeciwadhezyjnej i przeciwbiofilmowej. Analiza

otrzymanych wyników wskazuje, iż niezwykle ważna w ocenie skuteczności mikrobójczej produktów

naturalnych tego typu, jest optymalizacja i standaryzacja stosowanych metod badawczych. Obejmuje ona

użycie odpowiedniego rozcieńczalnika związków polifenolowych zapewniającego maksymalny stopień

ich rozpuszczalności, wystandaryzowanie wielkości inokulum drobnoustrojów (nie mniejszego niż stoso-

wane w ocenie skuteczności działania antybiotyków) oraz uwzględnienie interferencji barwy badanych

produktów w interpretacji zastosowanych metod pomiarowych.

II-43 P | Badania aktywności przeciwdrobnoustrojowej ekstraktów roślinnych bogatych

w polifenole

Więckowska-Szakiel M.1, Sadowska B.1, Paszkiewicz M.1, Bartnicka M.1, Podsędek A.2, Dudzińska D.3,

Klepacka A.3, Różalska B.1

1 Katedra Immunologii i Biologii Infekcyjnej, Uniwersytet Łódzki 2 Instytut Biochemii Technicznej, Politechnika Łódzki 3Zakład Zaburzeń Krzepnięcia, Uniwersytet Medyczny w Łodzi

e-mail: bsad@biol.uni.lodz.pl

Wstęp: Znane z doświadczeń etnomedycyny złożone preparaty, takie jak wyciągi i ekstrakty otrzymywa-

ne z różnych części roślin, stają się aktualnie coraz częstszym obiektem badań naukowych. Dominującą

w ich składzie kategorię związków stanowią polifenole, charakteryzujące się szerokim zakresem aktyw-

62

ności: antyoksydacyjną, przeciwalergiczną, przeciwzapalną, przeciwnowotworową, przeciwmiażdżycową.

Badania z ostatnich lat wykazują jeszcze inne ich właściwości, w tym przeciwdrobnoustrojowe. W tym

kontekście, istotnymi zaletami większości związków naturalnych jest ich zwykle niska toksyczność

w stosunku do komórek eukariotycznych oraz działanie mikrobójcze niezależne od profilu lekowrażliwości

patogenów. Tym samym, ekstrakty roślinne mogą mieć potencjalną wartość terapeutyczną w leczeniu

zakażeń, szczególnie jeśli wykażą synergizm z klasycznymi chemioterapeutykami lub w sposób pośredni

przyczynią się do podniesienia odporności przeciwzakaźnej makroorganizmu. Cel pracy: Ocena aktyw-

ności przeciwdrobnoustrojowej 23 ekstraktów uzyskanych z różnych części roślin użytkowych rodzimego

pochodzenia. Metody: Badania skryningowe aktywności mikrobójczej ekstraktów naturalnych prowadzo-

no równolegle metodą dyfuzyjno-krążkową, metodą „spot” i metodą mikrorozcieńczeń w bulionie, zgodnie

z rekomendacjami CLSI. Organizmy docelowe: Staphylococcus aureus ATCC 6538, Escherichia coli

NCTC 8196, Candida albicans ATCC 10231. Wyniki: Wykazano, iż największą wrażliwością na działanie

ekstraktów roślinnych charakteryzowały się S. aureus, a najmniejszą C. albicans. Preparaty uzyskane

z liści rokitnika i borówki czernicy, ziela rozmarynu oraz łusek cebuli żółtej wykazywały wysoką aktyw-

ność wobec S. aureus ATCC 6538, w zakresie stężeń MIC 0,97-1,58 mg/ml. Równie silnym działaniem

wobec E. coli NCTC 8196 charakteryzowały się jedynie ekstrakty z owoców jarząbu górskiego, których

MIC oszacowano na poziomie 2,83 mg/ml. Spośród wszystkich ekstraktów tylko nieliczne, w tym preparat

z ziela rokitnika wykazały aktywność przeciwgrzybiczą wobec C. albicans (MIC=15,57 mg/ml). Wnioski:

Wyniki badań wskazują na zróżnicowaną aktywność przeciwdrobnoustrojową ekstraktów roślinnych

wzbogaconych w związki polifenolowe - wyższą wobec drobnoustrojów Gram-dodatnich niż Gram-

ujemnych. Najmniejszą wrażliwością na działanie zbadanych naturalnych preparatów „polifenolowych”

cechowały się grzyby drożdżoidalne. Ekstrakty o najwyższej aktywności przeciwbakteryjnej przeznaczo-

no do dalszych badań nad wypracowaniem standardów alternatywnego leczenia określonych typów

zakażeń. Badana jest efektywność kombinacji klasycznych chemioterapeutyków z takimi naturalnymi

preparatami o aktywności biobójczej, niegenerującymi oporności patogenów.

II-44 P | Przeciwdrobnoustrojowe działanie ekstraktów z Physalis ixocarpa

Więckowska-Szakiel M.1, Bergier K.2., Budzyńska A.1, Skłodowska M.2, Różalska B.1

1 Katedra Immunologii i Biologii Infekcyjnej, Uniwersytet Łódzki 2 Katedra Fizjologii i Biochemii Roślin, Uniwersytet Łódzki

e-mail: rozab@biol.uni.lodz.pl

Wstęp: Znany impas antybiotykoterapii sprawia, iż wzrasta zainteresowanie roślinnymi związkami

naturalnymi, które mogłyby mieć zastosowanie zarówno w profilaktyce, jak i w leczeniu zakażeń oportu-

nistycznych. Jedną z roślin, której różnorodne właściwości lecznicze cenione są od wieków jest Physalis

ixocarpa (miechunka pomidorowa). Przedstawiciele rodzaju Physalis są bogatym źródłem metabolitów

wtórnych, takich jak witanolidy, fyzaliny, alkaloidy tropanowe i nortropanowe, które charakteryzuje aktyw-

ność biologiczna o niezwykle szerokim spektrum działania, w tym także aktywność przeciwdrobnoustro-

jowa. Cel pracy: Ocena aktywności przeciwdrobnoustrojowej ekstraktów otrzymanych z korzeni, kwia-

tów, liści i owoców miechunki pomidorowej wobec wybranych gatunków bakterii Gram-dodatnich Staphy-

lococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecalis; Gram-ujemnych Pseudomonas

aeruginosa i grzybów Candida albicans. Metody: W badaniach wykorzystano metanolowe ekstrakty

z różnych organów Physalis ixocarpa L. Po odparowaniu metanolu z homogenatu tkanek, suchą pozosta-

łość rozpuszczano w wodzie z dodatkiem alkoholu doprowadzając do stężenia 600 mg/ml. Biostatyczną

aktywność (MIC) uzyskanych preparatów oceniono metodą mikrorozcieńczeń w bulionie wg CLSI (po-

miar spektrofotometryczny), natomiast działanie bakterio- i grzybobójcze (MBC) ekstraktów sprawdzono

metodą ilościowego wysiewu na odpowiednie podłoża hodowlane (po inkubacji inokulum z badanym

preparatem). Wyniki: Wykazano zróżnicowaną aktywność ekstraktów pozyskanych z korzeni, liści,

63

kwiatów i owoców Physalis ixocarpa. Ekstrakt z liści miał działanie hamujące wzrost bakterii w stężeniu

37,5 mg/ml, a wzrost Candida w stężeniu 18,75 mg/ml. Podobną aktywność wykazywał ekstrakt z kwia-

tów, MIC w zakresie stężeń 37,5 - 75,0 mg/ml. Ekstrakty z korzenia i owoców miechunki były natomiast

mniej aktywne - zakres wartości MIC wynosił 75-300 mg/ml. Stężenie ekstraktów z liści i z kwiatów

Physalis ixocarpa wykazujące działanie bakteriobójcze/grzybobójcze było równe wartości MIC lub dwu-

krotnie wyższe od stężenia opisującego MIC. Wnioski: Spośród przebadanych preparatów najlepsze

działanie bakteriobójcze i grzybobójcze wykazywały ekstrakty z liści miechunki. Ustalone stężenia

aktywne przeciwdrobnoustrojowo uznano za stosunkowo wysokie, chociaż zachęcające do kontynuacji

badań. Warto byłoby bowiem dokonać frakcjonowania ekstraktów z liści w celu wydzielenia i identyfikacji

produktów o najwyższej aktywności. Możliwe, że obserwowana stosunkowo niska skuteczność mikrobój-

cza nierozdzielanych ekstraktów Physalis ixocarpa częściowo wynika z przypuszczalnie niewielkiej

zawartości steroli i flawonoidów, znanych ze swojej aktywności w tym zakresie (Agata i wsp., 2010).

II-45 P | Aktywność przeciwbakteryjna dendrymerów polipropylenoiminowych (PPI)

w skojarzonym działaniu z norfloksacyną

Wrońska N.1, Jankowicz A.2, Golaska M.2, Appelhans D.3, Lisowska K.1

1 Katedra Mikrobiologii Przemysłowej i Biotechnologii, Uniwersytet Łódzki 2 Studenckie Koło Biotechnologiczno-Mikrobiologiczne (SKN Bio-Mik) 3 Leibniz Institute of Polymer Research Dresden, Germany

e-mail: nwronska@biol.uni.lodz.pl

Wstęp: Norfloksacyna należy do grupy antybiotyków fluorochinolowych, powszechnie stosowanych

w lecznictwie. Obecnie poszukuje się alternatywnych metod leczenia, które pozwoliłyby na zmniejszenie

terapeutycznej dawki tych antybiotyków. Nową klasą polimerów o obiecujących właściwościach przeciw-

bakteryjnych są dendrymery. Dendrymery polipropylenoiminowe (PPI) są to małe, silnie rozgałęzione,

sferyczne nanopolimery zawierające na powierzchni trzeciorzędowe grupy alkiloamonowe. Cel pracy:

Określenie właściwości przeciwbakteryjnych skojarzonego działania dendrymeru PPI z norfloksacyną

w stosunku do referencyjnych szczepów bakterii: Staphylococcus aureus ATCC 6538 i Escherichia coli

ATCC 25922. Metody: Aktywność przeciwbakteryjną dendrymeru i badanego antybiotyku oznaczano

zmodyfikowaną metodą mikrorozcieńczeń w bulionie, zgodnie z normą NCCLS (National Committee for

Clinical Laboratory Standards). Analiza polegała na pomiarze spektrofotometrycznym gęstości optycznej

hodowli drobnoustrojów z seryjnymi rozcieńczeniami badanych związków na płytkach titracyjnych. Układ

kontrolny stanowiła hodowla bakterii, bez dodatku analizowanych związków. Wyniki: W przeprowadzo-

nych doświadczeniach dendrymer PPI dodawano w stałym stężeniu (50 µM), natomiast norfloksacyna

stosowana była w kilku wariantach stężeń (0,01-1 µg/ml). W badaniach skojarzonego działania dendry-

meru PPI i norfloksacyny wobec E. coli wykazano wyższą aktywność przeciwbakteryjną, w porównaniu

z układem zawierającym sam antybiotyk lub sam dendrymer. Wysoki stopień zahamowania wzrostu

zaobserwowano w każdym z analizowanych stężeń norfloksacyny, jednak efekt był najbardziej widoczny

w przypadku najniższych stężeń antybiotyku. Powyższej zależności nie zaobserwowano dla Gram

dodatniego gronkowca S. aureus. Wnioski: Uzyskane wyniki wskazują, że jednoczesne podanie den-

drymeru i niskich stężeń badanego antybiotyku powoduje wzrost aktywności przeciwdrobnoustrojowej

badanego układu.

64

II-46 P | Określenie aktywności antybakteryjnej anionowego dendrymeru fosforanowego oraz

dendrymeru w skojarzonym działaniu z ciprofloksacyną

Zawadzka K.1, Felczak A.2, Appelhans D.3, Lisowska K.2

1 Studenckie Koło Naukowe Biotechnologiczno-Mikrobiologiczne, Uniwersytet Łódzki 2 Katedra Mikrobiologii Przemysłowej i Biotechnologii, Uniwersytet Łódzki 3 Leibniz Institute of Polymer Research Dresden, Dresden, Germany

e-mail: kasiazawadzka88@gmail.com

Wstęp: Nanotechnologia jest jedną z najdynamiczniej rozwijających się gałęzi nauki. Zajmuje się opra-

cowaniem struktur rzędu wielkości kilku nanometrów, wśród których wyróżnia się dendrymery – makro-

molekuły o regularnej, silnie rozgałęzionej strukturze i kształcie zbliżonym do kuli. Ze względu na swoje

specyficzne właściwości dendrymery znalazły zastosowanie w medycynie m.in. jako nośniki środków

farmakologicznie aktywnych oraz kwasów nukleinowych. Niewiele natomiast wiadomo na temat właści-

wości przeciwdrobnoustrojowych wspomnianych makromolekuł. Większość publikacji w tej dziedzinie

dotyczy dendrymerów kationowych, niewielkim zainteresowaniem cieszą się dendrymery anionowe, które

charakteryzują się znacznie niższą toksycznością. Ciprofloksacyna należy do powszechnie stosowanych

antybiotyków fluorochinolowych, o szerokim spektrum działania wobec bakterii gram-ujemnych. Wzmoc-

nienie działania antybakteryjnego ciprofloksacyny poprzez podanie jej z dendrymerem mogłoby umożli-

wić obniżenie stosowanej dawki antybiotyku. Cel pracy: Ocena aktywności antybakteryjnej anionowego

dendrymeru fosforanowego generacji trzeciej oraz dendrymeru w skojarzonym działaniu z ciprofloksacy-

ną wobec referencyjnych szczepów bakterii E. coli, P. vulgaris i S. aureus. Metody: Aktywność antybak-

teryjną dendrymeru fosforanowego oraz dendrymeru i ciprofloksacyny zbadano zmodyfikowaną metodą

seryjnych rozcieńczeń w podłożu LB, zgodnie z normą National Committee for Clinical Laboratory Stan-

dards, polegającą na pomiarze spektrofotometrycznym gęstości optycznej hodowli drobnoustrojów

z seryjnymi rozcieńczeniami badanych związków. W badaniach wykorzystano stężenia dendrymeru

mieszczące się w zakresie od 0 do 150 μM oraz stałe stężenia ciprofloksacyny odpowiadające dawce

LD50. Wyniki: Przeprowadzone badania wykazały, iż dodatek dendrymeru fosforanowego do hodowli

S. aureus powodował ograniczenie wzrostu badanego szczepu o 20%-30%, w porównaniu do kontroli

biotycznych nie zawierających omawianego związku. W przypadku szczepu P. vulgaris inhibicja wzrostu,

niezależnie od stosowanego stężenia dendrymeru wynosiła 10%. Natomiast w hodowlach E. coli naj-

większe zahamowanie wzrostu drobnoustroju wynosiło ok. 15 %. Jednoczesne zastosowanie antybiotyku

i dendrymeru fosforanowego pozwoliło na zwiększenie aktywności antybakteryjnej testowanych związ-

ków, przy czym efekt ten był najlepiej widoczny w układach zawierających najniższe stężenia dendryme-

ru. W hodowlach zawierających ciprofloksacynę oraz dendrymer w stężeniu 1 μM wzrost szczepów

S. aureus i E. coli był ograniczony odpowiednio o 75% oraz 70%. Wnioski: Uzyskane wyniki wskazują,

że jednoczesne podanie bardzo niskich stężeń dendrymeru fosforanowego i ciprofloksacyny wzmacnia

działanie przeciwdrobnoustrojowe obu związków, co umożliwiałoby obniżenie dawki terapeutycznej

badanego antybiotyku.

65

Sesja III

Wyzwania, nadzieje i nowe kierunki

w biotechnologii i mikrobiologii

środowiskowej

66

67

Wykład plenarny

Pozytywne i negatywne skutki aktywności degradacyjnej drobnoustrojów w środowisku

Długoński J.

Katedra Mikrobiologii Przemysłowej i Biotechnologii, Instytutu Mikrobiologii, Biotechnologii i Immunologii

Uniwersytetu Łódzkiego, ul. Banacha 12/16, 90-237 Łódź

Rozwój cywilizacyjny ostatnich dwóch stuleci doprowadził do daleko idących zmian w otaczającym nas

środowisku. Wytwarzamy coraz więcej różnych produktów, które chcielibyśmy zabezpieczyć przed

destrukcyjnym wpływem drobnoustrojów. Jednocześnie staramy się pozbyć, z możliwie jak najmniejszym

nakładem kosztów, rzeczy już niepotrzebnych, jak i zanieczyszczeń towarzyszących naszej działalności.

Z punktu widzenia obiegu pierwiastków w przyrodzie, są to te same przemiany materii, zachodzące z

udziałem drobnoustrojów. Wyróżniamy tutaj trzy zasadnicze grupy procesów: rozkład substancji pocho-

dzenia naturalnego, biodegradacja szeroko rozumianych ksenobiotyków, przemiany związków nieorga-

nicznych. W każdym z tych obszarów można znaleźć wiele gatunków drobnoustrojów odznaczających

się szczególnie wysoką aktywnością metaboliczną, z jednej strony często niepożądaną (korozja mikro-

biologiczna), z drugiej z powodzeniem wykorzystywaną w procesach przemysłowych, czy ochronie

środowiska. Przykładem mogą być liczne gatunki mikroorganizmów z rodzajów Bacillus, Aspergillus,

Penicillium odpowiedzialne za psucie się żywności oraz wykorzystywane do produkcji amylaz, proteaz,

pektynaz, a także rozkładu ksenobiotyków, czy bakterie Leuconostoc mesenteroides stanowiące poważ-

ne zagrożenie w przemyśle cukrowniczym oraz stosowane do produkcji dekstranu klinicznego. Poznanie

czynników i mechanizmów warunkujących aktywność metaboliczną drobnoustrojów, a tym samym

zdolność do opanowania środowiska, pozwala zarówno na zabezpieczenie się przed ich niepożądaną

działalnością, jak i umożliwia optymalne wykorzystanie mikroorganizmów w różnych dziedzinach działal-

ności człowieka. Zagadnienia te zostaną bliżej omówione w trakcie prezentacji.

Nadesłane streszczenia

III-1 P | Występowanie endosymbiotycznych bakterii w komórkach boczniaka (Pleurotus (Fr.) P.

Kumm)

Adamski M., Pisarska K., Pietr S.J.

Zakład Mikrobiologii Rolniczej, Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu

e-mail: mariusz.adamski@up.wroc.pl

Wstęp: Endosymbionty bakteryjne w komórkach grzybów opisano dla kilku gatunków. Opisywane

bakterie to obligatoryjne endosymbionty, próby ich hodowli na podłożach kończyły się niepowodzeniem

lub były ograniczone czasowo. Wewnątrzkomórkowe bakterie zasiedlające grzyby są opisywane jako

organizmy mające zdolność wiązania wolnego azotu. Zaopatrują w ten sposób gospodarza w przyswa-

jalne związki azotowe i wspomagają jego rozwój. Cel pracy: Celem niniejszej pracy była izolacja endo-

symbiotycznych bakterii zasiedlających komórki boczniaka, analiza zróżnicowania, oraz ocena ich

potencjalnej zdolności do wiązania wolnego azotu. Metody: Przebadano 9 linii boczniaka pochodzących

z kolekcji Katedry Technologii Owoców, Warzyw i Grzybów Uniwersytetu Przyrodniczego w Lublinie.

W celu stwierdzenia obecności endosymbiontów komórki grzybów wybarwiono znacznikiem fluorescen-

cyjnym (Viability/Cytotoxicity Assay Kit for Bacteria, Biotium) i obserwowano przy użyciu mikroskopu

florescencyjnego. W celu izolacji endosymbiontów grzybnia została roztarta w 0,85% NaCl. Zawiesiną

inokulowano zmodyfikowane podłoże TSB zawierające 50 ppm nystatyny. Izolaty poddano analizie

molekularnej z wykorzystaniem technik PCR. Wykorzystano primery SMY-F511 i SMY-F1382 dla

68

markera 16S rDNA oraz PolF i PolR dla genu nifH. Dodatkowo przeprowadzono próbę hodowli izolatów

na różnych podłożach. Wyniki: W obrazie mikroskopowym stwierdzono obecność bakterii wewnątrz

komórek wszystkich linii boczniaka. Z każdej linii uzyskano jeden homogenny izolat. Pośród 9 izolatów

endosymbiontów wyróżniono 6 różnych wielkości produktu PCR (862pz – 2 izolaty, 839pz – 2 izolaty,

809pz – 2 izolaty, 829pz – 1 izolat, 819pz – 1 izolat, 799pz – 1 izolat). Badania z markerem genu nifH we

wszystkich przypadkach dały wynik negatywny. Pojedyncze kolonie endosymbiontów obserwowano

jedynie na podłożu TSA w obecności grzybów lub ekstraktu z grzybni. Wnioski: Obserwowany wzrost

endosymbiontów jedynie w obecności żywej grzybni lub ekstraktów wskazuje na ich bezwzględnie

endosymbiotyczną naturę. Różne wielkości uzyskanego fragmentu 16S rDNA mogą sugerować zróżni-

cowanie badanych izolatów w poszczególnych liniach boczniaka. Brak genu nifH u badanych endosym-

biontów nie potwierdza ich roli w udostępnianiu tego składnika pokarmowego boczniakowi.

III-2 P | Czeremcha amerykańska zmniejsza stopień porażenia liści dębu bezszypułkowego przez

patogenicznego grzyba Microsphaera alphitoides

Bielinis E.1, Robakowski P.1, Kruk M.1, Behnke-Borowczyk J.2, Wiatrowska B.3

1 Katedra Hodowli Lasu, Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu, 2 Katedra Fitopatologii Leśnej, Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu, 3 Katedra Przyrodniczych Podstaw Leśnictwa, Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu

e-mail: bielinis@up.poznan.pl

Wstęp: Czeremcha amerykańska konkuruje w naszych lasach z rodzimymi gatunkami roślin. Dzięki

dynamicznym przyrostom wysokości szybko osiąga przewagę nad sąsiadami. Na siedliskach boru

mieszanego świeżego i lasu mieszanego świeżego rośnie razem z siewkami dębu bezszypułkowego pod

okapem sosny. Sąsiedztwo czeremchy może hamować rozwój wolniej rosnących siewek dębu, a właści-

wości allelopatyczne mogą dodatkowo obniżać ich żywotność. W literaturze i w praktyce hodowli lasu nie

znaleziono przykładów pozytywnych interakcji między siewkami czeremchy amerykańskiej a rodzimymi

gatunkami drzew. Cel: Liście dębu są często atakowane przez patogenicznego grzyba Microsphaera

alphitoides. Grzyb ten najczęściej nie powoduje obumierania całych siewek, ale powtarzające się infekcje

mogą znacznie osłabić ich kondycję. W doświadczeniu kontrolowanym przetestowano hipotezę, że

bliskie sąsiedztwo siewek czeremchy oraz liście tego gatunku dodawane do substratu doniczkowego nie

będą wpływać na stopień porażenia siewek dębu bezszypułkowego przez Microsphaera alphitoides.

Wyniki: Zwiększanie liczby siewek czeremchy amerykańskiej sadzonych w doniczkach razem z siewka-

mi dębu bezszypułkowego spowodowało istotną redukcję liczby siewek oraz liści porażonych przez

Microsphaera alphitoides. Najwięcej siewek z mączniakiem stwierdzono w wariancie z trzema siewkami

dębu (56%), a w wariancie trzy siewki dębu + sześć siewek czeremchy + liście czeremchy było ich

najmniej (3%). Proporcja zarażonych dębów malała wraz z rosnącą liczbą siewek czeremchy w doniczce.

Podobnie zmieniała się proporcja porażonych liści. Najwięcej (35%) było ich w wariancie z trzema

siewkami dębu, a najmniej (6%) w wariancie trzy siewki dębu + sześć siewek czeremchy + liście czerem-

chy. Między pośrednimi wariantami (trzy siewki dębu + liście czeremchy, trzy siewki dębu + trzy siewki

czeremchy i trzy siewki dębu + trzy siewki czeremchy + liście) różnice pod względem procentu porażo-

nych siewek i liści były mniejsze. Wnioski: Porażenie siewek dębu bezszypułkowego przez Microsphae-

ra alphitoides było mniejsze w obecności siewek i liści czeremchy. Mogło to być spowodowane pogor-

szeniem się warunków świetlnych pod okapem siewek czeremchy. Nie można jednak wykluczyć oddzia-

ływania allelochemicznego lotnych związków emitowanych przez liście tego gatunku.

69

III-3 P | Technika dot-blot we wczesnej detekcji zmian w populacji bakterii nitkowatych w osadzie czynnym

Błaszczyk D.1, Bednarek I.1., Sołtysik D.1., Machnik G.2

1 Zakład Biotechnologii i Inżynierii Genetycznej, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach 2 Katedra Farmakologii, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach

e-mail: dblaszczyk@sum.edu.pl

Wstęp: Celem nowoczesnej prewencji pęcznienia osadu czynnego jest działanie na etapie pojawiania się pierwszych oznak zachwiania równowagi ekosystemu, niedostrzegalnych w standardowo stosowa-nych metodach analizy oraz wczesne podjęcie odpowiednich czynności minimalizujących ewentualne straty w wydajności pracy oczyszczalni ścieków. Duża różnorodność i okresowa zmienność w składzie mikrobiologicznym osadu czynnego wyklucza stworzenie uniwersalnych technik detekcji. Metody moleku-larne, m.in. hybrydyzacja DNA, dają możliwość dokładnej analizy eliminującej morfologiczne podobień-stwo drobnoustrojów nitkowatych przy ich genetycznej odmienności oraz wykrycia takich zmian w bioce-nozie osadu, które znacząco wpływają na stan i funkcjonowanie osadu. Cel pracy: Wczesna detekcja modyfikacji składu gatunkowego biocenozy osadu czynnego, monitorowanego sezonowo, ze szczegól-nym uwzględnieniem bakterii nitkowatych z rodzaju Chloroflexi, których zmiana liczebności może prowa-dzić do pęcznienia osadu. Materiały i metody: Hybrydyzacja genomowego DNA z prób osadu czynnego (prawidłowego i spęczniałego) z sondą molekularną, znakowaną w czasie PCR, specyficzną wobec bakterii z rodzaju Chloroflexi, stworzoną na bazie analizy porównawczej in silico zsekwencjonowanych fragmentów genu 16S rRNA bakterii z osadu czynnego. Kolorymetryczna detekcja sond znakowanych biotyną. Wyniki: Klonowanie amplimerów 16S rRNA w układzie prokariotycznym oraz poznanie ich sekwencji umożliwiło analizę porównawczą i wyodrębnienie sekwencji konsensusowej, występującej w próbach pochodzących ze spęczniałego osadu czynnego i w nielicznych próbach osadu prawidłowego. Sekwencja, specyficzna względem bakterii z rodzaju Chloroflexi, posłużyła do otrzymania sondy o długości 304 pz, użytej w dalszym teście hybrydyzacji. Sygnał detekcji sond hybrydyzujących do fragmentu genu 16S rRNA dla prób osadu spuchniętego wykazywał znacznie większą intensywność, w porównaniu z osadem prawidłowym, przy czym jego natężenie różniło się pomiędzy próbami spęcznia-łego osadu. Wnioski: Bakterie z rodzaju Chloroflexi charakteryzuje okresowa zmiana liczebności w osadzie czynnym, a ich obfite występowanie związane jest z jego puchnięciem. Opracowanie specy-ficznych sond oraz optymalnych warunków hybrydyzacji i detekcji daje możliwość interwencyjnej analizy prób osadu czynnego pod kątem pojawiania się wczesnych oznak pęcznienia osadu oraz modyfikacji pracy oczyszczalni ścieków dla uzyskania lepszej wydajności procesu.

III-4 P | Mycobacterium frederiksbergense IN 53: środowiskowy izolat zdolny do równoczesnego

degradowania węglowodorów alifatycznych i aromatycznych

Brzeszcz J.1, Steliga T.2, Kaszycki P.3, Kapusta P.1

1 Zakład Mikrobiologii, Instytut Nafty i Gazu, Kraków 2 Zakład Technologii Eksploatacji Płynów Złożowych, Instytut Nafty i Gazu, Krosno 3 Katedra Biochemii, Uniwersytet Rolniczy w Krakowie

e-mail: brzeszcz@inig.pl

Wstęp: Wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne (WWA), stanowią poważne zagrożenie tak dla

środowiska naturalnego, jak i zdrowia ludzkiego. Jakkolwiek zagadnienia biologicznego oczyszczania

gleb skażonych węglowodorami alifatycznymi są dobrze zbadane, a technologie oparte na zastosowaniu

wyspecjalizowanych mikroorganizmów stosowane od szeregu lat, to skuteczna biodegradacja WWA jest

wciąż sporym wyzwaniem. Ponieważ substancje ropopochodne stanowią z reguły mieszaninę różnego

rodzaju węglowodorów, niejednokrotnie nawet aktywne i zróżnicowane konsorcja mikroorganizmów nie

są w stanie zneutralizować wszystkich zanieczyszczeń. Rozwiązaniem o dużym potencjale wykorzysta-

nia w technologiach bioremediacyjnych wydaje się być poszukiwanie takich mikroorganizmów, które

będą posiadały szlaki metaboliczne umożliwiające równoczesne degradowanie węglowodorów alifatycz-

nych i aromatycznych. Cel pracy: Celem niniejszej pracy było poszukiwanie, izolacja ze środowiska

70

skażonego substancjami ropopochodnymi oraz identyfikacja bakterii wykazujących zdolność do równo-

czesnej degradacji węglowodorów alifatycznych i aromatycznych. Otrzymane izolaty oceniano pod kątem

ich przydatności i możliwości wykorzystania w konsorcjach mikroorganizmów przeznaczonych do likwi-

dacji zanieczyszczeń ropopochodnych w glebie. Metody: Izolacja szczepów prowadzona była na podło-

żach minimalnych z dodatkiem mieszanin wybranych węglowodorów alifatycznych oraz aromatycznych

jako jedynych źródeł węgla. Identyfikacji bakterii dokonywano na podstawie analizy sekwencyjnej genu

16S rRNA oraz standardowych testów biochemicznych. Badano zdolności wzrostu w obecności rozmai-

tych węglowodorów. Jakościowe i ilościowe oznaczanie sumy substancji ropopochodnych (TPH), identy-

fikacja węglowodorów oraz ilościowe i jakościowe oznaczanie zawartości węglowodorów alifatycznych

i aromatycznych prowadzono metodą chromatografii gazowej z detektorem FID. Ocena stopnia biode-

gradacji substancji ropopochodnych dokonywana była przy użyciu biomarkera 17α(H),21α(H)-hopan.

Wyniki: Wyizolowano i zidentyfikowano szczep bakteryjny Mycobacterium frederiksbergense IN53, który

efektywnie rozkładał zarówno węglowodory alifatyczne, jak i aromatyczne. Szczep posiada zdolności

wykorzystywania jako jedynego źródła węgla nC10-nC22 oraz węglowodorów aromatycznych: antracenu,

bifenylu i naftalenu. Obecność szczepu w konsorcjum mikroorganizmów wpłynęła korzystnie na proces

usuwania węglowodorów alifatycznych i aromatycznych w glebie skażonej substancjami ropopochodny-

mi. Wnioski: Uzyskane wyniki świadczą o celowym dla biotechnologii środowiska, poszukiwaniu szcze-

pów mikroorganizmów, posiadających aktywne szlaki metaboliczne degradacji węglowodorów alifatycz-

nych i aromatycznych.

III-5 P | Wytwarzanie enzymów celulolitycznych, proteolitycznych i chitynolitycznych przez

myksobakterie wyizolowane z gleby leśnej

Brzezińska A.J., Dahm H.

Zakład Mikrobiologii, Instytut Biologii Ogólnej i Molekularnej,

Uniwersytet Mikołaja Kopernika, ul. Gagarina 9, 87-100 Toruń

e-mail: ajbrzez@doktorant.umk.pl

Wstęp: Myksobakterie to mikroorganizmy charakteryzujące się wieloma niezwykłymi cechami, które

sprawiają, że są one najbardziej skomplikowanymi prokariota spośród dotychczas poznanych. Wykazują

one aktywność enzymatyczną szczególnie w rozkładzie biologicznych makromolekuł. Niektóre z tych

organizmów rozkładają celulozę, inne są drapieżcami - żywią się atakując inne mikroorganizmy (eubakte-

rie, drożdże, grzyby strzępkowe) za pomocą tzw. „taktyki wilków”. Atakują ofiary poprzez wydzielenie

przez duże grupy komórek związków dyfuzyjnych, które zabijają i rozkładają ofiary znajdujące się w ich

sąsiedztwie. Ze względu na wysoką aktywność enzymatyczną, która wpływa na regulację jakościowo -

ilościową populacji różnych mikroorganizmów, myksobakterie odgrywają znaczącą rolę w przyrodzie.

Wzbudzają coraz większe zainteresowanie jako producenci enzymów litycznych, proteaz, celulaz oraz

bakteriocyn i lektyn. Cel pracy: Celem niniejszej pracy było zbadanie aktywności enzymatycznej (celulo-

litycznej, proteolitycznej i chitynolitycznej) trzydziestu szczepów myksobakterii wyizolowanych z gleby

leśnej, wyselekcjonowanie z tej grupy myksobakterii szczepów o wysokiej aktywności enzymatycznej

i wykorzystanie ich do dalszych badań. Metody: Aktywność celulolityczna myksobakterii zbadano wg

metody Cai i in. (1994). Aktywność chitynolityczna myksobakterii zbadano metodą Jyh-Ping Chen i Maw-

Shyan Lee (1994). Aktywność proteolityczna myksobakterii zbadano metodą wg Hazena (1965). Wyniki:

Dotychczas wykazano, że zbadane szczepy myksobakterii nie wytwarzały enzymów chitynolitycznych.

Syntetyzowały natomiast, w większości przypadków, celulazy i proteinazy.

71

III-6 P | Skrining różnych gatunków drożdży pod względem zawartości polisacharydów ściany

komórkowej o właściwościach funkcjonalnych

Bzducha-Wróbel A., Błażejak S.

Katedra Biotechnologii, Mikrobiologii i Oceny Żywności, SGGW w warszawie

e-mail: anna_bzducha_wrobel@sggw.pl

Wstęp: Polisacharydy izolowane ze ściany komórkowej drożdży, takie jak β(1,3)-/ β(1,6)- glukan i man-

noproteiny, wykazują szereg właściwości funkcjonalnych, zarówno pod względem prozdrowotnym, jak

i technologicznym. Proponowane są jako suplement diety, przede wszystkim ze względu na stymulację

odpowiedzi immunologicznej w organizmie ludzi i zwierząt. Prozdrowotne oddziaływanie tych polimerów

polega także na wiązaniu szkodliwych substancji chemicznych i aktywności przeciwdrobnoustrojowej.

Ponadto stanowią naturalny błonnik pokarmowy o charakterze prebiotycznym. Prowadzone są również

badania nad ich właściwościami hydrokoloidowymi. Obecnie najdokładniej poznanym gatunkiem pod

względem budowy ściany komórkowej są drożdże Saccharomyces cerevisiae, podstawowe źródło

otrzymywania polisacharydów drożdżowych na skalę przemysłową. Cel pracy: Z powyższych względów

podjęto badania, których celem było określenie zawartości i przybliżonego składu polisacharydów ściany

komórkowej różnych gatunków drożdży. Metody: Materiałem badawczym było siedem szczepów droż-

dży, tj. Saccharomyces cerevisiae R9, Saccharomyces boulardii, Candida utilis (ATTC9950 i KKP 344),

Yarrowia lipolytica (KKP 322 i KKP 379 oraz Kluyveromyces fragilis R11. Preparaty ścian komórkowych

uzyskiwano na drodze autolizy komórek drożdży. Poddawano je następnie frakcjonowaniu w warunkach

alkalicznych na poszczególne polisacharydy. Frakcje nierozpuszczalne w zasadach trawiono enzyma-

tycznie celem oddzielenia β(1,6)-glukanu od β(1,3)-glukanu. Uzyskane frakcje hydrolizowano, oznaczając

następnie cukry redukujące metodą kolorymetryczną z odczynnikiem DNS. Wyniki: Badane szczepy

drożdży charakteryzowały się podobną zawartością ściany komórkowej (ok. 30% suchej biomasy droż-

dży). Zawartość cukrów ogółem w badanych preparatach stanowiła 30 - 57%, odpowiednio w przypadku

Kluyveromyces fragilis R11 i Yarrowia lipolytica KKP 379. Najwyższy sumaryczny udział β-glukanów

wykazały drożdże Saccharomyces cerevisiae R9 (ok. 71%) oraz Yarrowia lipolytica KKP 322 i KKP 379

(tj. ok. 55 i 58%). Jednocześnie dwa ostatnie gatunki odznaczały się najwyższą zawartością β(1,6)-

glukanu we frakcji polimerów β-D-glukopiranozy, co świadczy o wyższym stopniu rozgałęzienia łańcu-

chów β-glukanu.Najbogatsze w mannoproteiny okazały się preparaty otrzymane z drożdży Candida utilis

(ok. 74% dla obu badanych szczepów), Kluyveromyces fragilis (ok. 72%) oraz Saccharomyces boulardii

(ok. 68%). Wnioski: Badane drożdże mogą stać się nowym źródłem polisacharydów o przemysłowym

i medycznym znaczeniu. Dalsze prace powinny być ukierunkowane na przeprowadzenie dokładniejszej

charakterystyki izolowanych polimerów, określenie aktywności prozdrowotnej i próbę intensyfikacji ich

biosyntezy.

III-7 P | Ocena wpływu wybranych szczepów drożdży Saccharomyces cerevisiae na fermentację

hydrolizatów lignocelulozowych

Dziekońska U., Patelski P.

Zakład Technologii Spirytusu i Drożdży, Wydział Biotechnologii i Nauk o Żywności, Politechnika Łódzka

e-mail: urszula.dziekonska@dokt.p.lodz.pl

Wstęp: W ostatnich latach coraz większe zainteresowanie wzbudzają biopaliwa, zwłaszcza biopaliwa II

generacji, wytwarzane m.in. z surowców lignocelulozowych. W celu przeprowadzenia celulozy zawartej

w surowcu do cukrów prostych stosuje się rożne rodzaje hydrolizy, głównie z zastosowaniem agresyw-

nych odczynników chemicznych. Otrzymane w ten sposób hydrolizaty zawierają poza cukrami fermento-

wanymi przez drożdże także związki będące produktami rozkładu kompleksu lignocelulozowego, które

wpływają hamująco na fermentację alkoholową. Dobór drożdży, zdolnych do efektywnej fermentacji

72

hydrolizatów wydaje się być kluczowym etapem w produkcji bioetanolu II generacji z surowców lignocelu-

lozowych. Cel pracy: Celem podjętych badań była ocena przydatności wybranych szczepów drożdży

Saccharomyces cerevisiae do wydajnej fermentacji hydrolizatów lignocelulozowych. Metody: W bada-

niach wykorzystano szczepy drożdży Saccharomyces cerevisiae D2, M6, M2 oraz Bc-16 pochodzące

z kolekcji Zakładu Technologii Spirytusu i Drożdży PŁ. Czyste kultury drożdży przeszczepiono ze skosu

do płynnego podłoża YPG (48h/30ºC), przeniesiono następnie do 3x150ml YPG, hodowlę prowadzono

na wytrząsarce przez 48h w 30ºC. Po tym czasie biomasę odwirowano, przemyto dwukrotnie sterylną

solą fizjologiczną i zawieszono w 100ml soli fizjologicznej. Tak otrzymane mleczko drożdżowe służyło do

zaszczepienia hydrolizatów. Hydrolizaty lignocelulozowe otrzymano przez zastosowanie hydrolizy

kwasowej oraz hydrolizy enzymatycznej (z wykorzystaniem komercyjnego preparatu celulolitycznego)

poprzedzonej wstępną obróbką kwasową. Po fermentacji oznaczono zawartość alkoholu, wykorzystanie

cukrów oraz wydajność procesu. Fermentacje prowadzono przez 5 dni w temperaturze 30ºC, kontrolując

ubytki masy poszczególnych prób w celu oznaczenia dynamiki. Po zakończonej fermentacji oznaczono

zawartość alkoholu w próbach, oraz obliczono wydajność fermentacji Wyniki: Wióry brzozowe odznacza-

ły się zawartością celulozy na poziomie 51,39% s.s. Zastosowanie hydrolizy kwasowej doprowadziło do

uwolnienia 12,36g/l cukrów redukujących, natomiast hydroliza enzymatyczna z zastosowaniem preparatu

Accellerase 1500, poprzedzona wstępną obróbką kwasową doprowadziła do uwolnienia 23,31 g/l sub-

stancji redukujących. Najlepszą, blisko 80%, efektywność procesu zaobserwowano po fermentacji

hydrolizatu kwasowo-enzymatycznego z użyciem szczepu M6. Najniższą efektywność odnotowano

w przypadku szczepu D2 po fermentacji hydrolizatu otrzymanego metodą kwasową: wykorzystane

zostało jedynie 53% cukrów. Testowane szczepy kończyły fermentacje w czasie do 120 godzin, najkrót-

szym okresem zafermentowania odznaczał się szczep M6 (25 godzin), dla pozostałych szczepów czas

potrzebny na zafermentowanie wynosił około 30 godzin. Wnioski: Wykazano, że badane szczepy

wykazywały niezbyt wysoką efektywność w fermentacji hydrolizatów lignocelulozowych, co mogło być

spowodowane obecnością substancji toksycznych. Najlepsze wyniki uzyskano dla szczepu M6, dla

którego zarówno wydajność alkoholu jak i wykorzystanie cukrów były najwyższe.

III-8 P | Analiza morfologiczna komórek Candida albicans poddanych działaniu ekstraktu

z pelargonii (Pelargonium zonale)

Fiołka M.1, Chromy K.1, Ptaszyńska A.2, Wydrych J.3

1 Zakład Immunologii Bezkręgowców, 2 Zakład Botaniki i Mykologi,i 3 Zakład Anatomii Porównawczej i Antropologii, Instytut Biologii UMCS, Lublin, Polska

e-mail: mfiolka@poczta.onet.pl

Wstęp: Powszechne stosowanie antybiotyków o szerokim spektrum, w terapii chorób bakteryjnych, może

prowadzić do zaburzeń w organizmie i pojawienia się grzybicy. Kandydoza, zwana również drożdżycą

jest najczęściej wywoływana przez grzyby z rodzaju Candida (C. albicans, C. glabrata, C. crusei,

C. parapsilos, C. tropicalis), ale głównie przez Candida albicans. Szacuje się, że w krajach rozwiniętych

na tę chorobę cierpi powyżej 30% populacji, a obecnie tego typu infekcje są 15 razy częstsze niż 15 lat

temu. Wzrosła również śmiertelność z powodu zachorowania na drożdżycę w grupie osób wysokiego

ryzyka (chorujących na białaczkę, zespół zaburzeń odporności, AIDS oraz noworodków zakażonych

przez matkę). Stosowane w leczeniu antybiotyki, oprócz bakterii chorobotwórczych, eliminują bakterie

które spełniają pozytywną rolę w organizmie. Efektem tego jest zaburzenie równowagi między korzyst-

nymi bakteriami, a grzybami z rodzaju Candida, co prowadzi do groźnej choroby jaką jest kandydoza. Cel

pracy: Rozwój nowych strategii zapobiegania i leczenia grzybic jest jednym z najważniejszych wyzwań,

jakie stawia się współczesnej nauce. Dlatego istotne jest poszukiwanie nowych, naturalnych źródeł

aktywności przeciwgrzybowej. Do takich źródeł zalicza się ekstrakty z pelargonii, które od dawna stoso-

73

wane są przez afrykańskich uzdrowicieli w leczeniu kaszlu, biegunek, gruźlicy, a także wielu innych

dolegliwości. W ostatnich latach odkryto także działanie przeciwgrzybowe ekstraktów z korzeni pelargo-

nii, głównie przeciwko C. albicans, C. glabrata oraz C. crusei. Metody: Ekstraktem z pelargonii (Pelargo-

nium zonale) działano na komórki C. albicans (szczep dziki). Morfologię komórek obserwowano

w mikroskopie konfokalnym bez barwienia (stosowano laserowy skan dwuwymiarowy w technice kontra-

stu Nomarskiego) oraz z zastosowaniem fluorochromu Calcofluor- white. Ponadto przeprowadzano

obserwacje przy użyciu mikroskopu skaningowego Tescan Vega oraz analizę aktywności metabolicznej

komórek testem LIVE/DEAD Yeast Viability Kit. Wyniki: Po inkubacji C. albicans z ekstraktem (16 μg/ml

białka) przez 48 godzin w 37°C obserwowano zwiększone zdolności adhezyjne komórek, tworzenie

agregatów wielokomórkowych z wyraźnie pogrubioną ścianą w miejscu połączenia komórek, tworzenie

dużej ilości pseudostrzępek różnej grubości, często występujące formy filamentowe

z charakterystycznymi pączkami oraz komórki olbrzymie. Aktywność metaboliczna C. albicans była

obniżona. Wnioski: Ekstrakt z pelargonii zawiera bioaktywne komponenty o działaniu przeciwgrzybo-

wym. Wykazuje aktywność przeciwko Candida albicans zmieniając morfologię komórek. Jest obiecują-

cym źródłem pozyskania preparatu przeciwgrzybowego.

III-9 | Charakterystyka wybranych właściwości mikrobiologicznych osadu z oczyszczalni ścieków

mleczarskich

Frąc M., Oszust K., Rutkowska A.

Instytut Agrofizyki Polskiej Akademii Nauk, ul. Doświadczalna 4, 20-290 Lublin 27

e-mail: m.frac@ipan.lublin.pl

Wstęp: Utrzymanie równowagi w funkcjonowaniu agroekosystemu i zapewnienie odpowiedniego pozio-

mu produkcji rolnej wymaga oceny zachodzących zmian właściwości mikrobiologicznych i biochemicz-

nych gleb, ale również ciągłego monitorowania właściwości odpadów, zwłaszcza osadów ściekowych,

wprowadzanych do środowiska glebowego. Osady ściekowe mogą być źródłem różnego typu ksenobio-

tyków, czynników inhibujących, toksycznych oraz drobnoustrojów potencjalnie chorobotwórczych. Dlate-

go też ocena stanu mikrobiologicznego odpadów wprowadzanych do gleb, jak również ich składu che-

micznego jest niezwykle istotna biorąc pod uwagę aspekty zdrowotne, jakość plonów oraz ochronę

środowiska. Cel pracy: Celem przeprowadzonych badań była ocena wybranych właściwości mikrobiolo-

gicznych osadu, pochodzącego z oczyszczalni ścieków mleczarskich oraz charakterystyka zdolności

metabolicznej osadu pod kątem wykorzystania różnorodnych substratów węglowych. Metody: Badaniami

objęto osad ściekowy, pochodzący z oczyszczalni ścieków mleczarskich w Krasnymstawie. Badania

obejmowały ocenę wybranych właściwości mikrobiologicznych osadu: aktywność dehydrogenaz –

metodą Thalmanna, aktywność respiracyjną metodą Grewelinga i Peecha oraz ogólną liczebność bakterii

i grzybów strzępkowych metodą wysiewu rozciańczeń, stosując odpowiednie podłoża mikrobiologiczne.

W niniejszych badaniach oceniono również stan sanitarny odpadów, zidentyfikowano rodzaje dominują-

cych grzybów oraz scharakteryzowano skład chemiczny odpadów. Identyfikację grzybów przeprowadzo-

no w oparciu o ocenę makroskopową i mikroskopową szczepów w mikrokulturach. Ocena zdolności

metabolicznej osadów została określona z wykorzystaniem systemu BIOLOG Ecoplates. Jako kontrolę

zastosowano sterylny osad ściekowy. Wnioski: W badanym osadzie nie stwierdzono obecności bakterii

z rodzaju Salmonella oraz jaj pasożytów przewodu pokarmowego (ATT). Zawartość metali ciężkich

kształtowała się na bardzo niskim poziomie, istotnie niższym w porównaniu do obowiązujących norm.

Aktywność dehydrogenaz, respiracyjna oraz liczebność bakterii i grzybów strzępkowych kształtowała się

na wysokim poziomie w badanym osadzie. Grzyby wyodrębnione z badanego odpadu należały do

następujących rodzajów: Penicillium sp., Candida sp., Trichophyton sp. oraz Aspergillus sp.

____________________

Praca naukowa finansowana ze środków budżetowych na naukę w latach 2010-2013 jako projekt badawczy.

74

III-10 P | Aktywność enzymatyczna ektomikoryz Pinus sylvestris i Picea abies na podłożu

bogatym w metale toksyczne

Janik P.1, Kowalski S.2, Turnau K.1

1Instytut Nauk o Środowisku, Uniwersytet Jagielloński, Kraków 2Katedra Fitopatologii Leśnej, Uniwersytet Rolniczy, Kraków

e-mail: paulina.janik@uj.edu.pl

Wstęp: Ektomikoryza, rodzaj symbiozy mutualistycznej roślin z grzybami, nie tylko zapewnia roślinie

dostateczną ilość związków mineralnych, ale także chroni je przed patogenami, suszą czy metalami.

Z tego względu, symbioza ta jest szczególnie istotna na obszarach o podwyższonej zawartości metali

ciężkich. Gatunki i szczepy grzybów mikoryzowych różnią się pod względem tolerancji/oporności na

metale toksyczne. Niezbędna jest zatem selekcja odpowiednich symbiontów mikoryzowych w celu

opracowania skutecznych metod fitoremediacji. Cel pracy: W ramach niniejszej pracy porównano

aktywność enzymatyczną mikoryz utworzonych przez cztery szczepy ektomikoryzowe (Hebeloma

crustuliniforme, Suillus lutues, Paxillus involutus oraz Rhizopogon roseolus) oraz witalność aparatu

fotosyntetycznego Picea abies oraz Pinus sylvestris na podłożu z hałdy ołowiowo-cynkowej oraz na

piasku (kontrola). Metody: Pomiar aktywności enzymatycznej ektomikoryz (enzymów: fosfatazy,

-glukozydazy i chitynazy) wykonano metodą mikropłytkową wg. Pritsch et al. (2005, 2011), natomiast

pomiar fluorescencji chlorofilu a oraz ocenę parametrów aparatu fotosyntetycznego przy użyciu aparatu

Handy PEA i analizę testu OJIP. Wyniki: Analizy wykazały, że zarówno w przypadku aktywności enzy-

matycznej jak i fotosyntetycznej, u niemal wszystkich badanych gatunków istnieją statystycznie istotne

różnice w zależności od podłoża. Zaobserwowano negatywny wpływ podłoża hałdowego na aktywność

enzymatyczną grzybów i witalność roślin. Wyjątek stanowił układ Pinus sylvestris/Hebeloma crustulini-

forme. Tylko w tym przypadku, zarówno pomiar fotosyntezy, jak analiza enzymatyczna wykazały wyższe

wartości na podłożu zawierającym metale toksyczne niż w warunkach kontrolnych. Dodatkowo, wartości

enzymu fosfatazy były cztero- do siedmiokrotnie wyższe w porównaniu z pozostałymi gatunkami i enzy-

mami. Wnioski: Przeprowadzone badania potwierdzają przydatność H. crustuliniforme w fitoremediacji

hałd Zn-Pb. Analiza enzymatyczna mikoryz i pomiar fluorescencji chlorofilu stanowią dobry test selekcji

odpowiednich partnerów symbiozy.

III-11 P | Gleba z terenu byłych zakładów produkcji barwników „Boruta” w Zgierzu jako źródło

grzybów dekoloryzujących barwniki przemysłowe

Jasińska A.1, Pieniak A.2, Zawada I.2, Paraszkiewicz K.1, Długoński J.1

1 Katedra Mikrobiologii Przemysłowej i Biotechnologii Uniwersytetu Łódzkiego 2 Studenckie Koło Biotechnologiczno-Mikrobiologiczne „SKN Bio-Mik” BiOŚ UŁ

e-mail: ajas@biol.uni.lodz.pl

Wstęp: Barwniki dostające się do środowiska naturalnego w postaci ścieków przemysłowych stanowią

zagrożenie dla wszystkich organizmów. Szczególnie niekorzystne są barwniki azowe, ponieważ powsta-

jące pochodne często działają toksycznie i mutagennie. Zazwyczaj do eliminacji barwników stosowane

są metody fizykochemiczne. Jednakże coraz większym powodzeniem cieszą się efektywne i tanie

techniki biologiczne. Cel pracy: Celem pracy było określenie zdolności do eliminacji barwników przemy-

słowych przez grzyby strzępkowe wyizolowane z gleby pochodzącej z terenu zakładu „Boruta” w Zgierzu.

Metody: Zbadano zdolność 4 szczepów grzybowych: IM 6471, IM 6480, IM 6482 oraz IM 6491 do

dekoloryzacji 5 barwników oznaczonych symbolami: AO7, BB9, BV10, DB22, DB86. Wstępną ocenę

przeprowadzono podczas wzrostu grzybów na podłożu stałym Czapek–Dox z dodatkiem 50 mg/l danego

barwnika. Po 14 dniach inkubacji mierzono średnicę kolonii oraz średnicę strefy przejaśnienia wokół

75

grzybni. W kolejnym etapie oceniano przebieg eliminacji barwników (10 mg/l) podczas wzrostu w podłożu

płynnym Czapek-Dox. Po 96 godzinach hodowli próby wirowano, biomasę grzybni suszono i ważono.

W uzyskanych płynach pohodowlanych mierzono absorbancję przy długości fali właściwej dla danego

barwnika. Dekoloryzację (D) roztworów barwnika obliczono według wzoru: D[%]=[(A0–At)/A0]*100%,

gdzie: At – absorbancja próby badanej, A0 – absorbancja kontroli abiotycznej. Wyniki: Wszystkie badane

grzyby podczas wzrostu na podłożu stałym charakteryzowały się wysoką tolerancją wobec użytych

barwników. Największe ograniczenie wzrostu (około 40%) wyznaczono dla szczepu IM 6482 hodowane-

go w obecności barwników: AO7 oraz BB9. Wykazano, że izolaty IM 6480, IM 6482 oraz IM 6491 zdolne

są dekoloryzacji wszystkich barwników. Do kolejnego etapu wybrano 2 grzyby: IM 6480 oraz IM 6491,

zdolne do całkowitej eliminacji przynajmniej 3 barwników. W hodowlach płynnych szczep IM 6480 deko-

loryzował z wydajnością >80% tylko 1 barwnik. Równie wysoką efektywność w stosunku do 3 barwników

wyznaczono dla szczepu IM 6491. Stwierdzono także, że szczep IM 6491 usuwa z wysoką wydajnością

(>50%) oba badane barwniki azowe: AO7 i DB22. Obserwacja widm absorbancji nie wykazała obecności

dodatkowych maksimów pochłaniania światła, co wskazuje na eliminację barwników bez wytworzenia

barwnych pochodnych. Wnioski: Uzyskane wyniki wskazują na duży potencjał szczepu IM 6491 do

dekoloryzacji barwników, w tym opornych na mikrobiologiczną degradację barwników azowych. Dalsze

badania będą zmierzać do opracowania nowej, efektywnej metody eliminacji tej grupy związków ze

ścieków.

III-12 P | Izolacja glebowych szczepów z rodzaju Bacillus zdolnych do produkcji biosurfaktantów

Jasińska A.1, Rudnicka K.2, Cichocka O.3, Gawłowska M.3, Janowski A.3, Ponichtera M.3,

Paraszkiewicz K.1

1 Katedra Mikrobiologii Przemysłowej i Biotechnologii Uniwersytetu Łódzkiego

2 Zakład Gastroimmunologii Uniwersytetu Łódzkiego

3 Studenckie Koło Mikrobiologiczno –Biotechnologiczne „SKN Bio-Mik” BiOŚ UŁ

e-mail:ajas@biol.uni.lodz.pl

Wstęp: Biosurfaktanty to związki powierzchniowo czynne, pochodzenia biologicznego. Wykazują zdol-

ność do obniżania napięcia powierzchniowego, ułatwiają tworzenie emulsji i pian, a jednocześnie

w porównaniu do syntetycznych odpowiedników są mniej toksyczne i łatwiej ulegają biodegradacji.

Szczepy wielu gatunków Bacillus są zdolne do syntezy biosurfaktantów, głównie cyklicznych lipopepty-

dów. Do takich związków należy m.in.: surfaktyna, iturin i fengicyna. Związki te często wykazują działanie

przeciwdrobnoustrojowe. Cel pracy: Celem projektu była izolacja glebowych szczepów Bacillus zdolnych

do syntezy związków powierzchniowo czynnych oraz opracowanie schematu postępowania z wykorzy-

staniem szybkich metod izolacji drobnoustrojów środowiskowych zdolnych do produkcji biosurfaktantów.

Metody: Badaniu poddano glebę pobraną w z terenu parku im. J. Matejki w Łodzi. Zawiesinę gleby

w roztworze soli fizjologicznej wytrząsano z jałowymi perełkami szklanymi w temp. 80C przez 20 minut.

Próby z rozcieńczeń 10-3 i 10-4 wysiewano na płytki z 5% dodatkiem krwi owczej. Hodowle prowadzono

przez 72 godziny w temp. 28C. Czyste kultury izolowano z dużych, płaskich kolonii otoczonych strefą

hemolizy. Wyizolowane szczepy poddano analizie mikroskopowej stosując barwienie met. Grama oraz

badano z wykorzystaniem testów biochemicznych w celu wykluczenia obecności szczepów B. anthracis.

Zdolność szczepów do produkcji biosurfaktantów oceniono stosując płyny pohodowlane otrzymane z 72-

godzinnych hodowli płynnych. W badaniach wykorzystano szczep referencyjny B. subtilis DSM 3257

zdolny do produkcji surfaktyny, 5% roztwór SDS (syntetyczny surfaktant), mineralny olej silnikowy oraz

kerosen. Porównano szybkość wykonania i precyzję odczytu wyników 4 testów do wykrywania obecności

biosurfaktantów: oil spreading technique, aktywność emulsyfikacji, drop collapsing test oraz microplate

test. Wyniki: Wyizolowano 59 kolonii bakteryjnych hemolizujących. Badanie mikroskopowe potwierdziło,

że 22 szczepy to przetrwalnikujące laseczki Gram-dodatnie. Na podstawie testów biochemicznych

76

potwierdzono przynależność szczepów do rodzaju Bacillus oraz wykluczono izolację Bacillus anthracis.

Za najbardziej przydatny do wstępnego wykrywania biosurfaktantów uznano tzw. microplate test. Dla

siedmiu szczepów uzyskano przynajmniej 1 dodatni wynik w testach aktywności powierzchniowej, w tym

dla 2 szczepów (oznaczonych symbolami IM B47 oraz IM B54) aktywność ta była wyższa, w odniesieniu

do szczepu referencyjnego oraz roztworu syntetycznego surfaktanta. Wnioski: Efektem powyższej pracy

było opracowanie schematu badania przesiewowego w kierunku środowiskach szczepów bakterii

z rodzaju Bacillus, zdolnych do produkcji związków czynnych powierzchniowo. Ponadto, wykazano, że

dwa spośród 22 izolatów środowiskowych posiadają zdolność produkcji biosurfaktantów.

III-13 P | Właściwości antagonistyczne drożdży killerowych Willopsis saturnus wobec wybranych

patogenów roślin

Jaworski S.

Samodzielny Zakład Biologii Mikroorganizmów SGGW

e-mail: jaworski.slawek@gmail.com

Wstęp: Drożdże killerowe są mikroorganizmami, które wydzielają glikoproteinowe lub białkowe toksyny,

które zabijają wrażliwe komórki tego samego lub pokrewnego gatunku. Optymalna temperatura biosynte-

zy większości białek killerowych mieści się w przedziale 20-24°C, a optymalnym pH dla ich aktywności

jest przedział 4,2-5,0. Produkcja substancji o charakterze toksyn związana jest z obecnością wewnątrz

ich komórek wirusów, prionów, transpozonów plazmidów.Cel pracy: W niniejszej pracy oceniono

aktywność antagonistyczną drożdży Willopsis saturnus na wybrane patogeny roślin uzyskane z Instytutu

Hodowli i Aklimatyzacji Roślin w Młochowie i SZBM SGGW. Metody: Oznaczenia aktywności antagoni-

stycznej W. saturnus w stosunku do bakteryjnych szczepów testowych wykonano metodą dyfuzyjną –

stucienkową. Płytki inkubowano w temp. 30o C przez 24 godziny. Po tym czasie obserwowano pojawienie

się stref zahamowania wzrostu. W przypadku ich obecności zmierzono wielkość strefy hamowania przy

użyciu miarki milimetrowej.Dla grzybów z rodzaju Fusarium i Phytophtora wykonano oznaczenie ilości

suchej masy grzyba po okresie 14 w dni hodowli stacjonarnej. Hodowla każdego z gatunków prowadzona

była w trzech kombinacjach: a) pożywka zawierająca 5% objętościowych supernatantu z dwudniowej

hodowli Willopsis saturnus na podłożu YPG; b) pożywka zawierająca 10% objętościowych supernatantu

z dwudniowej hodowli Willopsis saturnus na podłożu YPG; c) kontrola bez supernatantu (czysta pożyw-

ka). Wyniki: Przeprowadzone badania pozwoliły stwierdzić, że bakterie tj. Klebsiella pneumoniae oraz

Pseudomonas aeruginosa pozostają obojętne na toksynę wytwarzaną przez W. saturnus. Wrażliwość

wykazują na nią jednak patogeny roślin : Pectobacterium carotoworum, Pectobacterium atrosepticum,

odpowiadające za mokrą zgniliznę ziemniaka, a także Erwinia chrysanthemii. Przy badaniu wrażliwości

szczepów na toksynę udowodniono również, że nie ma istotnej różnicy statystycznej w zależności czy

dodajemy hodowlę drożdży, czy sam płyn pohodowlany. Wnioski: W oparciu o własne doświadczenia

oraz dane literaturowe można wyciągnąć nastepujące wnioski: a) drożdże W. saturnus produkują toksynę

killerową w fazie logarytmicznego wzrostu, b) toksna killerowa traci aktywność w podwyższonej

temperaturze (ponad 25° C), c) zdecydowana większość badanych szczepów bakterii oraz izolatów

grzybowych okazała się wrażliwa na toksynę, co stwarza możliwość jej praktycznego wykorzystania

w procesach biokontroli.

77

III-14 P/O | Nanosrebro w kosmetykach i produktach chemii gospodarczej – fakt czy chwyt

marketingowy?

Juś K., Kujawa E., Mocek M., Piechocka J.

Katedra Biochemii i Mikrobiologii, Uniwersytet Ekonomiczny w Poznaniu

e-mail: martyna.mocek@gmail.com

Wstęp: Nanotechnologia jest obecnie najbardziej obiecującym polem do tworzenia nowych rozwiązań

technologicznych. Ze wszystkich nanoproduktów to właśnie nanosrebro wydaje się najbardziej interesu-

jącym ze względu na swoje właściwości. Po rozdrobnieniu srebra do rozmiarów 1- 5 nm, jego cząstki

nabywają bakterio- i grzybobójcze właściwości. Srebro posiada zdolność do wiązania się z grupami

tiolowymi, co hamuje oddychanie bakterii, ograniczając przez to możliwość ich namnażania i przeżywa-

nia. Prostota zastosowania tych właściwości oraz stosunkowo niska cena zaowocowała coraz częstszą

i powszechniejszą obecnością nanosrebra w życiu codziennym. Cel pracy: Celem przeprowadzonych

doświadczeń była ocena właściwości bakterio- i grzybobójczych wybranych produktów zawierających

nanosrebro wobec drobnoustrojów skórnych. Metody: W doświadczeniach wykorzystano sześć produk-

tów zawierających nanosrebro: żel pod prysznic, szampon, mydło, płyn do dezynfekcji blatów kuchen-

nych, płyn do impregnacji tkanin i płyn do zwalczania przykrego zapachu obuwia. Wymienione produkty

pochodziły od różnych producentów. Przeciwdrobnoustrojowe właściwości produktów oznaczano metodą

studzienkową i krążkową. Dla poszczególnych preparatów wyznaczono również wartość MIC (Minimal

Inhibitory Concentration) wobec badanych drobnoustrojów metodą seryjnych rozcieńczeń z rezazuryną

jako wskaźnikiem metabolicznej aktywności mikroorganizmów. Wyniki: Najszersze spektrum bakterio-

i grzybobójcze wykazał preparat do butów, hamujące rozwój C. albicans, B. megaterium, S. aureus oraz

S epidermidis. Szampon oraz żel wykazywał najsilniejszą aktywnosć względem B. megaterium,

P. aeruginosa i C. albicans. Mydło w niewielkim stopniu hamowało wzrost B. megaterium i S. aureus.

Pozostałe badane preparaty tj. płyn do dezynfekcji blatów i płyn do impregnacji tkanin nie wykazywały ani

antybakteryjnego ani antygrzybicznego działania wobec testowanych mikroorganizmów. Wyniki takie

uzyskano zarówno stosując metodę studzienkową jak i krążkową. Wnioski: Przeprowadzone obserwacje

potwierdziły, że nanosrebro posiada właściwości bakteriobójcze i grzybobójcze. Większość badanych

preparatów hamowała w największym stopniu wzrost bakterii Bacillus megaterium oraz grzyba Candida

albicans. Bardzo istotny jest wybór metody badania, ponieważ, jak wykazały przedstawione doświad-

czenia, wyniki uzyskiwane za pomocą różnych metod nie zawsze są porównywalne.

III-15 P | Immunomodulujące i tolerogenne właściwości mlecznych produktów fermentowanych

Kaliszewska A., Wróblewska B., Świątecka D., Chudzik-Kozłowska J., Ogrodowczyk A.

Instytut Rozrodu Zwierząt i Badań Żywności Polskiej Akademii Nauk w Olsztynie

e-mail: a.kaliszewska@pan.olsztyn.pl

Wstęp: Alergia pokarmowa na białka mleka krowiego jest najczęstszą postacią alergii pokarmowej.

Występowanie w początkowej fazie życia IgE-zależnej reakcji alergicznej na białka mleka krowiego

zwiększa ryzyko wystąpienia utrwalonej postaci alergii pokarmowej, może być przyczyną rozwoju na-

stępczych reakcji nadwrażliwości pokarmowej i kontaktowej, a także reakcji ze strony układu oddecho-

wego. Dotychczas jedynym sposobem zapobiegawczym jest usunięcie z diety alergika mleka i jego

przetworów, co wiąże się bezpośrednio ze zubożeniem diety w ważne źródło wapnia i białka. Stąd też

istotne jest „nauczenie” organizmu tolerowania białek zawartych w mleku, czyli pobudzenie naturalnego

układu odpornościowego w kierunku prawidłowego regulowania odpowiedzi immunologicznej organizmu.

Cel pracy: Podstawowym celem badań była weryfikacja hipotezy czy mleczne produkty fermentowane

(jogurt i kefir), charakteryzujące się obniżoną immunoreaktywnością oznaczoną in vitro posiadają zdol-

ność modulowania wybranych mechanizmów immunologicznych u osobników z alergią pokarmową na

78

białka mleka krowiego. Metody: Badania przeprowadzono z użyciem modelu zwierzęcego (myszy), które

wprowadzano w potencjalny stan alergii pokarmowej na białka mleka krowiego. Zwierzęta otrzymywały

analizowane produkty tolerogenne w określonej dawce. Po zakończeniu doświadczenia izolowano

komórki ze śledziony i oznaczano, metodą EliSpot, komórki wydzielające IgA oraz IgG, ponadto po

stymulacji komórek antygenami mleka, w mediach oznaczano testem ELISA, mediatory wzbudzania

mechanizmów stanów alergicznych oraz tolerancji. Wyniki: Uzyskane wyniki wykazały zróżnicowane

możliwości wzbudzania odpowiedzi immunologicznej w zależności od zastosowanego fermentowanego

produktu mlecznego, głównie od kompozycji szczepionek mleczarskich, jak i obecności różnych pepty-

dów i innych metabolitów wynikających z aktywności bakterii fermentacji mlekowej. Wnioski: Zastoso-

wanie mlecznych produktów fermentowanych wydaje się być zasadne u osobników z alergią pokarmową

na białka mleka krowiego, z uwagi na obecność w nich hydrolizowanych białek, o obniżonej immunoreak-

tywności. Ponadto, prawdopodobnie dochodzi do stymulacji komórek regulujących odpowiedź układu

odpornościowego z komponentami ścian komórkowych drobnoustrojów. Niezbędna jest kontynuacja

badań opierająca się między innymi o analizę aktywacji komórek regulatorowych i sprawdzenie obecno-

ści w jelitach bakterii kultur starterowych.

____________________

Autor otrzymał stypendium współfinansowane przez Unię Europejską w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego.

III-16 P | Konsorcja drobnoustrojów, przeznaczone do poprawy jakości surowców ceramicznych

Kaszycki P.1, Kłapkowska P.1, Kasprowicz A.2, Białecka A.2, Wyszomirski P.3, Międzobrodzki J.4

1 Katedra Biochemii, Wydział Ogrodniczy, Uniwersytet Rolniczy w Krakowie, 2 Centrum Badań Mikrobiologicznych i Autoszczepionek im. dr Jana Bobra w Krakowie 3 Katedra Technologii Ceramiki i Materiałów Ogniotrwałych, Wydział Inżynierii Materiałowej i Ceramiki, Akademia Górniczo-Hutnicza w Krakowie 4 Zakład Mikrobiologii, Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii, Uniwersytet Jagielloński

e-mail: p.kaszycki@ogr.ur.krakow.pl

Wstęp: Występowanie zanieczyszczeń organicznych w surowcach ilastych jest problemem, stanowią-cym poważne ograniczenie w przemyśle ceramicznym. Objawia się głównie negatywnym wpływem na takie właściwości wypalonego produktu, jak wytrzymałość mechaniczna i występowanie nieestetycznych, ciemnych przebarwień. Aby uzyskać poprawę jakości materiałów i dostosować je do wymagań przemy-słowych, stosuje się szereg zabiegów chemicznych i fizycznych. Ostatnio proponuje się wykorzystanie aktywnych mikroorganizmów, zdolnych do skutecznej biodegradacji frakcji organicznej w surowcach ceramicznych. Cel pracy: Celem badań było wykazanie przydatności wielogatunkowych, bioróżnorod-nych konsorcjów drobnoustrojów pro- i eukariotycznych do mikrobiologicznego wzbogacania surowców ilastych. Na skutek silnej presji selekcyjnej w środowisku iłów zaszczepiona mikroflora podlegała adapta-cji, a biomasa drobnoustrojów rozwijała się dzięki przyswajaniu ksenobiotyków. Metody: Doświadczenie prowadzono w skali laboratoryjnej, z wykorzystaniem zwilżonych iłów umieszczonych w specjalnych pojemnikach. Próby surowca zaszczepiano aktywnymi mikroorganizmami wariantowo, wykorzystując trzy różne typy konsorcjów: (1) biopreparat ZB-01, wytworzony w Katedrze Biochemii i zawierający wyspecja-lizowane drobnoustroje środowiskowe zdolne do bioremediacji skażeń organicznych, (2) konsorcja wyhodowane na bazie autochtonów wyizolowanych bezpośrednio z surowców ilastych oraz (3) bioprepa-rat hybrydowy, powstały przez zintegrowanie mikroorganizmów obu wymienionych biocenoz. Test trwał 14 tygodni, podczas których monitorowano skład i liczebność mikroflory oraz analizowano zawartość fazy organicznej w iłach. Wyniki: Potwierdzono możliwość wykorzystania biocenoz drobnoustrojów allochto-nicznych i autochtonicznych do wzbogacania surowców ceramicznych. W każdej z prób, po zaszczepie-niu, liczebność drobnoustrojów była wyższa, niż w testach kontrolnych, wskazując na przyswajanie i bioremediację ksenobiotyków. Analizy zawartości substancji organicznej w wybranych próbach pokaza-

79

ły, że biopreparat ZB-01 posiadał najwyższą zdolność degradacji zanieczyszczeń (spadek o ok. 60%), mniejszym potencjałem charakteryzował się biopreparat hybrydowy (spadek o 27%), najmniejszym zaś (10%) - biopreparat autochtoniczny. Wnioski: Konstrukcja i hodowla aktywnych biocenoz z wykorzysta-niem wyspecjalizowanych drobnoustrojów środowiskowych otwiera możliwość opracowania nowatorskich biotechnologii pozwalających zwiększyć przemysłową przydatność ilastych surowców ceramicznych poprzez biologiczny rozkład frakcji organicznej. Uzyskane wyniki uzasadniają pogląd, że nowe metody mikrobiologicznego wzbogacania iłów będą konkurencyjne w porównaniu z dotychczas stosowanymi konwencjonalnymi sposobami przeróbki.

III-17 P/O | Wpływ czynników Nod na kiełkowanie i wzrost wyki oraz wydajność symbiozy

w układzie Rhizobium leguminosarum bv. viciae – Vicia villosa cv. Wista

Kidaj D., Wielbo J., Skorupska A.

Department of Genetics and Microbiology, M. Curie-Sklodowska University, Lublin, Poland

e-mail: dominika.maj@poczta.umcs.lublin.pl

Wstęp: Symbioza roślin motylkowatych z rizobiami, wiążącymi N2, zapewnia roślinom dodatkowe źródło

azotu uniezależniając ich uprawę od stosowania sztucznego nawożenia azotowego. W procesie symbio-

zy rizobia zakażają system korzeniowy roślin motylkowatych, tworzą brodawki, wewnątrz których reduku-

ją niedostępny dla roślin azot atmosferyczny do amoniaku. Interakcja roślina motylkowata – rizobia jest

specyficzna. Określone gatunki roślin nawiązują symbiozę tylko z wybranymi gatunkami rizobiów. Partne-

rzy rozpoznają się wymieniając specyficzne sygnały molekularne. Roślinne flawonoidy aktywują tran-

skrypcję rizobiowych genów nod w wyniku czego syntetyzowane są chitolipooligosacharydy, zwane

czynnikami Nod. Sekrecja czynników Nod powoduje aktywację roślinnych białek (nodulin), syntezę nici

infekcyjnych, indukcję podziałów komórek kory korzenia oraz powstawanie zawiązków brodawek. Cel

pracy: Celem pracy było zbadanie możliwości przyspieszenia procesu nawiązania symbiozy między

wyką (Vicia villosa cv. Wista) a R. leguminosarum bv. viciae GR09 przez traktowanie nasion i siewek

wyki mieszaniną rizobiów z izolowanymi czynnikami Nod lub wyłącznie czynnikami Nod. Metody: I)

Izolowane czynniki Nod, syntetyzowane przez szczep RvGR09, podano w różnych stężeniach (10-9 – 10-

13 M ) na nasiona wyki. Badano wpływ swoistego czynnika Nod na kiełkowanie nasion i długość kiełkują-

cego korzenia. II) Zbadano wpływ czynników Nod na wzrost i brodawkowanie wyki w warunkach konku-

rencji z bakteriami autochtonicznymi w glebie. Doświadczenie przeprowadzono w Instytucie Uprawy

Nawożenia i Gleboznawstwa w Puławach. Nasiona wyki moczono w roztworze czynników Nod ( 10-10 M)

i zakażano szczepem RvGR09 znakowanym plazmidem pJB21Tc z genem gusA. Po 6 tygodniach

rośliny ważono i liczono brodawki korzeniowe. Korzenie barwiono na obecność β-glukuronidazy. Wyniki:

I) Zaobserwowano istotny statystycznie wpływ swoistego czynnika Nod w stężeniu 10-10 – 10-12 M na

kiełkowanie nasion i długość kiełkującego korzenia.II) Statystycznie istotnie wzrosła biomasa oraz liczba

brodawek w grupie roślin traktowanych czynnikiem Nod. Traktowanie nasion wyki czynnikami Nod nie

zwiększyło konkurencyjności szczepu RvGR09 względem autochtonów. Wnioski: Korzystne jest zasto-

sowanie w uprawie wyki, zamiast mało konkurencyjnych żywych rizobiów, bionawozu zawierającego

specyficzny izolowany czynnik Nod.

80

III-18 P | Charakterystyka mikroflory autochtonicznej występującej w ceramicznych surowcach

ilastych

Kłapkowska P.1, Kaszycki P.1, Białecka A.2, Kasprowicz A.2, Wyszomirski P.3

1 Katedra Biochemii, Wydział Ogrodniczy, Uniwersytet Rolniczy w Krakowie 2 Centrum Badań Mikrobiologicznych i Autoszczepionek im. dr Jana Bobra w Krakowie 3 Katedra Technologii Ceramiki i Materiałów Ogniotrwałych, Wydział Inżynierii Materiałowej i Ceramiki,

Akademia Górniczo-Hutnicza w Krakowie

e-mail: klapkowska.paulina@gmail.com

Wstęp: Szeroko stosowane w ceramice surowce ilaste są rozpowszechnione w przyrodzie, w tym na

terenie naszego kraju. Ich charakterystyczną cechą jest obecność substancji organicznej, pochodzącej

głównie z rozkładu szczątków roślinnych i składającej się z różnorodnych związków węglowodorowych

m.in. o budowie aromatycznej i heterocyklicznej. Frakcja organiczna jest odpowiedzialna na ogół za

obniżenie wartości technologicznej surowca i dlatego podejmuje się próby jej eliminacji. Jednocześnie,

substancja ta może stanowić źródło węgla dla wyspecjalizowanych, zaadaptowanych drobnoustrojów

autochtonicznych. Cel pracy: Badania prowadzono w celu stwierdzenia obecności w próbkach badanych

iłów mikroflory autochtonicznej. Wyizolowane szczepy poddawano charakterystyce mikrobiologicznej

oraz identyfikacji rodzajowej i gatunkowej. Badano możliwość hodowli konsorcjów mikroorganizmów

utworzonych z pozyskanych izolatów w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych. Metody: Izolację

drobnoustrojów autochtonicznych prowadzono z wykorzystaniem trzech wyselekcjonowanych iłów

bogatych w substancję organiczną. Rozdrobniony surowiec zawieszano w jałowej wodzie, wytrząsano

(4-24 h), a następnie wykonywano posiewy w seriach rozcieńczeń geometrycznych na podłoża wzboga-

cone. Analizy identyfikacyjne przeprowadzono z wykorzystaniem standardowych technik fenotypowego

oznaczania drobnoustrojów na podłożach selekcyjnych i z użyciem odpowiednich testów. Między innymi

stosowano: barwienie metodą Grama, system API Coryne oznaczania bakterii z grupy coryneform,

zestaw ID32GN przeznaczony do automatycznej identyfikacji pałeczek gramujemnych oraz testy krążko-

wo–dyfuzyjne dla form kulistych. Wodne zawiesiny surowców posłużyły również do hodowli bioprepara-

tów zawierających autochtoniczne drobnoustroje. Wyniki: Stwierdzono występowanie złożonej mikroflo-

ry, której głównymi składnikami były bakterie należące do grupy maczugowców. Wykazano stabilność tej

mikroflory w czasie przechowywania próbek w stanie suchym. Wyizolowane mikroorganizmy zostały

scharakteryzowane i zidentyfikowane. Na bazie autochtonów wyhodowano bioróżnorodne konsorcja –

biopreparaty, przeznaczone do bioaugmentacji procesu rozkładu ksenobiotyków w iłach. Wnioski:

Wyniki doświadczeń sugerują występowanie w badanym materiale bogatej mikroflory, osiągającej dużą

liczebność, rzędu 105 jtk/g. Autochtoniczne drobnoustroje, wyspecjalizowane i zaadaptowane do środo-

wiska iłów mogą zostać wykorzystane do celów poprawy jakości surowców ceramicznych. Posiadają one

bowiem rzadkie aktywności enzymatyczne pozwalające im na przyswajanie źródeł węgla występujących

w iłach jako organiczna frakcja zanieczyszczająca surowiec.

III-19 P | Wpływ streptomycyny na mikroflorę układu pokarmowego karaczana madagaskarskiego

(Gromphadorhina portentosa)

Kukla M., Piotrowska-Seget Z.

Department of Microbiology, University of Silesia Katowice, Poland

e-mail: malgorzata.kukla@us.edu.pl

Wstęp: Karaczany madagaskarskie (Gromphadorhina portentosa) mogą przenosić wiele groźnych dla

ludzi mikroorganizmów. Są plagą w niektórych domach mieszkalnych i szpitalach, gdzie zagrażają

pacjentom będąc wektorem wielolekoopornych szczepów bakterii. U tych owadów mikroflora układu

pokarmowego jest ważnym czynnikiem warunkującym ich prawidłowy wzrost i rozwój. Nową strategią

81

walki z owadzimi szkodnikami jest eliminacja ich endosymbiontów przewodu pokarmowego, co zaburza

funkcjonowanie owada i prowadzi do jego śmierci. Cel pracy: Ocena wpływu streptomycyny na liczeb-

ność i bioróżnorodność mikroflory różnych kompartymentów jelita środkowego karaczana madagaskar-

skiego. Metody: Liczebność bakterii tlenowych i beztlenowych oznaczano metodą płytek tartych na

podłożach: bulion odżywczy oraz TSA z odwłóknioną krwią baranią. Identyfikację dominujących gatun-

ków przeprowadzono metodą MIDI-MIS z wykorzystaniem chromatografu gazowego oraz bazy danych

Sherlock 5.0. Do określenia aktywności enzymatycznej wyizolowanych bakterii wykorzystano test api

Zym (bioMerieux). Oznaczano także oporność tych szczepów na streptomycynę. Wyniki: Badania

wykazały znaczne różnice w ogólnej liczebności bakterii tlenowych i beztlenowych w różnych komparty-

mentach jelita środkowego karaczana madagaskarskiego intoksykowanego antybiotykiem, w porównaniu

z owadami kontrolnymi (nie intoksykowanymi antybiotykiem). Wśród dominujących gatunków oznaczono

Bacillus cereus, Photorhabdus luminescens, Enterobacter aerogenes, Klebsiella oxytoca, Citrobacter

freundi, Klebsiella pneumoniae. Testem api ZYM potwierdzono zdolność badanych szczepów do wytwa-

rzania enzymów glikolitycznych i proteolitycznych. Klebsiella oxytoca oraz Citrobacter freundii wykazały

oporność na streptomycynę w stężeniu 50 μg/ml. Wnioski: Streptomycyna w istotny sposób zmieniała

liczebność i bioróżnorodność mikroflory jelita środkowego karaczana madagaskarskiego. W przyszłości

zjawisko to można wykorzystać do walki z owadami zagrażającymi zdrowiu człowieka. Aktywność

proteolityczna i glikolityczna bakterii potwierdza ich udział w procesach trawiennych zachodzących

w jelicie środkowym.

III-20 P | Stymulacja aktywności bakterioplanktonu Jeziora Parnowo

Lewicka K., Łaryonowicz M., Szlachciak M., Wawrzonkowski J., Wójcik A., Wasiniewska M., Czubek E.,

Pikuła K.

Katedra Biologii Środowiskowej, Politechnika Koszalińska, Koszalin

e-mail: katarzyna.lewicka@tu.koszalin.pl

Wstęp: Jezioro Parnowskie położone jest na Równinie Białogardzkiej w północno-zachodniej Polsce.

Pod względem administracyjnym przynależy do gminy Biesiekierz. Jest zbiornikiem śródpolnym, otoczo-

nym polami uprawnymi i łąkami, charakteryzującym się bardzo wysoką podatnością na degradację.

Położenie jeziora oraz nieprawidłowe użytkowanie w przeszłości przyczyniło się do przyspieszenia

procesu eutrofizacji, co znajduje odzwierciedlenie w III klasie jakości wód (stan umiarkowany). Próbki do

badań pobierane były z trzech stanowisk, pierwsze zlokalizowane było w okolicy głęboczka, drugie –

w centralnym punkcie zatoki północnej sąsiadującej z Cieszynem, trzecie – w zatoce południowo-

wschodniej od strony Parnowa. Na pierwszym stanowisku, woda pobrana została z: warstwy powierzch-

niowej, z głębokości 4 m i warstwy naddennej (8 m). W przypadku stanowisk drugiego i trzeciego, wodę

pobrano z warstwy powierzchniowej i z głębokości 3 m z uwagi na zbliżoną głębokość w profilu tych

stanowisk. Cel pracy: Celem przeprowadzonego eksperymentu było wykazanie wpływu łatwo przyswa-

jalnych substratów organicznych na aktywność metaboliczną i fizjologiczną bakterioplanktonu Jeziora

Parnowo. Metody: Próbki wody jeziornej, po usunięciu z niej frakcji fito- i zooplanktonu, inkubowano 24 h

w butelkach typu OxiTop w temperaturze 200C w dwóch wariantach: z dodatkiem peptonu i bez suple-

mentacji. W badanych próbkach określano: ilość komórek z aktywnym transportem elektronów (ETS+) na

podstawie reakcji z chlorkiem tetrazolowym CTC oraz liczbę komórek z aktywną membraną (MEM+) za

pomocą testu LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit Molecular Probes. Wyniki: Suplementacja

peptonem spowodowała wzrost procentowego udziału komórek z aktywnym transportem elektronów

(ETS+). W próbkach inkubowanych bez sztucznego substratu obserwowano obniżenie udziału komórek

z aktywnymi dehydrogenazami. Dodatek peptonu nie spowodował wzrostu odsetku komórek ze sprawną

membraną (MEM+).Wnioski: Można przypuszczać, że wzrost koncentracji łatwo przyswajalnych związ-

ków organicznych jest czynnikiem kształtującym aktywność metaboliczną bakterioplanktonu Jeziora

82

Parnowo, natomiast nie wpływa na ich stan fizjologiczny. Może to sugerować, że bakterie te są przysto-

sowane przede wszystkim do degradacji labilnych związków organicznych. Jednak obecność nawet

niewielkich ilości labilnych form substratów może pozwolić bakteriom utylizować allochtoniczne związki

trudno rozkładalne. Zjawisko to ma istotne znaczenie w naturalnych procesach samooczyszczania wód

zbiornika.

III-21 P | Wpływ biostymulacji na strukturę bakterioplanktonu Jeziora Parnowo

Lewicka K., Massopust H., Białous I., Nadzieja N., Łozowska A., Pikuła K.

Katedra Biologii Środowiskowej, Politechnika Koszalińska, Koszalin

e-mail: katarzyna.lewicka@tu.koszalin.pl

Wstęp: Jezioro Parnowskie położone jest na Równinie Białogardzkiej w północno-zachodniej Polsce.

Pod względem administracyjnym przynależy do gminy Biesiekierz. Jest zbiornikiem śródpolnym, otoczo-

nym polami uprawnymi i łąkami, charakteryzującym się bardzo wysoką podatnością na degradację.

Położenie jeziora oraz nieprawidłowe użytkowanie w przeszłości przyczyniło się do przyspieszenia

procesu eutrofizacji, co znajduje odzwierciedlenie w III klasie jakości wód (stan umiarkowany). Próbki do

badań pobierane były z trzech stanowisk, pierwsze zlokalizowane było w okolicy głęboczka, drugie –

w centralnym punkcie zatoki północnej sąsiadującej z Cieszynem, trzecie – w zatoce południowo-

wschodniej od strony Parnowa. Na pierwszym stanowisku, woda pobrana została z: warstwy powierzch-

niowej, z głębokości 4 m i warstwy naddennej (8 m). W przypadku stanowisk drugiego i trzeciego, wodę

pobrano z warstwy powierzchniowej i z głębokości 3 m z uwagi na zbliżoną głębokość w profilu tych

stanowisk. Cel pracy: Celem przeprowadzonego eksperymentu było wykazanie wpływu łatwo przyswa-

jalnych substratów organicznych na strukturę morfologiczną i wielkościową bakterioplanktonu Jeziora

Parnowo. Metody: Próbki wody jeziornej, po usunięciu z niej frakcji fito- i zooplanktonu, inkubowano 24 h

w butelkach typu OxiTop w temperaturze 200C w dwóch wariantach: z dodatkiem peptonu i bez suple-

mentacji. W badanych próbkach określano ogólną liczbę bakterii (OLB), średnią objętość komórek (SOK)

i biomasę bakteryjną (BB) za pomocą metody bezpośredniego liczenia bakterii w mikroskopie fluore-

scencyjnym z zastosowaniem fluorochromu DAPI. Wyniki: Stymulacja peptonem spowodowała wzrost

ogólnej liczby i biomasy bakterii. Obserwowano również wzrost średniej objętości komórek oraz procen-

towego udziału dużych form w grupach rozmiarowych bakterioplanktonu. Wnioski: Przeprowadzone

badania potwierdziły doniesienia licznych badaczy, że struktura związków tworzących pule pokarmowe

bakterii wpływa na tempo rozwoju bakterii oraz ilościowe i jakościowe parametry bakteriocenoz.

III-22 P | Dynamika mikrobiologicznej destrukcji materii organicznej w Jeziorze Parnowo

Lewicka K., Miszczyszyn M., Murawska A., Szeglewska K., Pikuła K.

Katedra Biologii Środowiskowej, Politechnika Koszalińska, Koszalin

e-mail: katarzyna.lewicka@tu.koszalin.pl

Wstęp: Jezioro Parnowskie położone jest na Równinie Białogardzkiej w północno-zachodniej Polsce.

Pod względem administracyjnym przynależy do gminy Biesiekierz. Jest zbiornikiem śródpolnym, otoczo-

nym polami uprawnymi i łąkami, charakteryzującym się bardzo wysoką podatnością na degradację.

Położenie jeziora oraz nieprawidłowe użytkowanie w przeszłości przyczyniło się do przyspieszenia

procesu eutrofizacji, co znajduje odzwierciedlenie w III klasie jakości wód (stan umiarkowany). Próbki do

badań pobierane były z trzech stanowisk, pierwsze zlokalizowane było w okolicy głęboczka, drugie –

w centralnym punkcie zatoki północnej sąsiadującej z Cieszynem, trzecie – w zatoce południowo-

wschodniej od strony Parnowa. Na pierwszym stanowisku, woda pobrana została z: warstwy powierzch-

niowej, z głębokości 4 m i warstwy naddennej (8 m). W przypadku stanowisk drugiego i trzeciego, wodę

83

pobrano z warstwy powierzchniowej i z głębokości 3 m z uwagi na zbliżoną głębokość w profilu tych

stanowisk. Cel pracy: Celem przeprowadzonego eksperymentu było wykazanie wpływu łatwo przyswa-

jalnych substratów organicznych na aktywność oddechową bakterioplanktonu Jeziora Parnowo. Metody:

Próbki wody jeziornej, po usunięciu z niej frakcji fito- i zooplanktonu, inkubowano 24 h w butelkach typu

OxiTop w temperaturze 200C w dwóch wariantach: z dodatkiem peptonu i bez suplementacji. Na podsta-

wie ilości zużytego tlenu wyznaczono: współczynnik aktywności heterotroficznej WAh mikroflory bakteryj-

nej oraz tempo rozkładu węgla organicznego – destrukcję materii organicznej przy założeniu że 1 mg O2

utlenia 0,29 mg C. Wyniki: Badania wykazały, że bakterie występujące w wodach powierzchniowych

charakteryzowały się wyższymi wartościami współczynnika aktywności heterotroficznej w stosunku do

wód przydennych. Ponadto suplementacja peptonem spowodowała wzrost aktywności oddechowej

bakterii, a tym samym wzrost tempa rozkładu węgla organicznego w badanych próbkach. Wnioski:

Można przypuszczać, że bakterioplankton Jeziora Parnowo charakteryzuje wysoki potencjał aktywności

oddechowej, natomiast tempo destrukcji materii organicznej jest uwarunkowane głównie liczbą aktyw-

nych metabolicznie komórek.

III-23 P | Dynamika rozwoju mikroorganizmów w serze dojrzewającym typu szwajcarsko-

holenderskiego

Mikš-Krajnik M., Babuchowski A.

Katedra Mikrobiologii Przemysłowej i Żywności, Uniwersytet Warmińsko-Mazurski

e-mail: marta.miks@uwm.edu.pl

Wstęp: Sery dojrzewające typu szwajcarsko-holenderskiego są serami produkowanymi z zastosowaniem

paciorkowców fermentacji mlekowej: Lactococcus sp., Leuconostoc sp. oraz pałeczek propionowych

Propionibacterium sp. Procesy biotechnologiczne zachodzące w matrycy sera dojrzewającego w warun-

kach przemysłowych zależą głównie od stanu fizjologicznego zastosowanych drobnoustrojów. Metabo-

lizm komórek bakterii nadaje kierunek prowadzonym w środowisku przemianom biochemicznym i enzy-

matycznym, kształtując tym samym pożądane cechy produktu. Cel pracy: W niniejszej pracy zastoso-

wano techniki fluorescencyjne i chromatograficzne celem monitorowania dynamiki zmian stanu fizjolo-

gicznego i metabolizmu populacji bakterii Lactococcus sp. i Propionibacterium sp. w serze typu szwajcar-

sko-holenderskiego dojrzewającym w warunkach przemysłowych. Metody: W trzech warstwach próbek

sera dojrzewającego oznaczano: liczbę bakterii wykazujących aktywność niespecyficznych wewnątrzko-

mórkowych esteraz (CFDA), liczbę żywych i martwych komórek w populacji (LIVE/DEAD® BacLightTM),

liczbę paciorkowców mlekowych i pałeczek propionowych (metoda płytkowa), zawartość lotnych związ-

ków organicznych (HS-GC-FID) oraz kwasowość czynną (pH). Do opisu metabolizmu wykorzystano

wyniki analizy składowych głównych PCA (STATISTICA 8.0, Statsoft). Wyniki: W pierwszym etapie

dojrzewania (12°C) obniżyła się zarówno liczba komórek LIVE jak i CFDA. Zmalała również zdolność

paciorkowców mlekowych do wzrostu na podłożach syntetycznych. W tym samym okresie liczba bakterii

Propionibacterium sp. zdolnych do wzrostu na podłożach stałych wzrosła. W drugim etapie dojrzewania,

w temperaturze 21°C, wzrosła zarówno liczba komórek LIVE jak i CFDA. Zaobserwowano przyrost liczby

paciorkowców zdolnych do wzrostu na podłożach stałych. Analiza PCA, której poddano siedem lotnych

metabolitów, pozwoliła wyodrębnić składowe główne, z których pierwsza wyjaśniała 68,36%, a druga

14.97% obserwowanej zmienności. Czynnik pierwszy budowały następujące związki: diacetyl, acetoina

oraz krótko-łańcuchowe kwasy tłuszczowe C2, C3, C4, C5izo. Drugi czynnik tworzył alkohol etylowy. Zaob-

serwowano występowanie 3 skupień, które tworzyły próbki sera: po soleniu i po 7 dniach dojrzewania

(w 12ºC), z 14-ego dnia dojrzewania oraz po 21 dniu dojrzewania (w 21ºC). Wnioski: W czasie dojrze-

wania sera stwierdzono: brak homogeniczności dojrzewania w całej objętości euro-bloku, który wyrażał

się niższym udziałem bakterii fermentacji mlekowej i propionowej, barwionych SYTO®9 i CFDA oraz

84

wzrastających na podłożach syntetycznych, w zewnętrznej warstwie euro-bloku oraz niższym stężeniem

związków lotnych w zewnętrznej warstwie sera.

III-24 P | Ocena skuteczności konserwacji nanosrebrem na przykładzie wybranych produktów

kosmetycznych

Napierała M., Nitka E., Nowak A.

Studenckie Koło Naukowe INVENTUM, Katedra Biochemii i Mikrobiologii,

Uniwersytet Ekonomiczny w Poznaniu; opiekun: dr inż. Daniela Gwiazdowska

e-mail: ankawokgmz@wp.pl

Wstęp: Nanosrebro jest obecnie często stosowanym komponentem przy produkcji kosmetyków ze

względu na swoje właściwości bakterio- oraz grzybobójcze, dzięki czemu może hamować rozwój niepo-

żądanej mikroflory. Cel pracy: Celem badania była ocena skuteczności konserwacji kosmetyków

z nanosrebrem na działanie wybranych drobnoustrojów. Metodyka: Weryfikację skuteczności konserwa-

cji przeprowadzono za pomocą testu Farmakopei Europejskiej 6.0, który polega na kontrolowanym,

jednorazowym wprowadzeniu szczepów testowych do próbek zakonserwowanego produktu. Jego

zadaniem jest symulowanie wtórnego zakażenia, jakie może powstać podczas użytkowania produktu

przez konsumenta. Kosmetyki zakażono następującymi drobnoustrojami: Staphylococcus aureus,

Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans. Wprowadzone mikroorganizmy zostały wybrane, ponieważ

są najpospolitszymi patogenami człowieka i stanowią częste zanieczyszczenia kosmetyków. Wyniki: Na

podstawie uzyskanych wyników można stwierdzić, że liczba bakterii, co prawda zmniejszyła się już po

2 dniach testu, w stosunku do wartości wyjściowej, jednak po upływie kolejnych 7, 14 oraz 28 dni, spadek

ilości drobnoustrojów nie był już tak intensywny lub w niektórych przypadkach pozostawał bez zmian.

Dużą wrażliwość na działanie środka konserwującego wykazały tylko drożdże Candida albicans. Nato-

miast w stosunku do wszystkich badanych mikroorganizmów, żaden z testowanych produktów kosme-

tycznych nie spełnił kryterium konserwacji A ani B według testu Farmakopei Europejskiej 6.0. Na pod-

stawie uzyskanych wyników można stwierdzić również, że oddziaływanie badanych kosmetyków zależy

przede wszystkim od rodzaju mikroorganizmów. Wnioski: Testowane produkty kosmetyczne wykazały

dość zróżnicowane działanie konserwujące na badane drobnoustroje. Żaden z nich nie spełnił wymaga-

nego według testu Farmakopei Europejskiej 6.0. kryterium A, jednak kryterium B, akceptowane tylko

w uzasadnionych przypadkach ( np. z przyczyn zwiększonego ryzyka działań niepożądanych) zostało

spełnione tylko odnośnie bakterii Pseudomonas aeruginosa we wszystkich badanych kosmetykach.

W stosunku do mikroorganizmu Staphylococcus aureus nie zostało spełnione żadne z kryteriów testu

Farmakopei. W badanych próbach nie stwierdzono natomiast rozwoju drobnoustroju Candida albicans.

III-25 P/O | Biosynteza nanocząstek srebra z wykorzystaniem grzybów w warunkach in vitro

Ogar A.1, Zapotoczny S.2, Turnau K.1

1 Instytut Nauk o Środowisku, Uniwersytet Jagielloński 2 Zakład Chemii Fizycznej i Elektrochemii, Uniwersytet Jagielloński

e-mail: anna.ogar@uj.edu.pl

Wstęp: Najnowsze badania naukowe wskazały istotny potencjał mikroorganizmów, w tym grzybów

w procesie biosyntezy nanocząstek. W płynnych hodowlach grzybów stwierdzono ich wewnątrzkomór-

kową lub/i zewnątrzkomórkową redukcję jonów srebra i formowanie się nanocząstek srebra. Stwarza to

możliwość wykorzystania grzybów w eko-przyjaznej metodzie produkcji nanocząstek, eliminując koniecz-

ność wykorzystania niebezpiecznych czy toksycznych związków chemicznych. Cel pracy: Optymaliza-

cja warunków procesu hodowli grzybów jest istotnym etapem w procesie biologicznej syntezy, którego

85

celem jest otrzymanie nanocząstek o określonym geometrycznym kształcie i rozmiarze. Wielkość nano-

cząstek srebra otrzymywanych na drodze „ekologicznej syntezy” wynosi od kilku do 100 nanometrów, co

czyni grzyby doskonałymi „biofabrykami” nanocząstek o różnej wielkości i kształcie (sferyczny, trójkątny).

Metody: Dwa gatunki grzybów Cladosporium cladosporoides i Ulocladium sp. hodowano w dwóch

rodzajach płynnych pożywek z dodatkiem AgNO3, o stężeniu 10-3 M i 10-2 M. Filtrat, który otrzymano po

hodowli grzybów poddano analizie spektrofotometrycznej. Wyniki: Filtrat z hodowli C. cladosporoides

zarówno przy stężeniu 10-3 M jak i 10-2 M AgNO3 dał silne pasmo absorpcyjne w zakresie 380-450 nm,

z maksimum przy 420 nm oraz 408 nm. Poddany analizie filtrat z hodowli Ulocladium sp. dał pasmo

absorpcji w zakresie 380-470 nm. Wykorzystując do hodowli Ulocladium sp. otrzymano intensywne

widmo o maksimum 424 nm przy stężeniu 10-3 M AgNO3. Wnioski: Otrzymanie widm absorpcji w zakre-

sie długości fali 360-500 nm świadczy o tym, że badane szczepy grzybów (C. cladosporoides i Ulocla-

dium sp.) mają zdolność do zewnątrzkomórkowej syntezy nanocząstek srebra z azotanu srebra. Ulocla-

dium sp. powiększa listę mikroorganizmów zdolnych do produkcji nanocząstek. Otrzymanie różnych

pasm/maksimów absorpcji, może być związane z występowaniem w roztworze różnej wielkości nanoczą-

stek, które nakładając się na siebie dają inne obrazy widm.

III-26 P | Zastosowanie techniki fluorescencyjnej do określania przeżywalności szczepów

Propionibacterium spp. w środowisku substancji bakteriostatycznych.

Olszewska M., Łaniewska-Trokenheim Ł.

Katedra Mikrobiologii Przemysłowej i Żywności, Wydział Nauki o Żywności,

Uniwersytet Warmińsko-Mazurski w Olsztynie

e-mail: magdalena.olszewska@uwm.edu.pl

Wstęp: Bakterie fermentacji propionowej PAB (propionic acid bacteria) to grupa drobnoustrojów, której

znaczenie technologiczne odgrywa coraz większą rolę. Dlatego też, wzrost zainteresowania konsumen-

tów żywnością funkcjonalną prowadzi do koncentracji badań w kierunku zastosowania PAB do produkcji

nowych wyborów żywności, także wykorzystania pałeczek Propionibacterium jako probiotyków. Potencjał

wydaje się być obiecujący, jednak wymagane są dalsze badania w celu wyselekcjonowania szczepów

o ściśle określonych właściwościach prozdrowotnych. Poza zapewnieniem satysfakcji konsumentów,

należy określić niepatogenność takich szczepów oraz poznać ich profile antybiotykooporności. Są to

cechy uwzględniane w trakcie oceny bezpieczeństwa stosowania szczepów jako bakterii potencjalnie

probiotycznych. Cel pracy: Celem pracy było określenie przydatności techniki epifluorescencyjnej

w badaniach przeżywalności szczepów Propionibacterium spp. w warunkach obecności substancji

antybiotycznych. Metody: Określono antybiotykooporność badanych szczepów na wybrane substancje

oraz założono modele doświadczalne z dodatkiem antybiotyków. Okresowo monitorowano liczebności

3 szczepów pałeczek fermentacji propionowej, oznaczając ich liczbę z zastosowaniem techniki epifluore-

scencyjnej CFDA/PI (dioctan karboksyfluoresceiny/jodek propidyny) oraz metody płytkowej. Wyniki:

Wykazano, że szczep Propionibacterium freudenreichii C08 charakteryzował się wrażliwością na cefo-

taksym oraz opornością na doksycylinę i rifampicynę. Szczepy Propionibacterium acidipropionici 78 i 79

wykazywały wrażliwość na wszystkie trzy antybiotyki. Stwierdzono, że liczebność komórek w czasie

długotrwałej hodowli oznaczana metodą epifluorescencyjną była większa od liczebności komórek ozna-

czanej metodą płytkową. Analiza statystyczna otrzymanych wyników wykazała istotne różnice między

porównywanymi technikami, które odnosząc się do różnych wyznaczników aktywności komórek wskazują

na wielowymiarowy wpływ substancji bakteriostatycznych na fizjologię PAB. Liczebność komórek aktyw-

nych esterolitycznie oznaczana metodą CFDA była większa od liczby komórek zdolnych do reprodukcji

średnio o 1 log kom./ml. Wnioski: Metoda CFDA/PI pozwoliła na monitorowanie zmian w liczbie

i procentowym udziale komórek żywych i martwych w modelach doświadczalnych. Metoda CFDA/PI

umożliwiła także oznaczanie całkowitej liczby komórek w badanych próbach. Zastosowanie techniki

86

fluorescencyjnej pozwala na monitorowanie zmian stanu fizjologicznego i morfologicznego w niekorzyst-

nych dla rozwoju pałeczek Propionibacterium spp. warunkach.

III-27 P | Charakterystyka profilu metabolicznego gleby nawożonej osadem z oczyszczalni

ścieków mleczarskich

Frąc M., Oszust K., Lipiec J.

Instytut Agrofizyki Polskiej Akademii Nauk, ul. Doświadczalna 4, 20-290 Lublin 27

e-mail: m.frac@ipan.lublin.pl, koszust@ipan.lublin.pl

Wstęp: Mikroorganizmy glebowe odgrywają kluczową rolę w podtrzymywaniu produktywności gleby,

uczestniczą w obiegu pierwiastków, ale z drugiej strony są niezwykle czułe na zmiany środowiska spo-

wodowane czynnikami antropogenicznymi. Dlatego też ocena stanu mikrobiologicznego gleby jest

jednym z istotnych parametrów z punktu widzenia ochrony środowiska. Zaproponowane w ostatnich

latach rolnicze zastosowanie osadów z oczyszczalni ścieków mleczarskich, polegające na ich wykorzy-

staniu jako nawóz organiczny wydaje się pozytywnie wpływać na metaboliczny profil gleby (CLPP),

zmieniając populację bytujących w tym środowisku mikroorganizmów, ich aktywność enzymatyczną,

a tym samym aktywności fizjologiczną gleby. Cel pracy: Celem przeprowadzonych badań była ocena

wpływu nawożenia gleby osadem z oczyszczalni ścieków mleczarskich na jej mikrobiologiczny profil

metaboliczny oraz jego porównanie z profilami metabolicznymi gleb poddanych nawożeniu mineralnemu.

Metody: Doświadczenie zostało założone na glebie brunatnej, wytworzonej z utworu pyłowego ilastego.

Zastosowano dwie znacznie różniące się dawki nawożenia osadem z oczyszczalni ścieków mleczarskich

i dwie nawożenia mineralnego. Kontrolę stanowiła gleba bez dodatku nawozu organicznego i mineralne-

go. Obiekty doświadczalne obsiano pszenicą ozimą. Analizy przeprowadzono z wykorzystaniem systemu

BIOLOG ECO-plates, który opierając się na procesie katabolizmu oksydacyjnego 31 różnych substratów

węglowych, między innymi aminokwasów, węglowodorów i kwasów karboksylowych, umożliwił ocenę

stanu metabolicznego badanej gleby. Mikrobiologiczną aktywność poszczególnych obiektów doświad-

czalnych wyrażano za pomocą takich parametrów jak: średnia gęstość optyczna (OD) 31 zastosowanych

substratów (AWCD- Average Well-Collor Development), współczynnik R (Richeness), opisywany jako

liczba zmetabolizowanych oksydatywnie substratów węglowych oraz współczynnik Shannon-Weaver (H)

opisujący zarazem jednoznaczność odpowiedzi w postaci stopnia zmetabolizowania danego substratu

(granicę pozytywnej odpowiedzi przyjęto na poziomie 0,25 OD). Wymienione wyżej współczynniki anali-

zowano statystycznie za pomocą metody analizy wariancji (ANOVA). Wnioski: Profile metaboliczne gleb

po zastosowaniu zaproponowanych rodzajów i dawek nawożenia różniły się miedzy sobą. Zanotowano

jednocześnie korzystny wpływ wzbogacenia gleby osadem ścieków mleczarskich na jej równowagę

mikrobiologiczną, o czym świadczy większa ilość metabolizowanych źródeł węgla i intensywność tego

procesu.

III-28 P | Ocena czystości mikrobiologicznej opakowań do żywności wykonanych z papieru

i tektury

Guzińska K., Owczarek M.

Instytut Biopolimerów i Włókien Chemicznych, Łódź

e-mail: mikrobiologia@ibwch.lodz.pl

Wstęp: Opakowania tekturowe i papierowe mają bardzo długą historię stosowania w przemyśle spożyw-

czym, gdzie są wykorzystywane często do bezpośredniego kontaktu z żywnością, np. torebkach do

herbaty, papierze do pieczenia, opakowaniach na cukier i cukierki czy też filtrach do kawy. Papier

i tektura mają również szerokie spektrum zastosowań jako opakowania zbiorcze do transportu i dystrybu-

87

cji. Cel pracy: Celem badań było określenie poziomu zanieczyszczeń mikrobiologicznych (bakterii

i grzybów) w różnego rodzaju papierowych i tekturowych materiałach opakowaniowych. Ponadto celem

badania był wybór najbardziej optymalnej metody ilościowego badania poziomu zanieczyszczenia

bakteriami i grzybami tektury i papieru. Metody: Badania zostały przeprowadzone trzema metodami:

metodą rozwłókniania (zgodnie z normą ISO 8784.1), metodą zalewnia agarem (zgodnie z niemiecką

normą DIN 54378) oraz metodą wymazową (w oparciu o normy PN-ISO 18593 i ISO 8784.1). Wyniki:

Wyniki badania zanieczyszczenia mikrobiologicznego próbek papieru (opakowania na cukier, papierki

z cukierków typu „krówka”) wykazały niski poziom zanieczyszczeń, który nie stwarza ryzyka dla konsu-

mentów. Wyższy poziom zanieczyszczenia mikrobiologicznego zaobserwowano w przypadku tektury

(opakowanie na pizzę, opakowanie na czekoladki, opakowanie zbiorcze do jajek). Wnioski: Na podsta-

wie badań stwierdzono, że metoda rozwłókniania jest najbardziej odpowiednia do ilościowego oznacze-

nia skażenie próbek papierowych i tekturowych. Metoda ta pozwala na precyzyjne oznaczenie pozio-

mu zanieczyszczenia mikrobiologicznego wyrażonego w jednostkach tworzących kolonie (jtk) na gram

próbki zarówno bardzo czystej jak i silnie skażonej. Metoda zalewania agarem nie jest czasochłonna, ale

pozwala tylko na orientacyjny odczyt poziomu zanieczyszczenia ze względu na zlewny wzrost kolonii

trudność w odczycie. Natomiast metoda wymazowa nie jest właściwa do oznaczania ogólnej liczby

bakterii i grzybów próbkach papieru i tektury ze względu na ich porowatą strukturę. Badania wykazały, że

poziom skażenia niektórych opakowań tekturowych mających kontakt z żywnością, przy jednoczesnym

braku przepisów prawnych zmuszających producentów do potwierdzania bezpiecznego poziomu skaże-

nia opakowań tekturowych, stwarza ryzyko dla zdrowia konsumentów.

III-29 P | Właściwości antygrzybicze i antybakteryjne szczepów Streptomyces sp. izolowanych

z ziemi i podłoży ogrodniczych

Peitler D., Fijałkowski K., Nawrotek P.

Studenckie Koło Naukowe Mikrobiologów, Katedra Immunologii, Mikrobiologii i Chemii Fizjologicznej,

Zachodniopomorski Uniwersytet Technologiczny w Szczecinie, Szczecin

e-mail: mikrobiolodzy@zut.edu.pl

Wstęp: Rodzaj Streptomyces tworzą Gram-dodatnie bakterie tlenowe, których naturalnym miejscem

występowania jest gleba i woda. Morfologią i sposobem rozmnażania bakterie te przypominają grzyby

strzępkowe. Komórki Streptomyces występują w grupach, tworzących nitkowate, rozgałęziające się

łańcuszki. Bardzo charakterystyczną cechą bakterii z rodzaju Streptomyces są ich produkty wtórne

metabolizmu. Bakterie te produkują ponad dwie trzecie używanych obecnie w medycynie antybiotyków.

Mogą syntetyzować również: pestycydy, insektycydy, fungicydy oraz związki przeciwwirusowe. Cel

pracy: Celem niniejszej pracy była izolacja oraz ocena właściwości antygrzybiczych i antybakteryjnych

bakterii z rodzaju Streptomyces izolowanych z różnych rodzajów ziemi oraz podłoży ogrodniczych.

Materiał i metody: Szczepy Streptomyces izolowano z ziemi i podłoży ogrodniczych różniących się

parametrami fizykochemicznymi oraz składem komponentowym. Po izolacji i wstępnej identyfikacji

wyhodowanych bakterii, oznaczano ich właściwości antygrzybicze i antybakteryjne. W tym celu izolaty

Streptomyces posiewano na podłoża BHI oraz Sabourauda i inkubowano w temperaturze pokojowej

przez 14 dni. Następnie na podłoże BHI prostopadle do wcześniejszego posiewu Streptomyces posiewa-

no cztery różne rodzaje bakterii (S. aureus, P. aeruginosa, A. baumannii, E. coli), natomiast na podłoże

Sabourauda cztery różne rodzaje grzybów (Alternaris sp., Rhizopus sp., Acremonium sp. oraz Candida

sp.). Podłoża inkubowano następnie przez 14 dni oceniając wzrost mikroorganizmów. Wyniki: Z 10

próbek ziemi wyizolowanych zostało 11 szczepów zakwalifikowanych do rodzaju Streptomyces. Wszyst-

kie szczepy charakteryzowały się wytwarzaniem substancji hamujących wzrost i rozwój użytych

w doświadczeniach bakterii i grzybów. Przy czym, poszczególne szczepy różniły się pod względem

właściwości antybakteryjnych i antygrzybiczych. Największy wpływ na uzyskiwane wyniki, oprócz użytego

88

w teście szczepu testowego, miał czas jego inkubacji z badanymi szczepami Streptomyces. Wnioski: Na

podstawie uzyskanych w badaniach wyników można stwierdzić, że ziemia ogrodnicza stanowić może

cenne źródło bakterii z rodzaju Streptomyces charakteryzujących się dużym potencjałem antybakteryj-

nym i antygrzybiczym.

III-30 P | Mikrobiologiczna degradacja bisfenolu A

Piątek M.A., Słaba M., Długoński J.

Katedra Mikrobiologii Przemysłowej i Biotechnologii, Uniwersytet Łódzki

e-mail: milena_piatek@10g.pl

Wstęp: Bisfenol A czyli 2,2-bis(p-4-hydroksyfenylo)propan (BPA) jest związkiem zaliczanym do substan-

cji zaburzających działanie układu dokrewnego, gdyż reaguje z receptorami estrogenowymi, zakłócając

równowagę hormonalną organizmu. Wykazuje także działanie toksyczne dla organizmów wodnych

(dawka EC lub LC 50 dla ryb i skorupiaków morskich lub słodkowodnych wynosi od 1 do 10 mg/l).

Pierwotnie BPA miał służyć do hormonalnej terapii zastępczej jako syntetyczny estrogen. Obecnie jest

wykorzystywany jako katalizator przy produkcji poliwęglanu, przezroczystego i sztywnego plastiku, oraz

żywic epoksydowych, a także jako przeciwutleniacz w kosmetykach i artykułach spożywczych. Poliwę-

glanowe tworzywa sztuczne cechują się wysoką wytrzymałością oraz plastycznością, dlatego służą one

do produkcji cyfrowych środków przekazu, sprzętu elektrycznego i elektronicznego oraz do wytwarzania

opakowań na żywność i butelek, w tym butelek do karmienia niemowląt. Cel pracy: Celem pracy jest

przedstawienie zagrożeń dla zdrowia ludzi, wynikających z powszechnego używania materiałów zawiera-

jących dodatek BPA oraz mikroorganizmów zdolnych do jego degradacji. Metody: Zawartość BPA

w próbach środowiskowych, materiałach biologicznych i hodowlach drobnoustrojów oznacza się meto-

dami chromatografii gazowej lub cieczowej. Wyniki: Najwięcej danych literaturowych o bakteryjnej

degradacji tego ksenoestrogenu, podobnie jak wielu innych toksycznych ksenobiotyków, dotyczy aktyw-

ności mikroflory autochtonicznej ze skażonych środowisk oraz szczepów z rodzaju Pseudomonas.

W literaturze opisywane są również grzyby strzępkowe jako organizmy zdolne do efektywnej biodegra-

dacji bisfenolu A ze środowiska wzrostu. Najczęściej wymieniane są grzyby białej zgnilizny drewna, ze

względu na obecność ligninaz, zaangażowanych w rozkład różnych toksycznych zanieczyszczeń.

Znacznie mniej wiadomo o mechanizmie rozkładu BPA przez mikroskopowe grzyby nieligninolityczne,

aktywne w tym procesie. Grzyb należący do Zygomycota - Cunninghamella elegans ATCC36112 - tworzy

hydroksylowane pochodne z udziałem cytochromu P-450, jednak główna pula metabolitów to produkty

sprzęgania z glukozą. Wśród Ascomycota najczęściej wymieniane są grzyby z rodzajów Aspergillus

i Fusarium jako zdolne do degradacji BPA, na drodze oksydacyjnego rozerwania wiązania pomiędzy

2 atomami węgla i wytworzeniem 4-izopropenylofenolu jako głównego produktu rozkładu. Wnioski:

Rozkład mikrobiologiczny tego związku zazwyczaj prowadzi do detoksykacji środowiska, czasem jednak

eliminacja BPA może powiększać efekt toksyczny lub estrogenny.

III-31 P | Jakość mikrobiologiczna powietrza klimatyzowanej i nieklimatyzowanej sali wykładowej

Pietruk M.

Katedra Mikrobiologii Środowiskowej, Uniwersytet Warmińsko-Mazurski

e-mail: marzena.pietruk@uwm.edu.pl

Wstęp: Jakość powietrza wewnętrznego w dużym stopniu zależy od powietrza atmosferycznego, usytu-

owania budynku, liczby jego użytkowników, a także od systemów wentylacyjnych i klimatyzacyjnych

w budynkach. Systemy te stosowane są w celu zapewnienia świeżego powietrza i usunięcia zanieczysz-

czeń z pomieszczeń. Dostępne dane literaturowe wykazują, że przewody powietrzne mogą stanowić

89

siedlisko mikroorganizmów. Zakumulowany kurz i mikroorganizmy w kanale nawiewnym mogą być

źródłem zanieczyszczenia powietrza w pomieszczeniach oraz wpływać na zdrowie ludzi. Cel pracy:

Oceniano stopień bakteriologicznego zanieczyszczenia powietrza wewnątrz dwóch sal wykładowych:

klimatyzowanej i nieklimatyzowanej, w zależności od pory roku i liczby użytkowników sal. Metody: Próbki

powietrza analizowano pod kątem liczebności bakterii heterotroficznych, oraz bakterii hemolizujących.

Powietrze do badań pobierano w cyklu rocznym, dwukrotnie w ciągu dnia: przed rozpoczęciem zajęć i po

ich zakończeniu. Próbki powietrza pobierane były metodą zderzeniową na 3 stanowiskach zlokalizowa-

nych wewnątrz sal, a także na 1 stanowisku w korytarzach przed salami. Kontrolnie pobierano próbki

powietrza atmosferycznego przed budynkami, w których znajdują się badane sale wykładowe. Wyniki:

Odnotowano różnice w liczebnościach badanych grup drobnoustrojów w zależności od pory roku, sposo-

bu wymiany powietrza oraz liczby użytkowników sal. Największe liczebności bakterii heterotroficznych

w powietrzu obu badanych sal występowały w sezonie jesiennym i kształtowały się na poziomie 102 – 103

jtk m-3. Bakterie hemolizujące w tym okresie stanowiły od 67 do 84% ogólnej liczby bakterii heterotroficz-

nych, odpowiednio w powietrzu sali nieklimatyzowanej i klimatyzowanej. Stwierdzono spadek liczebności

wszystkich badanych grup drobnoustrojów w próbkach powietrza pobranych po zakończeniu zajęć w sali

klimatyzowanej. Wnioski: Zgodnie z zaleceniami Górnego i na podstawie uzyskanych wyników badań,

stan środowiska wewnętrznego w obu badanych salach wykładowych można ocenić jako dobry. Spadek

liczebności badanych grup drobnoustrojów po zakończeniu zajęć, pomimo dużej liczby użytkowników

w klimatyzowanej sali wykładowej, świadczy o tym, iż właściwie użytkowana klimatyzacja może znacząco

poprawiać jakość powietrza pomieszczeń.

III-32 P | Identyfikacja wybranych cech bakterii endofitycznych z rodzaju Pseudomonas

zasiedlających kukurydzę (Zea mays L.)

Pisarska K., Adamski M., Pietr S.J.

Department of Plant Protection, Division of Agriculture Microbiology,

Wroclaw University of Environmental and Life Science, Poland

e-mail: katarzyna.pisarska@up.wroc.pl

Wstęp: Drobnoustroje endofityczne to mikroorganizmy, które bytują we wnętrzu rośliny i nie powodują

choroby swojego gospodarza. Izolowane są z wnętrza tkanek roślinnych po ich wcześniejszej powierzch-

niowej dezynfekcji. Wśród drobnoustrojów zasiedlających tkanki roślin kukurydzy stwierdza się liczne

bakterie z rodzaju Pseudomonas. Drobnoustroje z tego rodzaju stanowią źródło potencjalnych biologicz-

nych środków ochrony roślin. Przypisuje im się również zdolność do wiązania wolnego azotu i produkcji

sideroforów. Wśród składników soków komórkowych związki fenolowe wykazują największe właściwości

bakterio oraz grzybobójcze i stanowią naturalne źródło ochrony przed patogenami. Zdolność drobnou-

strojów do tolerowania takich substancji stanowi istotny czynnik selekcjonujący potencjalnych kandyda-

tów jako narzędzia biologicznej ochrony. Cel pracy: Celem niniejszej pracy była identyfikacja wybranych

cech bakterii z rodzaju Pseudomonas pozyskanych z tkanek liści sześciu odmian kukurydzy (KB1902,

KB1903, KB2704, KRÓL, KOSMO230, CYRKON) uprawianych w dwóch lokalizacjach. Metody: Bakterie

z rodzaju Pseudomonas wyizolowano z 6 odmian kukurydzy uprawianych na polach doświadczalnych

w Kobierzycach i Smolicach, Polska. Izolacji bakterii z rodzaju Pseudomonas dokonano na podłożu

Gould'a. Przebadano zdolność endofitów z rodzaju Pseudomonas do wykorzystywania jako jedynego

źródła węgla i energii kwasów fenolowych i alkoholu koniferylowego. Określono również zdolności do

produkcji sideroforów oraz zdolność do wiązania wolnego azotu z wykorzystaniem markera dla genu

nifH. Wyniki: Z 6 odmian kukurydzy uprawnej wyizolowano łącznie 42 szczepy bakterii z rodzaju Pseu-

domonas, z czego 3 izolaty nie wykazywały fluorescencji na podłożu typu Gould. Tylko 19% izolatów nie

wykazywało zdolności do wykorzystywania kwasów fenolowych (kwasu chlorogenowego, ferulowego,

p-kumarowego i o-kumarowego) oraz alkoholu koniferylowego jako jedynego źródła węgla i energii.

90

Wzrost szczepów, które nie wykorzystywały wyżej wymienionych związków, nie był hamowany w stęże-

niach nawet czterokrotnie wyższych niż stwierdzane w sokach komórkowych. Alkohol koniferylowy

w stężeniu czterokrotnie większym od występującego w sokach komórkowych (0,5%) hamował wzrost

tylko trzech izolatów. Dwa izolaty posiadały gen nifH odpowiedzialny za wiązanie wolnego azotu.

III-33 P | Niejednoznaczność identyfikacji gatunkowej bakterii z rodzaju Staphylococcus

izolowanych od drobiu

Polakowska K.1, Białecka A.4, Kasprowicz A.4, Król J.3, Wieliczko A.3, Dubin A.2, Władyka B.2,

Międzobrodzki J.1

1 Zakład Mikrobiologii, Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii, Uniwersytet Jagielloński, Kraków 2 Zakład Biochemii Analitycznej, Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii, Uniwersytet Jagielloński,

Kraków 3 Wydział Weterynarii, Uniwersytet Przyrodniczy, Wrocław 4 Centrum Badań Mikrobiologicznych i Autoszczepionek im. Dr J. Bobra, Kraków

e-mail: klaudia.polakowska@uj.edu.pl

Wstęp: W ostatnich latach opracowano wiele metod (fenotypowych i genetycznych) identyfikacji izola-

tów z rodzaju Staphylococcus. Konwencjonalna identyfikacja gatunków gronkowców oparta jest na

właściwościach fizjologicznych, biochemicznych oraz charakterystyce morfologicznej. Rezultaty otrzy-

mywane za pomocą komercyjnych testów opartych na profilach biochemicznych i immunologicznych

obarczone są pomyłkami z powodu zmiennej ekspresji niektórych cech fenotypowych i dwuznaczności

w interpretacji wyników. Sytuację tę komplikuje potwierdzenie odrębności genetycznej szczepów ludzkich

i zwierzęcych oraz ogromna, zarówno fenotypowa jak i genotypowa zmienność tych bakterii, co odzwier-

ciedla się powstawaniem coraz to nowych szczepów. Cel pracy: Pomimo wzrastającej świadomości

odrębności szczepów ludzkich i zwierzęcych oraz wzrostu zainteresowania w medycynie weterynaryjnej,

badania dotyczące szczepów izolowanych od zwierząt są słabiej zaawansowane. Dlatego celem niniej-

szej pracy była izolacja oraz ocena wiarygodności i skuteczności testów fenotypowych w oznaczaniu

izolatów pochodzących od zwierząt w odniesieniu do analizy genetycznej. Metody: Przeprowadzono

standardowe testy diagnostyczne: w kierunku katalazy, wolnej koagulazy, aglutynacji lateksowej,

z podłożami chromogennymi Staphylococcus select, test biochemiczny ID 32 STAPH. Spośród moleku-

larnych metod taksonomicznych zastosowano: PCR-RFLP z użyciem genu gap i trawienia enzymem

AluI, analizę sekwencyjną genu kodującego 16S rRNA oraz innych genów - rpoB, tuf, sodA, kodujących

wysoce konserwatywne białka. Wyniki: Metody fenotypowe nie pozwoliły na jednoznaczną identyfikację

gatunkową 3 spośród 40 szczepów, jednak pozwoliły zaklasyfikować je do rodzaju Staphylococcus.

Biochemiczy test ID 32 STAPH wskazał prawdopodobieństwo identyfikacji do 10% - stanowi to wynik nie

do zaakceptowania. W przypadku genu sodA nie otrzymano produktu PCR. Analiza polimorfizmu długo-

ści fragmentów restrykcyjnych (PCR-RFLP) nie potwierdziła jednoznacznie przynależności gatunkowej

w obrębie rodzaju Staphylococcus. Z kolei analiza sekwencji genu rpoB wskazała na odmienny gatunek

gronkowca w stosunku do wyników z analizy sekwencji genów tuf oraz 16S rRNA. Wnioski: Ustalenie

zróżnicowania taksonomicznego w obrębie rodzaju Staphylococcus nie jest łatwe, zwłaszcza w przypad-

ku badania szczepów zwierzęcych. Na podstawie uzyskanych wyników wskazane jest dalsze prowadze-

nie badań mających na celu poszerzenie wiedzy na temat charakterystyki fenotypowej i genetycznej

szczepów izolowanych od zwierząt, a także ich odrębności w stosunku do szczepów ludzkich oraz

szybkiej i dokładnej identyfikacji gatunkowej gronkowców.

____________________

Badania finansowane z grantów MNiSW: nr N N303 813340 (B. W.) oraz N N401 017740 (J. M.).

91

III-34 P | Mikologiczna charakterystyka osadu czynnego z oczyszczalni ścieków

Rutkowska A., Frąc M., Lipiec J.

Instytut Agrofizyki Polskiej Akademii Nauk, ul. Doświadczalna 4, 20-290 Lublin 27

e-mail: a.rutkowska@ipan.lublin.pl, m.frac@ipan.lublin.pl

Wstęp: Oczyszczanie ścieków w ostatnim czasie stanowi bardzo istotny problem związany z ochroną

środowiska. Jednym ze sposobów oczyszczania ścieków jest metoda osadu czynnego. Osad czynny

stanowi mieszaninę mikroorganizmów, jednak jego skład mikologiczny nie jest do końca poznany.

Dlatego też wydaje się celowe podjęcie badań dotyczących oceny populacji grzybów występujących

w osadzie czynnym. Cel pracy: W niniejszej pracy oceniono liczebność grzybów strzępkowych w osa-

dzie czynnym oraz zidentyfikowano dominujące szczepy mikrogrzybów. Badania obejmowały również

określenie wybranych właściwości metabolicznych izolatów. Metody: Osad czynny wykorzystany

w badaniach pochodził z oczyszczalni ścieków komunalnych w Nałęczowie. Liczebność grzybów okre-

ślono metodą wysiewu rozcieńczeń na podłożu Martina z różem bengalskim. Badania obejmowały

określenie dominujących gatunków grzybów oraz scharakteryzowanie ich wybranych właściwości meta-

bolicznych. Identyfikacja grzybów została przeprowadzona w oparciu o analizę genu D2 LSU z wykorzy-

staniem analizatora genetycznego. Poszczególne etapy badań obejmowały: ekstrakcję DNA z grzybni,

amplifikację fragmentu D2 oraz jego sekwencjonowanie. Identyfikację gatunkową przeprowadzono

z wykorzystaniem systemu MicroSEQ, opierając się na porównaniu otrzymanej sekwencji z bazą danych

sekwencji grzybowych. Właściwości fizjologiczne określono w oparciu o zdolność metabolizowania

różnych substratów węglowych z wykorzystaniem systemu BIOLOG. Wnioski: Przeprowadzone badania

pozwoliły na zidentyfikowanie dwóch dominujących szczepów grzybów (Penicillium spinulosum oraz

Beauveria felina) wyodrębnionych z osadu czynnego.

III-35 P | Skrining uzdolnień dekoloryzacyjnych wyselekcjonowanych grzybów glebowych wobec

błękitu alizaryny

Rybczyńska K., Korniłłowicz-Kowalska T.

Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie, Katedra Mikrobiologii Środowiskowej,

Pracownia Mikologiczna 20-069, Leszczyńskiego 7

e-mail: kamilarybczynska@wp.pl

Wstęp: Barwne ścieki przemysłowe powstają głównie w przemyśle włókienniczym i celulozowo-

papierniczym. Wzrastająca skala produkcji ścieków z tych sektorów przemysłowych przy niedostatecz-

nym ich odbarwianiu sprawia, że do środowiska przedostaje się od 2-50% substancji barwnych zależnie

od ich charakteru chemicznego. Do najgroźniejszych, z uwagi na właściwości mutagenne i karcinogenne,

oraz najodporniejszych na biodegradację substancji barwnych zaliczane są barwniki antrachinonowe.

Zalegając w środowisku wodnym stanowią one zagrożenie dla ludzi i zwierząt oraz przyczyniają się do

zaburzania równowagi biologicznej ekosystemów wodnych. Konwencjonalne metody dekoloryzacji oparte

na procesach fizyko-chemicznych nie dają trwałego i pełnego odbarwienia ścieków przemysłowych.

W związku z tym poszukuje się innowacyjnych rozwiązań z wykorzystaniem mikroorganizmów, które

będą dawały efektywną dekoloryzację. Cel pracy: Celem prezentowanej pracy była ocena uzdolnień

dekoloryzacyjnych wyselekcjonowanych szczepów grzybów glebowych wobec barwników antrachinono-

wych oraz zbadanie aktywności enzymatycznej zewnątrzkomórkowych fenolooksydaz tych drobnoustro-

jów. Materiał i metody: Użyte do badań szczepy grzybów glebowych (45) zidentyfikowane jako: Fusa-

rium solani, Gliocladium catenulatum, G. roseum, Trichoderma viride i Aspergillus sp. wyodrębniono

metodą pułapek, stosując ligninę po-przemysłową jako substrat. Zebrany materiał grzybowy został

wstępnie przetestowany na zagaryzowanym podłożu selektywnym z 0,06% błękitem alizaryny. Kryterium

selekcji szczepów stanowiło tempo odbarwiania błękitu alizaryny. Dalsze badania prowadzono w stacjo-

92

narnych hodowlach płynnych stosując 50cm3 podłoża mineralnego z 0,03% dodatkiem błękitu alizaryny

(28˚C, 14 dni). Okresowo oznaczano stopień dekoloryzacji oraz aktywność fenolooksydaz obejmujących

peroksydazy i lakazę. Wyniki: Stwierdzono, że badane grzyby wykazywały uzdolnienia dekoloryzacyjne

wobec 0,03% roztworu błękitu alizaryny. Tempo dekoloryzacji tego barwnika w płynnych hodowlach

stacjonarnych było zależne od szczepu grzyba. Dekoloryzacja zachodziła na drodze enzymatycznej

i sprzężona była z syntezą jednej lub kilku zewnątrzkomórkowych peroksydaz: manganozależnej (MnP),

ligninowej (LiP), podobnej do chrzanowej (HRP-like), uniwersalnej (VP) lub lakazy. Wnioski: Aktywność

dekoloryzacyjna poszczególnych szczepów była uwarunkowana rodzajem produkowanej fenolooksyda-

zy. Przeprowadzone badania wskazują na możliwość stosowania grzybów mikroskopowych w dekolory-

zacji barwników antrachinonowych.

III-36 P | Wpływ rasy drożdży Saccharomyces cerevisiae na przebieg i wskaźniki fermentacji

etanolowej żytnich zacierów gorzelniczych

Sapińska E., Stanisz M., Pielech-Przybylska K., Balcerek M., Szopa J.

Zakład Technologii Spirytusu i Drożdży, Instytut Technologii Fermentacji i Mikrobiologii,

Politechnika Łódzka

e-mail: ewelina.sapinska@dokt.p.lodz.pl

Wstęp: Fermentację zacierów gorzelniczych prowadzi się najczęściej z udziałem suszonych drożdży

gorzelniczych gatunku Saccharomyces cerevisiae. Ułatwia to prowadzenie procesu, gdyż umożliwia

likwidację działu propagacji drożdży w gorzelni, ograniczając tym samym koszty produkcji. Jednocześnie

w dowolnym czasie można rozpocząć fermentację, bez potrzeby przygotowania matki drożdżowej

i przycierka. Większość ras drożdży wykorzystywanych w procesie gorzelniczym charakteryzuje się m.in.:

odpornością na działanie alkoholu (rasy D2, As4 do 12% obj.; Ethanol Red do 18% obj.), podwyższoną

tolerancją na ciśnienie osmotyczne oraz zwiększoną energią zafermentowania zacierów i dużą prędko-

ścią właściwą wytwarzania etanolu. Cel pracy: W niniejszej pracy oceniano wpływ rasy drożdży

S. cerevisiae, D2 oraz As4 na przebieg i wskaźniki fermentacji etanolowej żytnich zacierów gorzelniczych.

Metody: Zaciery przygotowywano metodą bezciśnieniowego uwalniania skrobi (BUS) oraz ciśnieniowo-

termiczną, z żyta odmiany Amilo, z wykorzystaniem preparatów enzymatycznych zawierających

α-amylazę i amyloglukozydazę. Fermentację prowadzono systemem trzydobowym w temperaturze

28÷30°C, przy wykorzystaniu suszonych drożdży gorzelniczych S. cerevisiae, rasy D2 oraz As4 (dawka

0,3 g s.s/dm3 zacieru słodkiego), z dodatkiem pożywki (NH4)2HPO4. Po zakończeniu procesu pobrano

próbki zacierów odfermentowanych i wykonano analizy w celu określenia prawidłowości przebiegu

procesu. Oznaczano ekstrakt pozorny i rzeczywisty, zawartość alkoholu w zacierze, a także cukry:

redukujące, ogółem i dekstryny. Wyniki: Badania wykazały, że zaciery otrzymane w wyniku obróbki

ciśnieniowo-termicznej fermentowały szybciej przy użyciu drożdży rasy As4 (faza zafermentowania trwała

ok. 6 h, a czas trwania procesu wynosił ok. 30 h). Natomiast zaciery przygotowane metodą BUS fermen-

towały dynamicznej z udziałem drożdży rasy D2, proces zakończył się już po ok. 45 h. Na podstawie

otrzymanych wyników stwierdzono, iż rasa drożdży wykorzystanych do fermentacji zacierów żytnich

istotnie wpłynęła na skład fizyko-chemiczny zacierów odfermentowanych. Najwyższą wydajność etanolu -

87,28% wydajności teoretycznej, uzyskano dla drożdży D2, w zacierze przygotowanym metodą BUS.

Wnioski: Fermentacja żytnich zacierów gorzelniczych otrzymanych metodą BUS, z udziałem drożdży

rasy D2 przebiegała dynamiczniej oraz charakteryzowała się wyższymi wskaźnikami procesu, w stosun-

ku do As4. Natomiast zaciery otrzymane w wyniku obróbki ciśnieniowo-termicznej fermentowały efektyw-

niej przy użyciu drożdży rasy As4.

93

III-37 P | Wskaźniki zanieczyszczenia mikrobiologicznego powietrza w wybranych środowiskach

pracy

Skóra J., Gutarowska B., Rembisz D., Zduniak K., Śnioszek A.

Institute of Fermentation Technology and Microbiology, Technical University of Lodz, Poland

e-mail: justyna-skora@wp.pl

Wstęp: Zagrożenie zawodowe ze strony mikroorganizmów zgodnie z Rozporządzeniem Ministra Zdrowia

z dn. 22.04.2005 (Dz.U.2005, Nr 81, poz.716 ze zmianami: Dz.U.2008, Nr 48, poz.288) dotyczy pracy

w zakładach produkujących żywność; w rolnictwie; w służbie zdrowia; w laboratoriach, w zakładach

gospodarki odpadami; przy oczyszczaniu ścieków i innych. Dlatego istotne jest wyznaczenie wskaźników

zanieczyszczeniach mikrobiologicznego, które pozwoliłyby na szybką ocenę stopnia zanieczyszczenia

drobnoustrojami i zagrożenia dla pracowników. Cel pracy: Niniejsza praca miała na celu ocenę zanie-

czyszczenia mikrobiologicznego powietrza wybranych miejsc pracy: muzea, archiwa i biblioteki, garbar-

nie, kompostownie oraz wytypowanie drobnoustrojów wskaźnikowych w tych środowiskach. Metody:

Czystość mikrobiologiczną powietrza oznaczano metodą zderzeniową. Identyfikację grzybów prowadzo-

no na podstawie obserwacji makro- i mikroskopowych przy pomocy kluczy taksonomicznych. Identyfika-

cję bakterii przeprowadzono przy pomocy testów diagnostycznych API. Wyniki: Zanieczyszczenie

mikrobiologiczne powietrza w pomieszczeniach Archiwum i Biblioteki kształtowało się na poziomie:

2,1x102 jtk/m3 dla ogólnej liczby drobnoustrojów. W Muzealnych wynosiło 9,5x102 jtk/m3. W pomieszcze-

niach tych dominowały bakterie z rodzaju Micrococcus, Staphylococcus i Bacillus oraz grzyby z rodzaju:

Peniclillium, Cladosporium, Aspergillus, Rhizopus, Mucor. Na stanowiskach pracy w garbarni stężenie

mikroorganizmów w powietrzu wynosiło 2-3x103 jtk/m3, dominowały gatunki: Bacillus, Micrococcus,

Staphylococcus, Penicillium, Cladosporium, Alternaria. W powietrzu zakładu produkującego kompost

stężenie bakterii i grzybów przekraczało 5,3x104 jtk/m3. Drobnoustroje wyizolowane z powietrza kompo-

stowni należały głównie do grzybów: Penicillium, Cladosporium, Aspergillus, Rhizopus oraz bakterii

z rodzajów Micrococcus, Bacillus, Staphylococcus, wyizolowano również promieniowce. Wnioski:

Grzyby strzępkowe wyizolowane w powietrzu archiwów, bibliotek i muzeów z rodzajów: Penicillium,

Aspergillus, Cladosporium mogą być wskaźnikami zanieczyszczenia mikrobiologicznego w tego typu

obiektach. Stwierdzono w tych pomieszczeniach obecność gatunków potencjalnie chorobotwórczych:

Aspergillus fumigatus (BSL 2), Aspergillus flavus (BSL 2), Peacilomyces variotii (BSL 2). W powietrzu

garbarni zdiagnozowano liczne gatunki bakterii z rodzaju Bacillus, które mogą być wskaźnikiem mikrobio-

logicznego zanieczyszczenia powietrza w tych środowiskach. Wyizolowano również bakterie: Staphylo-

coccus aureus, Bacillus subtilis należące do 2 grupy zagrożenia zdrowotnego. Promieniowce termofilne

zostały uznane za dobry wskaźnik zanieczyszczenie mikrobiologiczne powietrza w kompostowniach. Nie

stwierdzono obecności bakterii patogennych w tym środowisku pracy.

III-38 P | Dobór warunków biosyntezy drożdżowego SCP z wykorzystaniem wybranych produktów

ubocznych przemysłu cukrowniczego

Stanisz M.1, Patelski P.2, Antczak A.1, Gruska R.1, Sapińska E.2

Politechnika Łódzka, ul. Wólczańska 171/173, 90-924 Łódź 1 Instytut Chemicznej Technologii Żywności, Zakład Cukrownictwa 2 Instytut Technologii Fermentacji i Mikrobiologii, Zakład Technologii Spirytusu i Drożdży

e-mail: maciej.stanisz@dokt.p.lodz.pl

Wstęp: Liście buraczane są jednym z produktów ubocznych przemysłu cukrowniczego i związanej z nim

uprawy buraków cukrowych. Obecnie, bezpośrednio po zbiorze buraków, liście najczęściej wykorzysty-

wane są jako pasza. Ten sposób zagospodarowania sprawia, że niewykorzystana część liści ulega

zepsuciu i zniszczeniu (nadmierna ilość liści w stosunku do trzody chlewnej). Cel pracy: W celu podnie-

94

sienia efektywności wykorzystania liści buraków cukrowych podjęto badania oceny liści jako surowca do

produkcji drożdży paszowych. Metody: W celu zwiększenia puli cukrów dostępnych dla drożdży zasto-

sowano trzy warianty obróbki zmielonych liści buraków cukrowych: hydrolizę enzymatyczną, hydrolizę

chemiczno-termiczną (z kwasem siarkowym) oraz hydrolizę łączoną – enzymatyczną, po wstępnej

obróbce chemicznej. W hydrolizie enzymatycznej wykorzystano preparaty celulolityczne, znane pod

nazwami handlowymi AlternaFuel 200P, CeluStar XL, CeluStar Plus oraz Accellerase 1500. Hydrolizaty

liści sączono (0,45µm), regulowano pH (pH=5) i wzbogacano solami mineralnymi (N, P, K, Mg). Otrzy-

maną pożywkę szczepiono drożdżami Trichosporon cutaneum lub Candida tropicalis lub Kluyveromyces

marxianus, które pochodziły z kolekcji Instytutu Technologii Fermentacji i Mikrobiologii Politechniki

Łódzkiej. Hodowle wstrząsane prowadzono w ciągu 48h, w temperaturze 30±1oC. W podłożach przed

hodowlą, jak i w odciekach pohodowlanych oznaczono zawartość węglowodanów metodą chromatografii

jonowej. Określono również namnożenie biomasy metodą wagową. Wyniki: Najbardziej wydajnie (nieza-

leżnie od wariantu hydrolizy liści) przebiegała biosynteza drożdży Trichosporon cutaneum. Największe

namnożenie (17.6±0.2 g s.s./dm3) uzyskano dla tego szczepu po skojarzonej hydrolizie chemiczno-

enzymatycznej. Ten wariant przygotowania surowca, okazał się najkorzystniejszy również w przypadku

hodowli dwóch pozostałych szczepów - uzyskano 13.1±0.2 g s.s./dm3 dla drożdży Kluyveromyces

marxianus oraz 12.3±0.2 g s.s./dm3 w przypadku biomasy Candida tropicalis. Najsłabsze namnożenie

stwierdzono w podłożach przygotowanych bez hydrolizy enzymatycznej. W stosunku do hydrolizatów

otrzymanych skojarzoną metodą chemiczno-enzymatyczną zaobserwowano spadki namnożenia

o 20.9%, 44.4% i 53.5% odpowiednio dla drożdży Trichosporon cutaneum, Candida tropicalis i Kluyve-

romyces marxianus. Wnioski: Wykonane badania potwierdzają możliwość zastosowania zhydrolizowa-

nych enzymatycznie liści buraków cukrowych jako surowca do produkcji białka SCP.

III-39 P | Przeciwdrobnoustrojowa aktywność folii pullulanowych wzbogaconych w wodno-etanolowy ekstrakt z bazylii wonnej (Ocinum basilicum L.)

Synowiec A.1, Gniewosz M.1, Przybył J.2, Bączek K.2

1 Zakład Biotechnologii i Mikrobiologii Żywności, Wydział Nauk o Żywności 2 Katedra Roślin Leczniczych i Warzywnych, Wydział Ogrodnictwa i Architektury Krajobrazu, Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie

e-mail: alicjasynowiec@poczta.onet.pl

Wstęp: Na całym świecie prowadzone są badania dotyczące powłok, które w swoim składzie zawierały-

by substancje hamujące wzrost drobnoustrojów. Jedną z substancji jakie można wykorzystać do tworze-

nia takich powłok jest pullulan mający zdolność do tworzenia lepkich cieczy, które po wyschnięciu mogą

tworzyć przezroczyste błony pozbawione smaku i zapachu. Wprowadzając do takiej błony ekstrakty

roślinne, mające działanie przeciwdrobnoustrojowe możemy ograniczyć niekorzystny wpływ mikroflory na

produkt. Cel pracy: Celem tych badań było określenie właściwości przeciwbakteryjnych filmów pullula-

nowych wzbogaconych w wodno-etanolowy ekstrakt z ziela bazylii. Metody: Ekstrakt z bazylii wonnej

przygotowano metodą ekstrakcji periodycznej jednostopniowej. Jako rozpuszczalnika użyto 40% roztwo-

ru etanolu. Surowiec ekstrahowano utrzymując temperaturę 70°C przez 2 godziny. Ekstrakt surowy

zagęszczono w wyparce do zawartości suchej masy równej: 0,35 g/cm3. W skład filmów pullulanowych

wchodził [g/100cm3]: pullulan 5,0; białko serwatkowe 3,75; ekstrakt z bazylii w zakresie 3-15% s.s,

glicerol 4-9,5%, woda destylowana do 100 cm3. Aktywność przeciwbakteryjną filmów zawierających

ekstrakty z ziela bazylii badano metodą płytkowo–dyfuzyjną. Z gotowych filmów wycinano krążki

o średnicy 12 mm. Po inkubacji mierzono średnicę strefy zahamowania wzrostu wokół krążków. Wynik

podawano w mm, po odjęciu średnicy krążka (12 mm). Jako mikroorganizmy testowe wykorzystano:

Aspergillus niger ATTC 9142, Rhizopus arrhizus ATCC 11145, Penicilium expansum ATTC 7861,

Saccharomyces cerevisiae rasy Bingen, Saccharomycopsis fibuliger E.ang , Bacillus sublilis ATCC 6633,

Escherichia coli ATCC 25922, Proteus mirabilis 14a PZH, Salmonella Enteritidis ATCC 13076, Staphylo-

95

coccus aureus ATCC 25923. Wyniki: Filmy pullulanowe z dodatkiem wyciągu z ziela bazylii wonnej

wykazały działanie hamujące w stosunku do trzech testowych szczepów bakteryjnych: Staphylococcus

aureus ATCC 25923, Bacillus sublilis ATCC 6633, Proteus mirabilis 14a PZH, Salmonella Enteritidis

ATCC. Pozostałe szczepy nie były hamowane przez badany ekstrakt. Wnioski: Uzyskane wyniki wyka-

zały, że zastosowanie w filmie ekstraktu z bazylii wonnej może mieć potencjalne zastosowanie w opako-

walnictwie żywności, zwłaszcza przeciwko zanieczyszczeniom wywołanym bakteriami gramdodatnimi.

III-40 P/O | Zastosowanie wielowarstwowych nanorurek węglowych do ekstrakcji patuliny z soków

jabłkowych metodą SPE

Śliwińska A., Przybylska A., Bazylak G.

Katedra i Zakład Bromatologii, Wydział Farmaceutyczny, Collegium Medicum im. Ludwika Rydygiera

w Bydgoszczy, Uniwersytet Mikołaja Kopernika, Jagiellońska 13, 85-067 Bydgoszcz

e-mail: gbazylak@cm.umk.pl; anna.sliwinska@cm.umk.pl

Wstęp: Patulina to mikotoksyna będąca produktem metabolizmu wtórnego niektórych szczepów grzybów

należących do rodzaju Penicillium i Aspergillus. W krajach Unii Europejskiej najwyższe dopuszczalne

stężenie patuliny w sokach i nektarach owocowych nie może przekraczać 50.0 μg/kg, a w produktach

przeznaczonych dla niemowląt i małych dzieci 10.0 μg/kg. Patulina zaliczana jest do tzw. naturalnie

występujących zanieczyszczeń żywności, co oznacza że jej całkowita eliminacja z owocowych produktów

spożywczych często nie jest możliwa. Cel pracy: Celem badań było określenie wydajności procesu

wyodrębniania patuliny z krajowych soków jabłkowych metodą ekstrakcji w fazie stałej - SPE, w której

zastosowano wielowarstwowe nanorurki węglowe różniące się stopniem oczyszczenia, cechami morfo-

logicznymi, strukturą molekularną i średnicą nanoporów. Celem pracy było także porównanie efektywno-

ści opracowanej metody ze stosowanymi dotychczas procedurami ekstrakcji patuliny w warunkach SPE.

Metody: W badaniach stosowano system Baker-spe12G i membranową pompę próżniową. Uzyskane

ekstrakty SPE zatężano w temp. 22-65°C w strumieniu helu i analizowano metodą chromatografii cien-

kowarstwowej na płytkach HPTLC. Chromatogramy rozwijano w planarnej komorze chromatograficznej

DS II stosując fazę ruchomą toluen-octan etylu-kwas mrówkowy (5+4+1,v/v/v), a uzyskane pasma

obserwowano w świetle lampy UV przy dł. fali 254 oraz 365 nm. Dodatkowo płytki HPTLC spryskiwano

0.5 % wodnym roztworem chlorowodorku 3-metylo-2-benzotiazalinonu (MBTH), a następnie ogrzewano

w temp. 100 °C przez 30 min w celu uzyskania zabarwionego na zółto produktu reakcji z patuliną.

Wyniki: W metodzie SPE-HPTLC granica detekcji patuliny w soku jabłkowym wynosi 5 ng per spot czyli

50 μg/kg. Oprócz patuliny w ekstraktach SPE z soku jabłkowego stwierdzono obecność

5-hydroksymetylofurfuralu, kwercetyny, kwasu askorbowego oraz insektycydów takich jak fenitrotion,

chlorpirifos i cypermetryna. Największy odzysk patuliny (98 %) z soków fortyfikowanych na poziomie

20-100 mg/L uzyskano po ekstracji SPE na kolumienkach Speedisc H2O. Najwyższą selektywność

ekstrakcji SPE patuliny z fortyfikowanego soku jabłkowego zapewnia kolumienka MultiSep 228 oraz

kolumienka zawierająca wielowarstwowe nanorurki węglowe o niskiej średnicy (2-6 nm). W żadnej

z badanych próbek krajowych soków jabłkowych nie stwierdzono obecności patuliny przy zastosowaniu

proponowanej metody. Wnioski: Badania wykazały wysoką przydatność wielowarstwowych nanorurek

węglowych jako wypełnienia kolumienek SPE do selektywnej i szybkiej ekstrakcji śladowych ilości

patuliny z soków jabłkowych.

96

III-41 P | Wpływ mikoryzacji na aktywność enzymów antyoksydacyjnych i syntezę flawonoidów

u odmian Allium cepa

Wężowicz K.1, Świadek M.1, Rąpała-Kozik M.2, Anielska T.1, Turnau K.1

1 Instytut Nauk o Środowisku, Uniwersytet Jagielloński, 2 Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii, Uniwersytet Jagielloński

e-mail: katarzyna.wezowicz@uj.edu.pl

Wstęp: Cebula (Allium cepa) jest jednym z najczęściej konsumowanych warzyw i jednocześnie stanowi

źródło licznych bioaktywnych substancji o działaniu terapeutycznym. Zawarte w niej flawonoidy wykorzy-

stywane są jako naturalne leki w leczeniu schorzeń układu krwionośnego, oddechowego i pokarmowego.

Cebula jest rośliną uprawiana na terenach stosunkowo ubogich w związki mineralne i do prawidłowego

rozwoju i jakości oferowanego produktu wymaga obecności grzybów mikoryzowych. Inokulacja roślin

arbuskularnymi grzybami mikoryzowymi często okazuje się pomocna w produkcji rolnej. Cel pracy:

W niniejszej pracy oceniono przydatność grzybów mikoryzowych w uprawach polskich odmian cebuli

poprzez oznaczenie stężenia flawonoidów oraz aktywność enzymów antyoksydacyjnych u cebuli inoku-

lowanej i nieinokulowanej Glomus intraradices. Metody: Po 3 miesiącach uprawy w sterylnym podłożu

komercyjnym, mikoryzowe i niemikoryzowe rośliny zważono i zhomogenizowano w metanolu przy użyciu

moździerza. Stężenie flawonoidów w cebuli zmierzono metodą chromatografii gazowej. Dla odmian

Wolska i Ishikura oznaczono aktywność dysmutazy ponadtlenkowej (SOD) stosując fotochemiczną

redukcję NBT do formazanu. Oznaczenie aktywności syntazy TMP i pirofosfokinazy tiaminy wykonano

przy zastosowaniu rozdziału analizowanych próbek techniką wysokosprawnej chromatografii cieczowej

(HPLC) sprzężonej z postkolumnową detekcją fluorescencyjną. Stopień mikoryzacji korzeni cebuli

oceniono za pomocą metody Trouvelot. Wyniki: Badania wykazały, że największy przyrost biomasy

zaobserwowano u roślin inokulowanych G. intraradices, w szczególności u odmian Wolska, Kuba,

Kristine i Karmen. Ostatnie dwie odmiany nie przeżyły bez inokulacji. Wykazano znaczące różnice

w stężeniach kwercetyny, kemferolu i apigeniny u mikoryzowej odmiany Wolska w porównaniu z niemiko-

ryzowymi roślinami. Ponadto istotne różnice zaobserwowano w stężeniu flawonoidów u odmian Kuba

i Sochaczewska. Wykazano również wzrost aktywności SOD, syntazy TMP i pirofosfokinazy tiaminy

u mikoryzowych roślin. Wnioski: Inokulacja grzybami mikoryzowymi powoduje znaczący wzrost biomasy

i okazuje się niezbędna dla przeżycia niektórych odmian (Kristine i Karmen). Ponadto, obecność grzybów

mikoryzowych powoduje wzrost produkcji flawonoidów oraz aktywności SOD, syntazy TMP oraz pirofos-

fokinazy tiaminy w porównaniu z roślinami nieinokulowanymi.

III-42 P | Zastosowanie grzybów mykoryzowych w komercyjnej uprawie storczyków gruntowych

Wojtczak G.

Instytut Nauk o Środowisku, Uniwersytet Jagielloński

e-mail: grzegorz.wojtczak@uj.edu.pl

Wstęp: Storczyki (Orchidaceae) stanowią jedną z najliczniejszych gatunkowo rodzin roślin naczynio-

wych. Jedyną synapomorfią w tej grupie roślin jest stadium protokormu, w pełni zależne od symbiozy

z grzybami mykoryzowymi. Protokorm rozwija się bezpośrednio z nasion storczyków, zawierających

znikome ilości substancji odżywczych. Udział grzybów mykoryzowych polega więc przede wszystkim na

dostarczeniu związków węgla mykotroficznym siewkom. W latach dwudziestych poprzedniego stulecia

opracowano asymbiotyczne metody in vitro otrzymywania siewek storczyków. Metody te jednakże,

pozwoliły na komercyjną uprawę stosunkowo niewielkiej liczby spośród ponad 25 tysięcy opisanych

gatunków storczyków. Jednocześnie obligatoryjny charakter symbiozy mykoryzowej naziemnych storczy-

ków spowodował niemal całkowity brak tych gatunków w ofercie sklepów ogrodniczych. Cel pracy:

Celem niniejszej pracy było zoptymalizowanie metod otrzymanie czystych kultur symbiontów mykoryzo-

97

wych, efektywnych w komercyjnej produkcji naziemnych storczyków, a także identyfikacja wyizolowanych

szczepów przy użyciu metod molekularnych. Metody: Mikroorganizmy izolowano ze sterylizowanych

powierzchniowo korzeni storczyków Dactylorhiza majalis, Ophrys apifera, Oph. insectifera, Orchis pal-

lens. Całe fragmenty korzeni lub zwoje grzybni wyjmowane z pojedynczych komórek kory pierwotnej

inkubowano na podłożach PDA, FIM, OAT z dodatkiem lub bez dodatku kombinacji różnych antybioty-

ków. Symbionty oznaczono poprzez porównanie otrzymanych sekwencji nukleotydów fragmentu rybo-

somalnego DNA z sekwencjami zgromadzonymi w ogólnodostępnych bazach za pomocą algorytmu

BLAST. Wyniki: Badania wykazały, że izolacja grzybów z całych fragmentów kory pierwotnej prowadzi

do otrzymania endofitów niezdolnych do stymulowania kiełkowania nasion storczyków. Symbiontami tymi

były głównie gatunki z rodzaju Fusarium. Z kolei izolacja symbiontów z pojedynczych zwojów jest utrud-

niona ze względu na zjawisko plazmolizy towarzyszące przenoszeniu delikatnych strzępek na sztuczne

podłoża mikrobiologiczne. Mimo podobnych trudności udało się otrzymać właściwe symbionty mykory-

zowe, stymulujące kiełkowanie nasion gatunków storczyków z których je izolowano. Na podstawie analiz

molekularnych, większość z tych symbiontów zaliczono do rodzaju Tulasnella; pozostała część, choć

bezpośrednio spokrewniona z tym rodzajem, posiadała unikalną sekwencję analizowanego fragmentu

DNA, porównywalną z nielicznymi sekwencjami zgromadzonymi w bazach NCBI. Wnioski: Korzenie

naziemnych storczyków skrywają ogromną różnorodność symbiotycznych mikroorganizmów, której

poznanie jest kluczowe dla wprowadzenia tych roślin na rynek sprzedaży. Jednakże tylko niektóre

symbionty mają znaczenie komercyjne, a metody molekularnej identyfikacji grzybów są niezawodne

w doborze odpowiednich szczepów.

____________________

Projekt finansowany w ramach programu Ventures Fundacji na rzecz Nauki Polskiej ze środków Europejskiego Fundu-

szu Rozwoju Regionalnego Unii Europejskiej.

III-43 P | Mikrobiologiczne oczyszczanie ścieków zanieczyszczonych estrogenami.

Włodarczyk M., Schmidt M.

Studenckie Koło Naukowe SKN Bio-Mik, koordynatorzy: dr S. Różalska, prof. dr hab. J. Długoński

e-mail: mateusz.wlodarczyk.1986@gmail.com, mravirr@gmail.com

Wstęp: Estrogeny są to pochodne steranu, o budowie wielopierścieniowej, zaliczane do steroidowych

hormonów płciowych. Najważniejszymi, a zarazem najczęściej występującymi w ściekach estrogenami

są 17 α-etynyloestradiol, (EE2), estradiol (E1), oraz 17β-estradiol (E2) pochodzące głównie ze źródeł

odzwierzęcych. Związki te charakteryzują się wysoką aktywnością biologiczną, pomimo, iż w ściekach

występują na poziomie ppm. Hormony te tylko w nieznacznym stopniu są usuwane w oczyszczalniach

ścieków przez osad czynny, co sprawia, że są uwalniane do rzek, gleby oraz wód gruntowych, gdzie

bezpośrednio oddziałują na żyjące tam organizmy. Cel pracy: W niniejszej pracy zwracamy uwagę na

problem zwiększania się ilości estrogenów w zbiornikach wodnych oraz płynące z tego zagrożenie.

Wskazujemy także na możliwości mikrobiologicznej degradacji i biotransformacji tych związków. Meto-

dy: Do opracowania niniejszej prezentacji wykorzystaliśmy najnowsze dane literaturowe dotyczące

mikrobiologicznej degradacji estrogenów, zawarte w następujących publikacjach naukowych: Cajthaml T,

Kresinová Z, Svobodová K, Sigler K, Rezanka T. Microbial transformation of synthetic estrogen 17-alpha-

ethinylestradiol. Environ Pollut. 2009; 157 (12): 3325-35. M. Muller, D. Patureau, J. Godon, J.P.

Delgenès, G. Hernandez-Raquet. Molecular and kinetic characterization of mixed cultures degrading

natural and synthetic estrogens. Appl Microbiol Biotechnol 2010; 85: 691–701. Wyniki: Na podstawie

informacji pozyskanych z naukowych publikacji, możemy stwierdzić że na dzień dzisiejszy brak jest

metody całkowicie eliminującej estrogeny ze ścieków, a co za tym idzie ze środowiska. Jednakże istnieją

metody, oparte na zastosowaniu konsorcjów szczepów bakteryjnych, które częściowo eliminują te

związki poprzez przekształcenie ich do związków o niższej aktywności biologicznej. Wnioski: Obecność

98

estrogenów w ściekach oraz brak metod całkowicie ich eliminujących, jest dużym problemem ekologicz-

nym, wpływającym w znaczny sposób na organizmy żywe. Poszukiwania określonych szczepów drobno-

ustrojów degradujących te hormony stwarzają nadzieje na skuteczne rozwiązanie problemu w najbliższej

przyszłości.

III-44 P | Nowy szczep bakterii Bacillus pumilus o aktywności przeciwprątkowej przeciwko

Mycobacterium smegmatis wyizolowany ze ściany jelita dżdżownicy Dendrobaena veneta

Fiołka M.1, Zagaja M.2, Wielbo J.3 , Wydrych J.4

Wydział Biologii i Nauk o Ziemi, Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej w Lublinie,

1 Zakład Immunologii Bezkręgowców, 2 Zakład Zoologii, 3 Zakład Genetyki i Mikrobiologii, 4 Zakład Anatomii Porównawczej i Antropologii

e-mail: mfiolka@poczta.onet.pl

Wstęp: Ewolucja pierścienic odbywała się w stałym kontakcie z mikroorganizmami saprofitycznymi

i patogennymi, pasożytami oraz zmiennymi warunkami fizyko-chemicznymi, w wyniku czego zwierzęta te

wykształciły skuteczne mechanizmy obronne. Odporność humoralna u Annelida związana jest z obecno-

ścią układu hemolitycznego i hemaaglutynacyjnego płynu jamy ciała, zwłaszcza cytolizyn i białek

o właściwościach lizozymu. Aktywność przeciwbakteryjna i przeciwgrzybowa typu lizozymu może pocho-

dzić w organizmie dżdżownicy z różnych źródeł: płynu celomatycznego, celomocytów, kokonów oraz

jelita. Aktywność typu lizozymu wykrywa się i oznacza względem bakterii indykatorowej Micrococcus

luteus. Cel pracy: Ekstrakt ze ścian jelita wykazywał silną aktywność przeciw M. luteus i dlatego podjęto

poszukiwania mikroorganizmów związanych ściśle ze ścianą jelita a, nie z jego treścią. W związku

z niedostatkiem skutecznych i nietoksycznych preparatów przeciwprątkowych podjęto poszukiwania

aktywności przeciwko Mycobacterium w naturalnym środowisku eliminującym te mikroorganizmy jakim

jest jelito dżdżownicy. Metody: Ze ścian jelita środkowego dżdżownicy Dendrobaena veneta wyizolowa-

no bakterie o aktywności typu lizozymu, który zidentyfikowano przy użyciu metod biochemicznych

i molekularnych. Do wykrywania aktywności stosowano metodę dyfuzyjną Fredericka oraz test LIVE

/DEAD, którym oznaczano przeżywalność prątków oraz analizę morfologiczną, komórek mykobakterii

w mikroskopie świetlnym i elektronowym skaningowym, po inkubacji z ekstraktem z bakterii wyizolowa-

nego szczepu. Wyniki: Wyizolowany szczep zidentyfikowano jako Bacillus pumilus. Bakterie z rodziny

Bacilli, stanowią znaczną część jelitowych mikroorganizmów u glebowych bezkręgowców. Pomagają one

w trawieniu pokarmu, produkują witaminy i chronią swoich gospodarzy przed patogenami. Szczep

wyizolowany charakteryzuje się aktywnością przeciwprątkową skierowaną przeciwko Mycobacterium

smegmatis. Zaobserwowano efekt lityczny M. smegmatis pod wpływem metabolitów B. pumilus, istotne

obniżenie przeżywalności badanych prątków oraz tworzenie owalnych i skróconych form morfologicznych

komórek M. smegmatis po inkubacji z ekstraktem z wyizolowanego szczepu, co świadczy

o bakteriobójczym działaniu nowego szczepu B. pumilus. Wnioski: Zarówno ekstrakt jak i płyn pohodow-

lany wyizolowanego szczepu B. pumilus wykazywał aktywność przeciwko M. smegmatis obniżając

istotnie przeżywalność i zmieniając morfologię komórek prątków. Można przypuszczać, że metabolity

nowego szczepu B. pumilus będą dogodnym źródłem pozyskania białek o działaniu przeciwprątkowym,

w tym na prątki gruźlicy.

99

III-45 P | Efektywne mikroorganizmy w ochronie środowiska

Czaiński T.

Instytut Przemysłu Skórzanego w Łodzi

e-mail: spike19851@gmail.com

Celem opracowania było przedstawienie praktycznych możliwości zastosowania Efektywnych Mikroorga-

nizmów w ochronie środowiska, w aspektach rolnictwa, gospodarstwa domowego, utylizacji odpadów

oraz oczyszczania wód. Efektywne Mikroorganizmy (EM) są mieszanką odpowiednio dobranych rodza-

jów bakterii, grzybów i promieniowców wykazującą właściwości regeneratywne i antyutleniające. Część

z nich jest tlenowa, a część beztlenowa. Bakterie te poprzez korzystną wymianę i magazynowanie

substancji pokarmowych zdolne są do symbiotycznej koegzystencji. Badania opisane w literaturze

wykazały zdolność EM do rozkładania wszelkiej materii organicznej, szkodliwych gazów (głównie H2S)

i materiałów pierwotnie organicznych. EM emitują korzystne drgania własne i na drodze rezonansu

oddziaływają z materia zewnętrzną. Dzięki zdolności do przeżywania w temperaturach rzędu 10000C,

wypalone w materiale ceramicznym, rozkładają dioksyny (z jednoczesną absorpcją chloru) emitowane

w procesie spalania oraz pestycydy. Fermentowane z udziałem EM osady ściekowe (eliminacja higieni-

zacji wapnem), odpady organiczne i zwierzęce służą jako cenny nawóz w postaci idealnej próchnicy.

Bakterie fotosyntetyczne redukują skutki radioaktywności poprzez wykorzystywanie promieni Gamma

jako źródła energii. Szerokie spektrum działania EM daje wiele różnych możliwości ich praktycznych

zastosowań w ochronie środowiska, m. in. jako środki ochrony i kondycjonowania roślin, wspierania

zdrowia zwierząt, środki do odświeżania i utrzymywania czystości, stabilizacji osadów ściekowych

i skratek oraz jako preparaty regenerujące i wzmacniające.

100

101

Sesja IV

Nowe zagadnienia z zakresu genetyki,

biochemii i biologii molekularnej

mikroorganizmów

102

103

Wykład plenarny

Poszukiwania nowych „tarcz” dla leków przeciwdrobnoustrojowych

Dziadek J.

Instytut Biologii Medycznej, Polska Akademia Nauk, Łódź

e-mail: jdziadek@cbm.pan.pl

Nadesłane streszczenia

IV-1 P/O | Kasety DIY – podstawa do konstrukcji nowych narzędzi genetycznych dla

Alphaproteobacteria

Adamczuk M., Dziewit Ł., Bartosik D.

Zakład Genetyki Bakterii, Instytut Mikrobiologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski

e-mail: marcinadamczuk@gmail.com

Wstęp: Bakterie z klasy Alphaprotoebacteria charakteryzuje bardzo duże zróżnicowanie metaboliczne.

Ze względu na swoje właściwości (np. zdolność do rozkładu ksenobiotyków i substancji toksycznych oraz

przenoszenia DNA do komórek roślinnych) znajdują zastosowanie w biotechnologii i inżynierii genetycz-

nej. Zakres prowadzonych badań jest jednak często limitowany brakiem odpowiednich narzędzi gene-

tycznych, specyficznych dla tej grupy bakterii. Aby dostarczyć takich narzędzi skonstruowano kasety

genetyczne, które mogą być wykorzystane do tworzenia wektorów wahadłowych. Cel pracy: Celem

niniejszej pracy była konstrukcja serii plazmidów, stanowiących źródło kaset genetycznych DIY (Do It

Yourself), użytecznych do tworzenia wektorów wahadłowych Escherichia coli/Alphaprotoebacteria.

Metody: Do konstrukcji poszczególnych kaset i wektorów zastosowano metody molekularne powszech-

nie wykorzystywane podczas pracy z DNA, jak również szereg standardowych technik mikrobiologicz-

nych. Wyniki: Skonstruowano ponad 50 kaset DIY o różnym stopniu złożoności i odmiennych właściwo-

ściach. Wszystkie powstały w oparciu o moduły plazmidowe Paracoccus aminophilus JCM 7686, funk-

cjonalne w 9 szczepach Alphaprotoebacteria (przedstawiciele rzędów Caulobacterales, Rhizobiales

i Rhodobacterales). Najprostsze kasety zawierają jedynie systemy replikacyjne (REP). Bardziej złożone

niosą moduły REP z dołączonymi do nich różnego typu systemami stabilizującymi. Część kaset wyposa-

żono również w: (i) geny opornościowe (Kmr lub Tcr), (ii) region MOB wraz z origin transferu plazmidu

RK2 (zapewnia mobilizację do transferu koniugacyjnego do szczepów Alphaproteobacteria z ominięciem

bariery restrykcyjnej) oraz (iii) różnego typu polilinkery, ułatwiające ich przeklonowanie do plazmidów

docelowych. Wybrane kasety wykorzystano do konstrukcji wektorów wahadłowych z serii pALPHA,

zawierających systemy replikacyjne specyficzne dla E. coli (typu pMB1 lub pSC101) i polilinkery

w obrębie lacZ’, co umożliwia selekcję z zastosowaniem α-komplementacji. Wnioski: Kasety DIY mogą

być wykorzystane do konstrukcji mobilizowalnych wektorów wahadłowych (np. seria pALPHA), które

umożliwiają przeprowadzanie manipulacji genetycznych w E. coli, a następnie wprowadzanie zrekombi-

nowanego plazmidu do Alphaprotoebacteria. Ponieważ kasety DIY powstały na bazie replikonów koeg-

zystujących w jednej komórce (naturalne plazmidy P. aminophilus JCM 7686), możliwe jest ich zastoso-

wanie przy projektowaniu układów wieloplazmidowych.

104

IV-2 P | Zastosowanie metagenomiki w badaniu różnorodności grzybów gleb leśnych

Behnke-Borowczyk J.1, Kwaśna H.1, Bielinis E.2, Wiatrowska B.3

1 Katedra Fitopatologii Leśnej, Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu, 2 Katedra Hodowli Lasu, Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu, 3 Katedra Przyrodniczych Podstaw Leśnictwa, Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu

e-mail: jbehnke@up.poznan.pl

Wstęp: Współczesna wiedza na temat składu i funkcji zbiorowisk grzybów glebowych jest bardzo ograni-

czona. Wynika z niedoskonałości metodyki stosowanej do izolacji i identyfikacji mikroorganizmów.

Metody klasyczne stosowane dotychczas pozwalały na poznanie gatunków hodowalnych in vitro. Metody

molekularne stosowane od niedawna pozwalają na detekcję i identyfikację również gatunków niehodo-

walnych in vitro. Metagenomika to kierunek nowoczesnej mikrobiologii. Opiera się na klonowaniu DNA

pozyskiwanego bezpośrednio z naturalnych środowisk i sekwencjonowaniu bibliotek genomowych.

Umożliwia analizowanie całych populacji mikroorganizmów danego środowiska, bez konieczności ich

hodowli in vitro. Pozwala na odkrycie nowych dla nauki gatunków bakterii i grzybów. Rewolucjonizuje

rozumienie i postrzeganie świata mikrobiologii. Umożliwia poznanie mikrobiologicznej bioróżnorodności

wielu środowisk. Sprzyja adaptacji i optymalizacji wielu procesów mikrobiologicznych stosowanych

w celu poprawy egzystencji człowieka. Metody: Całkowity (środowiskowy) DNA z gleby ekstrahowano

przy użyciu PowerSoil DNA Kit (Mo Bio). Specyficzny fragment rDNA grzybowego (ITS 1/2) amplifikowa-

no z zastosowaniem starterów specyficznych dla grzybów. Zamplifikowany fragment DNA poddano

klonowaniu z wykorzystaniem pGEM-T Easy Vector System (Promega). Przeprowadzone selekcję

wstępną uzyskanych kolonii (wybierano kolonie białe na pożywce z X-gal). Utworzono bibliotekę klonów

obejmującą 81 klonów grzybowych. Klony poddano selekcji wtórnej polegające na badaniu polimorfizmu

długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP) przy użyciu enzymów HhaI oraz BsuRI. Reprezentacyjne

klony wybrano do sekwencjonowania odcinka rDNA ITS1/2. Otrzymane sekwencje porównano z se-

kwencjami zdeponowanymi wcześniej w NCBI. Wykonano analizę filogenetyczną badanych sekwencji.

Wyniki: W badanej glebie stwierdzono obecność następujących gatunków grzybów: Cadophora finlandi-

ca, Cenococcum geophilum, Gongylonema macrocystis, Phialocephala fortinii, Piloderma olivaceum,

Piloderma sp., Rhizoscyphus ericae, Ascomycota spp. (włączając gatunki z podgromady Pezizomycoti-

na). Stwierdzono również obecność organizmów o sekwencjach niezdeponowanych dotychczas w EMBL

oraz jednego gatunku rośliny, tj. kapusty (Brassica oleracea). Wnioski: Zastosowanie metody molekular-

nej polegającej na ekstrakcji glebowego DNA, amplifikacji grzybowego DNA, klonowaniu, selekcji klonów

i sekwencjonowaniu klonów reprezentacyjnych pozwoliło stwierdzić obecność kilku gatunków grzybów

niehodowalnych w standardowych warunkach laboratoryjnych i nierozpoznawanych przez klasyczne

metody izolacji i identyfikacji mikroorganizmów. Stwierdzenie w glebie leśnej obecności rośliny, tj. kapu-

sty (Brassica oleraca) po zastosowaniu starterów ogólnie przyjętych jako specyficzne dla grzybów

sugeruje, że dotychczas stosowane startery są mało specyficzne dla grzybów gleb leśnych.

IV-3 P | Występowanie genu kodującego egzoenzym S u wielolekowrażliwych (MDS) i wielolekoo-

pornych (MDR) szczepów Pseudomonas aeruginosa

Bogiel T., Deptuła A., Gospodarek E.

Katedra i Zakład Mikrobiologii Collegium Medicum im. Ludwika Rydygiera w Bydgoszczy,

Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu

e-mail: bogiel.tomasz@wp.pl

Wstęp: Pałeczki Pseudomonas aeruginosa są jednymi z najczęściej izolowanych drobnoustrojów, będąc

częstą przyczyną zakażeń szpitalnych. W piśmiennictwie pojawiają się informacje o obniżonej zjadliwości

wielolekowrażliwych szczepów tego gatunku. Jednym z czynników zjadliwości występujących u szcze-

105

pów P. aeruginosa jest egzoenzym S. Jest on toksyną kodowaną w pozycji 4303141–4304502 chromo-

somu szczepu P. aeruginosa PAO1. Cel pracy: Ocena obecności genu kodującego egzoenzym S

u szczepów P. aeruginosa i porównanie częstości jego występowania w grupie szczepów wielolekowraż-

liwych i wielolekoopornych. Materiał i metody: Badaniem objęto 148 szczepów P. aeruginosa (83 MDS

i 65 MDR). Ich lekowrażliwość oceniano i interpretowano zgodnie z zaleceniami KORLD i CLSI, stosując

szczep wzorcowy P. aeruginosa ATCC 27853 i uznając za MDR szczepy oporne na wszystkich przed-

stawicieli co najmniej dwóch grup leków przeciwbakteryjnych (beta-laktamów, aminoglikozydów, fluoro-

chinolonów). W reakcji amplifikacji stosowano DNA wyizolowane z użyciem zestawu Genomic Mini (A&A

Biotechnology), zestaw z polimerazą Taq (Solis Biodyne) oraz startery exoS F i exoS R (Integrated DNA

Technologies) o sekwencjach 5’→3’, odpowiednio: -CTTGAAGGGACTCGACAAGG-i –TTCAGGTCCG-

CGTAGTGAAT-. Produkty rozdzielano w żelu agarozowym, wybarwiano bromkiem etydyny i oglądano w

świetle UV, uznając za wynik dodatni występowanie fragmentu DNA wielkości 504 pz. Analizę staty-

styczną występowania genu exoS w grupie szczepów wielolekowrażliwych i wielolekoopornych wykona-

no testem χ2. Za istotne statystycznie uznano różnice przy poziomie istotności α≤0,05. Wyniki: Wystę-

powanie genu exoS stwierdzono ogółem u 72 (48,7%) badanych szczepów, z czego 44 (53,0%)

u szczepów MDS i 28 (43,1%) MDR. Obserwowane różnice nie były istotne statystycznie. Wnioski: Nie

wszystkie szczepy P. aeruginosa posiadają geny kodujące egzoenzym S, przez co nie wszystkie mają

możliwość jego wytwarzania. Obecność u pałeczek P. aeruginosa genu exoS stwierdza się częściej

wśród szczepów MDS niż wśród MDR, jednak nie są to różnice istotne statystycznie.

IV-4 P| Specyficzność sekwencyjna endorybonukleazy PemKSa należącej do systemu toksyna-

antytoksyna kodowanego w plazmidzie niesionym przez szczep Staphylococcus aureus CH91

Bukowski M.1, Łyżeń R.2, Szalewska-Palasz A.2, Ilczyszyn W.3, Dubin A.1, Władyka B.1

1 Zakład Biochemii Analitycznej, Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii, Uniwersytet Jagielloński 2 Katedra Biologii Molekularnej, Uniwersytet Gdański 3 Zakład Mikrobiologii, Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii, Uniwersytet Jagielloński

e-mail: m.bukowski@uj.edu.pl

Wstęp: Fizjologiczna rola systemów toksyna-antytoksyna (TA) jest przedmiotem ciągłej dyskusji. Nie-

mniej w obliczu wyników trwających ponad dekadę badań wyłania się coraz bardziej ugruntowany

wniosek o ich charakterze jako regulatorów metabolizmu aktywowanych w odpowiedzi na warunki

stresowe. Aktywność systemów TA może być również istotna w przypadku szczepów patogennych, gdzie

systemy te są w stanie modulować formowanie się biofilmów oraz lekooporność bakterii. Cel pracy:

W niniejszej pracy określono specyficzność sekwencyjną endorybonukleazy PemKSa, poddano bioinfor-

matycznej analizie sekwencje kodujące znajdujące się w genomie jednego ze szczepów posiadających

operon pemIKSa pod kątem występowania tej sekwencji oraz pokazano w modelu in vitro różnicujący

wpływ aktywności badanej endorybonukleazy na ekspresję wybranych genów. Metody: Specyficzność

sekwencyjną określono z wykorzystaniem metody primer extension do sekwencjonowania końców 5’

fragmentów RNA faga MS2 powstałych w wyniku trawienia przez endorybonukleazę PemKSa. W oparciu

o dane z bazy Genbank, na podstawie opracowanego modelu matematycznego, wytypowano geny

o statystycznie istotnej nadreprezentacji i niedoreprezentowaniu rozpoznawanej sekwencji. Wpływ

aktywności endorybonukleazy PemKSa na produkcję białek bakteryjnych badano w układzie heterologicz-

nym, którym był laboratoryjny szczep Escherichia coli BL21(DE3), na drodze koekspresji genu pemK

i genów poddawanych analizie, które zostały umieszczone w wektorach plazmidowych pod kontrolą

fagowego promotora T7. Wyniki: Endorybonukleaza PemKSa charakteryzuje się wysoką specyficznością

sekwencyjną hydrolizując łańcuch RNA w obrębie tetranukeotydowej sekwencji UAUU. Analiza bioinfor-

matyczna pozwoliła wytypować dwie grupy genów, których ekspresja może być ściśle powiązana

z aktywnością endorybonukleazy PemKSa. Ponadto na wybranych genach wykazano oporność transkryp-

106

tów mRNA na endorybonukleolityczną aktywność białka PemKSa i możliwość ich ekspresji w hodowli

bakteryjnej pomimo ogólnego zahamowania wzrostu. Wnioski: Bakteriostatyczna aktywność endorybo-

nukleazy PemKSa, wynikająca z zahamowania syntezy większości białek bakteryjnych, może stanowić

odpowiedź na stres środowiskowy zwiększającą zdolność adaptacyjną szczepów, które w swoim geno-

mie posiadają operon systemu pemIKSa. Jednocześnie geny, których transkrypty nie posiadają rozpo-

znawanej przez nią sekwencji, mogą ulegać niezaburzonej ekspresji. Analiza sekwencji kodujących

w obrębie genomu jednego ze szczepów niosących plazmid z operonem pemIKSa pozwala przypuszczać,

że endorybonukleaza PemKSa może powodować kierunkowe zmiany w metabolizmie oraz w interakcji

komórki bakteryjnej z otaczającym środowiskiem.

____________________

Praca częściowo finansowana z projektu MNiSW nr N N303 813340.

IV-5 P | Zastosowanie mutagenezy transpozonowej do identyfikacji genów zaangażowanych

w syntezę karotenoidów w bakterii Brevundimonas sp. LM18

Czarnecki J., Bartosik D.

Zakład Genetyki Bakterii, Uniwersytet Warszawski

e-mail: jakub- -czarnecki@wp.pl

Wstęp: Karotenoidy są wytwarzane przez organizmy fotosyntetyzujące oraz niektóre niefotosyntetyzują-

ce bakterie i grzyby. Związki te chronią komórki przed reaktywnymi formami tlenu, powstającymi zarówno

w procesie fotosyntezy, jak i obecnymi w środowisku. Karotenoidy znajdują zastosowanie w przemyśle

jako antyoksydanty i barwniki. Poznanie genów zaangażowanych w biosyntezę karotenoidów jest waż-

nym etapem w drodze do konstrukcji szczepów bakteryjnych wydajnie wytwarzających te związki. Cel

pracy: Celem pracy była konstrukcja nowej kasety służącej do mutagenezy transpozonowej w Alphapro-

teobacteria oraz jej wykorzystanie do identyfikacji genów zaangażowanych w biosyntezę karotenoidów

w bakterii Brevundimonas sp. LM18. Metody: Stosowano standardowe metody inżynierii genetycznej

i mikrobiologii. Do analiz produkowanych przez bakterie karotenoidów wykorzystano HPLC (WATERS

600). Miejsca insercji kasety transpozycyjnej określono metodą odzyskania plazmidu (ang. plasmid

rescue) i sekwencjonowania DNA. Analizy bioinformatyczne przeprowadzono z wykorzystaniem progra-

mów z pakietu BLAST oraz ORF Finder (NCBI). Wyniki: Skonstruowano kasetę do mutagenezy transpo-

zonowej w Alphaproteobacteria, która zawierała (i) mobilną sekwencję insercyjną ISPmar4, (ii) gen

oporności na kanamycynę (selekcję mutantów) i (iii) origin replikacji R6K (szybka identyfikacja miejsc

transpozycji metodą „odzyskiwania plazmidów”). Kasetę sklonowano w plazmidzie samobójczym, który

wprowadzono do komórek Brevundimonas sp. LM18. Wyselekcjonowano pulę mutantów o zmienionym

zabarwieniu kolonii (inaktywacja genów zaangażowanych w produkcję barwników). Kilka z nich niosło

kasetę wbudowaną w obrębie genów crtI i crtB, odpowiedzialnych za końcowe etapy biosyntezy karote-

noidów. W innych mutantach stwierdzono mutacje (i) genu odpowiedzialnego za syntezę prekursorów

izoprenoidów, (ii) genów, których funkcja w szlaku biosyntezy karotenoidów nie została dotąd opisana.

Wnioski: Uzyskane wyniki pozwoliły na poznanie ścieżki biosyntezy karotenoidów w Brevundimonas sp.

LM18. Bakteria ta niesie zespół genów crt odpowiedzialnych za końcowe etapy szlaku biosyntezy dicy-

klicznych karotenoidów. Synteza prekursorów zachodzi ścieżką fosforanu metyloerytrolu. Mutacje

w genach odpowiedzialnych za syntezę puryn obniżają wydajność produkcji karotenoidów. Zidentyfiko-

wano również gen, którego funkcji nie wiązano dotąd z syntezą karotenoidów, a którego inaktywacja

prowadzi do całkowitej utraty zdolności wytwarzania tych związków.

107

IV-6 P/O | Zastosowanie metody RAPD w oparciu o sekwencje mikrosatelitarne do różnicowania

szczepów M. canis izolowanych od ludzi i zwierząt w Polsce

Dębska J., Ciesielska A., Jaworski A.

Zakład Genetyki Drobnoustrojów, Uniwersytet Łódzki

e-mail: joanna.p.debska@gmail.com

Wstęp: Badania dermatofitów z wykorzystaniem metod molekularnych ujawniły duże genetyczne zróżni-

cowanie w obrębie poszczególnych gatunków tych grzybów. Na tym tle zoofilny gatunek Microsporum

canis bardzo się wyróżnia. Dotychczasowe wyniki badań prowadzonych na świecie sugerują brak zróżni-

cowania klonalnego w przypadku tego dermatofita. Wyjątek stanowią dwie prace: Cano i wsp., w której

zastosowano z powodzeniem starter (ACA)5 do zróżnicowania 24 izolatów M. canis pochodzących

z 7 hiszpańskich miast oraz praca zespołu Gräser w oparciu o startery McGT13 oraz McGT17 użyte do

zbadania struktury klonalnej 101 szczepów dermatofitów. Cel pracy: Zbadanie stopnia zróżnicowania

struktury klonalnej szczepów M. canis, izolowanych od ludzi i zwierząt w Polsce przy zastosowaniu

metody RAPD (ang. Randomly Amplified Polymorphic DNA) w oparciu o sekwencje mikrosatelitarne.

Metody: Całkowity genomowy DNA badanych szczepów dermatofitów wyizolowano za pomocą zmodyfi-

kowanej metody Liu i wsp. Wyizolowany DNA posłużył jako matryca w reakcji RAPD w oparciu o wybra-

ne sekwencje starterowe - (ACA)5, McGT13 oraz McGT17. Wyniki: W wyniku zastosowania metody RAPD

w oparciu o starter (ACA)5 nie wykazano zróżnicowania w obrębie badanej kolekcji szczepów M. canis

(otrzymano jeden wspólny profil A). Taki sam rezultat otrzymano również w przypadku zastosowania

starterów McGT13 i McGT17. Wnioski: Uzyskane wstępne wyniki wskazują na brak zróżnicowania klonal-

nego szczepów M. canis izolowanych od ludzi oraz od zwierząt w Polsce, co stanowi kontrast co wyni-

ków uzyskanych przez zespół Cano oraz zespół Gräser.

____________________

Niniejsze badania są współfinansowanie przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego, Grant promotorski

N303568938, a także ze środków Europejskiego Funduszu Społecznego i Budżetu Państwa w ramach Działania 2.6

Zintegrowanego Programu Operacyjnego Rozwoju Regionalnego, w związku z realizacją Projektu p.n. „Stypendia

wspierające innowacyjne badania naukowe doktorantów” oraz w ramach Podziałania 8.2.1 Programu Operacyjnego

Kapitał Ludzki, w związku z realizacją Projektu „Doktoranci – Regionalna Inwestycja w Młodych naukowców – Akronim D-

RIM, II edycja”

IV-7 P | Determination of putative biological function of extracellular cell wall covalently anchored

protein from Leuconostoc mesenteroides

Dybka K., Walczak P.

Institute of Fermentation Technology and Microbiology, Technical University of Lodz

e-mail: katarzyna.dybka@p.lodz.pl

Introduction: Genetic analysis of dextran biosynthesis region of Leuconostoc mesenteroides ATCC

8293 by two dextransucrases LEUM_1747 and LEUM_1752 resulted with discovery of atypical gene

LEUM_1748 with unkonown biological function. LEUM_1748 encodes an extracellular protein linked to

bacterial envelope by sortase B recognizing C-terminal sorting motif LPKTNG. Correction of LEUM_1748

sequence (Walczak, 2008) revealed that 1381 amino acid sequence consists of following domains: signal

sequence, variable region, enzymatic domain, collagen-like region, transmembrane region with cell wall

anchoring motif LPKTNG. Proximity of two dextransucrases and presence of putative sucrose binding

boxes within enzymatic activity region sequence characteristic for inulosucrases or levansucrases may

suggest biological activity of LEUM_1748. Aim: The goal of the experiment was to analyse extracellular

protein from selected Leuconostoc mesenteroides strains and to demonstrate their biological function.

Methods: Leuconostoc mesenteroides cultures were grown in MRS medium. Simultaneously bacteria

108

were grown in MRS medium supplemented with hydroxylamine hydrochloride, which makes extracellular

protein containing LPXTG motif, recognized by sortase, being released to the culture medium. Protein

were precipitated with acetone 1:1 (v/v) or ammonium sulfate 1:1 or 1:2 (v/v). Obtained protein precipi-

tates were analysed with PAGE-SDS in polyacrylamide gel. Dextransucrase, levansucrase and inulosu-

crase activities of protein, were detected by enzymatic reaction with sucrose as a substrate and gel

embedded enzymes with subsequent periodoc acid-Schiff staining method (PAS). Results: It was

showed that the addition of hydroxylamine to the growth medium resulted with increased amount of

certain protein being released to the environment. Moreover, it was found that effectiveness of protein

isolation was better for ammonium sulfate precipitant comparing to acetone. It was discovered that

among obtained extracellular protein, beside LEUM_1747 and LEUM_1752 protein (with analysed in

silico molecular weights ~ 170 kDa and ~166 kDa respectively), LEUM_1748 (~ 140 kDa) was showed. It

was noticed that only one protein produced extracllularly by Leuconostoc mesenteroides Cyr21 pos-

sessed enzymatic activity leading to formation of polysaccharides from sucrose. Conclusion: Estimated

molecular weight of obtained protein (~ 140 kDa) with enzymatic activity may suggest that it is a product

of LEUM_1748 gene.

IV-8 P | Charakterystyka genu LEUM_1748 w wybranych szczepach Leuconostoc mesenteroides

Dybka K., Otlewska A., Walczak P.

Instytut Technologii Fermentacji i Mikrobiologii, Politechnika Łódzka

e-mail: katarzyna.dybka@p.lodz.pl

Wstęp: Kolageny są jednymi z najbardziej rozpowszechnionych białek. Dotychczas uważano, iż są

typowe tylko dla organizmów eukariotycznych, jednakże zastosowanie technik in silico w analizie geno-

mów dostępnych w bazach danych potwierdziło obecność charakterystycznych motywów Gly-X-Y

u wirusów i bakterii, a w tym bakterii fermentacji mlekowej. W kolagenach zwierzęcych w pozycji X

najczęściej występuje prolina a w pozycji Y hydroksyprolina. Bakterie produkujące białka kolagenopo-

dobne pozbawione są hydroksylazy prolinowej (EC 1.14.11.2) i w wyniku braku obróbki postranslacyjnej

ich białka nie zawierają hydroksyproliny. Cel pracy: Badania miały na celu detekcję genu LEUM_1748

i jego charakterystykę w 21 szczepach Leuconostoc mesenteroides wyizolowanych ze środowiska

naturalnego. Metody: Chromosomalne DNA wyizolowano metodą Andersona i McKay’a (1983), frag-

menty genu LEUM_1748 zamplifikowano techniką PCR wykorzystując primery zaprojektowane w oparciu

o sekwencję LEUM_1748 Ln. mesenteroides ATCC 8293 (CP000414), a następnie analizowano w 1 %

żelu agarozowym. Wybrane produkty PCR poddano sekwencjonowaniu i analizie porównawczej. Wyniki:

Obecność genu LEUM_1748 została potwierdzona we wszystkich badanych szczepach. Zaobserwowano

niewielkie różnice w sekwencjach amplikonów obejmujących początkowy fragment genu LEUM_1748.

W wyniku amplifikacji regionu kolagenopodobnego genu LEUM_1748 otrzymano produkty PCR o długo-

ści około 1000 pz, krótsze od analogicznego fragmentu w szczepie ATCC 8293 o około 600 pz. Analiza

porównawcza sekwencji aminokwasowych domeny kolagenopodobnej białka LEUM_1748 badanych

szczepów wykazała, iż zawierały one 33,1 % glicyny, nie stwierdzono natomiast obecności proliny,

treoniny i argininy. Różnice w ilości poszczególnych aminokwasów, w domenie kolagenopodobnej

LEUM_1748 badanych szczepów, wynosiły maksymalnie 2,8 %, a zawartość aminokwasów egzogen-

nych wahała się od 26,3 % do 26,7 %. Wnioski: Początkowy fragment genu LEUM_1748 charakteryzo-

wał się wysokim stopniem homologii z analogicznym regionem w szczepie ATCC 8293. Liczba powtó-

rzeń tripletu Gly-X-Y domeny kolagenopodobnej białka LEUM_1748 wydaje się być cechą szczepową.

Skład aminokwasowy kolagenopodobnego białka produkowanego przez badane szczepy był zbliżony do

homologicznego białka szczepu Ln. mesenteroides ATCC 8293. Kolagenopodobne białko LEUM_1748

może być źródłem aminokwasów egzogennych.

109

IV-9 P | MSMEG 4305 nie jest niezbędny dla przeżywalności M. smegmatis

Górna A.1,2, Dziadek J.1

1 Instytut Biologii Medycznej PAN, Łódź 2 Instytut Mikrobiologii, Biotechnologii i Immunologii, Uniwersytet Łódzki, Łódź

e-mail: agorna@cbm.pan.pl

Wstęp: Stosowana obecnie farmakoterapia gruźlicy, określonej przez Światową Organizację Zdrowia

jako jedna z najpoważniejszych chorób zakaźnych naszych czasów, wymaga od pacjenta długotrwałego

przyjmowania kilku leków równocześnie. Rosnąca liczba szczepów lekoopornych i wielolekoopornych

oraz krótka lista dostępnych związków przeciwgruźliczych zmuszają do poszukiwania nowych tarcz

molekularnych, w które mogłyby być skierowane leki przeciwprątkowe. Atrakcyjnym celem dla nowych

chemoterapeutyków wydają się być enzymy niezbędne dla procesów warunkujących przeżywanie

patogenu podczas infekcji, takich jak replikacja DNA. Do enzymów tego rodzaju zaliczana jest RNaza H

odpowiedzialna za usuwanie starterów RNA podczas replikacji DNA. U organizmu modelowego dla

rodzaju Mycobacterium, M. smegmatis, istnieją 3 geny kodujące białka wykazujące aktywność RNazy H-

MSMEG2442, MSMEG5562, MSMEG4305. Cel pracy: W niniejszej pracy określono rolę genu

MSMEG4305 dla przeżywalności M. smegmatis. Metody: W celu uzyskania ukierunkowanego mutanta

M. smegmatis pozbawionego funkcjonalnej kopii genu MSMEG4305 wykorzystano metodę wymiany alleli

na drodze rekombinacji homologicznej. W tym celu skonstruowano rekombinowany plazmid zawierający

sekwencje flankujące generowaną delecję, który następnie wprowadzono do komórek mykobakteryjnych

na drodze elektroporacji. Obecność wygenerowanej delecji w genomie M. smegmatis potwierdzono

metodą PCR. Wyniki: Uzyskano mutanta M. smegmatis pozbawionego funkcjonalnej kopii genu

MSMEG4305. Wnioski: W genomie M. smegmatis zidentyfikowano 3 geny, których produkt może

zawierać w swojej strukturze potencjalną domenę RNazy H. Można zatem przypuszczać, że brak produk-

tu genu MSMEG4305 w komórkach M. smegmatis jest rekompensowany dzięki obecności tych białek.

IV-10 P | Modyfikacja bakteryjnego systemu dwuhybrydowego ograniczająca wyniki fałszywie

pozytywne

Górna A.1,2, Dziadek J.1

1 Instytut Biologii Medycznej PAN, Łódź 2 Instytut Mikrobiologii, Biotechnologii i Immunologii, Uniwersytet Łódzki, Łódź

e-mail: agorna@cbm.pan.pl

Wstęp: Bakteryjny system dwuhybrydowy jest metodą identyfikacji oddziaływań pomiędzy białkami.

Konstruuje się plazmidy zawierające sekwencję analizowanego peptydu oraz plazmidy zawierające

sekwencję peptydów potencjalnie oddziałujących- przykładowo fragmenty biblioteki genomowej. Tak

przygotowane plazmidy wprowadza się do komórek bakteryjnych i identyfikuje oddziaływania pomiędzy

produktami ich ekspresji na podłożach selektywnych. Metoda ta charakteryzuje się wysokim odsetkiem

wyników fałszywie pozytywnych. Mylnie identyfikowane mogą być klony wzrastające na obrzeżach płytek

oraz zawierające w strukturze białka domeny transbłonowe lub wiązania ATP lub GTP. Cel pracy:

Modyfikacja bakteryjnego systemu dwuhybrydowego w celu ograniczenia wyników fałszywie pozytyw-

nych. Metody: Wykorzystano rekombinowane plazmidy bakteryjnego systemu dwuhybrydowego pUT18 i

pUT18C zawierające domenę prymazową ligazy D M. tuberculosis H37Rv oraz plazmidy pKT25 zawiera-

jące fragmenty biblioteki genomowej M. tuberculosis H37Rv. Plazmidy wprowadzono do komórek E. coli

BTH101 i wysiewano po około 300 kolonii na płytkę lub w formie murawy na podłoże LB z dodatkiem

IPTG i XGal. Oddziaływania identyfikowano na podstawie aktywności genu lacZ'. Oddziałujące klony

przesiewano na podłoże selekcyjne eliminując fałszywie pozytywne oddziaływania wynikające z roz-

mieszczenia klonów na płytce. Z wyselekcjonowanych klonów izolowano plazmidy i sekwencjonowano

110

fragment biblioteki genomowej. Oddziaływania potwierdzano poprzez ponowną transformację mieszaniną

plazmidów komórek E. coli BTH101. Wyniki: Zanalizowano w przybliżeniu po 30 000 klonów wysiewając

komórki na podłoże w postaci pojedynczych kolonii lub w formie murawy. Analiza mutantów wysiewanych

w formie kolonii wskazała 25 klonów. Zidentyfikowano 23 sekwencje- 19 pojawiło się jednokrotnie (12 ze

zidentyfikowanych białek zawierało w swojej strukturze domeny transbłonowe) oraz dwie dwukrotnie (oba

białka zawierały domeny transbłonowe). Analiza mutantów wysiewanych w formie murawy wskazała 16

klonów. Zidentyfikowano osiem sekwencji- sześć pojawiło się jednokrotnie (cztery białka z domeną

transbłonową oraz dwa zawierające miejsca wiązania ATP, GTP), jedna trzykrotnie (z domeną transbło-

nową) i jedna siedmiokrotnie. Oddziaływania potwierdzono jedynie w przypadku sekwencji zidentyfiko-

wanej siedmiokrotnie. Wnioski: Modyfikacja metody w postaci wysiewania bakterii w formie murawy

ogranicza ilość wyników fałszywie pozytywnych.

IV-11 P | Interakcje HtpG - DnaA u Escherichia coli, badania in vivo i in vitro

Grześ K., Grudniak A.M.

Zakład Genetyki Bakterii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski

e-mail: katarzynagrzes@student.uw.edu.pl

Wstęp: Bakteryjne białko HtpG (ang. high temperature protein G) to najsłabiej scharakteryzowany

przedstawiciel rodziny białek Hsp90. Należy ono do grupy białek opiekuńczych biorących udział

w ochronie komórek przed działaniem niekorzystnych warunków środowiska. Pełnione przez HtpG

funkcje, jak dotąd, nie zostały dobrze poznane. Kluczowym aspektem określenia roli tego białka

w komórce bakteryjnej jest między innymi poznanie jego zdolności do tworzenia kompleksów z innymi

cząsteczkami białkowymi. DnaA jest białkiem niezbędnym w procesie inicjacji replikacji chromosomowe-

go DNA w komórkach bakteryjnych. Cel pracy: W niniejszej pracy badano interakcje pomiędzy białkami

HtpG i DnaA w układzie in vivo przy pomocy bakteryjnego systemu dwuhybrydowego, jak również in vitro

z wykorzystaniem zmodyfikowanej metody “pull down” oraz reakcji sieciowania z udziałem oczyszczo-

nych białek. Metody: Oddziaływania między białkami identyfikowano z wykorzystaniem systemu dwuhy-

brydowego zaproponowanego w 2001 roku przez Di Lallo i wsp. [1]. Białka HtpG i DnaA oczyszczono

metodą chromatografii powinowactwa z wykorzystaniem systemu ekspresyjnego pET-28a, dzięki dołą-

czonym domenom polihistydynowym na C-końcu każdego z białek. W układzie in vitro badanie oddziały-

wań prowadzono z wykorzystaniem zmodyfikowanej metody “pull down” [2] oraz reakcji sieciowania

białek za pomocą aldehydu glutarowego i z udziałem DSP [ang. dithiobis(succinimidylpropionate)].

Wyniki: Badania z wykorzystaniem bakteryjnego systemu dwuhybrydowego wykazały istnienie silnych

oddziaływań między białkami HtpG i DnaA. Analizy w układzie in vitro z wykorzystaniem chromatografii

metalopowinowactwa na kolumnie z Ni-NTA agarozą potwierdziły występowanie wspomnianych interakcji

między HtpG i DnaA. Kompleksy obu białek identyfikowano bez względu na obecność czynników induku-

jących (tj. ADP lub ATP). Wyniki otrzymane w reakcjach sieciowania białek również potwierdziły wspo-

mniane oddziaływania. Wnioski: Białko szoku cieplnego HtpG oddziałuje z DnaA, białkowym inicjatorem

replikacji DNA chromosomowego, w układzie in vivo i in vitro. Może to wskazywać na pośredni udział

bakteryjnego przedstawiciela Hsp90 w inicjacji replikacji chromosomu E. coli.

____________________

[1] Di Lallo i wsp., 2001, Microbiol. 147:1651-1656.

[2] Kedzierska i wsp., 2005, Arch. Biochem. Biophis. 444:61-65.

111

IV-12 P | Konstrukcja rekombinowanego szczepu Pichia pastoris z nadekspresją antygenu SAG1

Toxoplasma gondii

Grzybowski M.1, Dziadek B.1, Dziadek J.2, Gatkowska J.1, Dzitko K.1, Długońska H.1

1 Zakład Immunoparazytologii, Uniwersytet Łódzki, Łódź 2 Instytut Biologii Medycznej, Polska Akademia Nauk, Łódź

e-mail: marcin@biol.uni.lodz.pl

Wstęp: Toksoplazmoza będąca wynikiem zarażenia pierwotniakiem Toxoplasma gondii jest jedną

z najbardziej rozpowszechnionych na świecie antropozoonoz. Przebiegające na ogół skąpoobjawowo

zarażenie T. gondii stanowi poważne zagrożenie dla kobiet w ciąży, ze względu na możliwość transmisji

pasożyta do płodu, a także dla osób z niesprawnym lub osłabionym układem immunologicznym, jak

zakażeni HIV czy biorcy przeszczepów. Co więcej, wysoka częstość zarażeń wśród zwierząt hodowla-

nych, takich jak owce, przyczynia się do znacznych strat ekonomicznych. Brak skutecznych metod

eradykacji T. gondii stwarza potrzebę opracowania skutecznej szczepionki ochronnej. Dostępny

w nielicznych krajach preparat Toxovax®, oparty na atenuowanym szczepie S48 T. gondii, jest stosowany

wyłącznie w weterynarii, a ponadto nie zapewnia pełnej ochrony przed inwazją pasożyta. Obiecującą

alternatywą są szczepionki nowej generacji, w tym szczepionki podjednoskowe, zawierające ściśle

wyselekcjonowane antygeny wyprodukowane drogą inżynierii genetycznej. Wśród potencjalnych antyge-

nów szczepionkowych, jednym z najlepiej poznanych jest główny antygen powierzchniowy tachyzoitów –

silnie immunogenne białko SAG1 (p30). Cel pracy: Sklonowanie genu sag1 T. gondii RH oraz uzyskanie

wysokiego stopnia ekspresji tego genu w komórkach metylotroficznych drożdży Pichia pastoris. Materia-

ły i metody: Na matrycy genomowego DNA T. gondii RH zamplifikowano fragment genu kodującego

białko SAG1 o długości 882 pz i poddano ligacji z wektorem pJET1.2/blunt. Następnie wytrawioną

wstawkę klonowano w wektorze ekspresyjnym pPICZ A, a uzyskanym konstruktem transformowano

komórki P. pastoris X-33 metodą elektroporacji, wykorzystując przy tym mechanizm homologicznej

rekombinacji z genomem gospodarza. Nadekspresję rekombinowanego białka indukowano na podłożu

minimalnym z metanolem, a supernatanty uzyskane po lizie zebranych komórek analizowano metodą

SDS-PAGE oraz Western Blot. Wyniki: Otrzymano transformanty P. pastoris produkujące wewnątrzko-

mórkowo rekombinowane białko SAG1 T. gondii RH. Wnioski: System ekspresyjny P. pastoris umożliwia

wydajną produkcję rekombinowanego antygenu SAG1 – pierwszego komponentu opracowywanej

podjednostkowej szczepionki przeciw toksoplazmozie.

____________________

Projekt współfinansowany ze środków Unii Europejskiej w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego oraz ze środ-

ków Uniwersytetu Łódzkiego w ramach dofinansowania badań młodych naukowców (grant nr 545/266).

C z ł o w i e k – n a j l e p s z a i n w e s t y c j a

112

IV-13 P | Wpływ gronkowcowego układu toksyna-antytoksyna pemIKSa na dziedziczenie plazmidu

oraz wzrost populacji bakteryjnej

Ilczyszyn W.M.2, Bukowski M.1, Międzobrodzki J.2, Dubin A.1, Władyka B.1

Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii Uniwersytetu Jagiellońskiego

1Zakład Biochemii Analitycznej 2Zakład Mikrobiologii

e-mail: weronika.ilczyszyn@uj.edu.pl

Wstęp: Operon pemIKSa odkryty w szczepie Staphylococcus aureus CH-91 jest jedynym do dzisiaj

znanym przykładem kodowanego plazmidowo gronkowcowego układu toksyna-antytoksyna. Składa się

on z dwóch elementów: stabilnej toksyny PemKSa i labilnej antytoksyny PemISa. Badania wykazały, iż

toksyna PemKSa jest endorybonukleazą - interferazą mRNA, rozpoznającą specyficzną sekwencję

w obrębie bakteryjnego mRNA. W przypadku utraty plazmidu zahamowanie ekspresji genu antytoksyny

prowadzi do aktywacji toksyny a tym samym do wejścia komórki w stan bakteriostazy. Postuluje się, iż

mechanizm ten odgrywa ważną rolę w stabilnym utrzymywaniu się w populacji pozachromosomowych

elementów genetycznych. Cel pracy: Celem pracy była charakterystyka funkcjonalna operonu toksyna-

antytoksyna odkrytego w plazmidzie szczepu Staphylococcus aureus CH-91. Materiały i metody:

Przeprowadzono test stabilności dziedziczenia systemu heterologicznej ekspresji białek PemI i PemK

otrzymanego w systemie pETDuet/pACYCDuet w populacji bakteryjnej Escherichia coli DH5α. Klonowa-

nie operonu pem do wektora pALC/P2/GFP pozwoliło na uzyskanie wektora z koekspresją układu

toksyna-antytoksyna pemIK i białka zielonej fluorescencji (GFP). Test stabilności otrzymanego konstruktu

pALC/P2/GFP/pemIK przeprowadzono w populacji bakteryjnej S. aureus RN4220. Wpływ ekspresji

toksyny PemKSa na dynamikę wzrostu populacji bakterii E. coli BL21 analizowano w hodowlach bakteryj-

nych na płytkach 96-dołkowych wykonując pomiary gęstości optycznej w odstępach 10 minutowych.

Żywotność komórek bakeryjnych sprawdzano zestawem LIVE/DEAD® BacLight™ Bacteria Viability Kit

(Invitrogen). Wyniki: Wykazano przy użyciu metody replik, iż w szczepie E. coli DH5α plazmid kodujący

antytoksynę był stabilnie dziedziczony w populacji niosącej plazmid z genem toksyny przez miesiąc,

pomimo braku czynników selekcyjnych. Konstrukt pALC/P2/GFP/pemIK był utrzymywany w populacji

S. aureus RN4220 znacznie dłużej niż plazmid kontrolny w podłożu płynnym bez dodatku antybiotyków.

Indukcja ekspresji toksyny PemKSa hamowała wzrost populacji bakteryjnej przy równoczesnym braku

spadku żywotności komórek. Wnioski: Uzyskane wyniki potwierdzają funkcjonowanie elementów kodo-

wanych przez gronkowcowy operon pemIKSa w roli układu toksyna-antytoksyna i sugerują ich potencjalny

wpływ na stabilne dziedziczenie plazmidu pCH91, a także na zdolność modulacji dynamiki wzrostu

populacji bakteryjnej.

____________________

Praca częściowo finansowana z projektu MNiSW nr N N303 813340.

IV-14 | Ocena stabilności wzoru molekularnego szczepów Mycobacterium tuberculosis complex

wyhodowanych na przestrzeni 7 lat od osób blisko spokrewnionych

Kozińska M., Zwolska Z., Augustynowicz-Kopeć E.

Zakład Mikrobiologii, Instytut Gruźlicy i Chorób Płuc, Warszawa

e-mail: m.kozinska@igichp.edu.pl

Wstęp. W trakcie rozprzestrzeniania się zakażenia gruźlicą, prątki wydalane są z kaszlem przez chorego

i dostają się do organizmu innej osoby. Do chwili rozwoju aktywnej gruźlicy u osoby zakażonej, w okresie

latencji mogą mieć miejsce zmiany w genomie transmitowanego szczepu. Różnice we wzorze moleku-

larnym szczepów izolowanych w różnym odstępie czasu spowodowane są najczęściej rearanżacjami

genowymi, na które przede wszystkim wpływa charakter choroby, czas jej trwania, leczenie, a także

113

zmiana gospodarza w czasie transmisji. Niewielkie różnice we wzorach DNA nie wykluczają pokrewień-

stwa szczepów i pozwalają przypuszczać, że są one powiązane klonalnie i pochodzą ze wspólnego

źródła.Badania nad dynamiką zmian profili DNA sugerują, że szybkość rearanżacji nie jest wartością

stałą i uzależniona jest od zegara molekularnego badanego markera oraz osiąga różne tempo w różnych

regionach geograficznych. W przypadku metody IS6110-RFLP wiąże się także z liczbą kopii sekwencji

IS6110.Celem pracy była ocena stabilności wzoru molekularnego szczepów M. tuberculosis complex

wyizolowanych na przestrzeni 7 lat od chorych blisko spokrewnionych – ojca i siedmiorga dzieci. Mate-

riały i metody. W analizie oceniono stabilność profilu DNA 11 szczepów wyhodowanych od chorych

w latach 2003-2010. Szczepy pochodziły od wielodzietnej rodziny, a której na gruźlicę chorował ojciec

i 12 dzieci. DNA genomowe poddawano analizie molekularnej obejmującej 4 metody typowania: spoligo-

typing, IS6110-Mtb1-Mtb2 PCR, MIRU-VNTR oraz IS6110-RFLP. Wyniki. W analizie spoligotyping,

IS6110-Mtb1-Mtb2 PCR oraz MIRU-VNTR szczepy były identyczne i tworzyły jeden klaster molekularny.

Typowanie IS6110-RFLP podzieliło badaną pulę szczepów na 2 rodziny molekularne (3 i 8 szczepów)

różniące się 1 prążkiem. Wnioski. Szczepy M. tuberculosis complex wyizolowane od 8 członków rodziny,

na przestrzeni 7 lat zachowały stabilną budowę DNA w regionie DR oraz w obrębie loci MIRU-VNTR.

Zaobserwowane zmiany we wzorze IS6110-RFLP szczepów nie wykluczają ich bliskiego pokrewieństwa

i przynależności do wspólnego łańcucha transmisji. Można przypuszczać, że pojawienie się dodatkowej

sekwencji IS6110 w genomie 3 szczepów wiąże się z długotrwałym okresem latencji u chorych, wielo-

krotnymi kursami leczenia (ojciec chorował 5-krotnie) oraz częstą zmianą gospodarza. Biorąc pod uwagę

fakt, że rearanżacje genomowe zaobserwowano jedynie w typowaniu IS6110-RFLP, wykluczenie tej

metody z algorytmu molekularnych badań epidemiologicznych w gruźlicy uniemożliwia obserwację

pojawiania się zmian we wzorach DNA szczepów.

IV-15 P/O | Charakterystyka mykobakteryjnej primazy DnaG jako miejsca docelowego dla nowych

leków przeciwgruźliczych

Kuroń A., Korycka-Machała M., Dziadek J.

Instytut Biologii Medycznej Polskiej Akademii Nauk, Lodowa 106, Łódź

e-mail: kanetka1@o2.pl

Wstęp: Primaza DnaG jest kluczowym enzymem uczestniczącym w replikacji DNA, będącej centralnym

procesem w podziałach komórkowych. Jest to specyficzna polimeraza RNA zależna od DNA, która

posiada zdolność syntezy de novo krótkich 5 – 10 nukleotydowych fragmentów RNA, pełniących rolę

primerów. Primaza, kodowana przez gen dnaG, występuje jedynie w komórkach bakteryjnych, zaś

u eukariontów aktywność primazy posiada jedna z podjednostek polimerazy DNA. Różnica w występo-

waniu genu dnaG oraz fakt, że jest to gen niezbędny dla funkcjonowania organizmów stała się podstawą

do rozpoczęcia badań nad możliwością wykorzystania mykobakteryjnej primazy DnaG jako potencjalne-

go miejsca docelowego dla nowych tuberkulostatyków. Cel pracy: Oprócz bakteryjnej primazy DnaG

w komórkach mykobakterii zidentyfikowano jeszcze 3 białka o aktywności primazy. Dlatego celem pracy

było przygotowanie modelu pozwalającego na weryfikację niezbędności primazy DnaG w komórkach

prątków po przez możliwość zastąpienia funkcjonalnego białka DnaG przez inne primazy mykobakterii

w warunkach ich nadprodukcji. Metody: Niezbędność genu dnaG oceniano wykorzystując system

homologicznej rekombinacji, który pozwala na selekcję pojedynczych (SCO) i podwójnych (DCO) krzy-

żowych rekombinantów. Uzyskane mutanty SCO komplementowano plazmidami integracyjnymi, zawiera-

jącymi geny badanych primaz znajdujących się pod kontrolą promotora acetamidowego. Białko DnaG

poddano również nadprodukcji w komórkach E. coli a następnie oczyszczono metodą chromatografii

powinowactwa i wykorzystano dla otrzymania swoistej surowicy odpornościowej. Wyniki: Przeprowadzo-

ne analizy wykazały, że DnaG jest niezbędna dla przeżycia komórek mykobakterii nawet w warunkach

nadprodukcji innych białek o aktywności primazy. Uzyskano warunkowe mutanty M. smegmatis, gdzie

114

jedyna funkcjonalna kopia genu dnaG (z M. smegmatis i M. tuberculosis) znajdowała się pod kontrolą

chemicznie regulowanego promotora. Poziom DnaG w komórkach szczepu dzikiego i mutantów monito-

rowano z wykorzystaniem uzyskanej poliwalentnej surowicy odpornościowej. Wnioski: Przeprowadzone

badania jednoznacznie wykazały, że obecność białka DnaG jest niezbędna dla przeżycia mykobakterii

i może ono być rozważane jako potencjalne miejsce docelowe dla nowych leków przeciwgruźliczych.

IV-16 P | Analiza genomiczna plazmidu p62BP1 szczepu Psychrobacter sp. 62B

Lasek R., Bartosik D.

Zakład Genetyki Bakterii, Instytut Mikrobiologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski

e-mail: r.lasek@student.uw.edu.pl

Wstęp: Bakterie z rodzaju Psychrobacter występują powszechnie w regionach polarnych oraz na obsza-

rach wiecznej zmarzliny (ponad 25% powierzchni Ziemi). Nasza wiedza o ruchomych elementach gene-

tycznych tych bakterii jest fragmentaryczna. Obiektem niniejszych badań jest plazmid pochodzący ze

szczepu Psychrobacter sp. 62B wyizolowanego na wyspie Spitsbergen z guana arktycznych ptaków –

traczyków lodowych (Alle alle). Cel pracy: Przeprowadzono kompleksową analizę bioinformatyczną

sekwencji nukleotydowej plazmidu p62BP1 (34 467 bp) w celu wyodrębnienia i zdefiniowania poszcze-

gólnych modułów genetycznych tego replikonu. Metody: Do wyznaczenia otwartych ramek odczytu użyto

programów Artemis, ORF Finder i Clone Manager. Analizę porównawczą sekwencji z danymi zdepono-

wanymi w bazie GenBank przeprowadzono przy pomocy programów BLAST. Przyrównania sekwencji

(alignments) wykonano w programie MUSCLE. Do pozostałych analiz wykorzystano narzędzia dostępne

on-line. Wyniki: W p62BP1 zidentyfikowano moduł replikacyjny (REP), system partycyjny (PAR), moduł

fenotypowy oraz dwa systemy restrykcji-modyfikacji (R-M). Białka modułów REP i PAR są homologiczne

z białkami kodowanymi w znanych replikonach Psychrobacter spp. oraz innych Gammaproteobacteria.

Organizacja miejsca origin replikacji wykazuje podobieństwo strukturalne do oriV plazmidu pPS10. Geny

modułu fenotypowego, potencjalnie tworzące operon, kodują enzymy szlaku przemian reszt alkilowych

siarczanów organicznych do acylo-CoA. Jednym z możliwych wyjściowych substratów jest dodecylosiar-

czan sodu (SDS). Ekspresja genów operonu potencjalnie może być zależna od aktywności regulatora

transkrypcji z rodziny AraC/XylS. Enzymy systemów R-M, specyficzne wobec sekwencji 5’-CCNGG-3’,

wykazują wzajemne podobieństwo na poziomie 99% (C5-metylotransferazy, MT) i 96% (endonukleazy

restrykcyjne, EN). Geny MT i EN ułożone są w obu przypadkach w przeciwnej orientacji transkrypcyjnej

(rzadko spotykanej w systemach R-M), w taki sposób, że ich kodony STOP zachodzą na siebie. Wnioski:

W badanym plazmidzie występują – oprócz modułów odpowiedzialnych za jego replikację i stabilność

(REP, PAR, prawdopodobnie także R-M) – również geny enzymów szlaku metabolicznego o potencjal-

nym znaczeniu przystosowawczym. Na podstawie analiz porównawczych można zaproponować modele

regulacji ekspresji genów zidentyfikowanych modułów genetycznych. Wyniki niniejszej pracy stanowią

punkt wyjścia do dalszych badań eksperymentalnych.

IV-17 P/O | Izolacja aktywności przeciwdrożdżowych i przeciwprątkowych z endosymbiotycznych

dla dżdżownicy Dendrobaena veneta bakterii Raoultella ornithinolytica

Pernach K.1, Nowak A.1, Grzywnowicz K.1, Fiołka M.2

1Zakład Biochemii, Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej, Lublin, 2Zakład Immunologii Bezkręgowców, Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej, Lublin

e-mail: grzyw@poczta.umcs.lublin.pl

Wstęp: Pierścienice (Annelida), w tym dżdżownice, rozwinęły różne mechanizmy odporności przed

zainfekowaniem ich przez mikroorganizmy. Są organizmami o stosunkowo dużej długości życia i stosun-

115

kowo dobrze przebadanymi, pod kątem immunologii porównawczej, bezkręgowcami. W środowisku

naturalnym dżdżownice odżywiają się substratami zawierającymi duże ilości mikroorganizmów, w tym

grzybów i bakterii, a nie wszystkie z nich są trawione. Zawartość przewodu pokarmowego dżdżownic ma

w związku z tym selektywne aktywności supresyjne, przeciw różnym mikroorganizmom dostającym się

do niego, w tym patogenom. Cel pracy: W niniejszej pracy oceniono aktywność przeciwdrożdżową

i przeciwprątkową izolatów z supernatantu kultur bakterii endosymbiotycznych Raoultella ornithinolytica.

Próbowano także określić właściwości biochemiczne i enzymologiczne wyizolowanych preparatów oraz

ich subfrakcji. Metody: Ze ściany jelita Dendrobaena veneta wyizolowano bakterie Raoultella ornithinoly-

tica, wykazujące między innymi aktywność przeciwdrożdżową i przeciwprątkową. Przy pomocy ultrafiltra-

cji podzielono supernatant kultury bakterii na frakcje 14-50, 50-100 i powyżej 100 kDa. Następnie doko-

nano izolacji subfrakcji przy pomocy chromatografii jonowymiennej i filtracji żelowej. Otrzymywane izolaty

poddawano analizie na aktywność przeciwdrożdżową (przeciw Candida albicans) i przeciwprątkową

(przeciw Mycobacterium tuberculosis), a także pod kątem typu aktywności zawartych w nich substancji

biologicznie aktywnych (aktywność lizozymu, proteolityczna, poziom inhibitorów proteaz, glikoprotein

oraz lipoprotein). Wykonano również analizy elektroforetyczne. Wyniki: Badania wykazały, że frakcja

wysokocząsteczkowa (powyżej 100 kDa) dzieliła sie na anionicie na trzy subfrakcje o różnych właściwo-

ściach biochemicznych, enzymologicznych i antybiotycznych. Zawierająca najwięcej białka frakcja po

chromatografii jonowymiennej wykazywała podział na dwa piki w trakcie filtracji żelowej. Frakcja średnio-

cząsteczkowa (50-100 kDa) wykazywała jeden pik w chromatografii na anionicie. Pik ten dzielił się na

trzy subfrakcje w trakcie filtracji żelowej. W przypadku frakcji średniocząsteczkowej również występowały

różnice we właściwościach. Frakcja niskocząsteczkowa (14-50 kDa) nie dała na razie zadowalających

rozdziałów. Wnioski: Można przypuszczać, że po dopracowaniu techniki izolacji/oczyszczania uda się

otrzymać z supernatantu kultur bakterii endosymbiotycznych Raoultella ornithinolytica frakcje substancji

biologicznie aktywnych, o konkretnych właściwościach antybiotycznych (przeciwdrożdżowe lub przeciw-

prątkowe) oraz zdefiniowanym składzie biochemicznym.

IV-18 P | Występowanie genów biosyntezy petrobaktyny u bakterii z grupy Bacillus cereus.

Pietraszek P., Ołtuszak-Walczak E., Walczak P.

Instytut Technologii Fermentacji i Mikrobiologii, Zakład Mikrobiologii Technicznej, Politechnika Łódzka

e-mail: patrycja.pietraszek@edu.p.lodz.pl

Wstęp: Żelazo jest mikroelementem odgrywającym kluczową rolę w podstawowych procesach biologicz-

nych każdej żywej komórki. Stężenie tego pierwiastka w środowisku naturalnym waha się od 10-9 do 10-18

mol/l. Podobnie przedstawia się sytuacja w płynach ustrojowych organizmów wyższych, co uwarunkowa-

ne jest wiązaniem żelaza przez takie białka jak laktoferyna, transferyna czy ferrytyna. Bakterie patogenne

pokonując bariery ochronne gospodarza syntetyzują cząsteczki zwane sideroforami wiążące żelazo

z bardzo wysoką swoistością i powinowactwem przez co zwiększają jego biodostępność i zapewniając

sibie korzystne warunki rozwojowe. Bakterie reprezentujące grupę Bacillus cereus podobnie jak inne

organizmy tlenowe i względnie beztlenowe w warunkach „głodu” żelazowego syntetyzują jonofory jonów

żelaza: bacillibaktynę i petrobaktynę. Pierwsza z nich syntetyzowana jest przez wiele gatunków należą-

cych do rodzaju Bacillus, podczas gdy petrobaktyna produkowana jest głównie przez bakterie z grupy

cereus, a co więcej uważana jest za czynnik wzmagający ich wirulencję. Cel pracy: Badania sprowadza-

ły się do opracowania metody umożliwiającej jednoczesne wykrywanie w genomie bakterii należących

do grupy Bacillus cereus operonu kodującego biosyntezę petrobaktyny wraz z poprzedzającym go

promotorem. Metody: Zaplanowane badania wymagały zaprojektowania uniwersalnych primerów do

reakcji PCR komplementarnych do DNA w rejonie pierwszego genu strukturalnego petrobaktyny asbA

(primery P2 i P3) oraz w rejonie poprzedzającego go promotora (primer P1). W tym celu wykorzystano

sekwencje operonów asb ze szczepów B. cereus (9), B. anthracis (4) oraz B. thuringensis (2) z bazy

116

danych (GeneBank). Analizie poddano 45 szczepów bakterii należących do grupy Bacillus cereus wyizo-

lowanych z żywności i środowiska naturalnego, w tym B. cereus, B. thuringensis oraz B. mycoides.

Zastosowanie pary starterów P2-P3 pozwalało na stwierdzenie obecności genu asbA, a zaangażowanie

pary P1-P3 umożliwiało wykrycie promotora tego genu. Wyniki: Wykazano, iż większość z badanych

szczepów, tj. 36 z 45, zawiera pierwszy gen operonu asb (asbA, w tym również szczepy B. mycoides),

a dodatkowo 34 z nich zawierają poprzedzający go region promotorowy. Wnioski: Otrzymane wyniki

wskazują, że operon biosyntezy petrobaktyny występuje u wszystkich gatunków bakterii należących do

grupy cereus. Cecha ta jest szeroko rozpowszechniona i jej występowanie nie ogranicza się jedynie do

chorobotwórczych szczepów B. anthracis i B. cereus, występuje też u uznanych za nie patogenne

szczepów B. mycoides.

IV-19 P | Oznaczanie poziomu uszkodzeń alkilacyjnych DNA u chorych na nowotwory głowy i szyi

przy użyciu białek MutS, MutL oraz MutH

Rusin P.1, Majsterek I.2

1 Katedra Genetyki Molekularnj, Uniwersytet Łódzki 2 Zakład Chemii i Biochemii Klinicznej, Uniwersytet Medyczny w Łodzi

e-mail: pawelrusin@gmail.com

Wstęp: Rozwój choroby nowotworowej może być związany z obniżeniem wydajności naprawy uszko-

dzeń DNA oraz wzrostem wrażliwości na mutageny środowiskowe. Wśród czynników związanych ze

zwiększoną częstością występowania płaskonabłonkowych nowotworów głowy i szyi (HNSCC) szczegól-

na uwagę zwraca się na dym tytoniowy oraz inne czynniki powodujące alkilację DNA. Alkilacja, najczę-

ściej metylacja i acetylacja, prowadzi do powstania różnych pochodnych zasad azotowych. Czynniki

alkilujące mogą zatem doprowadzić do błędnego sparowania zasad, utraty zasad azotowych bądź

pęknięć DNA. Cel pracy: Celem naszych badań było określenie poziomu alkilacyjnych uszkodzeń

endogennych w komórkach pochodzących od pacjentów z nowotworami głowy szyi. Metody: W bada-

niach zastosowalno modyfikacje alkaicznej wersji testu kometowego (comet assay). Uszkodzenia alkila-

cyjne oceniano poprzez wzrost ilości pęknięć dwuniciowych po zastosowanie białek naprawy błędnie

sparowanych zasad (MMR, ang. mismatch repair) – MutS, MutL oraz MutH. Wyniki: Zaobserwowano iż

poziom uszkodzeń alkilacyjnych był wyższy w badanych komórkach pacjentów z HNSCC w porównaniu

do poziomu w komórkach pochodzących od osób zdrowych. Wnioski: Uzyskane wyniki wskazują na to,

że podwyższony poziom uszkodzeń alkilacyjnych może odgrywać znaczącą rolę w mechanizmie kance-

rogenezy oraz może stanowić marker rozwoju nowotworów głowy i szyi.

____________________

Projekt współfinansowany ze środków Unii Europejskiej w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego.

IV-20 P | Analiza ekspresji OmpR-zależnych genów regulonu rzęskowego Y. enterocolitica O:9

w poszukiwaniu bodźców środowiskowych aktywujących szlak sygnałowy EnvZ/OmpR

Skorek K., Raczkowska A., Brzostek K.

Zakład Mikrobiologii Stosowanej, Instytut Mikrobiologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski

e-mail: kbrzostek@biol.uw.edu.pl

Wstęp: Yersinia enterocolitica jest ludzkim enteropatogenem - czynnikiem etiologicznym jersiniozy, która

po campylobakteriozie i salmonellozie jest najczęściej występującą w UE zoonozą. Dwuskładnikowe

systemy transdukcji sygnału w komórkach bakteryjnych umożliwiają regulację ekspresji odpowiednich

genów i efektywną adaptację do zmieniających się warunków środowiskowych. Dotychczasowe badania

sugerują, że dwuskładnikowy szlak sygnałowy EnvZ/OmpR Y. enterocolitica koordynuje ekspresję genów

wirulencji – w tym genów regulonu rzęskowego, w odpowiedzi na bodźce pochodzące z organizmu

117

gospodarza. Cel pracy: W pracy postanowiono zbadać wpływ różnorodnych czynników środowiskowych

na ekspresję OmpR-zależnych genów regulonu rzęskowego kodujących: FlhDC – nadrzędny aktywator

regulonu, FliA – alternatywny czynnik 28 oraz YplA – fosfolipazę A, w celu potwierdzenia hipotezy

o skoordynowanej, kaskadowej regulacji ekspresji OmpRFlhD/FlhCFliAYplA. Celem tych analiz

było także wskazanie bodźców aktywujących szlak EnvZ/OmpR. Metody: W badaniach wykorzystano

szczepy niosące fuzje transkrypcyjne promotorów genów regulonu rzęskowego: flhDC, fliA oraz yplA

z genem reporterowym lacZ, skonstruowane w szczepie dzikim Ye9 oraz izogenicznym mutancie

ompR. Aktywność promotorów badano w różnej temperaturze, pH oraz w obecności związków poten-

cjalnie aktywujących szlak sygnałowy EnvZ/OmpR, m.in. NaCl, prokainy oraz indolu. Wyniki: Badania

z zastosowaniem reporterowych fuzji transkrypcyjnych wykazały wpływ warunków środowiskowych na

poziom ekspresji genów flhDC, fliA oraz yplA. Podwyższenie temperatury z 26 °C do 37 °C w znacznym

stopniu zmniejszyło aktywność wszystkich analizowanych fuzji zarówno w szczepie dzikim, jak

i w mutancie ompR. Maksimum ekspresji badanych genów obserwowano w pH 7,0, a podwyższenie

oraz obniżenie pH miało hamujący wpływ na aktywność promotorów bez względu na obecność OmpR.

Podobny efekt obserwowano w warunkach zwiększonej osmolarności (dodanie NaCl). Indol, związek

zakłócający funkcjonowanie błony zewnętrznej, wyraźnie zwiększał aktywność analizowanych promoto-

rów w szczepie dzikim. Efekt ten był zniesiony w szczepie nie syntetyzującym białka OmpR. Wnioski:

OmpR jest pozytywnym regulatorem ekspresji wszystkich analizowanych genów regulonu rzęskowego

zgodnie z przyjętą wcześniej hipotezą. Termoregulacja oraz osmoregulacja ekspresji badanych genów

jest niezależna od aktywności regulatora OmpR. Jedynym induktorem szlaku transdukcji sygnału

EnvZ/OmpR kontrolującym analizowane geny jest indol.

IV-21 P | Badanie aktywności antybakteryjnej pochodnych tiosemikarbazydów

Strzelczyk A., Stączek P.

Zakład Genetyki Drobnoustrojów, Instytut Mikrobiologii, Biotechnologii i Immunologii,

Uniwersytet Łódzki, Łódź

e-mail: ola.strzelczyk@wp.pl

Wstęp: Systematycznie rosnąca liczba szczepów bakterii opornych na antybiotyki jak np. oporny na

metycylinę Staphylococcus aureus (MRSA), wielolekooporne pałeczki Pseudomonas czy wankomycyno-

oporne szczepy Enterococcus stanowi ogromny problem, a jednocześnie wyzwanie dla mikrobiologów

i lekarzy zajmujących się antybiotykoterapią. Dlatego też, większość badań skierowanych jest na znale-

zienie nowych, syntetycznych związków celujących w podstawowe procesy życiowe bakterii. Jedną

z klas enzymów stanowiących dogodny cel dla chemioterapii są topoizomerazy typu IIA zaangażowane

w regulację poziomu superskręcenia chromosomu, replikację, transkrypcję i rekombinację. Cel pracy:

Celem niniejszej pracy była wstępna selekcja pochodnych tiosemikarbazydów pod kątem ich zdolności

do działania przeciwbakteryjnego oraz określenie wpływu wybranych w ten sposób związków na aktyw-

ność topoizomeraz klasy IIA, pochodzących zarówno z drobnoustrojów gramujemnych jak i gramdodat-

nich. Metody: Wykorzystując zalecany przez Krajowy Ośrodek Referencyjny ds. Lekowrażliwości Drob-

noustrojów zestaw szczepów bakteryjnych, poszerzony o dwa szczepy z rodzaju Proteus i jednego

grzyba mikroskopowego Candida albicans dla badanych związków wyznaczono najniższe stężenie

hamujące wzrost drobnoustrojów (MIC, ang. Minimal Inhibitory Concentration) metodą mikrorozcieńczeń

w płytkach titracyjnych oraz zmierzono strefy zahamowania wzrostu metodą dyfuzyjno-krążkową. Ozna-

czono także zdolność do hamowania aktywności gyrazy i topoizomerazy IV z E. coli i S. aureus poprzez

określenie wartości współczynnika IC50. Wyniki: Największą aktywność hamującą wzrost drobnoustro-

jów wykazywały związki 27 i 33, szczególnie wobec bakterii gramdodatnich przy stężeniach 5 µM dla

związku 27 i 30 µM dla związku 33. Żaden z przebadanych związków nie wykazywał wyższej aktywności

118

hamującej gyrazę E. coli od novobiocyny, która hamuje ten enzym w stężeniu 0,5 µM. Najbardziej

skuteczne okazały się związki TT i 8P w stosunku do gyrazy i topoizomerazy IV S. aureus (IC50 ≈ 30 µM

dla gyrazy i IC50 ≈ 8 µM dla topoizomerazy IV). Wnioski: Otrzymane wyniki wskazują, że niektóre nowe

pochodne tiosemikarbazydów wykazują aktywność antybakteryjną wykorzystując mechanizm hamowania

aktywności topoizomeraz typu IIA. Konieczne jest przeprowadzanie dalszych badań mających na celu

zbadanie m.in. mutagenności, genotoksyczności i cytotoksyczności badanych związków.

IV-22 P | Transformacja szczepów A. tumefaciens z zastosowaniem wektorów pRF-HUE oraz

pRF-HU2E

Wypyszczak K., Dębska J.

Zakład Genetyki Drobnoustrojów, Uniwersytet Łódzki, Łódź

e-mail: joanna.p.debska@gmail.com

Wstęp: Metoda ATMT (ang. Agrobacterium Tumefaciens Mediated Transformation) stosowana po-

wszechnie do transformacji roślin, znalazła również zastosowanie w przypadku transformacji wielu

gatunków grzybów strzępkowych. Zastosowanie odpowiednio skonstruowanego wektora oraz wprowa-

dzenie go do komórki A. tumefaciens umożliwia klonowanie genów w docelowych genomach. Cel pracy:

Konstrukcja stabilnych transformantów szczepów A. tumefaciens niosących wektory pRF-HUE oraz pRF-

HU2E do zastosowania w transformacji dermatofitów za pomocą metody ATMT (ang. Agrobacterium

Tumefaciens Mediated Transformation). Metody: Transformację szczepów A. tumefaciens przeprowa-

dzono za pomocą procedury, która obejmowała przygotowanie wektorów plazmidowych oraz elektro-

kompetentnych komórek A. tumefaciens, elektroporację szczepów bakteryjnych oraz hodowlę transfor-

mantów. Stabilność transformantów sprawdzono metodą hodowli płytkowej do 4 pokolenia na podłożu z

dodatkiem antybiotyku selekcyjnego oraz bez dodatku antybiotyku, przeprowadzając analizę restrykcyjną

pDNA izolowanego z kolejnych pokoleń. Wyniki: Uzyskano transformanty A. tumefaciens niosące

wektory plazmidowe pRF-HUE oraz pRF-HU2E, których obecność potwierdzono na drodze analizy

restrykcyjnej endonukleazą EcoRI pDNA izolowanego z kolejnych pokoleń hodowli bakteryjnych. Wnio-

ski: Zastosowane wektory pRF-HUE oraz pRF-HU2E pozwoliły na transformację wybranych szczepów

A. tumefaciens i uzyskanie stabilnych układów. Uzyskane transformanty wykazywały dużą stabilność

nawet w przypadku ich hodowli na podłożu pozbawionym selekcyjnego antybiotyku. Otrzymane układy

A. tumefaciens - wektor plazmidowy mogą znaleźć zastosowanie w metodzie ATMT do transformacji

wybranych szczepów dermatofitów.

IV-23 | Opracowanie metody izolacji białek z grzybów strzępkowych

Soboń A., Szewczyk R., Długoński J.

Instytut Mikrobiologii, Biotechnologii i Immunologii, Uniwersytet Łódzki

e-mail: adisobon@gmail.com

Wstęp: Z uwagi na złożoną budowę ściany komórkowej grzybów strzępkowych, której efektem jest

utrudniona ekstrakcja białek, badania proteomu tych mikroorganizmamów nie są prowadzone na szeroką

skalę. Po latach nacisku na badania genetyczne, coraz większa uwagę naukowców przykuwa proteomi-

ka. Pod pojęciem proteomiki rozumie się badania nad ekspresją wszystkich białek występujących

w komórce w określonym czasie. Kluczowymi etapami wydajnej izolacji białek jest opracowanie skutecz-

nej metody homogenizacji biomasy i późniejszej ekstrakcji białek. Cel pracy: W niniejszej pracy ocenio-

no skuteczność wypracowanej metody izolacji białek pochodzących od różnych gatunków grzybów

strzępkowych. Metody: W zależności od badanego szczepu grzyba strzępkowego, nastawiono hodowle

bezpośrednio z zawiesiny zarodników bądź z zastosowaniem prekultury w celu wytworzenia homogennej

119

hodowli wgłębnej. Po dwudniowej hodowli, biomasę poddawano mechanicznej homogenizacji, otrzymane

białka precypitowano przy pomocy kwasu trichlorooctowego, a następnie osad poddawano działaniu 0,2

M NaOH, a następnie rozpuszczano w standardowym buforze rozpuszczającym. Uzyskane frakcje

białkowe rozdzielano przy pomocy elektroforezy 1D-SDS-PAGE. Wyniki: Opracowana przez nas metoda

doskonale nadaje się do izolacji białek pochodzących od różnych gatunków grzybów strzępkowych.

Zastosowana preparatyka pozwala na uzyskanie oczyszczonych roztworów białkowych w stężeniach od

10 ng/ml do 1 mg/ml . Różnice w profilach białkowych poszczególnych mikroorganizmów są dobrze

widoczne na żelach 1-D, także w przypadku różnych szczepów należący do tego samego gatunku

(Trichoderma sp.). Wnioski: Zastosowana przez nas metodyka izolacji białek pochodzących od grzybów

strzępkowych jest skuteczna w porównywaniu proteomów badanych mikroorganizmów.

120

121

Alfabetyczny

indeks autorów

122

A

Adamczuk M. 103

Adamczyk M. 32

Adamiak M. 32

Adamski M. 67, 89

Agier J. 18

Anielska T. 96

Antczak A. 93

Antosik A. 40

Appelhans D. 63, 64

Augustyniak A. 52

Augustynowicz-Kopeć E. 12, 112

B

Babuchowski A. 83

Balcerek M. 92

Bartnicka M. 61

Bartosik D. 103, 106, 114

Bawej E. 59

Bazylak G. 57, 95

Bączek K. 94

Bednarczyk-Drąg A. 22

Bednarek I. 69

Behnke-Borowczyk J. 68, 104

Bergier K. 62

Białecka A. 44, 78, 80, 90

Białous I. 82

Bielinis E. 68, 104

Blus E. 33

Błaszczyk D. 69

Błażejak S. 71

Bogiel T. 50, 104

Bogut A. 23

Bonar E. 34

Boratyńska A. 55

Borkowska D. 12

Brzeszcz J. 69

Brzezińska A.J. 70

Brzezińska M. 34, 54

Brzostek A. 33, 34, 54

Brzostek K. 116

Budzyńska A. 12, 13, 35, 36, 37, 61, 62

Bukowski M. 105, 112

Bzducha-Wróbel A. 71

C

Chajęcka-Wierzchowska W. 14

Chmiela M. 38, 43, 45, 48, 52, 53

Chromy K. 72

Chudzik-Kozłowska J. 77

Cichocka O. 75

Cichy W. 21

Ciesielska A. 107

Czaiński T. 99

Czarnecki J. 106

Czernek U. 18

Czubek E. 81

D

Daczkowska-Kozon E.G. 22

Dahm H. 70

Dąbrowski W. 22

Deptuła A. 104

Dębska J. 107, 118

Długońska H. 11, 37, 111

Długoński J. 67, 74, 88, 118

Drobińska-Janiszewska B. 25

Drulis-Kawa Z. 39

Druszczyńska M. 25

Drzewiecka D. 59

Dubin A. 34, 44, 90, 105, 112

Duda K.A. 20

Dudzińska D. 61

Dybka K. 107, 108

Dziadek B. 37, 111

Dziadek J. 33, 34, 54, 109, 111, 113

Działo J. 32

Dziekońska U. 71

Dziewit Ł. 103

Dzitko K. 37, 111

124

F

Felczak A. 64

Fijałkowski K. 25, 26, 52, 87

Fiołka M. 72, 98, 114

Frąc M. 73, 86, 91

Furmaga J. 49

G

Gajek A. 15

Gałęcka M. 21

Gamian A. 16

Gancarz R. 41

Gatkowska J. 37, 111

Gawłowska M. 75

Gernand A. 16

Gibus D. 36, 37

Gniewosz M. 94

Golaska M. 63

Gorzkiewicz M. 32

Gospodarek E. 50, 60, 104

Górna A. 109

Graczykowski M. 38

Gregorczyk K. 39

Grochowska A. 39

Grudniak A.M. 110

Gruska R. 93

Grzebalska A. 49

Grześ K. 110

Grzybowski M. 111

Grzywnowicz K. 114

Gutarowska B. 93

Guzińska K. 86

H

Hirnle L. 16

I

Ibran J. 18

Ilczyszyn W. 105

Ilczyszyn W.M. 112

J

Jachna-Sawicka K. 60

Janecki T. 35

Janik P. 74

Jankowicz A. 63

Janowski A. 75

Jarząb A. 16

Jasińska A. 74, 75

Jaworska O. 44

Jaworski A. 107

Jaworski S. 76

Jeziorski A. 18

Juś K. 77

K

Kaliszewska A. 22, 77

Kamińska T. 56

Kandefer-Szerszeń M. 56

Kapusta P. 69

Kasińska P. 52

Kasperkiewicz K. 20

Kasprowicz A. 44, 78, 80, 90

Kassner J. 39

Kaszycki P. 69, 78, 80

Kędzierska M. 18

Kęsik-Szeloch A. 39

Kidaj D. 79

Kielnierowski G. 25

Kiełbik M. 33, 34, 54

Klepacka A. 61

Klink M. 33, 34, 54

Kłapkowska P. 78, 80

Kłębukowska L. 14

Konieczna E. 59

Konieczna O. 51

Kontek B. 17, 18, 40, 41

Korniłłowicz-Kowalska T. 91

Korycka-Machała M. 113

Kowalski S. 74

125

Kozińska M. 112

Kozioł-Montewka M. 23, 49

Krajewska U. 35

Krawczyk. B. 54

Kręgiel D. 42

Król J. 90

Kruk M. 68

Krupińska A. 52

Kruszewska D. 57, 58

Krzyżowska M. 39

Książek A. 49

Kubala N. 18

Kubiś M. 32

Kucharczyk H. 59

Kuczyńska-Wiśnik D. 43

Kuder P. 19

Kujawa E. 77

Kukla M. 80

Kulifer A. 17

Kurantowicz N. 20

Kurek A. 41

Kur-Kowalska K. 42

Kuroń A. 113

Kutkowska J. 59

Kwaśna H. 104

Kwiecińska-Piróg J. 60

L

Lasek R. 114

Laskowska E. 43

Leszczyńska D. 43

Lewandowska M. 15

Lewicka K. 81, 82

Li C-M. 20

Lipiec J. 86, 91

Lipowczan G. 37

Lisowska K. 63, 64

Lubudzisz Z. 21

Ł

Łaniewska-Trokenheim Ł. 14, 85

Łaryonowicz M. 81

Łozowska A. 82

Łukasik M. 20

Łyżeń R. 105

M

Machnik G. 69

Macura A. 37

Magryś A. 49

Majsterek I. 116

Malinowska M. 18

Martyniszyn L. 55

Massopust H. 82

Matusiak A. 43, 45, 48, 52

Matuszewska E. 43

Mazurczyk M. 18

Mądrzak K. 18

Michałek E. 52

Micota B. 18

Międzobrodzki J. 44, 78, 90, 112

Mikš-Krajnik M. 83

Mikucka A. 24

Miller E. 17

Miszczyk E. 43, 45, 48, 53

Miszczyszyn M. 82

Mocek M. 77

Modranka J. 35

Moryl M. 18

Mól M. 52

Mroczyńska M. 21

Murawska A. 82

N

Nadzieja N. 82

Napierała M. 84

Nawrotek P. 25, 26, 52, 87

Niedźwiadek J. 23

Niemiałtowski M. 55

Nitka E. 84

Nowak A. 84, 114

Nowak M. 36, 37

126

O

Ogar A. 84

Ogrodowczyk A. 22, 77

Olas B. 18

Olek J. 59

Olszewska M. 85

Ołtuszak-Walczak E. 115

Ostrowska K. 46

Oszust K. 73, 86

Otlewska A. 108

Owczarek M. 86

P

Paduch R. 56

Pakulska J. 46

Pali M. 18

Paluch-Oleś J. 49

Palusińska-Szysz M. 59

Paraszkiewicz K. 74, 75

Paszkiewicz M. 13, 47, 61

Patelski P. 71, 93

Pawełkiewicz A. 46

Pawlaczyk I. 41

Peitler D. 87

Pernach K. 114

Piątek M.A. 88

Piechocka J. 77

Piekarski J. 18

Pielech-Przybylska K. 92

Pieniak A. 74

Pietr S.J. 67, 89

Pietraszek P. 115

Pietruk M. 88

Pikuła K. 81, 82

Piotrowska-Seget Z. 80

Pisarska K. 67, 89

Podsędek A. 61

Polakowska K. 44, 90

Ponichtera M. 75

Potemski P. 18

Przybylska A. 57, 95

Przybył J. 94

Ptaszyńska A. 72

R

Rabsztyn K. 20

Raczkowska A. 116

Radziejewska-Lebrecht J. 20

Rąpała-Kozik M. 96

Rechciński T. 43

Rembisz D. 93

Robakowski P. 68

Rola B. 58

Roszak D. 21

Różalska B. 12, 13, 31, 35, 36, 37, 47,

61, 62

Różalski A. 46

Różalski M. 35

Rudnicka K. 38, 43, 45, 48, 52, 53, 75

Rudnicka W. 25, 43, 52

Rudzki S. 49

Rusin P. 116

Rutkowska A. 73, 91

Rybczyńska K. 91

S

Sadowska B. 13, 18, 31, 46, 47, 61

Saluk J. 41

Sapińska E. 92, 93

Schmidt M. 97

Seifert K. 22

Sekret J. 18

Sidorczyk Z. 49

Sierpińska M. 14

Sikora A. 23, 49

Siwińska M. 49, 59

Skalski T. 50

Skłodowska M. 62

Skorek K. 116

Skorupska A. 79

Skóra J. 93

Skurnik M. 20

127

Słaba M. 88

Sobczak K. 51

Soboń A. 118

Solecka A. 52

Sołtysik D. 69

Spiżak A. 52

Stanisz M. 92, 93

Stanuch M. 18

Stańczyk J. 18, 59

Stączek P. 117

Steć A. 49

Steliga T. 69

Stobieniecka D. 52

Strzelczyk A. 117

Strzelec-Nowak D. 23, 49

Sułowska Z. 33, 34, 54

Synowiec A. 94

Szachta P. 21

Szalewska-Palasz A. 105

Szczepaniak P. 43

Szczęsna E. 18, 53

Szeglewska K. 82

Szejbach A. 24

Szemiako K. 54

Szewczyk R. 118

Szkudlarek J. 16

Szlachciak M. 81

Szopa J. 92

Szostko B. 16

Szponar B. 19

Szulc I. 34, 54

Szulc L. 55

Szuster-Ciesielska A. 56

Szwiec K. 57, 58

Szydłowska-Pazera K. 18

Ś

Śliwińska A. 57, 95

Śnioszek A. 93

Świadek M. 96

Świątecka D. 77

Świeboda P. 57, 58

T

Tokarz-Deptuła B. 32

Trzeciak-Ryczek A. 32

Turnau K. 74, 84, 96

Turska-Szewczuk A. 59

U

Urbanik-Sypniewska T. 59

W

Wachowicz B. 17, 18, 41

Walczak P. 107, 108, 115

Walencka M. 43, 45, 48, 52

Wasilewska E. 22

Wasiniewska M. 81

Wasyluk A. 59

Wawrzonkowski J. 81

Weber-Dąbrowska B. 39

Wężowicz K. 96

Wiatrowska B. 68, 104

Wieczorek M. 37

Wieczorkiewicz A. 51

Wielbo J. 79, 98

Wieliczko A. 90

Więckowska E. 60

Więckowska-Szakiel M. 35, 61, 62

Wiśniewska M. 60

Witkowska D. 16

Wlazłowicz E. 41

Władyka B. 34, 44, 90, 105, 112

Własak A. 25

Włodarczyk M. 25, 48, 97

Wojtczak G. 96

Wolska K.I. 41

Woźniak A. 56

Wójcik A. 81

Wójtowicz M. 49

Wrońska N. 63

Wróblewska B. 22, 77

Wydrych J. 72, 98

128

Wypyszczak K. 118

Wyszomirski P. 78, 80

Z

Zabłotni A. 59

Zadernowska A. 14

Zagaja M. 98

Zakrzewska M. 22

Zalewska J. 59

Zapotoczny S. 84

Zawada I. 74

Zawadzka J. 25

Zawadzka K. 64

Zduniak K. 93

Zwolska Z. 12, 112

Ż

Żakowska Z. 16

Żbikowska H.M. 40

Żurek A. 56

Żywicka A. 26