Nghiên cứu vi sinh vật để xử lý chất thải chăn

nuôi dạng rắn

Phạm Bích Hiên

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên

Khoa Sinh học

Luận án Tiến sĩ ngành: Vi sinh vật học; Mã số: 62 42 40 01

Người hướng dẫn: PGS.TS. Phạm Văn Toản, GS.TS. Nguyễn Đình Quyến

Năm bảo vệ: 2012

Abstract. Chương 1. Trình bày tổng quan về chất thải chăn nuôi và biện pháp xử lý;

vi sinh vật tham gia quá trình xử lý chất thải hữu cơ. Chương 2. Vật liệu và phương

pháp: các mẫu thu thập và chủng vi sinh vật, hóa chất; phương pháp: phân loại vi

sinh vật; xác định hoạt tính sinh học của vi sinh vật; xác định hiện trạng chất thải

chăn nuôi; thử nghiệm và đánh giá hiệu quả của chế phẩm. Chương 3. Kết quả và

thảo luận: thực trạng chất thải tại một số cơ sở chăn nuôi; nghiên cứu vi sinh vật để

xử lý chất thải chăn nuôi; nghiên cứu sản xuất chế phẩn vi sinh vật để xử lý chất thải

chăn nuôi ứng dụng chế phẩm vi sinh vật xử lý chất thải chăn nuôi hiệu quả sử dụng

phân hữu cơ từ chất thải chăn nuôi đối với cây trồng.

Keywords. Sinh học; Vi sinh vật học; Xử lý chất thải; Phế thải chăn nuôi

Content

MỞ ĐẦU

1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA LUẬN ÁN

Việt Nam là nước nông nghiệp, trong thời kỳ đổi mới ngành chăn nuôi có những bước

phát triển nhanh chóng, mô hình trang trại chăn nuôi tập trung được nhân rộng trong toàn

quốc. Mỗi năm cả nước có khoảng 60 triệu tấn chất thải vật nuôi, trong đó chỉ có khoảng

50% được xử lý, số còn lại được sử dụng trực tiếp bón cho cây trồng hoặc làm thức ăn cho

cá. Do chỉ tập trung đầu tư để nâng cao năng suất và chất lượng vật nuôi, phần nhiều các

trang trại chưa chú trọng đến công tác kiểm soát, quản lý chất thải nên làm phát sinh dịch

bệnh, tác động xấu đến sức khỏe cộng đồng và ảnh hưởng trực tiếp đến việc phát triển bền

vững của ngành chăn nuôi. Tại nhiều địa phương người dân còn coi chất thải chăn nuôi là

phân bón, không quan tâm đến việc xử lý hoặc nếu có cũng chỉ ủ đống để chờ bón cho cây

trồng theo mùa vụ. Đây là một trong các nguyên nhân gây ô nhiễm môi trường và lây truyền

các dịch bệnh cho người, vật nuôi và cây trồng. Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành

nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu vi sinh vật để xử lý chất thải chăn nuôi dạng rắn”.

2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CỦA LUẬN ÁN

- Tuyển chọn được bộ chủng vi sinh vật (VSV) thuộc nhóm an toàn, sinh trưởng mạnh, cạnh

tranh được với VSV trong chất thải, chuyển hóa nhanh các hợp chất hữu cơ và ức chế hiệu

quả các vi khuẩn (VK) gây bệnh, gây thối, làm giảm ô nhiễm môi trường từ chất thải chăn

nuôi.

- Tạo được chế phẩm VSV để xử lý chất thải chăn nuôi thành phân hữu cơ đáp ứng yêu cầu

dinh dưỡng cây trồng, thay thế một phần phân vô cơ, góp phần phát triển nông nghiệp an

toàn, bền vững.

3. ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN

- Đây là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu một cách có hệ thống, từ hiện trạng chất

thải dạng rắn ở trang trại chăn nuôi tập trung đến sản xuất và ứng dụng thành công chế phẩm

VSV xử lý có hiệu quả chất thải chăn nuôi, giảm ô nhiễm môi trường và rút ngắn thời gian

chuyển hóa các chất hữu cơ từ 3- 4 tháng xuống còn 21- 30 ngày, đánh giá đựơc hiệu quả của

phân hữu cơ chế biến từ chất thải chăn nuôi đối với cây trồng.

- Là công trình đầu tiên nghiên cứu một cách tổng hợp và chứng minh được hiệu quả sử dụng

vi khuẩn lactic sinh các chất kháng khuẩn (axit lactic và bacterioxin) để xử lý mùi hôi thối và

ức chế vi khuẩn gây bệnh trong chất thải chăn nuôi.

- Xây dựng được qui trình sản xuất và ứng dụng chế phẩm vi sinh vật xử lý chất thải chăn

nuôi dạng rắn làm phân bón hữu cơ thay thế phân chuồng và tiết kiệm được 25% lượng phân

khoáng góp phần phát triển sản xuất nông nghiệp an toàn, bền vững.

4. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ Ý NGHĨA THỰC TIỄN

- Cung cấp 4 chủng vi sinh vật an toàn, có hoạt tính sinh học cao trong sản xuất chế phẩm vi

sinh xử lý chất thải chăn nuôi, tạo phân hữu cơ góp phần giảm lượng phân hoá học và nâng

cao hiệu quả sản xuất của nông dân.

- Đề xuất giải pháp giảm thiểu ô nhiễm môi trường trong chăn nuôi qui mô trang trại góp

phần phát triển bền vững ngành chăn nuôi.

BỐ CỤC LUẬN ÁN:

Luận án bao gồm: Phần mở đầu (3 trang); tổng quan tài liệu (37 trang); vật liệu và

phương pháp (17 trang); kết quả và thảo luận (71 trang); kết luận và kiến nghị (2 trang); danh

mục công trình liên quan đến luận án; danh mục 122 tài liệu tham khảo và các phụ lục. Luận

án có 45 bảng, 42 hình.

Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Chất thải chăn nuôi và biện pháp xử lý

1.1.1. Chất thải chăn nuôi và nguy cơ ô nhiễm môi trƣờng

Chất thải chăn nuôi: Là chất thải ra trong quá trình chăn nuôi, gồm ba dạng chủ yếu:

Chất thải rắn (bao gồm chủ yếu là phân, chất độn chuồng, thức ăn thừa và đôi khi là xác gia

súc, gia cầm chết hàng ngày); chất thải lỏng (bao gồm nước rửa chuồng, nước tắm cho vật

nuôi, nước tiểu, một phần phân); chất thải bán lỏng (gồm cả chất thải rắn và chất thải lỏng).

Nguy cơ ô nhiễm môi trƣờng:

- Ô nhiễm do kim loại nặng: Các nguyên tố vi lượng, kim loại nặng, vật nuôi không tiêu hoá

hết bài tiết ra ngoài theo đường phân làm thoái hoá đất, ức chế hoạt động của VSV, ô nhiễm

nước ngầm, tích tụ trong nội tạng người và vật nuôi là nguyên nhân gây các loại bệnh tật.

- Ô nhiễm do khí độc: Trong phân, nước thải của lợn có khoảng 40 loại khí độc khác nhau

sinh ra từ quá trình thối rữa thức ăn thừa và xác động thực vật do hoạt động sống của vi

khuẩn yếm khí. Các khí thải H2S, NH3, CH4, CO2, N2O...gây mùi hôi thối khó chịu, kích thích

trung khu hô hấp của người và vật nuôi, có thể gây ngộ độc hoặc tử vong.

- Ô nhiễm do vi sinh vật và ký sinh trùng gây bệnh: Theo tài liệu của FAO có khoảng 90 loại

bệnh liên quan giữa người và gia súc mà phần lớn do các vi sinh vật và ký sinh trùng (KST)

lan truyền từ chất bài tiết của vật nuôi bị bệnh vào không khí, nguồn nước, đất, nông phẩm,

trong đó phổ biến và nguy hiểm nhất là nhóm vi khuẩn gây bệnh đường ruột.

1.1.2. Tình hình sử dụng chất thải chăn nuôi ở Việt Nam

Mỗi ngày đàn gia súc, gia cầm của Việt Nam thải ra khoảng 539.733.15 tấn chất thải rắn,

khoảng 25-30 triệu khối chất thải lỏng, ước tính mỗi năm có trên 60 triệu tấn phân vật nuôi

các loại. Trong số đó chỉ có khoảng 50% được xử lý bằng phương pháp ủ trước khi sử dụng.

1.1.3. Các biện pháp xử lý chất thải chăn nuôi

- Phƣơng pháp vật lý: Bao gồm phương pháp lắng cặn; sử dụng máy tách chất rắn; lọc.

- Phƣơng pháp hoá học: Bơm và trộn các chất điện ly đơn giản hoặc các chất điện ly

polyme cùng với hỗn hợp chất thải trước khi tách cơ học làm tăng 82% hiệu quả tách chất

rắn.

- Phƣơng pháp sinh học:

+ Sử dụng thảm thực vật, hồ thuỷ sinh

+ Sử dụng vi sinh vật: Là biện pháp chính trong phương pháp sinh học. Dựa trên cơ sở tối ưu

hoá các điều kiện môi trường cho hệ vi sinh vật tự nhiên hoặc vi sinh vật khởi động phát triển

để phân giải các hợp chất hữu cơ trong phân trong điều kiện hiếu khí hay kỵ khí tạo sản phẩm

cuối cùng ổn định, có giá trị kinh tế, giảm hàm lượng chất rắn tổng số, giảm mùi, tiêu diệt vi

sinh vật gây bệnh. Biện pháp chủ yếu xử lý chất thải lỏng là biogas, xử lý chất thải rắn là

composting.

1.2. Vi sinh vật tham gia quá trình xử lý chất thải hữu cơ

Hệ vi sinh vật trong chất thải chăn nuôi gồm nhiều nhóm VSV có hoạt tính sinh học khác

nhau giữ vai trò hết sức quan trọng trong chu trình chuyển hóa các hợp chất hữu cơ thành các

chất mùn mà cây trồng có thể sử dụng được. Ở đây chúng tôi chỉ đề cập các nhóm VSV có

khả năng phân huỷ các hợp chất phổ biến, là thành phần chính trong chất thải chăn nuôi gồm

xenluloza, tinh bột, protein và VSV có khả năng ức chế các vi khuẩn gây bệnh đường ruột, vi

khuẩn gây thối.

1.2.1. Vi sinh vật phân giải xenluloza

Xenluloza là thành phần chủ yếu của thành tế bào thực vật. Trong tự nhiên khu hệ VSV

có khả năng sinh tổng hợp enzym xenlulaza phân giải xenluloza vô cùng phong phú, bao gồm

vi khuẩn, xạ khuẩn và vi nấm. Xenlulaza là một phức hệ 3 enzym (Endo-1,4-glucanaza, Exo-

1,4-gluconaza, -1,4-glucozidaza) hoạt động cùng nhau để thuỷ phân xenluloza tạo ra các

loại đường có thể đi qua thành tế bào VSV.

1.2.2. Vi sinh vật phân giải tinh bột

Amylaza là hệ enzym rất phổ biến đối với VSV. Cơ chất xúc tác của amylaza là tinh bột

và glycogen, theo tính chất và cách tác dụng lên tinh bột, phân biệt amylaza thành các loại:

-amylaza, -amylaza, glucoamylaza và oligo 1-6 glucozidaza. -amylaza gặp ở hầu hết các

loại VSV như nấm sợi, nấm men giả, vi khuẩn có bào tử và xạ khuẩn.

1.2.3. Vi sinh vật phân giải protein

VK có khả năng sinh ra cả hai loại proteaza (endopeptidaza và exopeptidaza), do đó

proteaza của VK có tính đặc hiệu cơ chất cao. Các VK có khả năng tổng hợp proteaza mạnh

nhất. Nhiều loại nấm mốc cũng có khả năng tổng hợp một lượng lớn proteaza còn xạ khuẩn ít

được nghiên cứu hơn.

1.2.4. Vi khuẩn lactic sinh tổng hợp axit lactic và bacterioxin

Vi khuẩn lactic có khả năng sinh axit lactic làm tăng sự phân hủy các hợp chất hữu

cơ, là chất tiệt trùng được ứng dụng nhiều trong bảo quản, chế biến thực phẩm, trong y, dược

và xử lý môi trường. Gần đây vi khuẩn lactic còn được đặc biệt quan tâm nghiên cứu về khả

năng sinh bacterioxin là các chất diệt khuẩn thế hệ mới có phổ kháng khuẩn đa dạng, tính đặc

hiệu tế bào đích cao, an toàn với người, vật nuôi, cây trồng và môi trường là giải pháp cho

vấn đề kiểm soát các nguồn bệnh

Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

2.1. Vật liệu

- Mẫu thu thập: 50 mẫu nghiên cứu gồm phân ủ, thức ăn chăn nuôi, các phụ phẩm nông

nghiệp và chất thải sinh hoạt, chất thải chăn nuôi, phụ phẩm chế biến thực phẩm và sản phẩm

lên men truyền thống được thu thập trên địa bàn Hà Nội, Nghệ An, Đăklac.

- Vi sinh vật gồm: VK lactic: Lactobacillus agilis JCM 1230,L. salivarius JCM 5804, L.

plantarum JCM 1048 và JCM1149, Leuconostos mesenteroides, L. fermentum, Streptocccus

spp do Phòng Công nghệ Vật liệu Sinh học- Viện CNSH cung cấp. Chủng VK gây thối nhũn

khoai tây Erwinia carotovora KT03 do Bộ môn Bệnh cây, Viện Bảo vệ Thực vật cung cấp.

Chủng VK gây bệnh cho người và vật nuôi: E. coli PA2, E. coli NC, S. typhimurium, Shigella

flexneri, Enterococcus faecalis, S. aureus ATCC 29213 do Phòng VK hiếm gặp- Viện Vệ

sinh dịch tễ TW và Viện CNSH cung cấp.

- Các hoá chất, thiết bị máy móc: Được sản xuất tại các nước Mỹ, Nhật Bản, Thụy Điển và

Đức.

2.2. Phƣơng pháp

- Các phương pháp nghiên cứu VSV học thông thường: Phương pháp nuôi cấy, lên men, xác

định đăc điểm sinh hóa…

- Phân loại: Theo truyền thống (dựa trên đặc điểm hình thái, sinh hóa) và bằng kỹ thuật sinh

học phân tử (lập cây phả hệ dựa trên kết quả giải trình tự gien ADNr 16S. Xác định trình tự

ADNr 16S của các chủng VK theo phương pháp của Sakiyama và cs năm 2009).

- Các phương pháp xác định hoạt tính: Phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch, điện di tricin

SDS-PAGE, phương pháp Thener, Anson cải tiến, Micro-bertrand …

- Phân tích lý hoá và thí nghiệm đồng ruộng theo TCN, TCVN, xử lý số liệu theo thống kê

sinh học.

Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. THỰC TRẠNG CHẤT THẢI TẠI MỘT SỐ CƠ SỞ CHĂN NUÔI

Số liệu khảo sát trung bình về sử dụng chất thải chăn nuôi dạng rắn tại 6 cơ sở chăn nuôi

tập trung ở thành phố Hà Nội, tỉnh Nghệ An, Đắklắc cho thấy: Phần lớn (52%) chất thải chăn

nuôi được bán cho các cơ sở thu mua, có 21% lượng chất thải được dùng để bón cho cây,

17% dùng làm thức ăn cho cá và 10% được thải ra hệ thống nước thải công cộng. Kết quả xác

định nồng độ trung bình một số khí thải và vi sinh vật gây bệnh tại các điểm điều tra đều vượt

ngưỡng cho phép (bảng 3.1.).

Bảng 3.1. Môi trƣờng không khí tại các trang trại chăn nuôi

Nơi đánh giá Chỉ tiêu đánh giá (số liệu trung bình 3 nơi đánh giá)

Độ nhiễm khuẩn

không khí (CFU/m3)

Nồng độ H2S

(mg/m3)

Nồng độ NH3

(mg/m3)

1. Khu tập kết chất thải nuôi

lợn

5,8 ± 0,45 x 106 0,36 ± 0,05

(4,5a)

3,12 ± 0,06

(15,6b)

2. Khu tập kết chất thải nuôi

gà

7,2 ± 0,38 x 106 0,32 ± 0,04 (4

a) 2,94 ± 0,08

(14,7b)

Giới hạn tối đa 106 0,08 * 0,2 **

(*): Theo TCVN 5937/95; (**): Theo TCVN 5938/95; a,b: số lần tăng so với giới hạn cho

phép

Nồng độ H2S tại các trang trại chăn nuôi gà và lợn cao gấp 4- 4,5 lần so với giới hạn.

Nồng độ NH3 ở trang trại nuôi lợn và gà cũng đều cao hơn mức giới hạn 15 lần. Kết quả

nghiên cứu của chúng tôi thấp hơn kết quả điều tra trong báo cáo của Cục Chăn nuôi, trong

đó nồng độ H2S trong chuồng nuôi gà cao gấp 83,4 lần so với giới hạn và trong chuồng nuôi

lợn gấp 64,4 lần; Nồng độ NH3 trong chuồng nuôi gà cao gấp 30,6 lần so với giới hạn và

trong chuồng nuôi lợn gấp 24,15 lần. Sở dĩ có sự sai khác là do khác nhau về thời điểm

nghiên cứu, mô hình chăn nuôi và địa điểm lấy mẫu trong chuồng nuôi và ngoài khu vực tập

kết chất thải.

Bảng 3.2. Mật độ vi sinh vật gây bệnh và ký sinh trùng trong chất thải chăn nuôi

Chất thải chăn nuôi Mật độ tế bào vi khuẩn (CFU/g) Trứng

giun/g VKTS * E. coli Salmonella sp

1. Chất thải nuôi lợn 6,58±0,6 x 106 2,20±0,5x 10

5 1,2±0,2x 10

3 105± 4,8

2. Chất thải nuôi gà 7,10 ±0,4x 107

8,06±0,3x 105 2,4±0,1x 10

3 120± 3,5

Mức cho phép 104 (-)

**

(*): VK tổng số ); (-)**

: Không được có trong 25 g mẫu

Theo qui định thì chất thải chăn nuôi sử dụng cho nông nghiệp không chứa Salmonella

trong 25 g mẫu tuy nhiên kết quả phân tích đều cho thấy các mẫu chất thải chăn nuôi lợn và

gà đều chứa Salmonella sp với nồng độ 103

CFU/g và E. coli cao hơn 20- 80 lần giới hạn cho

phép. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Cục Chăn nuôi và Viện Chăn

nuôi.

3.2. NGHIÊN CỨU VI SINH VẬT ĐỂ XỬ LÝ CHẤT THẢI CHĂN NUÔI

3.2.1. Phân lập, tuyển chọn bộ chủng giống vi sinh vật

Từ 28 mẫu phân ủ; thức ăn và chất thải chăn nuôi; phân ủ từ rác thải, phế phụ phẩm

nông nghiệp, bã nấm đã phân lập được 17 chủng VSV có khả năng phân giải xenluloza, 12

chủng phân giải tinh bột và 6 chủng phân giải protein. Trong đó, sàng lọc được 15 chủng

sinh trưởng mạnh, hoạt tính sinh học ổn định và đa hoạt tính chúng tôi tuyển chọn được

chủng xạ khuẩn ký hiệu XK112 có khả năng phân giải xenluloza cao nhất (kích thước VPG

đạt 34mm); chủng VK B20 có hoạt tính phân giải tinh bột mạnh nhất (kích thước VPG đạt

38mm); chủng VK B15 có hoạt tính phân giải protein mạnh nhất (kích thước VPG đạt 30

mm). Từ 22 mẫu thu thập trên địa bàn Hà Nội đã phân lập được 7 chủng VK lactic, lựa

chọn chủng LH19 sinh bacterioxin và ức chế chủng VK gây thối Erwinia carotovora KT03.

Kết quả thử nghiệm khả năng ức chế chéo trên môi trường thạch cho thấy 4 chủng LH19,

XK112, B20 và B15 không ức chế nhau, 4 chủng VSV trên được tuyển chọn cho nghiên cứu

tiếp theo.

Bảng 3.7. Hoạt tính sinh học của 4 chủng vi sinh vật tuyển chọn

Kí hiệu

chủng

Kích thước vòng phân giải (D-d) mm Hàm lượng

axit lactic

(mg/ml)

Kháng E.

carotovora KT03

(D-d, mm) Xenluloza Tinh bột Protein

XK112 34 20 - - -

B20 26 38 - - -

B15 - 21 30 - -

LH19 27,9 22

Hình 3.2. Hoạt tính

phân giải xenluloza

của chủng XK112

Hình 3.3. Hoạt tính

phân giải tinh bột

của chủng B20

Hình 3.4. Hoạt tính

phân giải protein của

chủng B15

Hình 3.5. Hoạt tính

kháng E. carotovora

KT03 của chủng

LH15

3.2.2. Định tên và xác định độ an toàn sinh học các chủng vi sinh vật tuyển chọn

3.2.2.1. Định tên vi sinh vật bằng phƣơng pháp truyền thống

Chủng XK112: Sau 48- 72 giờ nuôi cấy trên môi trường Gauze ở 35- 370C, khuẩn

lạc chủng XK112 có hình tròn, bề mặt khô, nhăn, đường kính 2- 2,5 mm, màu trắng xám,

chân khuẩn lạc bám sâu vào môi trường thạch. Chuỗi bào tử dạng thẳng, mỗi chuỗi có từ 15

đến 35 bào tử.

Hình 3.6. Hình thái cuống sinh bào tử, bào tử

của chủng XK112

Hình 3.10. Hình thái khuẩn

lạc của chủng XK112

Chủng B20: Chủng VK B20 thuộc Gram (+), kỵ khí không bắt buộc. Nuôi cấy trên

môi trường King B ở nhiệt độ 300C, sau 48 giờ khuẩn lạc khô, màu nâu nhạt, mép có thùy, có

đường kính 0,5-1 mm. Tế bào chủng B20 hình que, ngắn, kích thước 5,2 x 0,8 m. Bào tử

hình ovan

Hình 3.7. Hình dạng tế bào của chủng B20 Hình 3.11. Hình thái

khuẩn lạc của chủng

XK112

Chủng B15: Chủng VK B15 thuộc Gram (+), hiếu khí. Trên môi trường KingB ở 300C,

sau 48 giờ, khuẩn lạc khô, lan trên bề mặt thạch, màu vàng nhạt, lồi ở tâm, mép xẻ thùy, có

đường kính 0,7-1 mm. Tế bào hình que nhỏ, đứng riêng rẽ kích thước 444 nm x 2,02 m. Tạo

bào tử hình bầu dục.

Hình 3.8. Hình dạng, kích thước tế bào của chủng B15 Hình 3.12. Hình thái

khuẩn lạc của chủng

B15

Chủng LH19: Trên môi trường thạch đĩa MRS ở 32-350C, sau 48 giờ, khuẩn lạc nhỏ,

tròn lồi màu trắng sữa, bề mặt mịn, mùi chua thơm, tạo vòng phân giải trong suốt xung quanh

khuẩn lạc trên môi trường thạch MRS có bổ sung 0,5% CaCO3. Chủng LH19 không di động,

không sinh bào tử, bắt màu Gram (+), thuộc loại kỵ khí không bắt buộc. Tế bào hình que,

đứng riêng rẽ, kích thước 514 nm 2,44 m.

Hình 3.9. Hình dạng, kích thước tế bào của chủng LH19 Hình 3.13. Hình thái

khuẩn lạc của chủng

LH19

Cả 4 chủng đều có khả năng đồng hóa đa dạng với các nguồn hydratcacbon, trong đó có

chủng vừa có khả năng phân giải CMC hoặc tinh bột vừa có khả năng thuỷ phân gelatin,

cazein. Đặc tính này thuận lợi cho việc lựa chọn môi trường nhân sinh khối sản xuất đồng

thời phù hợp với mục đích sử dụng VSV để xử lý chất thải chăn nuôi giàu các hợp chất

hydratcacbon và protein.

Căn cứ vào tất cả các kết quả về đặc điểm hình thái, các phản ứng sinh hoá của 4 chủng

VSV, dựa vào khoá phân loại của Bergey, có thể sơ bộ khẳng định chủng XK112 thuộc chi

Streptomyces, có đặc điểm tương tự như loài S. griceosporeus; chủng B20 thuộc chi Bacillus,

có đặc điểm tương tự như loài B. licheniformis; chủng B15 thuộc chi Bacillus, có đặc điểm

tương tự như loài B. subtilis; chủng LH19 thuộc chi Lactobacillus, có đặc điểm tương tự như

loài L. plantarum.

3.2.2.2. Định tên vi sinh vật bằng kỹ thuật sinh học phân tử

Kết quả giải trình tự gien cho thấy: Chủng XK112 có trình tự gien ARNr 16S tương đồng

tới 99,7% (1245/1250 bp) so với trình tự của chủng XK S. griseosporeus có ký hiệu

AB184419. Chủng B20 có trình tự gen ARNr 16S tương đồng 99,9 % (1429/1430 bp) với

trình tự gien của chủng B. licheniformis_X68416. Trình tự gien ARNr 16S của chủng B15

tương đồng 99,9% (1449/1451 bp) với đoạn 16S của Bacillus subtilis. Chủng LH19 có trình

tự ARNr 16S tương đồng 99,9% với các loài của nhóm Lactobacillus plantarum, nằm cùng

vị trí với Lactobacillus pentosus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paraplantarum.

Căn cứ vào kết quả định danh theo phương pháp truyền thống và bằng kỹ thuật sinh

học phân tử cho phép xác định chủng XK112 là Streptomyces griseosporeus, chủng

B20 là Bacillus licheniformis, chủng B15 là Bacillus subtilis, chủng LH19 là

Lactobacillus plantarum.

Cả 4 chủng VSV nghiên cứu đều thuộc nhóm 1, đảm bảo độ an toàn sinh học đối với

người, vật nuôi, cây trồng và môi trường, được phép sử dụng trong sản xuất nông

nghiệp.

3.2.3. Một số yếu tố môi trƣờng ảnh hƣởng đến khả năng phân giải chất hữu cơ của các

VSV

3.2.3.1. Ảnh hƣởng đến khả năng phân giải xenluloza của chủng XK112

* Ảnh hưởng của nhiệt độ

Chủng XK112 được nuôi cấy trong môi trường Gauze, sau 72 giờ ở các điều kiện nhiệt

độ từ 25 đến 650C, xác định mật độ tế bào và kích thước vòng phân giải cơ chất xenluloza

trên thạch đĩa.

Bảng 3.10. Ảnh hƣởng nhiệt độ đến sinh trƣởng và khả năng phân giải xenluloza của

XK112

Nhiệt độ nuôi

(0C)

Mật độ tế bào

(x 106 CFU/ml)

Kích thước VPG (D-d, mm) Hoạt tính

tương đối (%) CMC Bột giấy

25 0,53 10 +/- 29,5

30 180 18 11 52,8

35 5400 31 15 91,2

40 6200 34 16 100

45 5600 32 16 94,1

50 3600 31 15 92,2

55 440 31 14 92,0

60 22 19 11 56,0

65 0,26 +/- +/- 26,0

Chú thích: (+/-) Vòng phân giải mờ, kích thước VPG<10 mm

Chủng XK112 có khả năng thích nghi ở dải nhiệt độ tương đối rộng (25- 600C), nhiệt độ

thích hợp là 35- 550C, trong đó sinh trưởng và hoạt tính xenlulaza cao nhất ở nhiệt độ 40

0C.

Khoảng nhiệt độ này hoàn toàn phù hợp với sự biến động nhiệt độ trong quá trình ủ, đặc biệt

là từ ngày thứ 4 đến ngày thứ 15, khi nhiệt độ đống ủ tăng cao phù hợp cho VSV ưa nhiệt

phát triển và phân giải xenluloza

* Ảnh hưởng của pH

Nuôi cấy chủng XK112 ở 370C trong môi trường Gauze với các pH khác nhau từ 4,0 đến

9,0. Sau 72h nuôi cấy, xác định mật độ tế bào và kích thước vòng phân giải cơ chất

xenluloza.

Bảng 3.11. Ảnh hƣởng pH đến sinh trƣởng và khả năng phân giải xenluloza của chủng

XK112

pH

ban đầu

pH cuối Mật độ tế bào

(x 106 CFU/ ml)

Kích thước VPG (D-d, mm) Hoạt tính

tương đối (%) CMC Bột giấy

4 5,0 0,18 20 11 58,0

5 5,4 6,4 22 12 64,3

6 6,8 320

26 14 76,5

7 7,3 5600 34 16 100

8 7,6 2800 29 15 85,3

9 8,2 3,4 24 14 70,0

pH thích hợp cho chủng XK112 sinh trưởng và tổng hợp xenlulaza là pH6- 8, trong

đó pH7 là tối thích. Kết quả nghiên cứu này phù hợp với kết quả nghiên cứu của các tác giả

Trần Đình Toại, tăng Thị chính cho rằng pH ban đầu thích hợp nhất cho sinh trưởng và tổng

hợp xenlulaza của xạ khuẩn là pH 7- 7,5. Chất thải chăn nuôi thường có pH ban đầu trong

khoảng 5- 8 và đạt mức trung tính sau khi xử lý cơ chất, do đó chủng XK112 phù hợp cho

sản xuất chế phẩm xử lý chất thải chăn nuôi.

Chủng XK112 có khả năng sinh trưởng và tổng hợp enzym xenlulaza trong phạm vi nhiệt

độ 25- 600C, pH 4,0- 9,0. Nhiệt độ thích hợp là 35- 55

0C, pH 6,0- 8,0, điều kiện này là phù

hợp với quá trình xử lý chất thải chăn nuôi dạng rắn.

3.2.3.2. Ảnh hƣởng đến khả năng phân giải tinh bột của chủng B20

* Ảnh hưởng của nhiệt độ: Chủng B20 được nuôi cấy lắc trên môi trường dịch thể ở các

nhiệt độ khác nhau 30, 37, 40, 50, 550C. Sau 48h xác định mật độ tế bào và hoạt tính amylaza

trên môi trường thạch đĩa chứa tinh bột tan, nhuộm màu với thuốc thử Lugon.

Hình 3.18. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới sinh trưởng và khả năng phân giải tinh bột của chủng

B20

Chủng B20 sinh trưởng và tổng hợp amylaza trong dải nhiệt độ 30-550C nhưng thích

hợp ở 30- 500C, sinh khối và hoạt tính đạt giá trị cao nhất ở nhiệt độ 37

0C. Khoảng nhiệt độ

này là phù hợp với giai đoạn 15 ngày đầu của quá trình xử lý chất thải chăn nuôi, khi đó quá

trình phân giải tinh bột trong khối ủ sẽ diễn ra mạnh nhất. Kết quả này phù hợp với nghiên

cứu của Ashger và cs, Nadia riaz và cs cho rằng nhiệt độ tối ưu cho khả năng tổng hợp

amylaza của Bacillus subtilis là 400C. Ngô Xuân Mạnh và cs đã lựa chọn nhiệt độ tối ưu nuôi

cấy chủng B. licheniformis BCRP để thu nhận enzym -amylaza là 420C, cao hơn nhiệt độ tối

ưu của chủng B20.

* Ảnh hưởng của pH

Chủng B20 được nuôi lắc 220 vòng/phút trên môi trường dịch thể với các pH khác nhau

gồm: 4,0, 5,0 , 6, 6,5, 7,0, 7,5 và 9,0. Sau 48h xác định mật độ tế bào và hoạt tính amylaza

của dịch nuôi.

Hình 3.19. Ảnh hưởng của pH tới sinh trưởng và khả năng phân giải tinh bột của chủng B20

Chủng B20 sinh trưởng và tổng hợp enzym phân giải tinh bột thích hợp ở pH 6,0- 8,0.

Khoảng pH này hoàn toàn thích hợp với quá trình xử lý chất thải chăn nuôi. Kết quả này khá

phù hợp với nghiên cứu của một số tác giả khác (Đỗ Bích Thuỷ và cs xác định pH thích hợp

cho chủng B. subtilis tổng hợp -amylaza là 6-7,5 với pH tối ưu là 7; Ashger và cs chọn pH

nuôi cấy tối ưu để chủng B. subtilis JS2004 tổng hợp amylaza là pH7; Nadia riaz và cs kết

luận pH thích hợp để B. subtilis tổng hợp -amylaza là 6-8 với pH tối ưu là 7,5. Ngô Xuân

Mạnh và cs lựa chọn được khoảng pH thích hợp nuôi cấy chủng B. licheniformis BCRP để

thu nhận enzym -amylaza là 6-8 với pH tối ưu là 7,5).

* Ảnh hưởng của ion kim loại

Nuôi cấy chủng B20 trong môi trường và điều kiện thích hợp, ly tâm thu dịch enzym, bổ

sung CaCl2 với các nồng độ 2và 4 mM, xử lý nhiệt ở 85oC trong 15 và 30 phút. Xác định ảnh

hưởng của Ca2+

trong môi trường tới hoạt tính amylaza của chủng B20.

Bảng 3.12. Ảnh hƣởng của ion Ca2+

đến độ bền nhiệt của amylaza do chủng B20 tổng

hợp

Nồng độ Ca2+

(mM)

Thời gian xử lý

(phút)

Hoạt tính tương đối (%)

0

15 21,2

30 4,5

2

15 92,2

30 29,5

4 15 40,3

Nồng độ Ca2+

(mM)

Thời gian xử lý

(phút)

Hoạt tính tương đối (%)

30 20,5

Nồng độ Ca2+

thích hợp là 2 mM trong thời gian xử lý nhiệt là 15 phút. Kết quả thử

nghiệm này phù hợp với các nghiên cứu của các tác giả khác đã công bố cho rằng Ca2+

làm

ổn định hoá cấu trúc bậc III của enzym amylaza khi ở nhiệt độ cao (Nguyễn Thị Hoài Hà;

Kwak và Akiba).

Từ các kết quả nghiên cứu trên cho thấy enzym amylaza của chủng B20 hoạt động trong

dải nhiệt độ 30-550C; pH 4,0-8,0, điều kiện thích hợp là 37- 50

0C, pH 6,0- 8,0. Sự có mặt của

ion Ca2+

làm tăng hoạt tính và độ bền nhiệt của amylaza.

3.2.3.3. Ảnh hƣởng đến khả năng phân giải protein của chủng B15

* Ảnh hưởng của nhiệt độ:

Chủng B15 được nuôi lắc trong môi trường dịch thể thích hợp ở các điều kiện nhiệt

độ khác nhau trong khoảng từ 25 đến 550C. Xác định khả năng sinh trưởng (OD) và hoạt độ

enzym proteaza trong dịch nuôi cấy (PA), kết quả thể hiện trên hình 3.20

Hình 3.20. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng và khả năng phân giải protein của chủng

B15

Chủng B15 có khoảng nhiệt độ thích hợp tương đối rộng (30-500C), nhiệt độ 35-45

0C

là thích hợp nhất (OD>0,2 và PA>0,8HP/ml). Nhiệt độ tối ưu cho sinh trưởng của B15 là ở

350C (OD 2,8) còn PA đạt mức cao nhất ở 40

0C (1,02 HP mg/l). Nhiệt độ này hoàn toàn phù

hợp với giai đoạn 2-10 ngày đầu của quá trình xử lý chất thải chăn nuôi. Sản phẩm của quá

trình phân giải protein tạo các axit amin là nguồn cung cấp dinh dưỡng cho các VSV trong

quá trình chuyển hoá tiếp theo. Kết quả này phù hợp với kết quả của một số nghiên cứu khác

(Kim J. M và cs xác định nhiệt độ nuôi cấy tối ưu cho vi khuẩn B. subtilis tổng hợp proteaza

là 400C. Nghiên cứu của Đỗ Bích Thuỷ và cs lại cho thấy chủng B. subtilis có hoạt tính

proteaza cao nhất khi nuôi ở nhiệt độ 350C).

* Ảnh hưởng của pH

Chủng B15 được nuôi lắc trong môi trường dịch thể thích hợp ở các điều kiện pH

khác nhau trong khoảng từ 5 đến 9. Xác định khả năng sinh trưởng (OD) và hoạt độ enzym

proteaza trong dịch nuôi cấy (PA), kết quả thể hiện trên hình 3.21

Hình 3.21. Ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng và khả năng phân giải protein của chủng B15

Hình 3.21 cho thấy: Sinh khối đạt mức cao nhất ở pH 7,0 (OD 2,6), pH tối ưu cho tổng

hợp proteaza là 7,5 (đạt 0,98 HP/ml). Khoảng pH thích hợp cho chủng B15 sinh trưởng và

tổng hợp enzym proteaza là 6,0-8,0 hoàn toàn phù hợp với quá trình xử lý chất thải chăn

nuôi. Trong một số nghiên cứu khác, tác giả Kim J. M và cs xác định pH nuôi cấy thích hợp

cho vi khuẩn B. subtilis tổng hợp proteaza là từ 5 đến 6, pH tối ưu là 7. Nghiên cứu của Đỗ

Bích Thuỷ và cs lại cho thấy chủng B. subtilis có hoạt tính proteaza cao nhất khi nuôi ở pH 8.

* Ảnh hưởng của ion kim loại: Các ion kim loại được sử dụng là: Ca2+

, Ba2+

, Mg2+

, Cu2+

,

Fe2+

, Zn2+

, với nồng độ cuối cùng trong hỗn hợp phản ứng bằng 10-3

M.

Bảng 3.13. Ảnh hƣởng của ion kim loại đến hoạt tính proteaza của chủng B15

Ion

Mật độ quang (OD)

Hoạt độ tương đối

(%) Lần 1 Lần 2

Giá trị

TB

Ca2+

0,622 0,675 0,649 95,018

Ba2+

0,683 0,702 0,693 101,47

Mg2+

0,682 0,704 0,693 101,54

Cu2+

0,334 0,311 0,323 47,253

Fe2+

0,629 0,647 0,638 93,48

Zn2+

0,294 0,382 0,338 49,524

ĐC 0,664 0,701 0,683 100,00

Số liệu bảng 3.13 cho thấy proteaza của chủng B15 khá ổn định với sự có mặt của ion

Ca2+

; bị giảm hoạt tính mạnh bởi Cu2+

, Zn

2+; ngược lại ion Ba

2+, Mg

2+ lại làm tăng hoạt độ

enzym.

Từ các kết quả nghiên cứu trên cho thấy enzym proteaza của chủng B20 hoạt động trong

khoảng nhiệt độ 30-550C, pH 6,0- 9,0. Điều kiện thích hợp của enzym là 35- 50

0C, pH 6,0-

8,0. Hoạt tính enzym tăng hoặc tương đối ổn định với sự có mặt của các ion Ca2+

, Ba

2+ và

Mg2+

3.2.4. Hoạt tính đối kháng của chủng LH19

3.2.4.1. Khả năng đối kháng vi khuẩn gây bệnh, gây thối rữa

* Đối kháng vi khuẩn gây bệnh

Các chủng VK được nuôi cấy riêng rẽ sau 48 giờ trong môi trường dịch thể ở điều kiện

thích hợp, cho tiếp xúc trực tiếp VK lactic với từng chủng VK kiểm định. Xác định khả năng

tồn tại của mỗi chủng trong hỗn hợp sau các khoảng thời gian nhất định.

Bảng 3.14. Khả năng đối kháng vi khuẩn gây bệnh cho ngƣời và vật nuôi của chủng

LH19

Chủng kiểm định Mật độ ban đầu

(CFU/ml)

Mật độ sau khi tiếp xúc với chủng LH19 theo thời

gian (CFU/ml)

6h 24h 48h 72h

E. coli 4,8 x 106 6,3 x 10

4 1,8 x 10

4 1,4 x 10

4 -

Salmonella 3,5 x 106 2,7 x 10

4 1,5 x 10

4 1,0 x 10

4 -

Shigella 3,8 x 106 7,0 x 10

3 - - -

S. aureus 3,6 x 106 6,2 x 10

3 - - -

(-): Không xác định được ở nồng độ pha loãng 10-1

Kết quả cho thấy chủng LH19 đối kháng được cả 4 chủng VK gây bệnh thử nghiệm, thời

gian ức chế nhanh (sau 6h tiếp xúc, nồng độ tế bào các VK gây bệnh đều giảm mạnh,

Shigella, Staphylococcus giảm từ 106 xuống 10

3 CFU/ml;

E. coli và Salmonella

giảm từ 10

6

xuống 104

CFU/ml). Khả năng kháng khuẩn nhanh, mạnh nhất với Shigella, Staphylococcus

aureus (ở 24h tiếp xúc), kháng E. coli và Salmonella ở 72h tiếp xúc trực tiếp.

* Đối kháng vi khuẩn gây thối rữa

Chủng VK lactic LH19 và VK gây thối E. carotovora KT03 được nuôi cấy riêng rẽ

sau 48h trong môi trường dịch thể đặc hiệu và điều kiện sinh trưởng phù hợp với mỗi chủng.

Cho tiếp xúc dịch thể ở nồng độ 106 và 10

8 CFU/ml. Xác định mật độ tế bào của mỗi chủng

trong hỗn hợp.

Bảng 3.15. Khả năng đối kháng E. carotovora KT03 của chủng LH19

Nồng độ

tiếp xúc

Chủng vi khuẩn Mật độ

ban đầu

(CFU/ml)

Mật độ sau khi tiếp xúc với chủng

LH19 theo thời gian (CFU/ml)

24h 48h 72h

108 E.carotovora KT03 1,6 x 10

8 3,6 x 10

4 - -

LH19 1,4 x 108 2,2 x 10

8 4,6 x 10

8 3,08 x 10

8

106 E.carotovora KT03 3,2 x 10

6 1,06 x 10

4 - -

LH19 3,0 x 106 6,8 x 10

6 1,52 x 10

7 1,4 x 10

7

(-): Không tìm thấy khuẩn lạc ở nồng độ pha loãng 10-1

Kết quả thử nghiệm cho thấy, chủng LH19 đối kháng mạnh với VK gây thối rữa thực vật,

sau 24h tiếp xúc mật độ tế bào chủng E. carotovora KT03 đã giảm mạnh từ 108

hoặc 106

xuống 104, sau 48h không xác định được VK E. carotovora KT03 trong hỗn hợp.

Kết quả tại các bảng 3.14 và 3.15 cho thấy chủng LH19 có hoạt tính kháng khuẩn nhanh

(sau 6-48 giờ) nên giai đoạn đầu khi nhiệt độ tăng ở mức phù hợp cho VK ưa ấm phát triển,

chủng LH19 sẽ sinh trưởng mạnh và tiêu diệt được nhóm VK gây thối rữa, VK gây bệnh

đường ruột vì vậy bổ sung vào chế phẩm xử lý chất thải chăn nuôi sẽ có hiệu quả làm giảm

mùi hôi thối và sự lan truyền nguồn bệnh.

3.2.4.2. Khả năng sinh tổng hợp bacterioxin của VK lactic LH19

Ngoài axit lactic là tác nhân diệt khuẩn, liệu chủng LH19 có khả năng tổng hợp

protein kháng khuẩn hay không? Để tìm hiểu rõ yếu tố kháng khuẩn của chủng LH19, nghiên

cứu tiến hành các thử nghiệm xác định khả năng sinh tổng hợp bacterioxin của chủng LH19

Xác định phổ kháng khuẩn

Mục tiêu của thí nghiệm là tìm phổ kháng khuẩn của chủng LH19 trong điều kiện sinh

trưởng và của dịch ly tâm đã được trung hòa pH để làm giảm tác động kháng khuẩn của axit

lactic, từ đó xác định được yếu tố kháng khuẩn của LH19. Căn cứ vào các công trình nghiên

cứu đã được công bố về bacterioxin của VK lactic, chúng tôi lựa chọn bộ chủng giống VK

kiểm định có cùng họ hàng hoặc cạnh tranh về dinh dưỡng, môi trường cư trú. Kết quả đánh

giá nhanh, định tính phổ kháng khuẩn của LH19 bằng phương pháp đục lỗ thạch và cấy chấm

điểm cho thấy chủng LH19 có phổ ức chế tương đối rộng với các chủng kiểm định thuộc cả

VK Gram (+) và VK Gram (-). Tuy nhiên khi điều chỉnh dịch nuôi cấy về pH trung tính để

loại bỏ tác động của axit lactic thì phổ ức chế bị thu hẹp lại, trong khi khả năng ức chế một số

VK gram (-) giảm xuống rõ rệt, vòng ức chế mờ, hầu hết nhỏ hơn 10 mm thì dịch nuôi cấy đã

trung hòa vẫn ức chế mạnh nhóm gram (+) trong đó có các chủng gây bệnh như E. faecalis và

S. aureus và khá nhiều loài VK lactic nhưng lại không ức chế các chủng L. plantarum là VK

sinh ra bacterioxin đó. Kết quả thử nghiệm này rất có ý nghĩa, phù hợp với các kết quả

nghiên cứu trước đây cho phép đưa ra khả năng chủng L. plantarum LH19 sinh tổng hợp

bacterioxin kháng khuẩn.

Xác định bản chất của chất kháng khuẩn

Để khẳng định bản chất của bacterioxin của VK lactic có phải là protein hay không,

chúng tôi nuôi cấy VK LH19 trong môi trường MRS dịch thể, sau 14 giờ đem ly tâm thu dịch

nổi. Điều chỉnh về pH6,5; xử lý dịch ly tâm với các enzym proteaza (nồng độ 0.2 mg ml-1

)

theo tỉ lệ 1:1. Mẫu đối chứng dương (dịch nuôi cấy VK với đệm phốtphát theo tỷ lệ 1:1). Các

mẫu thí nghiệm được ủ ở 37oC trong 2 giờ, dừng phản ứng bằng tác động nhiệt ở 100

oC/15

phút. Sau đó, tiến hành thử hoạt tính của mẫu theo phương pháp khuếch tán bacterioxin trên

thạch.

Sự nhạy cảm với enzym thể hiện qua việc mẫu bị mất hoạt tính. Nếu các giếng mẫu không

xuất hiện hoặc vòng vô khuẩn giảm nhiều so với mẫu đối chứng, có nghĩa đã xảy ra phản ứng

thuỷ phân protein, là nguyên nhân làm mẫu bị mất hoạt tính kháng khuẩn. Kết quả tại bảng

3.17 và hình 3.25

Bảng 3.17. Phản ứng của dịch chứa chất kháng khuẩn với các enzim phân giải

protein

Phản ứng với enzim (0,2 mg/ml)

Trypsin

(1)

Pepsin (2) α-chymotrypsin

(3)

Pronaza (4) Proteinaza K (5) Đối chứng

(6)

+ - +/- +/- - -

Chú thích: (+): Mất hoạt tính; (-): Không mất hoạt tính; (+/-): Giảm hoạt tính

Chủng LH19 tổng hợp nhạy cảm với các enzim thuỷ phân protein. Độ nhạy cảm cao nhất

đối với trypsin, yếu hơn với α-chymotrypsin và không có phản ứng với pepsin và proteinaza

K. Kết quả này chứng minh bản chất protein của mẫu bacterioxin của LH19.

Điện di đồ xác định kích thước bacterioxin. Kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn

Do bacterioxin của L. plantarum thuộc phân lớp IIa có kích thước <10kDa, chúng tôi tiến

hành điện di trên gel Tricine SDS-PAGE. Sau khi điện di, cắt đôi bản gel, nửa có marker

được nhuộm Coomasie brilliant blue, nửa còn lại được rửa (với 35% cồn, 2% glycerol 30÷60

phút, rửa nước cất vô trùng 15÷30 phút) để xác định hoạt tính kháng khuẩn. Đặt bản gel lên

đĩa petri vô trùng đã có sẵn 1 lớp thạch, sau đó đổ 1 lớp thạch bán lỏng có chứa chủng kiểm

định S. aureus. Úp ngược đĩa để trong tủ lạnh 4 giờ, sau đó nuôi 300C trong 24 giờ.

A: Điện di trên gel acrylamide 16%

1: Thang protein chuẩn;

2: Tủa bacterioxin từ dịch nuôi cấy

B: Vùng ức chế S.aureus do bacteriocin

từ bản gel tạo ra sau khi điện di tricine-

SDS- PAGE).

Hình 3.25. Điện di tricine SDS- PAGE xác định kích thước và kiểm tra

hoạt tính bacterioxin của chủng LH19

Kết quả điện di cho thấy, bacterioxin do chủng LH19 tổng hợp có khối lượng phân tử

khoảng 3,5 kDa. Kết quả xác định hoạt tính kháng của bacterioxin tại bản gel sau điện di đối

với chủng kiểm định S. aureus cũng đã khẳng định kết quả này.

Xác định độ bền của bacterioxin

Trong khoảng nhiệt độ <800C và -20

0C bacterioxin duy trì hoạt tính trong 120 phút. Đặc

biệt vẫn có hoạt tính kháng khuẩn ở 800C trong vòng 60 phút và giảm hoạt tính trong 120

phút. Như vậy bacterioxin của chủng LH19 thuộc loại bền với nhiệt độ. Bacterioxin cũng thể

hiện hoạt tính kháng khuẩn trong khoảng pH từ axit (2,0) đến trung tính (7,0), đây là một đặc

điểm mà nhiều bacterioxin không có (như nisin chủ yếu thể hiện hoạt tính trong vùng axit).

Như vậy sử dụng LH19 trong sản xuất chế phẩm VSV là phù hợp trong điều kiện xử lý chất

thải chăn nuôi.

3.2.4.3. Một số yếu tố môi trƣờng ảnh hƣởng đến hoạt tính kháng khuẩn của chủng

LH19

* Ảnh hưởng của nhiệt độ

Chủng LH19 được nuôi lắc ổn nhiệt trên môi trường dịch thể MRS, ở các nhiệt độ 25, 30,

35, 40, 45, 500C, trong thời gian 48 giờ. Xác định khả năng sinh trưởng, sinh tổng hợp axit

lactic và khả năng kháng E. carotovora KT03 của dịch nuôi cấy của chủng LH19.

Bảng 3.20. Ảnh hƣởng nhiệt độ đến sinh trƣởng và hoạt tính kháng khuẩn của

chủng LH19

Nhiệt độ nuôi

(0C)

Khả năng sinh

trưởng (OD, 600nm)

Hàm lượng axit

lactíc

ĐK vòng vô khuẩn

(D-d, mm)

(mg/ml)

25 1,8 14,8 14

30 2,2 23,5 19

35 3,2 27,9 22

40 2,3 21,2 17

45 1,2 8,4 8

50 0,7 5,0 6

Kết quả ở bảng 3.20 cho thấy chủng VK lactic LH19 thể hiện hoạt tính kháng khuẩn

trong dải nhiệt độ 25- 500C. Ở nhiệt độ 35

0C thì OD, hàm lượng axit lactic, kích thước vòng

kháng khuẩn đều đạt mức cao nhất (lần lượt là 3,2; 27,9 mg/ml và 22mm). Khả năng sinh

trưởng, tổng hợp axit lactic và kháng khuẩn giảm nhanh ở nhiệt độ 450C và 50

0C tuy nhiên

vẫn có khả năng kháng khuẩn. Nhiệt độ 30- 400C là thích hợp cho sinh trưởng, tổng hợp axit

lactic và ức chế chủng VK gây thối E.carotovora KT03. Điều này phù hợp với nghiên cứu

của cho rằng mặc dù không hình thành bào tử nhưng VK lactic vẫn có thể tồn tại trong điều

kiện nhiệt độ dưới 150C và nhiệt độ trên 40

0C.

Như vậy trong đống ủ chất thải chăn nuôi, VK lactic sẽ sinh trưởng, tổng hợp các chất

kháng khuẩn mạnh và hoạt động hiệu quả trong vòng 3 ngày đầu khi nhiệt độ đống ủ <500C

nhưng vẫn tồn tại trong đống ủ trong quá trình xử lý.

* Ảnh hưởng của pH

Nuôi lắc ổn nhiệt trên môi trường MRS. Điều chỉnh và ổn định bằng đệm ở các pH khác

nhau từ 4,0 đến 9,0 trong thời gian 48 giờ. Xác định khả năng sinh trưởng, sinh tổng hợp axit

lactic, khả năng kháng E. carotovora KT03 của dịch nuôi cấy chủng LH19.

Bảng 3.21. Ảnh hƣởng của pH đến sinh trƣởng và hoạt tính kháng khuẩn của chủng

LH19

pH

Khả năng sinh

trưởng (OD, 600nm)

Hàm lượng axit lactíc

(mg/ml)

ĐK vòng vô khuẩn

với E. carotovora (D-

d,mm)

4 0,9 16,8 18

5 1,6 25,3 19

6 2,2 29,2 22

7 3,2 30,5 22

8 2,4 25,0 17

9 1,2 19,6 13

Ở pH 4- 9 chủng LH19 đều có khả năng sinh trưởng, tổng hợp axit lactic và bacterioxin.

Tuy nhiên ở pH 4, khả năng sinh trưởng của chủng LH19 kém (OD chỉ đạt 0,9) do đó hàm

lượng axit lactic cũng ở mức thấp (16,8 mg/ml). Khả năng sinh trưởng (OD) và sinh tổng hợp

axit lactic tăng nhanh ở pH 5-7, đạt cao nhất ở pH 7 (lần lượt là 3,2 và 30,5mm/ml), ở pH 9,

khả năng sinh trưởng (OD) và sinh tổng hợp axit lactic lại giảm xuống mức thấp (1,2 và 19,6

mg/ml). Trong khoảng pH 4- 8, chủng LH19 vẫn thể hiện hoạt tính kháng khuẩn cao (17-

22mm). Kích thước vòng kháng khuẩn đạt cao nhất ở pH 6-7 là 22 mm và giảm ở pH 9

(13mm). Như vậy bacterioxin của chủng LH19 hoạt động mạnh trong khoảng pH từ axit nhẹ

đến trung tính và giảm dần ở pH kiềm.

Nghiên cứu của chúng tôi cũng phù hợp với các công trình đã công bố cho biết trong

điều kiện pH axit và trung tính, bacterioxin thể hiện hoạt tính kháng khuẩn mạnh hơn ở pH

kiềm, dải pH thích hợp của L. plantarum từ 4 cho đến 10, tuy nhiên Ogunbanwo và cs lại xác

định pH thích hợp cho hoạt tính của L. plantarum là từ 2 đến 8.

* Ảnh hưởng của nguồn hydratcacbon

Nghiên cứu của chúng tôi nhằm mục đích tìm ra nguồn hydratcacbon là nguồn nguyên

liệu rẻ tiền, sẵn có ở các địa phương phù hợp với giá thành, điều kiện sản xuất chế phẩm VSV

ở nước ta.

Bảng 3.22. Sinh trƣởng hoạt tính kháng khuẩn của chủng LH19 trên các loại đƣờng

khác nhau

Nguồn đường Mật độ tế bào

(x 108CFU/ml)

Hàm lượng axit

lactic (mg/ml)

ĐK vòng vô khuẩn với

E. carotovora (D-d,mm)

Sacaroza 1,2 26 20

Glucoza 46 30 23

Rỉ đường 28

32 22

Bảng 3.22 cho thấy chủng LH19 có khả năng tổng hợp chất kháng khuẩn ở cả 3 nguồn

đường. Glucoza là nguồn đường tốt nhất (Mật độ tế bào, lượng axit lactic và kích thước vòng

kháng khuẩn cao nhất, lần lượt là 4,6x 109CFU/ml, 30 mg/ml, 23 mm). Trên môi trường rỉ

đường cũng cho lượng axit lactic và vòng kháng khuẩn cao tương đương. Như vậy có thể sử

dụng rỉ đường để thay thế glucoza trong điều kiện sản xuất qui mô lớn hoặc tại địa phương có

sẵn nguồn nguyên liệu rỉ đường.

* Ảnh hưởng của các muối nitơ vô cơ

Chủng LH19 được nuôi trên môi trường dịch thể trong các điều kiện thích hợp với sự bổ

sung các muối amon (0,1% nitơ trong phân tử muối amon). Sau 48h, xác định khả năng sinh

trưởng và ức chế vi khuẩn E. carotovora KT03 của chủng LH19.

Bảng 3.23. Ảnh hƣởng các muối nitơ vô cơ đến sinh trƣởng và hoạt tính của chủng

LH19

Muối nitơ Khả năng sinh trưởng

(OD, 600 nm)

Đường kính vòng vô khuẩn với

E. carotovora (D-d,mm)

(NH4)3H7O3 1,8 20

(NH4)2C4H4O6 3,3 22

(NH4)2PO4 2,3 19

NH4Cl 2,4 16

NH4NO3 2,5 18

NH4H2PO4 1,7 15

Amoni xitrat là thích hợp nhất cho sinh trưởng và khả năng kháng khuẩn của LH19 (OD

đạt 3,3, ĐT vòng vô khuẩn đạt 22 mm). Sự khác nhau này có thể do gốc xitrat có tính đệm

cao và tính axit yếu nên không làm giảm pH của môi trường nhiều như các gốc khác. Kết quả

thử nghiệm này là phù hợp vì amoni xitrat được chọn là nguồn nitơ vô cơ trong môi trường

nuôi cấy chuẩn.

3.3. NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHẾ PHẨM VI SINH VẬT XỬ LÝ CHẤT THẢI

CHĂN NUÔI

- Điều kiện nhân sinh khối VSV: Kết quả nghiên cứu động thái sinh trưởng của 4 chủng

VSV (ở các mốc thời gian 24, 48, 72, 96h) đã xác định được thời gian nuôi cấy để mật độ tế

bào đạt mức cao nhất, từ đó xác định được thời điểm thu sinh khối thích hợp nhất đối với

chủng XK112 là 72 giờ, các chủng B20, B15 và LH19 là 48 giờ.

- Tỷ lệ giống cấy: Thí nghiệm được triển khai với các tỷ lệ cấy giống gốc là 1, 2, 3, 4, 5 %.

Kết quả cho cho thấy ở tỷ lệ giống cấy 3%, cả 4 chủng nghiên cứu đều sinh trưởng và phát

triển tốt (đạt mức ổn định > 109 CFU/ml). Bổ sung 3% giống vào bình lên men vừa thích hợp

cho thu sinh khối vừa hiệu quả đối với chi phí sản xuất.

- Điều kiện cấp khí: Các được nuôi cấy trong các điều kiện cấp khí 0,3; 0,4; 0,5; 0,6 và 0,73

dm3 không khí/lít môi trường/phút. Nhu cầu oxy của chủng XK112 và B15 là 0,5-0,6 dm

3

không khí/lít môi trường/phút, của chủng B20 (0,3-0,4 dm3 không khí/lít môi trường/phút).

Riêng chủng LH19 có nhu cầu oxy thấp nhất, có thể lên men tĩnh hoặc khuấy nhẹ (≤0,3dm3

không khí/lít môi trường/phút).

- Môi trƣờng nhân sinh khối: Các môi trường sử dụng trong nghiên cứu gồm SX1, SX2,

SX3. Kết quả xác định sinh khối đạt cao nhất ở môi trường SX1 đối với chủng XK112, môi

trường SX2 đối với chủng LH19 và môi trường SX3 đối với chủng B20 và B15, mật độ tế

bào các chủng đều đạt ≥109

CFU/ml. Như vậy môi trường nhân sinh khối phù hợp đối với

chủng XK112 là SX; chủng LH19 là SX2 và chủng B20, B15 là SX3.

Tổng hợp các yếu tố kỹ thuật thích hợp cho quá trình lên men của 4 chủng VK nghiên

cứu được trình bày trong bảng 3.28.

Bảng 3.28. Điều kiện thích hợp nhân sinh khối của các chủng VSV nghiên cứu

Thông số kỹ thuật

Chủng vi khuẩn

XK11

2 B20 B15 LH19

pH 7,3 ± 0,2 7,0 ± 0,2 7,0 ± 0,2 6,5 ± 0,2

Nhiệt độ nhân sinh khối (oC) 37 ± 2 30 ± 2 30 ± 2 35 ± 2

Thời gian nhân sinh khối (giờ) 72 48 48 48

Tỷ lệ giống gốc (%) 3 3 3 3

Môi trường nhân sinh khối SX1 SX3 SX3 SX2

Lưu lượng cấp khí (dm3

KK/dm3

môi trường/phút)

0,5-

0,6 0,3- 0,4 0,5- 0,6 ≤ 0,3

3.3.2. Quy trình sản xuất chế phẩm

Trên cơ sở kết quả nghiên cứu các yếu tố thích hợp cho quá trình nhân sinh khối của các

chủng VSV và tham khảo các công trình nghiên cứu trước đây, chúng tôi đã xây dựng quy

trình công nghệ sản xuất chế phẩm VSV xử lý nhanh phế thải chăn nuôi. Qui trình sản xuất

chế phẩm vi sinh vật được tóm tắt theo sơ đồ sau:

Kiểm tra hoạt

tính

Kiểm tra

hoạt tính

Kiểm tra

hoạt tính

Nhân giống cấp

I

Nhân giống cấp

I

Nhân giống

cấp I

Xa khuân phân giải

xenluloza (Streptomyces

griseosporeus)

Vi khuân phân giải tinh

bột (Bacillus licheniformis)

Vi khuân lactic kháng

khuân, khư mui hôi

(Lactobacillus

plantarum)

Môi trường lên

men cấp II

Môi trường lên

men cấp I

Vi khuân phân

giải protein

(Bacillus subtilis)

Kiểm tra hoạt

tính

Nhân giống

cấp I

Hình 3.27. Sơ đồ Quy trình sản xuất chế phẩm vi sinh vật xử lý chất thải chăn nuôi

3.3.3. Chất lƣợng chế phẩm

Bảng 3.29. Khả năng tồn tại của 4 chủng vi sinh vật trong chế phẩm

Chủng

VSV

Mật độ tế bào (x 108

CFU/ml)

0 giờ 7

ngày

1

tháng

2

tháng

3

tháng 6 tháng

XK112 5,6 40 56 52 42 4,6

B20 4,4 32 45 36 64 2,4

B15 5,2 46 55 40 18 3,8

Chất mang

(than bùn)

Nhân giống cấp

II

Nhân giống cấp

II

Nhân giống cấp

II

Phối trộn

Kiểm tra chất lượng

Bao gói

Bảo quản sử dụng

Lên men

xốp Lên men xốp

Lên men xốp

Nhân giống cấp

II

Lên men xốp

Bổ sung

dinh

dưỡng

Sấy khô

LH19 3,6 32 12 62 1,4 0,42

Bảng 3.30. Hoạt tính của 4 chủng XK112, B20, B15 và LH19 trong chế phẩm

Chủng

VSV

Đường kính vòng phân giải (D-d, mm) sau thời gian bảo

quản

Đường kính vòng

kháng E.

carotovora KT03

(D-d, mm) Xenluloza Tinh bột Protein

3 tháng 6 tháng 3 tháng 6 tháng 3

tháng 6 tháng 3 tháng 6 tháng

XK112 34 33 19 18 - - - -

B20 27 25 38 36 - - - -

B15 - 22 20 28 27 - -

LH19 - - - - - - 22 20

Sau 3- 6 tháng bảo quản, các chủng VSV vẫn tồn tại tốt trong chế phẩm; mật độ tế bào

của 3 chủng XK112, B20, B15 đạt 109

CFU/g sau 3 tháng và 108

CFU/g sau 6 tháng, riêng

chủng LH19 mật độ tế bào thấp hơn (đạt 108

CFU/g sau 3 tháng và 107

CFU/g sau 6 tháng).

Hoạt tính sinh học của các chủng sau 3 tháng bảo quản đều tương đương so với hoạt tính ban

đầu (bảng 3.7), sau 6 tháng hoạt tính vẫn tương đối ổn định. Như vậy, các yếu tố kỹ thuật lựa

chọn trong qui trình sản xuất thử nghiệm là phù hợp cho sản xuất chế phẩm vi sinh vật để xử

lý chất thải chăn nuôi.

3.4. ỨNG DỤNG CHẾ PHẨM VI SINH VẬT ĐỂ XỬ LÝ CHẤT THẢI CHĂN NUÔI

3.4.1. Hiệu quả xử lý chất thải chăn nuôi

Căn cứ vào kết quả thử nghiệm và kế thừa kết quả nghiên cứu đã được công bố trong

nước và trên thế giới, đề tài đã xây dựng quy trình xử lý chất thải chăn nuôi dạng rắn tóm tắt

theo sơ đồ sau:

(Chất thải chăn nuôi + than bùn,

trấu, rơm rạ khô theo tỷ lệ 1:1đến 2:1)

Chất thải chăn

nuôi dạng rắn

Chế phẩm

VSV Phối trộn

Điều chỉnh pH,

độ ẩm, tỷ lệ C/N

Ủ nóng

Đảo trộn, ủ chín, để

hoai đến nhiệt độ

không đổi

Hình 3.29. Sơ đồ Quy trình sử dụng chế phẩm vi sinh vật xử lý chất thải chăn nuôi

3.4.1.1. Động thái nhiệt độ đống ủ

Khảo sát biến động nhiệt độ đống ủ trên 2 loại chất thải chăn nuôi gà và lợn dạng rắn. Thí

nghiệm với 2 công thức: Đối chứng (ĐC) không xử lý bằng VSV và thí nghiệm (TN) xử lý

bằng VSV.

Bảng 3.31. Biến động nhiệt độ trong quá trình xử lý chất thải chăn nuôi

Thời gian theo dõi

(ngày)

Nhiệt độ khối ủ chất thải

nuôi lợn (0C)

Nhiệt độ khối ủ chất thải

nuôi gà (0C)

ĐC TN ĐC TN

0 29,0 29,0 29,5 29,5

2 34,0 38,5 34,5 39,0

4 41,3 52,0 42,0 52,7

7

Trước/sau đảo trộn

47,5 / 33,5 60,5 /

34,8

48,0 / 35,0 62 / 35,5

9 42,6 53,5 43,0 55,3

12 46,5 55,0 47,6 56,5

15

Trước/sau đảo trộn

50,8 / 36,0 51 / 34,6 51 / 41,2 51,5 /

35,0

18 45,7 40,2 46,0 42,5

21 46,0 35,5 47,2 36,0

24 46,5 34,6 48,3 35,0

Làm khô, đóng bao,

kiểm tra, sử dụng

27 47,2 33,2 48,5 34,2

30 49,5 32,5 49,0 33,0

Ở công thức TN, nhiệt độ tăng nhanh trong những ngày đầu cho thấy quá trình chuyển

hóa chất hữu cơ xảy ra sớm và mạnh hơn so với đối chứng. Nhiệt độ tăng thúc đẩy các phản

ứng hoá học xảy ra, kích thích sự hoạt động của VSV ưa nhiệt, đồng thời tiêu diệt các VSV

gây bệnh, ký sinh trùng, mầm bệnh trong nguyên liệu ủ. Ở công thức ĐC, nhiệt độ có xu

hướng tăng nhẹ và liên tục trong vòng 30 ngày, chỉ giảm sau khi đảo trộn rồi lại tiếp tục tăng.

Công thức ĐC, mức độ tăng nhiệt độ chậm hơn so với công thức TN chứng tỏ khi không sử

dụng chế phẩm, trong đống ủ vẫn xảy ra quá trình phân huỷ các hợp chất hữu cơ bởi quần thể

VSV tự nhiên. Nhiệt độ cao nhất của khối ủ là 460C đối với phân lợn và 47,2

0C đối với phân

gà ở ngày thứ 21, chứng tỏ mức độ quá trình chuyển hoá cơ chất chậm và yếu hơn so với

công thức bổ sung VSV khởi động. Sau 21 ngày ủ, quá trình phân giải cơ chất ở công thức

TN đã kết thúc nhưng ở thời điểm này quá trình phân huỷ vẫn đang tiếp tục xảy ra trong đống

ủ ở công thức đối chứng. Kết quả này phù hợp với các kết quả nghiên cứu trước đây, với

phương pháp ủ thông thường, thời gian phân huỷ hoàn toàn cơ chất kéo dài từ 4- 6 tháng, bổ

sung VSV khởi động rút ngắn được thời gian xử lý cơ chất xuống còn 21- 30 ngày

3.4.1.2. Hiệu quả chuyển hóa các thành phần dinh dƣỡng

Trong thành phần chất thải chăn nuôi dạng rắn, các mẫu sau khi sấy khô để xác định độ

ẩm được phân tích tỷ lệ các thành phần chủ yếu gồm: OM (chất hữu cơ), N, P2O5, K2O. Kết

quả phân tích (tính theo khối lượng khô) đã xác định sự thay đổi về thành phần hoá học của

hai loại chất thải chăn nuôi lợn và gà sau quá trình ủ và sự sai khác giữa công thức TN và

ĐC.

Tỷ lệ OC ở cả hai công thức TN và ĐC đều giảm so với ban đầu, chứng tỏ ở cả hai công

thức ủ đều diễn ra quá trình phân giải các hợp chất hydratcacbon. Tỷ lệ OC chỉ giảm khoảng

20% ở công thức ĐC nhưng lại giảm tới 40% ở công thức TN. Sự sai khác này chứng tỏ khi

xử lý chất thải bằng VSV, quá trình phân giải xenluloza, tinh bột diễn ra mạnh hơn và nhanh

hơn nên sau 21 ngày ủ tỷ lệ các hydratcacbon ở công thức TN giảm nhiều hơn so với ĐC.

Do tỷ lệ OC trong tổng lượng chất khô đều giảm ở cả hai công thức kéo theo tỷ lệ %

trong tổng lượng chất khô của P2O5 và K2O của hai công thức đều tăng nhẹ mặc dù thực chất

tổng lượng P, K không tăng lên so với cơ chất ban đầu. Mức độ giảm OC% của công thức TN

cao gấp 2 lần so với ĐC do đó mức tăng P2O5 và K2O ở công thức TN cũng cao hơn so với

công thức ĐC. Công thức ĐC, N% giảm từ 2,68% xuống 2,27% ở chất thải chăn nuôi lợn và

giảm từ 2,84 xuống 2,3% ở chất thải chăn nuôi gà. Trong công thức TN, N% giảm từ 2,68%

xuống 2,5% ở chất thải chăn nuôi lợn và giảm từ 2,84 xuống 2,5% ở chất thải chăn nuôi gà.

Mức giảm N% ở công thức TN thấp hơn so với ĐC đối chứng. Như vậy bổ sung VSV khởi

động vào chất thải giúp làm tăng quá trình chuyển hoá các chất hữu cơ và giảm lượng nitơ

thất thoát.

Bảng 3.32. Thành phần của chất thải chăn nuôi sau xử lý

Chỉ tiêu phân

tích

Thành phần chất thải nuôi lợn Thành phần chất thải nuôi gà

Trước ủ Sau ủ Trước ủ

Sau ủ

ĐC TN ĐC TN

Độ ẩm (%) 68 42 20 56 37 20

pH 5,6 7,2 6,9 5,8 7,4 7,1

OC (%)* 25,35 19,8 14,2

5 26,4

21,0 15,9

N (%)* 2,68 2,27 2,5 2,84 2,3 2,5

P2O5 (%)* 0,31 0,32 0,34 0,78 0,82 0,86

K2O (%)* 0,38 0,39 0,4 0,63 0,66 0,7

Tỷ lệ giảm OC

(%)

- 21,9 43,8 -

20,5 39,8

Chú thích: (*): Tính theo khối lượng khô

3.4.1.3. Hiệu quả xử lý vi sinh vật gây bệnh và ký sinh trùng

Bảng 3.33. Mật độ vi sinh vật gây bệnh và ký sinh trùng trong chất thải chăn nuôi

Chỉ tiêu E.coli (x10

3CFU/g) Salmonella (CFU/25g) Trứng giun /g

ĐC TN ĐC TN ĐC TN

Chất thải nuôi lợn

Trước xử lý 80 80 1,2 1,2 105 105

Sau 3 ngày 34 (-)* 0,6 (-)* 65 56

Sau 21 ngày 1,2 (-)* 0,22 (-)* 8 0

Chất thải nuôi gà

Trước xử lý 220 220 2,4 2,4 120 120

Sau 3 ngày 108 (-)* 0,62 (-)* 82 75

Sau 21 ngày 4,6 (-)* 0,18 (-)* 14 0

(-)*: Không phát hiện trong 25 g mẫu thử

Kiểm tra các mẫu chất thải chăn nuôi gia súc, gia cầm sau 3 ngày và 21 ngày được xử lý

bằng chế

phẩm VSV đều không phát hiện thấy E. coli và Salmonella, điều đó chứng tỏ hiệu lực của

VSV sau 3 ngày xử lý, VK lactic LH19 được bổ sung trong chế phẩm đã tổng hợp các chất

kháng khuẩn ức chế và tiêu diệt các VSV gây bệnh trong chất thải chăn nuôi. Kết quả này

phù hợp với kết quả nghiên cứu VK lactic LH19 có khả năng tiêu diệt các chủng

Staphylococcus aureus, Shigella và Erwinia trong vòng 24 giờ và kháng E. coli, Salmonella

trong vòng 72 giờ tiếp xúc trực tiếp (Bảng 3.14 và 3.15)

3.4.1.4. Hiệu quả xử lý mùi hôi do khí phát thải

Sau 3 ngày ủ phân, nồng độ cả hai loại khí đều giảm rất mạnh (trên 70% so với nồng độ

ban đầu). Nồng độ NH3 giảm tới 73,1% ở trang trại nuôi lợn và 72,4% ở trang trại nuôi gà so

với trước khi xử lý. Nồng độ khí H2S đều đã giảm xấp xỉ 78% so với trước khi xử lý đối với

cả 2 loại trang trại chăn nuôi gà, lợn và đều đạt yêu cầu giới hạn cho phép theo TCN678-

2006. Sau 21 ngày, nồng độ NH3 ở mức 0,82 và 0,79 mg/m3 (lần lượt đối với chất thải nuôi

lợn và nuôi gà). Nồng độ H2S là 0,06 mg/m3

với cả 2 loại chất thải (đều giảm trên

80% so với

ban đầu) và ở dưới mức cho phép theo TCN678-2006.

Bảng 3.34. Môi trƣờng không khí tại trang trại chăn nuôi lợn

Thời gian

đánh giá

Độ nhiễm khuẩn KK

(x106 CFU/m

3)

Nồng độ H2S

(mg/m3)

Nồng độ NH3

(mg/m3)

ĐC TN ĐC TN ĐC TN

Trước xử lý 5,8 5,8 0,32 0,32 3,12 3,12

Sau 3 ngày 5,2 2,2 0,28

(12,5%)a

0,07

(78,1%)a

2,04

(34,6%)b

0,84

(73,1%)b

Sau 21 ngày 3,4 1,6 0,25

(21,9%)a

0,06

(81,3%)a

1,96

(37,2%)b

0,82

(73,7%)b

Giới hạn

*

106 0,08 * 0,2 **

(*): Theo TCVN 5937/95; (**): Theo TCVN 5938/95; a,b: Tỷ lệ giảm so với nồng độ ban

đầu;

Bảng 3.35. Môi trƣờng không khí tại trang trại chăn nuôi gà

Thời gian

đánh giá

Độ nhiễm khuẩn KK

(x106

CFU/m3)

Nồng độ H2S

(mg/m3)

Nồng độ NH3

(mg/m3)

ĐC TN ĐC TN ĐC TN

Trước xử lý 7,2 7,2 0,36 0,36 2,94 2,94

Sau 3 ngày 4,02 2,8 0,31

(13,9%)a

0,08

(77,8%)a

1,85

(37,1%)b

0,81

(72,4%)b

Sau 21 ngày 4,0 1,34 0,28

(22,2%)a

0,06

(83,3%)a

1,78

(39,5%)b

0,79

(73,1%)b

Giới hạn 106 0,08 * 0,2 **

(*): Theo TCVN 5937/95; (**): Theo TCVN 5938/95; a,b: Tỷ lệ giảm so với nồng độ ban

đầu;

Kết quả thử nghiệm đã khẳng định sử dụng VSV có hiệu lực ức chế, tiêu diệt các VK gây

bệnh rất nhanh (sau 3 ngày ủ), kết quả này cũng phù hợp với kết quả đánh giá khả năng

kháng khuẩn của LH19 trong môi trường thạch đĩa và dịch thể.

3.4.2. Khả năng sử dụng chất thải chăn nuôi sau xử lý làm phân bón

Sau 21 ngày ủ, các hợp chất hữu cơ được chuyển hoá nhờ hoạt động sống của VSV nên

sản phẩm sau ủ mủn và tơi xốp, kích thước hạt nhỏ hơn. Màu sắc chuyển từ nâu (phân lợn)

hoặc vàng (phân gà) thành nâu sẫm hoặc vàng sẫm. Độ ẩm giảm, đặc biệt là không còn mùi

hôi thối khó chịu của chất thải ban đầu. Sau 21 ngày xử lý nhiệt độ trong túi sản phẩm sau ủ

từ chất thải chăn nuôi gà và lợn ở công thức TN ổn định trong 3 ngày liên tiếp với mức chêch

lệch nhiệt độ <0,50C, chứng tỏ nguyên liệu được ủ sau 21 ngày đã hoai mục, đạt độ chín theo

quy định. Trong khi đó ở công thức ĐC, nhiệt độ túi sản phẩm không ổn định, vẫn có sự

chênh lệch lớn hơn 10C giữa các lần đo chứng tỏ vẫn diễn ra quá trình chuyển hoá các chất,

nguyên liệu ủ chưa hoai mục. Kiểm tra độ chín, hoai mục của phân ủ cũng được thực hiện

theo phương pháp thử nghiệm cây trồng: Công thức TN, khối lượng trung bình của 3 lần thí

nghiệm là 105,3g, chứng tỏ các hợp chất hữu cơ trong chất thải đã chuyển hoá tốt, không còn

ức chế sự nảy mầm của hạt cải, phân ủ đã đạt yêu cầu độ chín, độ hoai mục.

Phân lợn trước ủ: Màu đen,

ướt và vón cục.

Phân lợn sau ủ: Màu nâu,

vón

(ĐC: không có VSV)

Phân lợn sau ủ: Màu nâu,

xốp

TN: Xử lý bằng VSV

Phân gà trước ủ: Màu vàng,

không tơi xốp

Phân gà sau ủ: Màu nâu,

không tơi xốp (ĐC: không có

VSV)

Phân gà sau ủ: Màu nâu, xốp

TN: Xử lý bằng VSV

Hình 3.29. Màu sắc và kết cấu của chất thải chăn nuôi trước và sau ủ

3.5. HIỆU QUẢ PHÂN HỮU CƠ TỪ CHẤT THẢI CHĂN NUÔI ĐỐI VỚI CÂY

TRỒNG

3.5.1. Hiệu quả của phân hữu cơ đối với rau cải

Thí nghiệm tại xã Vân Nội- Đông Anh- Hà Nội. Các công thức có sử dụng phân bón hữu

cơ chế biến từ chất thải chăn nuôi (sau đây gọi tắt là phân hữu cơ) thay thế phân chuồng được

điều chỉnh giảm lượng phân hóa học từ 25%- 50% N,P so với đối chứng (nền bón phân của

địa phương).

Bảng 3.38. Hiệu quả sử dụng phân hữu cơ tới năng suất rau cải

Công thức

Vụ xuân hè Vụ thu đông

Năng suất

cá thể

(g/cây)

Năng suất

lý thuyết

(tạ/ha)

Năng suất

thực thu

(tạ/ha)

Năng suất

cá thể

(g/cây)

Năng suất

lý thuyết

(tạ/ha)

Năng suất

thực thu

(tạ/ha)

CT1(ĐC) 4,2 121,78 80,9 4,67 192,4 114,4

CT2 4,8 128,37 84,9 5,26 217,7 121,8

CT3 3,9 119,57 77,8 4,76 197,1 117,8

CT4 3,3 94,00 63,1 4,46 185,5 98,44

CV

(%)

10,0 7,7

LSD

0,05

14,7 16,4

Ghi chú: CT1 (ĐC): Nền 100% NPK + Phân chuồng. CT2: 100% NPK+ Phân hữu cơ; CT3:

75% NP+ 100% K+ Phân hữu cơ;CT4: 50% NP+ 100% K+ Phân hữu cơ. Nền bón địa

phương: NPK/ ha là 60N: 60P2O5: 30 K2O; Phân chuồng/Phân hữu cơ: 8 tấn/ha.

Ở công thức 4, khi thay nền phân chuồng bằng phân hữu cơ và giảm 50% phân khoáng

N, P thì năng suất giảm đi đáng kể (vụ xuân hè giảm 22%, vụ thu đông giảm 14%). Năng suất

rau cải ở công thức 3 không có sự sai khác so với ĐC chứng tỏ sử dụng phân hữu cơ từ chất

thải chăn nuôi thay thế được phân chuồng và còn giảm được 25% phân N,P mà không ảnh

hưởng đến năng suất rau cải.

Xác định hàm lượng đường tổng số và vitamin C của rau cải để đánh giá ảnh hưởng của

phân hữu cơ đến chất lượng của rau cải.

Bảng 3.39. Hiệu quả sử dụng phân hữu cơ đến chất lƣợng rau cải

Công thức

Vụ xuân hè Vụ thu đông

Đường tổng số

(g/100g)

Vitamin C

(mg/100g)

Đường tổng số

(g/100g)

Vitamin C

(mg/100g)

CT1(ĐC) 0,70 26,1 0,8 28,2

CT2 0,68 32,3 0,82 36,4

CT3 0,68 25,7 0,78 27,8

CT4 0,54 14,6 0,50 15,3

Kết quả phân tích cho thấy sử dụng phân hữu cơ chế biến từ chất thải chăn nuôi không những

thay thế được phân chuồng mà còn có tác dụng giảm 25% liều bón phân hóa học N, P mà vẫn

không ảnh hưởng đến chất lượng rau cải.

Hình 3.31. Thí nghiệm đánh giá hiệu quả của phân hữu cơ từ chất thải chăn nuôi

đối với rau cải tại xã Vân Nội- Đông Anh- Hà Nội

So sánh lợi ích kinh tế của việc sử dụng phân bón hữu cơ chế biến từ chất thải chăn nuôi

cho thấy sử dụng phân hữu cơ chế biến từ chất thải chăn nuôi có thể giảm chi phí phân bón

cho rau cải khoảng 435.000 VNĐ/vụ/ha do giảm 25% lượng phân N, P hóa học do đó còn

làm giảm mức độ ô nhiễm, thoái hóa đất, giảm lượng tích lũy nitrat trong rau xanh, mang lại

lợi ích về mặt môi trường cũng như vệ sinh an toàn thực phẩm cho người tiêu dùng.

3.5.2. Hiệu quả của phân hữu cơ đối với cây dƣa chuột

Thí nghiệm tại xã Tam Hợp, Quỳ Hợp, Nghệ An vụ xuân hè 2011, bố trí 2 công thức sử

dụng phân hữu cơ chế biến từ chất thải chăn nuôi, giảm lượng phân hóa học 25% NPK so với

ĐC. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của phân hữu cơ đến năng suất và chất lượng dưa chuột

trình bày trong bảng 3.41, 3.42.

Ở dưa chuột, NSLT được quy định bởi số cây/m2, số quả hữu hiệu/cây và khối lượng

trung bình 1 quả. Như vậy, sự sai khác có ý nghĩa về tỷ lệ quả hữu hiệu (thương phẩm)/cây

giữa công thức TN và ĐC đã dẫn đến năng suất lý thuyết (NSLT) của công thức TN cao hơn

có ý nghĩa so với ĐC. Năng suất thực thu (NSTT) của hai công thức không khác biệt, chứng

tỏ trong cùng điều kiện chăm sóc hiện có tại địa phương, thì việc bón giảm đi 25% phân NPK

đã không làm ảnh hưởng đến NSTT. Việc giảm lượng phân NPK khi sử dụng phân hữu cơ

làm giảm chi phí sản xuất và đem lại lợi ích lâu bền cho đất trồng và môi trường sinh thái.

Bảng 3.41. Hiệu quả sử dụng phân hữu cơ đến năng suất dƣa chuột

Công thức Số

quả/cây

Số quả

thương

phẩm/cây

Tỷ lệ quả

thương

phẩm/cây

(%)

Khối lượng

trung bình

1 quả (g)

Năng suất

lý thuyết

(tấn/ha)

Năng suất

thực thu

(tấn/ha)

CT1 (ĐC) 4,45a

3,15a

71,25a

188,86a

35,70a

29,39a

CT2 (TN) 4,50a 3,40

b 75,50

b 189,97

a 38,71

b 31,55

a

CV(%) 3,0 2,2 2,4 0,4 1,8 6,6

LSD0,05 0,30 0,16 3,96 1,87 1,52 4,49

Ghi chú: CT1 (ĐC): Nền 100% NPK + Phân chuồng; CT2: 75% NPK + Phân hữu cơ. Nền

bón địa phương: NPK/ ha là 90N: 60P2O5: 100 K2O; Phân chuồng/Phân hữu cơ: 12 tấn/ha.

Một trong những yếu tố làm nên giá trị kinh tế của dưa chuột đó là hình thái, độ dày thịt

quả vì chúng có ảnh hưởng không nhỏ đến khả năng vận chuyển cũng như tiêu thụ của dưa

chuột. Để đánh giá ảnh hưởng của phân bón hữu cơ chúng tôi dựa trên một số chỉ tiêu sau:

Bảng 3.42. Hiệu quả bón phân hữu cơ đến hình thái, kích thƣớc quả dƣa chuột

Công thức Chiều dài quả

(cm) Đường kính quả (cm)

Độ dày thịt quả

(cm)

CT1

(ĐC) 22,24a

4,91a

0,92a

CT2 23,61b

4,53a 1,14

b

CV(%) 2,2 3,6 7,1

LSD0,05 1,12 0,38 0,16

Ghi chú: CT1 (ĐC): Nền 100% NPK + Phân chuồng; CT2: 75% NPK + Phân hữu cơ. Nền

bón địa phương: NPK/ ha là 90N: 60P2O5: 100 K2O; Phân chuồng/Phân hữu cơ: 12 tấn/ha.

Chiều dài quả và độ dày thịt quả có sự khác biệt rõ rệt. Ở công thức TN, hai chỉ tiêu này

cao hơn so với công thức ĐC. Đây là một trong những chỉ tiêu góp phần làm tăng khả năng tiêu

thụ và giá thành nông phẩm. Có thể nói việc bón phân hữu cơ đem lại hiệu quả tốt đối với cây

dưa chuột, ngay cả khi giảm 25% lượng bón phân NPK vẫn không ảnh hưởng đến năng suất,

mà còn làm tăng giá trị tiêu thụ của nông sản.

Hình 3.32. Thí nghiệm đánh giá hiệu quả sử dụng phân hữu cơ từ chất thải chăn nuôi cho dưa chuột tại Tam Hợp, Quỳ Hợp, Nghệ An vụ xuân hè 2011.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

KẾT LUẬN

1. Đã tuyển chọn và định danh được bộ chủng giống gồm: 01 chủng xạ khuẩn

Streptomyces griseosporeus (ký hiệu XK112) phân giải xenluloza; 01 chủng vi khuẩn

Bacillus licheniformis (B20) phân giải tinh bột; 01 chủng vi khuẩn Bacillus subtilis (B15)

phân giải protein và 01 chủng vi khuẩn lactic Lactobacillus plantarum (LH19) ức chế vi

khuẩn gây bệnh đường ruột, vi khuẩn gây thối.

Cả 4 chủng trên đều có hoạt tính sinh học cao, an toàn với người, cây trồng, vật nuôi và

môi trường; có đặc điểm phù hợp để sản xuất chế phẩm vi sinh vật xử lý chất thải chăn nuôi

dạng rắn.

2. Xác định được điều kiện nhiệt độ và pH nuôi cấy thích hợp đối với sinh trưởng và hoạt

tính sinh học của chủng XK112 tương ứng là 35-550C, pH 6,0- 8,0; của chủng B20 là 37-

500C, pH 6,0- 8,0; của chủng B15 là 30- 50

0C, pH 6,0- 8,0 và của chủng LH19 là 30- 40

0C,

pH 5,0- 8,0. Ion Ca2+

làm tăng hoạt tính và độ bền amylaza của chủng B20 và proteaza của

chủng B15.

Bacterioxin của chủng vi khuẩn lactic LH19 có khối lượng phân tử là 3,5 kDa và có đặc

điểm tương tự nhóm plantarixin C. Glucoza, rỉ đường và amoni xitrat là nguồn hydratcacbon

và nitơ vô cơ thích hợp cho môi trường nuôi cấy chủng vi khuẩn LH19.

3. Đã xây dựng được quy trình sản xuất và sử dụng chế phẩm vi sinh vật để xử lý chất

thải chăn nuôi dạng rắn làm phân bón hữu cơ.

4. Sử dụng chế phẩm vi sinh vật xử lý chất thải chăn nuôi dạng rắn làm giảm tỷ lệ các

bon hữu cơ gấp hai lần so với đối chứng, rút ngắn được thời gian xử lý chất thải chăn nuôi

xuống 21 ngày; làm giảm gần 80% khí H2S và trên 70% khí NH3 từ chất thải chăn nuôi, do

đó làm giảm mùi hôi thối sau 2- 3 ngày xử lý. Phân hữu cơ sau xử lý đáp ứng các yêu cầu chỉ

tiêu dinh dưỡng, độ hoai mục và an toàn sinh học.

5. Sử dụng phân hữu cơ chế biến từ chất thải chăn nuôi có thể thay thế phân chuồng và

tiết kiệm được 25% phân khoáng NP đối với rau cải, 25% NPK đối với dưa chuột mà không

ảnh hưởng đến năng suất, chất lượng nông sản.

KIẾN NGHỊ

1. Tiếp tục thử nghiệm chế phẩm vi sinh vật để xử lý các loại chất thải động vật khác

nhau.

2. Tiếp tục đánh giá hiệu quả của phân hữu cơ từ chất thải chăn nuôi trên các loại cây

trồng và mùa vụ khác nhau.

3. Tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện qui trình sản xuất và sử dụng chế phẩm vi sinh vật từ

4 chủng đã tuyển chọn để tạo sản phẩm hàng hoá cung cấp cho thị trường.

References

A. Tiếng Việt

1. Nguyễn La Anh, Đặng Thu Hương, Nguyễn Việt Anh, Lê Văn Bắc (2008), “Nghiên cứu

đặc điểm bacterioxin được sản xuất bởi vi khuẩn lactic Lactobacillus plantarum NCDN4

được ứng dụng làm giống khởi động nhằm nâng cao chất lượng sản phẩm lên men truyền

thống”, Ký yếu Hội nghị khoa học toàn quốc lần thứ IV, Hội Hóa sinh và Sinh học phân

tử phục vụ Nông, Sinh, Y học và Công nghiệp thực phẩm, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, tr

260- 263.

2. Vũ Ngọc Bội (2004), Nghiên cứu quá trình thuỷ phân protein cá bằng enzym protease từ

B. subtilis S5, Luận án Tiến sỹ Sinh học, Hà Nội.

3. Bộ Nông nghiệp và PTNT (2007), Ô nhiễm môi trường trong chăn nuôi gia súc, gia cầm

tập trung và giải pháp khắc phục, Báo cáo của Cục Chăn nuôi.

4. Tăng Thị Chính (2001), Nghiên cứu các vi sinh vật phân giải xenluloza trong phân huỷ

rác thải hiếu khí và ứng dụng, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Hà Nội.

5. Nguyễn Thị Đà, Hoa Thị Minh Tú, Lê Thanh Bình (2008), “Một số tính chất của

bacterioxin được tổng hợp bởi vi khuẩn lactic phân lập từ sữa bò tươi”, Tạp chí Khoa học

và Công nghệ (6), tr 33- 41

6. Hoàng Kim Giao, Bùi Thị Oanh, Đào Lệ Hằng (2008), “Ô nhiễm môi trường trong chăn

nuôi gia súc, gia cầm tập trung và các giải pháp khắc phục”, Tạp chí Nông nghiệp và

phát triển nông thôn Số Đặc san về Môi trường nông nghiệp, nông thôn, tr 72- 75.

7. Nguyễn Thị Hoài Hà (2004), Nghiên cứu sử dụng chế phẩm vi sinh vật phân huỷ rác thải

sinh hoạt tại Hà Nội, Luận án tiến sĩ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội.

8. Nguyễn Thị Hoài Hà, Phạm Văn Ty, Nguyễn Thị Kim Quy (2002), “Nghiên cứu khả

năng sinh tổng hợp bacterioxin của loài Lactobacillus plantarum L24”, Tạp chí Di truyền

học và Ứng dụng Chuyên san CNSH, tr 47- 52.

9. Võ Thị Hạnh, Lê Thị Bích Phượng, Trần Thạnh Phong, Lê Tấn Hưng, Trương

Thị Hồng Vân (2007), “Giảm thiểu ô nhiễm mùi hôi chuồng trại và sản xuất phân vi sinh

từ phân chuồng bằng chế phẩm sinh học”, Tuyển tập báo cáo Hội nghị Khoa học và công

nghệ 2007, tr 226- 230.

10. Bùi Huy Hiền (2010), Báo cáo tổng kết đề tài “Nghiên cứu sử dụng chế phẩm vi sinh vật

xử lý nhanh phế thải chăn nuôi”, Bộ Nông nghiệp & PTNT.

11. Phan Thị Khánh Hoa (2003), Nghiên cứu sinh tổng hợp nisin từ vi khuẩn Lactobacillus

lactis. subsp lactis 11, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Hà Nội.

12. Nguyễn Lan Hương, Hoàng Đình Hòa (2003), “Hệ vi khuẩn có hoạt tính thủy phân tinh

bột, protein, xenluloza hoặc dầu ô liu trong quá trình phân hủy chất thải hữu cơ”, Báo cáo

Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nxb Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội, tr 288- 291.

13. Phạm Thùy Linh (2011), Nghiên cứu khả năng tạo chất diệt khuẩn Enterocin tái tổ hợp

dùng trong bảo quản thực phẩm, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội.

14. Ngô Xuân Mạnh, Nguyễn Thị Lâm Đoàn, Võ Nhân Hậu, Ngô Xuân Dũng (2008), “Chọn

nuôi cấy tối ưu vi khuẩn Bacillus licheniformis (chủng BCRP) để sinh tổng hợp -

amylaza chịu nhiệt”, Tạp chí Khoa học và Phát triển VI(5), tr 460- 466.

15. Trần Đình Mấn (2001), Nghiên cứu thu nhận -amylaza bền nhiệt bằng chủng Bacillus

subtilis tái tổ hợp mang gen -amylaza của vi khuẩn phân lập ở Việt Nam, Luận án Tiến

sĩ Sinh học, Đại học Bách khoa Hà Nội.

16. Nguyễn Văn Năm (2004), Nghiên cứu sử dụng các vi sinh vật hữu hiệu để nâng cao hiệu

quả xử lý nước thải chế biến thực phẩm giàu tinh bột bằng phương pháp bùn hoạt tính,

Luận án Tiến sĩ Sinh học, Viện KH và CN Việt Nam.

17. Đặng Xuyến Như (2001), Nghiên cứu hoàn thiện quy trình xử lý phế thải chăn nuôi lợn

(nước thải và chất thải rắn) ở trang trại quy mô hộ gia đình bằng biện pháp sinh học,

Báo cáo đề tài nghiên cứu khoa học của Viện Nghiên cứu Ứng dụng Công nghệ.

18. Nguyễn Quang Thạch (2001), Báo cáo nghiệm thu đề tài độc lập cấp Nhà nước “Nghiên

cứu thử nghiệm và tiếp thu công nghệ vi sinh vật hữu hiệu (EM) trong nông nghiệp và vệ

sinh môi trường”, Trung tâm Thông tin Tư liệu và Khoa học Công nghệ, Bộ Khoa học

và Công nghệ.

19. Đỗ Thị Bích Thuỷ (2008), “Ảnh hưởng của sự thay thế hàm lượng protein bởi phế liệu

tôm trong môi trường nuôi cấy lên men sinh tổng hợp proteinasa ngoại bào từ Bacilius

subtilis”, Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn (6), tr 64- 69.

20. Đỗ Thị Bích Thuỷ, Trần Thị Xô (2006), “Nghiên cứu quy trình thu nhận và khảo sát một

số tính chất của chế phẩm protease Bacilius subtilis”, Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển

nông thôn (1), tr 41- 43.

21. Đỗ Thị Bích Thuỷ, Nguyễn Trần Phương Thảo (2008), Đinh Thị Thu Thanh “Ảnh hưởng

của một số yếu tố lên khả năng sinh tổng hợp -amylaza ngoại bào của Bacilius

subtilis”, Kỷ yếu Hội nghị khoa học toàn quốc lần thứ IV, Hội Hóa sinh và Sinh học

phân tử phục vụ Nông, Sinh, Y học và Công nghiệp thực phẩm, Nxb Khoa học và Kỹ

thuật, tr 416-420.

22. Phùng Đức Tiến, Nguyễn Duy Điều, Hoàng Văn Lộc, Bạch Thị Thanh Dân (2009),

“Đánh giá thực trạng ô nhiễm môi trường trong chăn nuôi”, Tạp chí Chăn nuôi (4), tr 10-

16.

23. Trần Đình Toại, Trần Thị Hồng, Lê Minh Trí, Đỗ Trung Sỹ, Hoàng Thị Bích, Hoàng Thị

Hà Giang (2008), “Nghiên cứu sử dụng cellulase tách từ Actinomyces để xử lý phế thải

nông nghiệp”, Kỷ yếu Hội nghị khoa học toàn quốc lần thứ IV, Hội Hóa sinh và Sinh học

phân tử phục vụ Nông, Sinh, Y học và Công nghiệp thực phẩm, Nxb Khoa học và Kỹ

thuật, tr 901- 903.

24. Hà Thanh Toàn, Mai Thu Thảo, Nguyễn Thu Phương, Trần Lê Kim Ngân, Bùi Thế Dinh

và Cao Ngọc Diệp (2008), “Phân lập vi khuẩn phân giải cellulose, tinh bột và protein

trong nước rỉ từ bãi rác ở thành phố Cần Thơ”, Tạp chí Khoa học, tr 10-13.

25. Phạm Văn Toản và cs (2004), Nghiên cứu sản xuất và ứng dụng chế phẩm vi sinh vật

trong xử lý nguyên liệu và phế thải giàu hợp chất các bon làm phân bón hữu cơ sinh học,

Hội nghị khoa học Ban Đất, Phân bón và Hệ thống nông nghiệp- Bộ Nông nghiệp và

PTNT, Nha Trang 8/2004.

26. Nguyễn Thị Hương Trà, Nguyễn Tuấn (2002), “Nghiên cứu công nghệ sản xuất

bacteriocin từ chủng vi khuẩn lactic ST20”, Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông

thôn (6), tr 507- 508.

27. Trịnh Quang Tuyên và cs (2010), Báo cáo tổng kết đề tài do Viện Chăn nuôi chủ trì

“Nghiên cứu lựa chọn một số giải pháp khoa học phù hợp nhằm giảm thiểu ô nhiễm môi

trường ở một số vùng chăn nuôi lợn trang trại tập trung”, Bộ Nông nghiệp & PTNT.

28. Lâm Xuân Uyên, Nguyễn Thúy Hương, Huỳnh Tấn Thạch (2009), “Lên men nuôi cấy bổ

sung theo đợt (fed-batch) Lactococcus sp để thu nhận hợp chất kháng khuẩn

(bacteriocin) ”, Tạp chí Nông nghiệp & PTNT (4), tr 30-b35.

29. Nguyễn Quỳnh Uyển, Nguyễn Xuân Trường, Phan Thị Hà, Nguyễn Huỳnh Minh Quyên,

Trần Quốc Việt (2010), “Nghiên cứu một số tính chất và sử dụng hoá chất gây đột biến

NTG để nâng cao hoạt độ phân giải protein của protease ngoại bào của vi khuẩn Bacillus

sp”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ (26), tr 121- 128.

30. Vũ Thị Khánh Vân, Trần Minh Tiến, Đặng Thị Thanh Sơn (2007), “Khảo sát quản lý

phân ở các trang trại chăn nuôi lợn ở miền Bắc Việt Nam”, Tạp chí Khoa học Chăn nuôi

112, tr 288- 297.

31. Vincient Pophyre, Nguyễn Quế Côi (2006), Thâm canh chăn nuôi lợn, quản lý chất thải

và bảo vệ môi trường, Ấn phẩm của PRISE.

32. Lê Thị Thanh Xuân, Phan Thị Tuyết Minh, Trần Hà Ninh, Tăng Thị Chính (2005), Phân

lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn ưa nhiệt sinh tổng hợp xenlulaza cao. Báo cáo

Hội nghị toàn quốc, Nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, Nxb Khoa học và Kỹ

thuật, Hà Nội, tr 872- 875.

33. 10 TCN 676-2006; 10 TCN 677-2006; 10TCN (216-2005);

TCVN 5937/95; TCVN 5938/95; TCVN 4829:2001;

TCVN 4829: 2005, ISO 6579:2002/Amd.1:2007;

TCVN 6846: 2007, ISO 7251:2005

TCVN 4883: 1993; TCVN 5168-1990; TCVN 6187: 1996

TCVN 6168: 2002; TCVN 6268:2002; TCVN 7185: 2002;

ISO 16649:2001; ISO 6579:2003

B. Tiếng Anh

34. Ajay (EDT) Singh, Owen P. (EDT) Ward (2004), Biodegradation and Bioremediation,

Springer, pp. 57-74.

35. Anissa Haddar, Ali Bougatef, Rym Agrebi, Alya Sellami-Kamoun, Moncef Nasri (2009),

“A novel surfactant-stable alkaline serine-protease from a newly isolated Bacillus

mojavensis A21: Purification and characterization”, Process Biochem (44), pp. 29–35.

36. Antonio Maldonado, José Luis Ruiz-Barba, and Rufino Jiménez-Díaz (2003),

“Purification and Genetic Characterization of Plantaricin NC8, Novel Coculture-

Inducible Two-Peptide Bacteriocin from Lactobacillus plantarum NC8”, App. Environ.

Microbiol. (69), pp. 383-389.

37. Asgher M., Javaid Asad M., Rahman S. U., Legge R. L. (2007), A thermostable -

amylase from a moderately thermophilic Bacillus subtilis strain for starch processing,

Engineering (79), pp. 950-955.

38. Atrih A., Rekhif N., Milliere J. B. and Lefebvre G. (1993), “Detection and

characterization of a bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum C19”, Can. J.

Microbiol. (39), pp. 1173-1179.

39. Beguin P., Millet J. and Aubert J. (1992), “Cellulose degradation by Clostridium

thermocellum from manure to molecular biology”, FEMS Microbiol. Lett. (100), pp.

523-528.

40. Beguin, P., Millet S., Chauvaux S., Salamitou K., Tokatlidis J., .Navas T.,

Fujino M., Lemaire O., Raynaud M., K. Daniel, and J. P. Aubert (1992), “Bacterial

cellulases”, Biochem. Soc. Trans. (20), pp. 42- 46.

41. Bose K., Das D. (1996), “Thermostable -amylase production using Bacillus

licheniformis NRRL”, India J. Exp. Biol. (34), pp. 1279- 1282.

42. Bruno, J. M., Sineriz, F., Gonzalez, D., Rodriguez, A. & Suárez, J.E (1998), “Chemostat

production of plantaricin C by Lactobacillus plantarum LL441”. Appl. Environ.

Microbiol. (64), pp. 3512– 3514.

43. Burianek L. L. and A. E. Yousef (2000), “Solvent extraction of bacteriocins from liquid

cultures”, Appl. Environ. Microbiol. (31), pp. 193-197.

44. Chellapandi P, Himanshu M, Jani (2008), “Production of endoglucanase by the native

strains of Streptomyces isolates in submerged fermentation”, Brazil Microbiol. (9), pp.

122-127.

45. Cintas L. M., Casaus M. P., Herranz C.., Nes I. F. and Hernández P. E. (2001), “Review:

Bacteriocins of Lactic Acid Bacteria”, Food Sci. Technol. Int. ( 7), pp. 281-305

46. Cleveland J., Montville T. J., Nes I. F., Chikindas M. L. (2001), “Bacteriocins: safe,

natural antimicrobials for food preservation”, Int. J. Food Microbiol. ( 71), pp. 1-20.

47. Composting Symposium (ISC1999), Vol 1. Nova Scotia: CBA Press Inc. pp.1-13.

48. Coughlan M. Hazlewood G. (1997), “-1,4-D-xylan-degrading enzyme systems,

biochemistry molecular biology and application”, Biotechnol, Appl., Biochem., (17), pp.

259- 289.

49. Coughlan M. and Mayer F. (1998). Cellulose decomposing bacteria and their enzyme

system, The procayotes (20), pp. 460- 502.

50. Daba H., Pandian S., Gosselin J. F., Simard R. E., Huang J., Lacroix C. (1991),

"Detection and activity of a bacteriocin produced by Leuconostoc mesenteroides", Appl.

and Environ. Microbiol. pp. 3450- 3455.

51. Dharani Aiyer P. V. (2004), Effect of C:N on -amylase production by Bacillus

licheniformis SPT 27, Afr. J. Biotechnol. (10), pp. 519- 522

52. Dimitrov P. I., Kambourova M. S., Mandeva R. D., Emanuilova E. (1997), “Isolation and

characterization of xylan-degrading alkali-tolerant thermophiles”, FEMS Microbiol.

Lett., pp. 157: 27-30.

53. Dobreva E., Tonkova A., Ivanova V., Stefanova M., Spassova L., Spassova D. (1998),

“Immobilization of Bacillus licheniformis cells, producers of thermostable alpha amylase

on polymer membranes”, J. Ind. Microbiol. (20), pp. 166- 170.

54. Drider D., Fimland G., Hechard Y., MacMullen L. M., Prevost H. (2006), “The

continuing story of class IIa bacterioxins”, Microbiol.Molec biol rev. 70(2), pp 564- 582.

55. Edited by the research society of Japan, CRC (1994), Enzym chemistry and molecular

biology of amylases and relate enzyme, Press Becaration Am London Tokyo (V1-3), pp.

40-45.

56. Ennahar S., Sashihara T., Sonomoto K., Ishizaki A. (2000), “Class IIa bacteriocins:

biosynthesis, structure and activity”, FEMS Microbiol. Rev. (24), pp. 85-106.

57. FAO (1980), A manual of rural composting. FAO/UNDP Regional Project RAS/75/004

Field Document No. 15. Rome.

58. Gálvez A. , Abriouel H. , López R. L. , Omar N. B. (2007), “Bacteriocin-based strategies

for food biopreservation”, Int. J. Food Microbiol. 120(1-2), pp.51- 70.

59. Garc Salva T., Moraes I. (1994), “Effect of pH and temperature on Bacillus subtilis

ATCC 601-amylase production. Some properties of the crude enzyme”, Rev.

Microbiol., S. Paulo, Brasil (25), pp. 119-125.

60. Garc Salva T., Moraes I. (1995), “Effect of carbon source on -amylase production by

Bacillus subtilis BA-04”, Rev. Microbiol., S. Paulo, Brasil (26), pp. 46-51.

61. Gauze A. C. (1980), Microbial decomposition of organic material and humus in soil and

compost, FAO/UNDP, Technology composting.

62. Gilbert H. J. and Hazelwood G. P. (1993), “Bacterial cellulases and xylanases”, J. Gen.

Microbiol. (139), pp.187- 194.

63. Gilkes N. R., Henrissat B., Kilburn D. G., Miller R. C. and Warren R. A. J. (1991),

“Domains in microbial -1,4-glycanases: sequence conservation, function, and enzyme

families”, Microbiol. Rev., (55), pp. 303-315.

64. Gupta A., Roy I., Khare S. K., Gupta M. N. (2005), “Purification and characterization of

a solvent stable protease from Pseudomonas aeruginosa”, PseA. J. Chromato A. 1069,

pp155– 161.

65. Gyxbitz G. M., Stebbing D., Johansson C. I., Saddler J. N. (1998), “Lignin-carbohydrate

complexes restrict enzymatic solubilization of mannan and xylan from dissoving pulp”,

Appl. Microbiol. Biotechnol. pp. 390-395.

66. Herranz C ., Chen Y ., Chung H . J., Cintas L . M., Hernándezv P . E., Montville T. J.,

Chikindas M. L. (2001), “Enterocin P selectively dissipates the membrane potential of

Enterococcus faecium T136”, App. Environ. Microbiol. 67(4), pp. 1689- 1692.

67. Hesham M. Abdulla (2007), “Enhancement of rice straw composting by

lignocellulolytic Actinomycete strain”, Int. J. Agricuture & Biology 9(1), pp. 106- 109.

68. Hittu M., P. Vasu (1998), “Isolation and partial characterization of thermostable

extracellular protease of Bacillus polymyxa B-17”, Int. J. Food Microbiol. pp. 42: 139.

69. Holt J. G., Krieg N. R., Sneath P. H. A. , Staley J. T., Williams S. T. (2000), Bergey’s

Manual of Determinative Bacteriology. 9th

Edition, Lippincott Williams & Wilkins (4),

pp.1256- 1259.

70. Holt J. G., N. R. Krieg, P. H. A. Sneath, J. T. Staley, and S. T. Williams (1994), Bergey's

Manual of Systematic Bacteriology. Williams and Wilkins. Baltimore, Maryland, pp.

235- 242.

71. Hoitink, H. A. J. (2000), Trends in Treatment and Utilization of Solid Waste though

Composting in the United State, In: Warman, P .R., Taylor, B. R. (Eds.), Proceeding of

the International.

72. Hussein T., Jilani G. M., Anjum S. and Zia M. H. (2000), “Effect of EM application on

soil properties”. In Proceedings of the 13th

International Scientific Conference of

IFOAM, Alfoeldi, T. et al. (Ed). FiBL, Basel, Switzerland, 267.

73. Ivanova V. N., Dobreva E. D. (1992), “Purification and characterization of a

thermostable -amylase from Bacillus subtilis alkaline protease”, J. Biochem. (Tokyo)

(108), pp. 954- 959.

74. Jen-Kuo Y., S. Ing-Lung, T. Yew-Min, W. San-Lang (2000), “Production and

purification of protease from a Bacillus subtilis that can deproteinize crustacean wastes”,

Enz. Microb. Technol. (26), pp. 406.

75. Ji G. E., Han H. K., Yun S. W. and Rhim S. L. (1992), “Isolation of amylolytic

Bifidobacterium sp. Int-57 and characterization of amylase”, J. Microbiol. Biotechnol. (

2), pp. 85- 91.

76. Joo H. S., C. G. Kumar, G. C. Park, K. T. Kim, S. R. Park, C. S. Chang (2002)

“Optimization of theproduction of an extracellular alkaline protease from Bacillus

horikoshii”, Process Biochem. 38 (2), 155.

77. Keener H. M., Marugg C. , Hansen R.C. , and Hoitink H. A. (1993), Optimizing the

efficiency of the composting process. Science and Engineering of Composting, pp. 59-

93.

78. Kim J. M., Lim W. J., Suh H. J. (2001), “Feather- degrading Bacillus species from

poutry waste”, Process Biochem. (37), pp. 287- 291.

79. Klaenhammer T. R. (1993), “Genetics of bacteriocins produced by lactic acid bacteria”,

FEMS Microbial Review (12), pp. 39- 86.

80. Ko E. P., Akatsuka H., Moriyama H., Shinmyo A., Katsube Y., Urabe I. and Okada H.

(1992), “Site-directed mutagenesis at aspartate and glutamate residues of xylanase from

Bacillus pumilus”, Biochem. J. 288, pp. 117- 121.

81. Kuriki T., Imanaka T. (1999), “The concept of the alpha-amylase family:

structural similarity and common catalytic mechanism”, J. Biosci. Bioeng, (87), pp. 557-

565.

82. Kwak Y. S. Akiba T. (1990), “Production of an extracellular thermostable calcium-

inhibited -amylase by Bacillus licheniformis”, Enz. Microb. Technol. (12), pp. 714-

716.

83. Lausing M. Prescott, Jonh P. Harley, Donald A. Klein (2005), Microbiology. WCB

McGraw-Hill.

84. Lausing M. Prescott, John P. Harley, Donald A. Klein (2002), Microbiology. Lisbon

London, (Fourth edition), pp. 394-420.

85. Linder M. and Teeri T. T. (1997), “The roles and function of cellulose-binding domains”,

J. Biotechnol. (57), pp. 15- 28.

86. Lonvaud-Funel A. (1999), “Lactic acid bacteria in the quality improvement and

depreciation of wine”, Antonie Leewenhouck (76), pp. 317- 331.

87. Maria P., Nicholaos A., Goerge F., Despina D., and Ioannis A. B. (2006),

“Determination of bacteriocin activity with bioassays caried out on solid and liquid

substrates: Assessing the factor “indicator microorganism”, Microbial Cell Factory,

1475, pp. 5-30

88. Meera Venugopal, A. V. Saramma (2006), Characterization of alkaline protease from

Vibrio fluvialis strain VM10 isolated from a mangrove sediment sample and its

application as a laundry detergent additive, Process Biochem. (41), pp. 1239–1243.

89. Meinke A., Gilkes N. R., Kilburn D. G., Miller R. C., Jr. and Warren R. A. J. (1993),

“Cellulose-binding polypeptides from Cellulomonas fimi: endoglucanase D (CenD), a

family A -1,4-glucanase”, J. Bacteriol. (175), pp. 1910-1918.

90. Menzi H., Gerber P. (2004), Livestock balance approach and its implications for

intensive livestock production in South- East- Asia, BSASA, Thailand, pp.131-144.

91. Messaaoud E. B., Ali M. B., Elleuch N., Masmoudi N. F., Bajar S. (2004),

“Purification and properties of maltoheptaose and maltohexaose forming amylase

produced by Bacillus subtilis US116”, Enz. Microb. Technol. (34), pp. 662- 666.

92. Mira de Orduna, R., Patchett, M. L. Liu, S-Q and Pilone G. J. (2001), “Growth and

arginine metabolism of the wine lactic acid bacteria Lactobacillus buchneri and

Oenococcus oeni at different pH values and arginine concentrations”, Appl. Environ.

Microbiol . (67), pp. 1657- 1662.

93. Mohsen Fathi Najafia, Dileep N. Deobagkar, Mohsen Mehrvarz, Deepti D. Deobagkar

(2006), “Enzymatic properties of a novel highly active and chelator resistant protease

from a Pseudomonas aeruginosa PD100”, Enz. Microb. Technol. (39), pp. 1433–1440.

94. Molinos A . C., Abriouel H ., Omar N . B., Valdivia E ., López R . L., Maqueda M.,

Canamero M. M., Galvez A. (2005), “Effect of immersion solution containing

enterocin AS-48 on Listeria monocytogenes in vegetable foods”, Appl. Environ.

Microb. 71(12), pp. 7781- 7787.

95. Montvile T. J. and Keiser A. L. (1993), “Antimicrobial proteins: classifications,

nomenclature, diversity, and relationship to bacteriocins”. In Bacteriocins of lactic acid

bacteria (Eds Hoover, D. G. and Steenson, L.R.), London Academic Press., pp. 1- 22.

96. Nadia riaz, Ikram-ul-haq and M. A.Qadeer (2003), “Characterization of -amylase by

Bacillus subtilis”, Inter. J. Agric and biology, pp. 249- 252

97. Najafi M. F., Dileep N. Deobagkar., Deepti D. Deobagkar (2005), “Potential

application of protease isolated from Pseudomonas aeruginosa PD100”. Electron J.

Biotechnol. 8(2) [online].

98. Narasimha G., Sridevi A., Buddolla V., Subhosh C. M., Rajsekhar R. B. (2006),

“Nutrient effect on production of cellulolytic enzyme by Aspergillus oryzae”, Afr. J.

Biotechnol. (5), pp. 472- 476.

99. Ogunbanwo S. T., Sanni A. I. and Onilude A. A., (2003), “Characterization of

bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum F1 and Lactobacillus brevis OG1”,

Afr. J. Biotechnol. 2(8), pp. 219- 227.

100. Omojasola P. , Jilani O. (2008), “Cellulase production by Trichoderma, Aspergillus

niger and Saccharomyces cerevisae cultured on waste from orange”, Pakistan Biol. Sci.

(11), pp. 2382- 2388.

101. Oscasriz J. C., Pisabarro A. G. (2001), “Classification and mode of action of

membrane-active bacteriocins produced by gram-positive bacteria”, Int. Microbiol. (4),

pp.13- 19.

102. Parada J. L., Caron C.R., Medeiros A. B. P., Soccol C. R. (2007), “Bacteriocins from

lactic acid bacteria: purification, properties and use as biopreservatives”, Braz. Arch.

Biol. Technol. (50), pp. 521- 542.

103. Riley M. A., Wertz J. E. (2002), “Bacteriocins: evolution, ecology, and application”,

Annu. Rev. Microbiol. (56), pp.117- 137.

104. Riley M. A., Chanvan M. A. (2007), Bacteriocins: Ecology and evolution, Springer-

Verlag Berlin Heidelberg Press, Germany.

105. Riley M. A, Gillor O. (2007), Research and application in bacteriocins, Horizon

Biosciences Press, UK.

106. Sakiyama, Y., Nguyen, K. N. T., Nguyen, M. G., Miyadoh, S., Duong, V. H. & Ando,

K. (2009), “Kineosporia babensis sp. nov., isolated from plant litter in Vietnam", Int.

J. Syst Evol. Microbiol. (59), pp. 550- 554.

107. Schangger H. , Von Jagow G. (1987), “Tricine-sodium dodesulphate polyacrylamide

gel electrophoresis for the separation of proteins in range from 1 to 100 kDa”,

Analytical Biochemistry (166), pp. 368-379.

108. Schagger H. (2006), “Tricine-SDS-PAGE”, Nat. Protocols 1, 1, pp. 16-22.

109. Smith, R. C. (1995), Composting practices, NDSU Extension Service, North Dakota

State University of Agriculture and Applied Science, and USDA.

110. Sneath P. H. A., Mair N. S., Sharpe E. M., Holt J. G. (1986), Bergey’s manual of

systematic bacteriology. Baltimore: Williams & Wilkins.

111. Sommer Sven G. & Lars Stoumann Jensen (2006), Conceptual model for plant nutrient

recycling on animal farms in northern Vietnam, SUSANE project – unpublished.

112. Souza E. L., Silva C. A., Sousa C. P. (2005), “Bacteriocins: Molecules of fundamental

impact on the microbial ecology and potential food biopreservatives”, Braz. Arch. Biol.

Technol. 48(4), pp. 559-666.

113. Tiwari S. , S. Srivastrava (2008), “Purification and characterization of plantaricin

LR14., a novel bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum LR14”, J. Appl.

Microbiol. Biotechnol. (79), pp. 759-767.

114. Tonkova A., Ivanova V., Dobreva E., Stefanova M., Spassova D. (1994),

“Thermostable alpha-amylase production by immobilized Bacillus licheniformis cells

in agar gel and on acrylonitrile-acrylamide membranes”, Appl. Microbiol. Biotechnol.

(41), pp. 517- 522.

115. Tran Minh Tien (2009), Optimizing Animal Manure Fertilizer value Enhancement of

crop Nutrition by Appropriate Pig Manure Management on small- scale Farm in

Northern Vietnam, PhD thesis, submitted 10/9/2009.

116. Viginia C. C. (1997), Rapid composting technology in Philippines: its role in

producing good quality organic fertilizer, Extension Bulletin. Taiwan Province of

China, FFTC.

117. Wenhua L., Cong W., Cai Z. (2004), “Improvement of nisin production in pH feed-

back controlled, fed-batch culture by Lactococcus lactic subsp. Lactis”, Biotechnol.

Lett. (26), pp. 1713- 1716.

Tài liệu mạng

118. www.agroviet.gov.vn

119. http://www.academicjournals.org/AJB

120. http://en.wikipedia.org/wiki/Proteaza

121. http://www.thuvienkhoahoc.com/tusach/Sub…

122. http://www.enzymeessentials.com/HTML/pro…