UNIVERZA V NOVI GORICI FAKULTETA ZA ZNANOSTI O OKOLJU

VPLIV VNOSA GLIVNIH EKSTRAKTOV V RASTLINE PARADIŽNIKA IN KROMPIRJA NA RAZVOJ

BOLEZENSKIH ZNAMENJ, KI JIH POVZROČA BAKTERIJA Ralstonia solanacearum

DIPLOMSKO DELO

Irena JEŽEK

Mentorica: prof. dr. Maja Ravnikar

Nova Gorica, 2010

i

ZAHVALA Mentorici prof. dr. Maji Ravnikar se zahvaljujem, ker mi je omogočila zanimivo diplomsko delo in mi je vedno, ko sem jo potrebovala, hitro in konkretno pomagala. Za vso neprecenljivo pomoč pri izvedbi poskusov, zbiranju literature, obdelavi in interpretaciji podatkov se zahvaljujem Jani Erjavec. Za koristne napotke pri izdelavi diplome se zahvaljujem dr. Tanji Dreo. Za pomoč pri poskusih se zahvaljujem Matejki Mesarič in zaposlenim na Nacionalnem inštitutu za biologijo. Na tem mestu bi se rada zahvalila še vsem, ki so mi pomagali v času študija in pri izdelavi tega diplomskega dela, predvsem mojim staršem in sestri. Vsi poskusi so bili opravljeni na Oddelku za biotehnologijo in sistemsko biologijo na Nacionalnem inštitutu za biologijo v Ljubljani.

ii

POVZETEK Ralstonia solanacearum je rastlinska patogena bakterija, ki povzroča rjavo gnilobo krompirja ter venenje številnih razhudnikov. Prisotna je v širokem geografskem območju. Njeno zatiranje je težavno predvsem zaradi velikega števila gostiteljev – okuži lahko več kot 200 rastlin, med njimi tudi gospodarsko pomembne vrste, kot so krompir, paradižnik, tobak, banane, pelargonije itd. Trenutno za nadzor bolezni uporabljamo kombinacijo različnih, predvsem preventivnih ukrepov. Ker se je uporaba dezinfekcijskih sredstev in antibiotikov izkazala za neuspešno, iščemo nove načine nadzora. Že dalj časa se v medicini uporabljajo substance višjih gliv za zdravljenje različnih bolezni. V zadnjem času pa se raziskuje možnost uporabe biološko aktivnih snovi, ki jih proizvajajo višje glive, tudi proti rastlinskim patogenim bakterijam. V tem delu smo dokazali, da lahko z ekstrakti nekaterih višjih gliv zmanjšamo pojav bolezenskih znamenj, ki jih povzroča bakterija R. solanacearum tako na krompirju kot na paradižniku. Ugotovili smo najboljše zaporedje inokulacije ekstrakta in bakterije v rastline ter vpliv glivnih ekstraktov na razvoj bolezenskih znamenj in koncentracijo bakterije R. solanacearum v rastlinah. Ključne besede: Ralstonia solanacearum, ekstrakti višjih gliv, krompir, paradižnik SUMMARY Ralstonia solanacearum is a plant pathogenic bacterium that causes potato brown rot and wilting of many solanaceous plants. It is distributed over a wide geographic area and control of disease is often difficult due to large number of host plants. It can infect over 200 plants, among which are also economically important crops such as potato, tomato, tobacco, bananas, geranium and others. To control the spread of the disease, many preventive measures are being taken. Currently combinations of different preventive measures are in use to control its spread. However there is no known chemical or biological agent. The use of fumigants and antibiotics has not been effective. Thus new means of control are being investigated. Many substances of higher fungi are already in use in medicine to treat different human diseases. In recent studies these substances have also been used against plant pathogens. In this diploma thesis we have proven that we can treat infected potato and tomato plants with some extracts of higher fungi. We have determined the best time sequence of plant inoculation with extracts and bacteria and the influence these extracts have on development of disease symptoms development and concentration of R. solanacearum in plants. Key words: Ralstonia solanacearum, higher fungi extracts, potato, tomato

iii

KAZALO VSEBINE

1 UVOD.................................................................................................................... 1 1.1 Opredelitev problema .................................................................................... 1 1.2 Namen raziskave........................................................................................... 1 1.3 Hipoteze........................................................................................................ 2

2 TEORETIČNE OSNOVE IN PREGLED OBJAV..................................................... 2 2.1 Ralstonia solanacearum ................................................................................ 2 2.2 Načini detekcije in identifikacije bakterije R. solanacearum ........................... 7 2.3 Zatiranje bakterije R. solanacearum in nadzor širjenja okužbe ...................... 7

3 EKSPERIMENTALNI DEL ................................................................................... 11 3.1 Uporabljeni organizmi in glivni ekstrakti ....................................................... 11 3.2 Uporabljeni gojišči in pufer .......................................................................... 11 3.3 Priprava in določanje koncentracije bakterijskih suspenzij ........................... 12 3.4 Inokulacija rastlin paradižnika in krompirja................................................... 13 3.5 Preverjanje vpliva zaporedja inokulacije glivnega ekstrakta in bakterije R. solanacearum na razvoj bolezenskih znamenj pri rastlinah paradižnika .................. 13 3.6 Test razširjenosti bakterije po paradižniku ................................................... 14 3.7 Vpliv glivnih ekstraktov na razvoj simptomov, ki jih povzroča bakterija R. solanacearum na krompirju ..................................................................................... 15 3.8 Ocenjevanje bolezenskih znamenj .............................................................. 16 3.9 Potek vzorčenja tkiva za določanje prisotnosti bakterij in koncentracije bakterijske DNK v rastlini......................................................................................... 17 3.10 Analiza koncentracije bakterijske DNA v rastlinah ....................................... 18

4 REZULTATI IN RAZPRAVA................................................................................. 19 4.1 Rezultati poskusa: Preverjanje vpliva zaporedja inokulacije glivnega ekstrakta in bakterije R. solanacearum na razvoj bolezenskih znamenj pri rastlinah paradižnika.............................................................................................................. 19

4.1.1 Rast in število CFU bakterij v suspenziji, ki smo jo uporabili za inokulacijo paradižnikov ........................................................................................................ 19 4.1.2 Razvoj bolezenskih znamenj na paradižnikih, okuženih z bakterijo R. solanacearum in inokuliranih z ekstraktoma gliv Suillus sp. in Tricholoma sp. ..... 20 4.1.3 Širjenje bakterije po rastlini paradižnika................................................... 22 4.1.4 Razprava o poskusu: Preverjanje vpliva časovnega zaporedja inokulacije ekstrakta na razvoj bolezenskih znamenj pri rastlinah paradižnika, okuženih z bakterijo R. solanacearum, in širjenje bakterij po rastlini ...................................... 23

4.2 Rezultati poskusa: Vpliv glivnih ekstraktov na razvoj bolezenskih znamenj, ki jih povzroča bakterija R. solanacearum na rastlinah krompirja ................................ 25

4.2.1 Rast in število CFU bakterij v suspenziji, ki smo jo uporabili za inokulacijo rastlin krompirjev.................................................................................................. 25 4.2.2 Razvoj bolezenskih znamenj na krompirjih, okuženimi z bakterijo R. solanacearum in inokuliranimi z glivnimi ekstrakti Suillus sp., Tricholoma sp. in Clitocybe sp. ........................................................................................................ 25 4.2.3 Rezultati qPCR........................................................................................ 29 4.2.4 Razprava................................................................................................. 35

5 ZAKLJUČKI ......................................................................................................... 38 6 VIRI ..................................................................................................................... 39

iv

PRILOGE PRILOGA A – Rezultati testa patogenosti na rastlinah paradižnika PRILOGA B – Rezultati testa patogenosti na rastlinah krompirja PRILOGA C – Rezultati qPCR PRILOGA Č – Umeritvene krivulje za koncentracije bakterije R. solanacearum in gena COX na posameznih qPCR ploščicah

1

1 UVOD 1.1 Opredelitev problema Bakterija Ralstonia solanacearum je po Gramu pozitivna, gibljiva, patogena bakterija, ki povzroča rjavo gnilobo krompirja in bakterijsko venenje številnih pomembnih kulturnih rastlin, kot so paradižnik, jajčevci, tobak itn. Ima širok krog gostiteljev, ki obsega preko 200 vrst rastlin. Predvsem so to poljščine v tropskih in subtropskih predelih. V Evropi je najpomembnejši gostitelj na poljih krompir, v rastlinjakih pa so to paradižnik, jajčevci ter pelargonije. Običajne so tudi latentne okužbe z bakterijo R. solanacearum, in sicer ta okuži grenkoslad (Solanum dulcamara), ki ima korenine v vodi, nadzemni del pa nad vodo. Bakterija se nato širi z vodo na druge rastline, lahko tudi na polja, če se ta voda uporablja za namakanje obdelovalnih površin. Latentne okužbe se pojavljajo tudi pri krompirju. Za učinkovit način sanacije okuženih polj se je do sedaj izkazalo le večletno kolobarjenje, tretiranje z bakrovimi snovmi in preprečevanje okužbe polj z vnosom okuženih rastlin ali namakanjem z okuženo vodo. V primeru okužbe lahko zabeležimo tudi 100% izpad pridelka. Na istem polju več let ne smemo saditi gostiteljskih rastlin, zaradi česar nastaja velika gospodarska škoda. Do sedaj so že izolirali številne snovi s protimikrobnim delovanjem iz različnih naravnih virov, kot so živali, rastline, bakterije in nižje glive. Čeprav obstajajo domneve o višjih glivah iz debla Basidiomycota kot o možnem viru novih in uporabnih spojin, je dejanskih raziskav takih spojin malo. Gobe proizvajajo različne biološko aktivne substance, za zaviranje rasti bakterij in gliv v svojem okolju. Preliminarni poskusi so pokazali, da ekstrakti gob iz rodov Suillus, Tricholoma in Clitocybe zavirajo rast bakterije R. solanacearum na gojiščih ter zmanjšajo stopnjo bolezenskih znamenj na rastlinah paradižnika (Skubic, 2007). V tem diplomskem delu je opisana raziskava vpliva zaporedja vnosa ekstrakta na razvoj bolezenskih znamenj pri rastlinah paradižnika in vpliv glivnih ekstraktov na napredovanje bolezenskih znamenj pri rastlinah krompirja kot primarnem gostitelju bakterije R. solanacearum v Evropi. Opisan je tudi vpliv ekstraktov na koncentracijo bakterij v rastlini in povezava koncentracije bakterij s stopnjo bolezenskih znamenj. 1.2 Namen raziskave

• Ugotoviti najprimernejše zaporedje vnosa glivnih ekstraktov in bakterije R. solanacearum v rastlino ter tako pripraviti eksperimentalni načrt, ki nam omogoča uspešno opazovanje vpliva glivnih ekstraktov na razvoj bolezenskih znamenj na rastlinah krompirja.

• Raziskati, kako glivni ekstrakti vplivajo na razvoj bolezenskih znamenj na rastlinah paradižnika in krompirja, ter na ta način ugotoviti, ali so uporabljeni glivni ekstrakti možen vir protibakterijskih substanc.

• Vzorčiti rastlinsko tkivo za določanje koncentracije bakterij v rastlini s kvantitativno PCR (verižna reakcija polimeraze v realnem času, v nadaljevanju qPCR) in s tem ugotoviti, ali glivni ekstrakti vplivajo na koncentracijo bakterij v rastlinah.

2

1.3 Hipoteze Zaporedje vnosa glivnega ekstrakta in bakterije R. solanacearum vpliva na razvoj bolezenskih znamenj na rastlinah paradižnika. Glivni ekstrakti zmanjšajo število uvelih rastlin pri rastlinah paradižnika in krompirja, okuženih z bakterijo R. solanacearum. Glivni ekstrakti vplivajo na koncentracijo bakterije v rastlinah. 2 TEORETIČNE OSNOVE IN PREGLED OBJAV 2.1 Ralstonia solanacearum Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi in sod. (cit. po Smith in sod, 1997), znana tudi kot: Bacterium solanacearum (Smith) Chester (cit. po Smith in sod, 1997); Burkholderia solanacearum (Smith) Yabuuchi in sod. (1992); Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith (cit. po Smith in sod, 1997) je taksonomsko uvrščena med betaproteobakterije, red Burkholderiales in družino Burkholderiaceae. Je po Gramu negativna bakterija, paličaste oblike, velikosti od 0,5 – 1,5 µm, gibljiva z enim polarnim bičkom (Smith in sod.,1997). Bakterija povzroča venenje več ekonomsko pomembnih rastlin, kot so krompir, paradižnik, tobak, banane, jajčevec in nekaterih okrasnih rastlin, npr. pelargonije. Evropska in mediteranska organizacija za varstvo rastlin - EPPO (ang. European and Mediterranean Plant Protection Organization), je bakterijo pod številko 58 uvrstila na A2 seznam organizmov (organizmi, ki so lokalno prisotni v območju EPPO članic), priporočenih za obravnavo in nadzor kot karantenske. Prav tako predstavlja bakterija R. solanacearum pomembno fitosanitarno tveganje za območji, ki ju pokrivata APPPC (ang. Asia and Pacific Plant Protection Commission) in IAPSC (ang. Interafrican Phytosanitary Council). Bakterija R. solanacearum lahko okuži več kot 200 vrst rastlin v širokem geografskem območju. Njeni sevi so glede gostiteljev in geografske razširjenosti bolj omejeni. To raznolikost so poskušali klasificirati na različne načine. Uveljavljeni sta delitev na rase in biovarje. Delitev na rase je osnovana glede na to, katere rastlinske vrste posamezen sev bakterije okuži (Buddenhagen in sod., 1962). Haywardova (1964) delitev na pet biovarjev razlikuje seve glede zmožnosti proizvajanja kisline iz različnih disaharidov in sladkornih alkoholov. Na podlagi te delitve je v Council Directive 98/57/EC osnovan test za določanje biovarjev, ki je predstavljen v tabeli 1. Rase in biovarji večinoma niso soodnosni. Sevi rase 1 sovpadajo z biovarji 1, 3 in 4, rase 2 z biovarjem 1, rasa 3 in biovar 2 sta ekvivalentna, rasa 4 sovpada z biovarjema 3 in 4, rasa 5 pa z biovarjem 5 (Smith in sod.,1997). Rasa 1 Okuži tobak, paradižnik, krompir, diploidne bananovce in druge kulturne

rastline ter plevele družine razhudnikov. Bakterije optimalno rastejo pri temperaturah od 35 do 37 ˚C

3

Rasa 2 Okuži triploidne banane (bolezen Moko) in Heliconia sp Visok temperaturni optimum od 35 – 37 ˚C.

Rasa 3

Okuži predvsem krompir in paradižnik. Na ostalih kulturnih rastlinah družine razhudnikov nima visoke virulence. Optimalna temperatura rasti bakterije je nižja kot pri ostalih rasah, to je 27 ˚C. Drugi gostitelji so pleveli S. dulcamara, S. nigrum, S. cinereum (v Australiji); sestavljena trava Melampodium perfoliatum (v Costa Rici); Pelargonium hortorum.

Rasa 4 Okuži ingver in še nekatere druge rastline Rasa 5 Okuži le murve (Smith in sod.,1997). Tabela 1 Test določanja biovarjev bakterije R. solanacearum vir: Council Directive 98/57/EC

Biovar Uporaba 1 2 3 4 5 Maltoza - + + - + Laktoza - + + - +

Celobioza - + + - + Manitol - - + + + Sorbitol - - + + - Dulcitol - - + + -

Zanimiva je tudi delitev sevov na azijske in ameriške, kjer so z molekularno analizo RFLP (ang. restriction fragment length polymorphism) ugotovili povezanost med sevi, ki izhajajo iz Azije oz. južne Amerike (Smith in sod.,1997). Z molekularno analizo so French in sodelavci (1993) ugotovili, da je rasa 3 homogena in metabolno manj raznolika kot ostale rase. Torej bi odpornost na raso 3, ki bi jo ugotovili na eni lokaciji, delovala tudi na drugi s podobnimi okoljskimi pogoji (French, 1994). Bakterija R. solanacearum je razširjena v tropskih, subtropskih in zmerno toplih predelih vsega sveta. V slednjih je razširjena predvsem rasa 3, ki je prilagojena na hladnejše podnebje in zato predstavlja pomembno nevarnost tudi za Evropo (Smith in sod.,1997). Na sliki 1 je prikazana razširjenost bakterije R. solanacearum rase 3 po svetu. V območju, ki ga pokriva EPPO, je predvidoma občasno navzoča predvsem rasa 3, ki lahko ogroža pridelek krompirja in paradižnika v omenjenem območju. V južnih, toplejših predelih ali v nadzorovanih pogojih, kot so rastlinjaki, je lahko prisotna tudi rasa 1, ki je posebej pomembna zaradi širšega kroga gostiteljev (Smith in sod.,1997). Bolezenska znamenja okužbe paradižnika in krompirja z bakterijo R. solanacearum se v zgodnji fazi bolezni kažejo z venenjem mladih listov ob visokih dnevnih temperaturah, ponoči pa si rastline opomorejo. V ugodnih razmerah (T ≈ 25 °C) je venenje hitro in lahko povzroči propad rastline v manj kot štirinajstih dneh. Na steblu se lahko pojavi bel sluzast izcedek bakterije, ki ob pritisku na steblo izteče (slika 3). Če okuženo steblo vertikalno namočimo v vodo, se iz žil izlijejo sluzaste niti (slika 4). Pri gomoljih krompirja se lahko bolezenska znamenja kažejo kot sluzast izcedek, ki priteče iz žilnega dela tkiva. V zgodnji fazi bolezni je žilni krog rumen do rahlo rjav, kasneje je rjava obarvanost izrazitejša, saj začne odmirati tudi parenhimsko tkivo. Na koncu lahko infekcija izbruhne na spodnjem delu gomolja ali na očescih (Council Directive 98/57/EC).

4

Slika 1 Razširjenost bakterije R. solanacearum rase 3 po svetu. Prirejeno po: Distribution maps of quarantine pests for the European Union and for the European and Mediterranean Plant Protection Organization Maps. Urednika I.M. Smith (EPPO) in L.M.F. Charles (CABI), 1998

Slika 2 Nekroza listnega peclja in glavne listne žile lista krompirja, posledica okužbe z bakterijo R. solanacearum.

5

Slika 3 Slika krompirja, okuženega z bakterijo R. solanacearum, pri katerem se je poleg venenja na steblu pokazal bel izcedek bakterije.

Slika 4 Nitast izcedek iz stebla rastline, okužene z bakterijo R. solanacearum, namočenega v vodi. Vir http://www.zipcodezoo.com/hp350/Ralstonia_solanacearum_6.jpg

6

V manj ugodnih pogojih (T ≈ 21 °C) začne paradižnik razvijati več adventivnih korenin. Žilno tkivo stebla začne odmirati, kar se kaže kot rjav obroč, če steblo prečno prerežemo. Tudi tu se izloči bela bakterijska sluz (Council Directive 98/57/EC). Ker je zaenkrat najbolj učinkovito zatiranje bolezni preprečevanje razširjanja le te, je odsotnost bakterije pomembna tudi za države, ki uvažajo krompir. Največjo grožnjo evropskemu območju predstavlja uvožen okužen krompir, s katerim bi se bakterija hitro razširila. Najhitreje bi se to zgodilo z okuženim semenskim krompirjem, posredno pa tudi s krompirjem, namenjenim za krmo živali ali za industrijsko predelavo, če bi se odpadki uporabili v kmetijstvu. Bakterija bi se lahko v okolje razširila tudi z odpadno vodo (Smith in sod.,1997). Bakterija R. solanacearum v naravi vstopi v rastline prek poškodovanih korenin, stebla ali listnih rež. Proces pospeši prisotnost talnih ogorčic ali okuženo obdelovalno orodje. V tropskih predelih lahko okuži trave, v katerih se širi počasneje. Trave zato prenašajo okužbo in tako omogočijo bakteriji, da se razširi na kmetijsko pomembne rastline. Visoke temperature ta proces še pospešijo (Smith in sod.,1997). Bakterija lahko dolgo časa preživi v zemlji ali vodi. To je odvisno od seva bakterije, tipa prsti, vlage in temperature. Najdlje preživi v vlažnih tleh z nevtralnim do nizkim pH. Kljub temu se bolezen pojavi v skoraj vseh prsteh in pri skoraj vseh pH, pri katerih navadno rastejo gostiteljske rastline (Roberts, 2004). Razmnoževanje bakterije je počasnejše pri pH 8, pri pH 9 pa se ustavi. Za razvoj bolezni so najbolj primerne temperature od 24 do 35 ˚C, razmnoževanje pa se ustavi pri 4 oz. pri 40 ˚C (EPPO, 2003). Bakterija R. solanacearum lahko dalj časa preživi tudi ob odsotnosti gostiteljskega tkiva. Grey in Steck (2001) sta ugotovila, da se bakterija v neugodnih pogojih spremeni v stanje, v katerem je sicer živa, vendar ne tvori kolonij - VBNC (ang. viable but nonculturable state). Prehod v tako stanje se predvideva že za druge bakterije, ki ne tvorijo spor, zato sta avtorja pri bakteriji R. solanacearum opazovala, kateri dejavniki sprožijo prehod v VBNC stanje. Ugotovila sta, da se to zgodi ob prisotnosti bakrovega sulfata, ki se uporablja kot baktericid, odsotnosti hranil v zemlji in odmiranju gostiteljske rastline. Pri slednjem se je odstotek VBNC bakterij višal s povečevanjem količine odmrlega rastlinskega tkiva. Ob prisotnosti živih korenin gostiteljev so bakterije ponovno prešle v normalno stanje in so jih lahko gojili na gojišču. Bakterij v stanju VBNC ni mogoče gojiti s standardnimi testi, kar pojasnuje, zakaj je bilo pri nekaterih opazovanjih število kolonij majhno ali pa te sploh niso zrasle. VBNC stanje tako tudi pojasni nekatere ponavljajoče okužbe na poljih, ki so jih tretirali z baktericidnimi snovmi. Bakterija R. solanacearum ima enega do štiri polarne bičke (Roberts, 2004). V zemlji je gibljiva, kar ji omogoča, da se lahko izogne strupom, neugodnim pogojem, najde gostitelja in se približa območju z več hranili. Gibljivost obdrži še krajši čas po vstopu v rastlino. Ko je v primernem gostitelju, se namnoži v tkivu povrhnjice, od tam pa vdre v ksilem. Tans - Kerstenova in sod. (2001) so ugotovili, da bakterija v rastlini skoraj ni gibljiva, dokler koncentracija bakterijskih celic ne naraste na vsaj 5 x 108 CFU/ml. Najvišjo gibljivost v rastlini doseže pri 109 CFU/ml, gibljive je 5% bakterijske populacije. Ko populacija postane gibljiva, ji to omogoči iskanje novih mest za kolonizacijo. Le manjši del bakterij se giblje po rastlini, ostale tvorijo biofilm na stenah žil. V tej raziskavi so ugotovili tudi, da se z gibljivostjo bakterije poviša njena virulentnost. Ker lahko pri nekaterih živalih imunski sistem zazna ravno bičke bakterij, so to predpostavko testirali tudi na rastlinah. Ugotovili so, da izguba bička nima direktne povezave z virulenco oz. so dopustili možnost, da jo ima, vendar v povezavi z drugimi mehanizmi.

7

2.2 Načini detekcije in identifikacije bakterije R. solanacearum V direktivi Evropske skupnosti 98/57/EC (1998) je postopek diagnosticiranja razdeljen na presejalne teste, izolacijo bakterije iz okuženega tkiva in v primeru pozitivnega rezultata na identifikacijo kulture kot bakterijo R. solanacearum s potrditvenimi testi. Med presejalne teste spadajo test izcedka iz stebla (kot je opisan med opisom bolezenskih znamenj na strani 5), zaznavanje poli-β-hidroksilbutiratnih (PBH) zrnc, test z barvilom nilskim modrilom, test z barvilom Sudan črno, test indirektne imunofluorescence (IIF), test ELISA (ang. Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay) ali PCR test (verižna reakcija polimeraze) oziroma PCR v realnem času (v nadaljevanju qPCR). Za izolacijo bakterije R. solanacearum se po direktivi 98/57/EC uporabljajo selektivna ali osnovna hranilna gojišča, kot so NA (hranilni agar), YPGA (kvasno pepton glukozni agar), SPA (agar s saharozo in peptonom), TTC (Kelmanovo tetrazolijevo gojišče) ter selektivno SMSA gojišče, ki so ga leta 1996 definirali Elphinstone in sod. Gojišča po nanosu ekstrakta iz stebla ali gomolja, raztopljenega v fosfatnem pufru, inkubiramo tri dni pri 28˚C. Inkubacija lahko traja tudi šest dni, če je rast počasna, vendar lahko v tem primeru na SMSA gojišču postanejo kolonije netipične in odmrejo. Virulentne kolonije so na osnovnem gojišču ploske, biserno bele barve, nepravilne oblike, svetleče in fluidne. Na selektivnem SMSA gojišču pa so tipične virulentne kolonije mlečno bele barve, ploske, nepravilne, fluidne, v centru pa so obarvane rdeče. Avirulentne bakterije na SMSA gojišču so suhe, celotna kolonija je rožnate oziroma rdeče barve. Če zrastejo na gojiščih tipične kolonije, je treba vzorce (čisto kulturo bakterij) testirati še s potrditvenimi testi. Ti so npr. test IIF, test ELISA, test PCR, FISH (ang. Flourescent in situ hybridization), FAP (ang. fatty acid profiling). Patogenost in virulentnost bakterije se določi s testom patogenosti in uspešno reizolacijo bakterije iz testnih rastlin. 2.3 Zatiranje bakterije R. solanacearum in nadzor širjenja okužbe Zatiranje bakterije R. solanacerum se je izkazalo za težavno, predvsem zaradi velikega števila gostiteljev in odsotnosti primernih učinkovitih baktericidov. EPPO za zatiranje bakterije R. solanacearum priporoča 5 do 7 letno kolobarjenje brez rastlin, ki bi bile možni gostitelji. Prav tako je priporočeno spreminjanje pH zemlje (poleti nižanje na 4 – 5, jeseni pa višanje na 6). Predvsem pa EPPO poudarja preventivne ukrepe, kot so uporaba zdravih (testiranih) semenskih gomoljev krompirja, hitra in zanesljiva detekcija bakterije, karantenski ukrepi na okuženih poljih in kmetijah, zadostno kolobarjenje, nadzor plevelov, ki so potencialni gostitelji, izogibanje uporabi površinske vode za namakanje in izobraževanje uporabnikov (Smith in sod., 1997). S kombinacijo različnih ukrepov so na nekaterih območjih preprečili pojavljanje bakterije R. solanacearum, na drugih pa so vzpostavili nadzor nad boleznijo. Integriran nadzor, kot ga imenujejo, je sicer lahko uspešen na enem območju, na drugem pa ne, saj se ta razlikujejo tako po okoljskih značilnostih kot po socio-ekonomskih faktorjih, ki vplivajo na odločitve pridelovalcev (French, 1994).

8

Iščejo se učinkovitejši načini nadzora bakterije. Kemični nadzor se ni izkazal kot učinkovit, saj dezinfekcijska sredstva in antibiotiki niso imeli učinka ali pa je bil ta slab. EPPO omenja možnosti biološkega nadzora z antagonističnimi bakterijami, uporabo odpornih vrst krompirja in skupno gojenje krompirja s koruzo. Vse te možnosti so uspešne le delno, le na enem območju ali pa niso dovolj raziskane (Smith in sod.,1997). Povečana odpornost proti bakteriji R. solanacearum je odvisna tako od vrste in sorte gostitelja, kakor od okoljskih dejavnikov. Pri preverjanju odpornosti različno občutljivih sort paradižnika na bakterijo R. solanacearum ob različnih temperaturah, osvetlitvi in fotoperiodi sta Krazusz in Thurston (1975) ugotovila, da je stopnja dovzetnosti na bakterijo R. solanacearum pri različnih temperaturah najbolj odvisna od sorte rastlin. Nekatere sorte paradižnikov so občutljive na temperaturo, druge ne. Zaradi pomanjkanja produktov fotosinteze lahko tudi krajša fotoperioda in manjša moč osvetlitve povečata občutljivost nekaterih vrst paradižnika. Za več rastlin je znano, da njihovo rizosfero kolonizirajo mikroorganizmi, s katerimi rastline tudi izmenjujejo razne produkte. Ker lahko ti mikroorganizmi s svojo rastjo zavrejo rast ostalih, tudi patogenih organizmov, jih uporabljamo kot biološko kontrolo za nekatere patogene bakterije. Ugotovili so, da psevdo-gliva Pythium oligandrum proizvaja elicitorje, ki aktivirajo obrambne reakcije rastline. Dva sta bila podrobneje opisana. Oligandrin sproži citološke in biokemične spremembe v celicah paradižnika in s tem inducira odpornost proti Phytophthora parasitica. Drugi elicitor so ekstrahirali iz dela proteinov celične stene P. oligandrum. Za tega so ugotovili, da v koreninah paradižnika poviša količino etilena in jasmonske kisline, ki imata pomembno vlogo v obrambi rastlin proti patogenim bakterijam. Slednji je v poskusih povišal odpornost paradižnika (cv. Micro-Tom in Moneymaker) proti bakteriji R. solanacearum rasa 1, biovar 4 (Hase in sod., 2008). Za zaščito pred mikroorganizmi, žuželkami in herbivori mnoge rastline same proizvajajo snovi s protimikrobnim učinkom. Cowanova (1999) je protimikrobne snovi iz rastlin razdelila v štiri skupine: fenoli in polifenoli, terpenoidi in eterična olja, alkaloidi in lektini ter polipeptidi. Te spojine lahko na različne načine inhibirajo bakterije, viruse in glive. In sicer tako, da zmotijo delovanje plazmaleme (npr. se vežejo na membranske proteine ali ogljikove-hidrate). Hranila spremenijo v mikroorganizmom nedostopno obliko, onemogočijo delovanje encimov, tvorijo komplekse s kovinskimi ioni, se vrinejo ali vežejo s celično steno ali DNK (deoksiribonukleinska kislina) ali pa tekmujejo za vezavna mesta na gostiteljevih receptorjih. Timol je antibakterijska frakcija eteričnih olj origana in timijana, ki zavira rast tako po Gramu pozitivne kot negativne bakterije, in sicer razbije bakterijsko celično membrano s spreminjanjem beljakovinskih reakcij. Ima in vitro kontaktno aktivnost proti bakteriji R. solanacearum (Helander, 1998). Zanimivo raziskavo so izvedli Pradhanang in sod. (2003), v kateri so za zatiranje bakterije R. solanacearum (rasa 1, biovar 1) uporabili različna eterična olja. Poskus je potekal v rastlinjaku. 900 ml zemlje so okužili s 100 ml suspenzije bakterije R. solanacearum, ki je imela koncentracijo 9*108 CFU/ml, in jo nato tretirali s 63 ml stabilnimi suspenzijami eteričnih olj (700 µl eteričnega olja, 6,3 ml 70% etanola z 0,1% detergenta in 56 ml vode). Zemljo so 3 dni hranili v zaprtih vrečah in jo vsak dan temeljito premešali. Naslednje 4 dni so iz nje odzračevali odvečne hlape olj. 7 dni po obdelavi so vanjo posadili 5 tednov stare paradižnike (cv. Equinox) s 4 – 5 pravimi listi. Po 3 tednih so se pri kontrolni skupini pojavili prvi bolezenski znaki. Timol, olje limonine

9

trave in olje palmarose so se izkazali za precej uspešne, saj rastline niso razvile bolezenskih znamenj ali pa je bilo teh veliko manj kot v kontrolni skupini. Poleg tega, da so esencialna olja zavrla venenje rastlin, se je znižala tudi koncentracija bakterije R. solanacearum v zemlji. Raziskavo s timolom so izvedli še na poljskem poskusu, kjer je timol prav tako znatno izboljšal zaščito rastlin pred okužbo z bakterijo R. solanacearum. Tudi tu so za testno rastlino uporabili paradižnik (cv. Equinox in Solar Set) in bakterijo R. solanacearum raso 1, biovar 1 (Ji in sod., 2005). Podobno kot so Pradhanang in sod. (2003) v poskusu z eteričnimi olji v rastlinjaku, so tudi Ji in sod. (2005) pri poljskem poskusu v prvih dneh po obdelavi z bakterijo in timolom zemljo za 3 ali 6 dni prekrili s polietilensko folijo in jo, preden so vanjo posadili 5 tednov stare paradižnike, še teden dni zračili. Za povečanje odpornosti rastlin proti bakteriji R. solanacearum se raziskuje tudi možnost uporabe transgenih rastlin. Huang in sod. (2007) so transformirali paradižnik tako, da so mu dodali gen sladke paprike za proizvajanje proteina feradoksin-I. Prekomerno izražanje tega gena v rastlinah je ob okužbi povečalo proizvodnjo aktivnih kisikovih spojin in aktiviralo hiperobčutljivostno reakcijo. V poskusu so uporabili virulenten sev bakterije R. solanacearum (rasa 1 biovar 4). Zemljo (16 l) so okužili s suspenzijo bakterije s koncentracijo 108 CFU/ml in vanjo posadili en mesec stare transgene paradižnike. Transgene linije, ki so imele visoke vrednosti feradoksina-I v koreninah, so bile odporne na okužbo z bakterijo R. solanacearum. Nekatere transgene linije so kazale spremembe v metabolizmu in rasti. Tako kot rastline morajo tudi glive za svoje preživetje sintetizirati protimikrobne snovi. Flemingovo odkritje protibakterijskega učinka penicilina je stimuliralo raziskovanje učinkov biološko aktivnih produktov gliv proti humanim patogenim bakterijam. Najbolj so znani produkti mikroskopskih gliv, kot so npr. Penicillium, Aspergillus, Tolypocladium inflatum W. Gams, Claviceps purpurea in ostalih. V zadnjih desetletjih v zahodni zemeljski hemisferi narašča zanimanje za protibakterijske lastnosti višjih gliv. Te so v prehrambene in medicinske namene uporabljala ljudstva po vsem svetu že v času pred našim štetjem. Njihova uporaba v medicinske namene je v azijskih državah že tradicionalna. Znanih naj bi bilo okoli 140000 vrst, kar je le desetina vseh vrst na svetu. Ker še ni odkritih veliko višjih gliv, večina znanih pa še ni dobro preučenih, pripisujejo prav tem zaradi ekološke potrebe gob za proizvodnjo biološko aktivnih snovi, izboljšanih analiznih tehnik in zaradi izkušenj v etno-medicini velik potencial v farmaciji. Poleg tega so se nekateri ekstrakti višjih gliv izkazali za učinkovite proti bakterijskim sevom, odpornim na več različnih protibakterijskih snovi. Sestavine in kompleksne substance gliv imajo protibakterijski učinek, delujejo protivirusno, protialergično in protivnetno. Varujejo jetra, uravnavajo imunski sistem, preprečujejo zamašitev arterij, znižujejo raven sladkorja v krvi, uravnavajo krvni pritisk, izkazale pa so se, da delujejo preventivno in kurativno na tumor in lajšajo simptome protitumorske terapije. Ekstrakti gob so se izkazali za bolj učinkovite kot prehrana z njimi. Aktivne komponente gliv so različni polisaharidi, terpenoidi, lektini, encimi, proteoglikani, antioksidanti in proteinski derivati. Posamezna vrsta gliv lahko vsebuje več različnih snovi, torej lahko ima tudi več zdravilnih učinkov (Lindequist in sod., 2005). Lektini se povratno vežejo na specifičen monosaharid oziroma oligosaharid. Ti so običajno prisotni v membranah različnih celic, ki jih lektini posledično zlepijo. To je učinkovit obrambni mehanizem proti gibljivim bakterijam, saj se s tem njihova gibljivost močno zmanjša, posledično pa tudi patogenost (Peumans in Van Damme, 1995).

10

Z raziskavami ekstraktov višjih gliv so v njih našli tudi nove snovi s protibakterijskim učnikom. Tak primer protibakterijske snovi je klitocipin, cisteinski proteinazni inhibitor, ki ga proizvaja gliva Clitocybe nebularis (Brzin in sod., 2000) in ga je moč najti v vsaj še dveh drugih vrstah rodu Clitocybe. Cisteinski proteinazni inhibitorji sodelujejo pri različnih predelavah oz. razkrajanju beljakovin v različnih organizmih. Nastajajo večinoma v gostiteljskih organizmih kot obrambni mehanizem ali v invazivnih vrstah plenilcev in parazitov. Nalagajo se v različnih organih ali tkivih, kot so semena, jajca, skladiščni organi, v tekočinah, ki omogočajo prenos povzročitelja bolezni, npr. hemolimfi, floemu, ali pa so kot dejavnik patogenosti prisotni v slini pijavk in insektov (Christeller, 2005). Večina raziskav o protibakterijskem učinku višjih gliv je bila opravljena na humanih patogenih bakterijah, virusih in glivah, čeprav imajo ekstrakti bazidiomicetnih gliv protibakterijski učinek tudi proti rastlinskim patogenim bakterijam. Pacumbaba in sod. (1999) so za zatiranje več različnih humanih in rastlinskih patogenih bakterij, med njimi tudi bakterije R. solanacearum, prvi testirali ekstrakte podgobja gliv šitake. Ekstrakte so na bakterijah testirali in vitro in in vivo. Pri in vitro testih so uporabili agarjeva gojišča, ki so vsebovala NaCl, tripton, agar, timin in destilirano vodo, eksponentno rastoče kulture bakterij in 10 krat koncentriran podgobni ekstrakt Lentinula edodes. Za testiranje in vivo vpliva ekstraktov na bakterijo R. solanacearum (rasa 1, biovar 1) so uporabili 3 do 4 tedne stare paradižnike cv. Big boy. Avtoklaviran vermikulant in šotno mešanico so najprej prelili s 50 ml bakterijske suspenzije, ki je imela koncentracijo 5*108 celic/ml, nato pa še s 50 ml 10 krat koncentriranega ekstrakta L. edodes. Po 3 do 4 dneh so v mešanico posadili paradižnike. Inokulirane rastline so do 40 dni gojili pri temperaturi 21,1 – 23,8 ˚C. Ekstrakt se je in vitro izkazal za učinkovitega tako proti humanim kot rastlinskim patogenim bakterijam. Pri in vivo testih z bakterijo R. solanacearum so z ekstraktom uspeli preprečiti pojav bolezenskih znamenj na paradižnikih do konca poskusa. Kontrolna skupina paradižnikov, inokulirana samo z bakterijsko suspenzijo, je bolezenska znamenja razvila v 17 do 22 dneh. Dreo in sod. (2007) so in vitro testirali več različnih glivnih ekstraktov na različnih rastlinskih patogenih bakterijah, tudi na bakteriji R. solanacearum. Nekateri ekstrakti na trdih gojiščih niso kazali inhibitornega učinka, drugi so zavrli rast bakterije v obsegu do 5 mm, tretji do 45 mm, nekateri pa so rast bakterij verjetno zaradi prisotnosti hranil še pospešili. Skubic J. (2007) je teste vpliva glivnih ekstraktov na bakterijo R. solanacearum opravila tudi v tekočem gojišču. Vpliv ekstraktov je bil izmerjen z absorbanco pri 595 nm. Pri ekstraktih, ki so kazali delno ali popolno inhibitorno aktivnost, je bil test opravljen še pri različnih koncentracijah bakterije in ekstrakta. Izrazit inhibitorni učinek sta imela ekstrakta, pridobljena iz zelene mušnice (Amanita phalloides) in milnate kolobarnice (Tricholoma saponaceum). Oba sta dobro zavrla rast bakterije. Ekstrakta peščenke (Suillus variegatus) in glive Bovista nigrescens sta v tekočem gojišču rast bakterije upočasnila, ekstrakta gliv Agricus silvaticus in Entoloma rhodopolium pa sta imela v tekočem gojišču šibek inhibitoren učinek. V isti raziskavi je bilo ugotovljeno tudi, da je inhibitorna aktivnost ekstrakta odvisna od koncentracije bakterij. Manjša je koncentracija bakterij in manj je ekstrakt zredčen, večja je inhibitorna aktivnost. Pri testih in vivo ekstrakti niso enako intenzivno zavrli rasti bakterije kot in vitro. Tu so se nekateri ekstrakti, ki in vitro niso imeli najboljšega inhibitornega učinka, izkazali bolje kot tisti, ki so imeli in vitro močan inhibitorni učinek.

11

3 EKSPERIMENTALNI DEL 3.1 Uporabljeni organizmi in glivni ekstrakti V poskusu, pri katerem smo preverjali vpliv zaporedja inokulacije glivnega ekstrakta in bakterije na razvoj bolezenskih znamenj pri rastlinah paradižnika, okuženih z bakterijo R. solanacearum, smo uporabili sev bakterije R. solanacearum NCPPB 4156, rasa 3, biovar 2. Isti sev smo uporabili tudi v poskusu, kjer smo opazovali vpliv glivnih ekstraktov na razvoj simptomov, ki jih povzroča bakterija R. solanacearum na krompirju. Pred uporabo smo bakterije gojili 72 ur pri temperaturi 28 °C. Za gojenje smo uporabili trdna YPGA ali SMSA gojišča. V poskusih smo uporabili ekstrakte gliv rodu Suillus sp, Tricholomas sp. in Clitocybe sp., ki so bili izbrani s presejalnimi in vitro testi v predhodnih poskusih. Prva dva sta bila izbrana na podlagi poskusov J. Skubic (2007). Ekstraktu glive rodu Clitocybe sp. smo prav tako v preliminarnih poskusih preverili njegovo inhibitorno aktivnost in vitro s testom minimalne inhibitorne koncentracije in testom cone inhibicije na trdnem gojišču. Na podlagi navedb v referencah in preliminarnih poskusih smo za test patogenosti uporabili paradižnik, Lycopersicon esculentum cv. Moneymaker in krompir Solanum tuberosum cv. Desirée. Rastline paradižnika so bile ob inokulaciji z bakterijo stare 21 dni. Vzgojili smo jih iz semena. Do inokulacije smo jih gojili v rastlinjaku pri temperaturi 25˚C. Rastline krompirja so bile vzgojene iz tkivnih kultur (dnevna T = 21 °C, nočna T = 21 °C, relativna vlaga = 55%). Od presaditve rastlin v zemljo do inokulacije z bakterijo smo jih 14 dni gojili v rastlinjaku pri temperaturi 22 ˚C, osvetlitvi 5000 luxov in 16 urni fotoperiodi. 3.2 Uporabljeni gojišči in pufer Pufer in gojišča so bila pripravljena po navodilih direktive sveta Evrope 98/57/EC. Za gojenje bakterije R. solanacearum smo uporabili YPGA in modificirano SMSA gojišče. Pri slednjih smo poleg rasti in števila CFU (ang. collony forming units) lahko določili še morfologije, tipične za virulentne bakterije R. solanacearum. Gojišče SMSA z agarjem Difco (Elphinstone in sod., 1996) je vsebovalo: Kazamino kisline 1 g / l Pepton 10 g / l Glicerol 5 ml / l Agar 15 g / l Bidestilirana voda dopolnjeno do 1000 ml pH je bil uravnan na 6,5. Gojišča so bila avtoklavirana 15 minut pri 121 °C. Po ohlajanju na približno 50 °C so bile dodane še naslednje raztopine: Bacitracin 1250 U / 0,5 l SMSA Kristal violet 2,5 mg / 0,5 l SMSA Polimiksin B sulfat 300.000 U / 0,5 l SMSA Kloramfenikol 2,5 mg / 0,5 l SMSA TTC 25 mg / 0,5 l SMSA Penicilin G 412,5 U / 0,5 l SMSA

12

Raztopine antibiotikov so bile pripravljene kot založne raztopine. Gojišče YPGA je vsebovalo naslednje sestavine: Kvasni ekstrakt 5,0 g Proteozni pepton 5,0 g Glukoza 10,0 g Agar 12,0 g Bidestilirana voda dopolnjeno do 1000 ml pH vrednost YPGA gojišč je bila umerjena na 7,2 − 7,4. Gojišča so bila avtoklavirana 20 minut pri temperaturi 121 °C in pritisku 2,34 x 105 Pa. 0,01M fosfatni pufer, ki smo ga uporabljali za pripravo bakterijskih suspenzij, je vseboval: Na2HPO4 1,071 g NaH2PO4 x 2H2O 0,4 g NaCl 8 g Bidestilirana voda dopolnjeno do 1000 ml Njegova končna pH vrednost je bila 7,2. Avtoklaviran je bil 20 minut pri temperaturi 121 °C in pritisku 2,34 x 105 Pa. 3.3 Priprava in določanje koncentracije bakterijskih suspenzij Poskuse smo izvajali z začetno koncentracijo bakterij 105 celic/ml, ki je najnižja koncentracija bakterij in je v predhodnih poskusih dala ponovljive rezultate z zagotavljanjem razvoja bolezenskih znamenj pri večini okuženih rastlin (Skubic, 2007). Suspenzije bakterij smo pripravljali po McFarland standardu, kjer za določanje števila celic primerjamo optično gostoto bakterijske suspenzije z optično gostoto raztopine BaCl2 v H2SO4. Za natančnejše določanje dodatno merimo absorbanco bakterijske suspenzije (Klement in sod., 1990). Standardne raztopine za določanje lestvice po McFarland standardu so bile pripravljene, kot je prikazano v tabeli 2. Nanesli smo jih po 200 µl v dveh paralelkah na mikrotitrsko ploščo in jim izmerili absorbanco pri 595 nm. Absorbanca je bila izmerjena z aparatom Tecan Genios z uporabo programa Magellan 6.4. Tabela 2: Priprava raztopin za določanje koncentracije bakterij po McFarlandu

McFarlandova lestvica

1% BaCl2 (ml)

1% H2SO4 (ml)

Ustreza koncentraciji bakterij (x 108 celic/ml)

1 0.1 9.9 3.0 2 0.2 9.8 6.0 3 0.3 9.7 9.0 4 0.4 9.6 12.0 5 0.5 9.5 15.0 6 0.6 9.4 18.0 7 0.7 9.3 21.0 8 0.8 9.2 24.0 9 0.9 9.1 27.0

10 1.0 9.0 30.0

13

Poleg standardnih raztopin smo na mikrotitrsko ploščo nanesli tudi 200 µl suspenzije bakterij. Pripravili smo jo tako, da smo bakterije iz gojišča prenesli v 4,5 ml 0,01M PBS in mešali pol minute. Rezultate merjenja absorbance smo vnesli v program Excel in na podlagi McFarland standarda narisali umeritveno krivuljo. Iz te smo preračunali, koliko pufra moramo dodati naši suspenziji bakterij, da bo njena koncentracija 108 celic/ml. Suspenzijo smo nato ustrezno redčili do koncentracije 105 celic/ml. Nadaljnje zaporedne redčitve od 105 do 1 celico/ml suspenzije, ki smo jo uporabili za inokulacijo paradižnikov, smo nanesli na SMSA gojišča za štetje števila živih bakterij v suspenziji − CFU (ang. Colony Forming Units). Vsako redčitev smo na gojišče nanesli 6 krat po 20 µl. Podobno smo napravili s suspenzijo, ki smo jo uporabili za inokulacijo krompirja. Tu smo na YPGA gojišče nanesli 4 krat po 20 µl vzorcev suspenzije z redčitvami od 106 do 103 celic/ml. 3.4 Inokulacija rastlin paradižnika in krompirja Rastline smo inokulirali, ko so imele razvita 2 do 4 prave liste. Rastlin vsaj en dan pred inokulacijo nismo zalili, saj na ta način lažje vsrkajo bakterijsko suspenzijo in ekstrakt. Pri inokulaciji smo bili pozorni, da smo prebodli steblo rastline in na vsako stran stebla spustili po eno kapljico suspenzije bakterij, mešanice suspenzije bakterij in ekstrakta, ali samo pufra. Ko smo inokulirali samo z ekstraktom, smo ga na mesto inokulacije kanili le eno kapljico. 3.5 Preverjanje vpliva zaporedja inokulacije glivnega ekstrakta in

bakterije R. solanacearum na razvoj bolezenskih znamenj pri rastlinah paradižnika

Namen poskusa je bil preveriti, če vpliva in kako zaporedje inokulacije glivnega ekstrakta in bakterije v rastlino na razvoj simptomov. Zanimala nas je tudi razlika med vplivom ekstraktov iz gob Suillus sp. in Tricholoma sp. na razvoj bolezenskih znamenj, ki jih na rastlinah paradižnika povzroči bakterija R. solanacearum. Kot testne rastline smo uporabili paradižnike L. esculentum cv. Moneymaker. Razdelili smo jih na 6 skupin − po 3 skupine za vsak ekstrakt. Za vsako skupino smo uporabili 42 testnih rastlin, 6 rastlin pozitivne in 6 negativne kontrole, skupaj 54 rastlin v vsaki skupini. Za vse skupine smo uporabili isto suspenzijo bakterij. Rastline paradižnika smo inokulirali med klična lista (slika 5). Pri vseh skupinah smo ekstrakt in bakterijo inokulirali vedno na isto mesto. Pri skupini, kjer smo inokulirali ekstrakt in bakterijo hkrati, smo ekstrakt zmešali s suspenzijo bakterij v razmerju 1:10 tik preden smo mešanico inokulirali v rastline. Tako smo preprečili, da bi ekstrakt inhibiral preveč bakterij, še preden bi z mešanico inokulirali rastline. Rastline smo inokulirali z ekstraktom oziroma bakterijo po zaporedju, ki je prikazan v tabeli 3. Poskus smo izvedli v rastlinjaku, kjer je bila stalna temperatura 25 °C, relativno vlago pa smo vzdrževali nad 75%.

14

Tabela 3 Načrt inokulacije rastlin paradižnika z bakterijo R. solanacearum in glivnim ekstraktom.

1. skupina Pozitivna

kontrola 1. skupine

2. skupina Pozitivna

kontrola 2. skupine

3. skupina Pozitivna

kontrola 3. skupine

1. dan Ekstrakt Ranitev na

mestu inokulacije

2. dan Bakterija Bakterija Ekstrakt + bakterija

Bakterija Bakterija Bakterija

3. dan Ekstrakt

Razvoj bolezenskih znamenj smo ocenjevali 1., 2., 3., 4., 6., 7., 8., 10. in 14. dan po inokulaciji z bakterijo. Rezultate poskusa smo uporabili pri načrtovanju poskusa, v katerem smo opazovali učinek glivnih ekstraktov na napredovanje okužbe pri rastlinah krompirja. Pozitivne kontrole obeh prvih skupin paradižnikov smo dan pred vnosom suspenzije prebodli na mestu vnosa. Na ta način smo izločili možnost, da bi bilo v primeru počasnejšega napredovanja bolezenskih znamenj to posledica odgovora rastline na ranitev in ne delovanja ekstrakta. 3.6 Test razširjenosti bakterije po paradižniku Za preverjanje razširjenosti bakterije po rastlini smo vzorčili rastline iz obeh skupin pozitivnih kontrol. Na 1., 2. in 3. dan po inokulaciji z bakterijo smo vzorčili po eno rastlino brez bolezenskih znamenj, na 6. dan po inokulaciji z bakterijo pa po eno rastlino z bolezenskim znamenjem 2, 3 in 4. Rastlino smo odrezali tik nad korenino in jo po površini razkužili in očistili s 70% etanolom. Tako smo se znebili drobcev zemlje, ki bi lahko motili test, in drugih bakterij s površine. Rastlino smo nato zarezali na v naprej določenih mestih 1 do 6 (slika 5) in vsak kos odtisnili na enako označenem delu SMSA gojišča. Pred vsakim rezom smo pinceto in skalpel ožgali, zato da ne bi prenašali bakterij iz enega mesta na drugega in tako dobili napačnih rezultatov. Na plošči z gojiščem smo opazovali rast bakterij. Na ta način smo preverili prisotnost bakterij v posameznih delih rastline. Vsakič, ko smo žrtvovali rastlino za preverjanje razširjenosti bakterije po rastlini, smo v laboratoriju pripravili še pozitivno kontrolo za rast bakterij. Za to smo uporabljali 3 dni stare kulture bakterij R. solanacearum. Vse plošče smo inkubirali 72 ur pri 28 ˚C.

15

Slika 5 Skica mest rezov na paradižniku za preverjanje razširjenosti bakterije po rastlini 0 mesto inokulacije 1 tik nad zemljo 2 1 cm pod kličnima listoma 3 tik pod 1. pravim(a) listom(a) 4 0,5 cm od začetka peclja manjšega lista 5 0,5 cm od začetka peclja večjega lista 6 na koncu peclja večjega lista

3.7 Vpliv glivnih ekstraktov na razvoj simptomov, ki jih povzroča

bakterija R. solanacearum na krompirju Namen poskusa je opazovanje razvoja simptomov, ki jih povzroča bakterija R. solanacearum na krompirju, po tretiranju z glivnimi ekstrakti Suillus sp., Tricholoma sp. in Clitocybe sp. Zanimalo nas je tudi, kako se s časom spreminja koncentracija bakterije v rastlini, zato smo med poskusom vzorčili tkivo za qPCR. Za poskus smo načrtovali po eno testno skupino s 45 rastlinami krompirja S. tuberosum cv. Desirèe za vsak ekstrakt, pozitivno kontrolo s 43 rastlinami in negativno kontrolo s 36 rastlinami. Za inokulacijo smo, po McFarland standardu, pripravili suspenzijo bakterij s koncentracijo 105 celic/ml. Za preverjanje koncentracije bakterije v rastlini smo 1., 2., 3., 4., 6. in 9. dan po inokulaciji v vsaki skupini vzorčili od 2 do 3 rastline brez bolezenskih znamenj. Poleg tega smo 6. dan po inokulaciji v skupinah pozitivne kontrole in testnima skupinama inokuliranima z glivnima ekstraktoma Suillus sp. ter Tricholoma sp. (v nadaljevanju skupini Suillus in Tricholoma) vzorčili še po dve rastlini z bolezenskimi znamenji 3 (opis ocenjevanja bolezenskih znamenj je v poglavju 3.8). V skupini, ki je bila inokulirana z bakterijo in glivnim ekstraktom Clitocybe sp. (v nadaljevanju skupina Clitocybe), rastlin z bolezenskim znamenjem 3 (glej poglavje 3.8) nismo vzorčili, ker jih je bilo 6. dan po inokulaciji premalo.

16

Inokulirane rastline smo gojili v rastlinjaku pri temperaturi 25 ˚C, 75 - 90% relativni zračni vlagi, osvetlitvi 5000 luxov in 16 urni fotoperiodi. Razvoj bolezenskih znamenj smo ocenjevali 1., 2., 3., 4., 5., 6., 7., 8., 10., 11. in 14. dan po inokulaciji. Rastline krompirja smo inokulirali 1 cm nad zemljo (slika 7). V času inokulacije je bilo to približno pri prvem večjem pravem listu. Inokulirali smo jih tako, da smo tik pred inokulacijo suspenziji dodali ekstrakt in ju dobro premešali. Rastline pozitivne kontrole smo inokulirali samo s suspenzijo bakterij, rastline negativne kontrole pa samo z 0,01 M PBS pufrom. 3.8 Ocenjevanje bolezenskih znamenj

Slika 6 Primer ocenjevanja bolezenskih znamenj na krompirju od 0 do 5 iz leve proti desni.

Ocena Opis bolezenskih znamenj

0 ni znamenj bolezni

1 1 list delno ovenel

2 2 ali 3 listi delno oveneli

3 vsi listi razen vrha oveneli

4 vsi listi oveneli

5 propad rastline

Za vrednotenje bolezenskih znamenj smo uporabili lestvico po Winsteadu in Kelmanu (1952). Primer bolezenskih znamenj je prikazan na sliki 6. Za obdelavo podatkov smo uporabili program R verzija 2.8.0, s katerim smo izračunali mediano in kvartile za pojav bolezenskih znamenj na posamezni dan ocenjevanja le-teh.

17

3.9 Potek vzorčenja tkiva za določanje prisotnosti bakterij in koncentracije bakterijske DNK v rastlini

Slika 7 Slika mest vzorčenja tkiva stebla krompirja za določanje prisotnosti in koncentracije bakterije v rastlinah.

Mesto reza Opis mesta reza

1 tik nad zemljo, kjer smo rastlino odrezali za vzorčenje

2 mesto inokulacije - 1 cm nad zemljo

3 2 cm nad mestom inokulacije

4 0,5 cm nad mestom 3 } Vzorec 1

5 2 cm nad mestom 4

6 0,5 cm nad mestom 5 } Vzorec 2

Za določanje koncentracije bakterijske DNK v krompirju smo rastline odrezali tik nad zemljo in jih po površini razkužili s 70% etanolom. Ob gorilniku smo s skalpelom odrezali dvakrat po 0,5 cm stebla krompirja. Ker so listi pri krompirju neenakomerno razporejeni po steblu, smo vzorčili 2 cm nad mestom inokulacije in drugi vzorec še dva centimetra višje (glej sliko 7). Izrezan del stebla smo prerezali še vzdolžno zato, da se je v pufer izločilo čim več bakterij. Vzorce tkiva smo prenesli v laboratorij in dodali 500 µl 0,01 M PBS pufra, jih dobro premešali in pustili 20 minut. Nato smo 400 µl ekstrakta prenesli v sveže epice in jih shranili v zamrzovalniku pri -20 °C.

18

3.10 Analiza koncentracije bakterijske DNA v rastlinah Koncentracijo bakterij v tkivu krompirja smo določili z verižno reakcijo polimeraze v realnem času (qPCR). Ker smo iz predhodnih eksperimentov pričakovali visoke koncentracije bakterij, smo ekstrakte, ki smo jih pridobili iz tkiva krompirjev, analizirali neredčene in 10 krat redčene. Na vsako ploščo smo za izračun umeritvene krivulje dodali znane koncentracije DNK bakterije R. solanacearum, ki je služila za izračun koncentracij bakterij in za pozitivno kontrolo poskusa, in izolirano rastlinsko DNK iz zaporednih redčin rastlinskega tkiva za analizo gena COX (citokrom oksidaza). Za detekcijo smo uporabili naslednje začetne oligonukleotide (zo) in sondi (Weller in sod., 2000): RS-I-F (zo) 5’-GCA TGC CTT ACA CAT GCA AGT C-3’ RS-II-R (zo) 5’-GGC ACG TTC CGA TGT ATT ACT CA-5’ RS-P (sonda) 5’-AGC TTG CTA CCT GCC GGC GAG TG-3’ COX-F (zo) 5’-CGT CGC ATT CCA GAT TAT CCA-3’ COX-R (zo) 5’-CAA CTA CGG ATA TAT AAG AGC CAA AAC TG-3’ COX-P (sonda) 5’-TGC TTA CGC TGG ATG GAA TGC CCT-3’ Za kontrolo kontaminacij smo na vsako mikrotitrsko ploščico z vzorci dodali še NTC (ang. no template control). Tu smo namesto tarčne DNK v mešanice dodali sterilno vodo. PCR mešanico za detekcijo bakterije R. solanacearum smo pripravili po protokolu Weller in sod. (2000). Volumen posameznih komponent smo prilagodili številu vzorcev. RS (Weller in sod.,2000) µl za 1 vzorec Univerzalni Master Mix TaqMan, št. serije MO6787 (Applied Biosystems, 2000) 5.0 RS-I-F (10pmol/µ) 0.9 RS-II-R (10pmol/µ) 0.9 RS-P (10µM) 0.2 ddH2O 1.0 Vzorec 2.0 Skupni volumen 10.0

Podobno smo pripravili mešanico za detekcijo rastlinskega gena za proizvajanje citokrom oksidaze, le da smo tu uporabili druge začetne oligonukleotide in sondo (Weller in sod., 2000). MM COX (Weller in sod., 2000) µl za 1 vzorec Univerzalni Master Mix TaqMan, št. serije MO6787 (Applied Biosystems, 2000) 5.0 COX-F (zo) (10pmol/µ) 0.9 COX-R (zo) (10pmol/µ) 0.9 COX-P (sonda) (10µM) 0.2 ddH2O 1.0 Vzorec 2.0 Skupni volumen 10.0

19

qPCR reakcija in detekcija fluorescence sta potekali v aparaturi ABI Prism 7900 HT Fast Real-Time PCR Systems sequence detection system. DNK se je pomnoževala po naslednjem protokolu:

• 50 °C, 2 min • 95 °C, 10 min • 95 °C, 15 s in • 60 °C, 1min • 45 ponovitev

Rezultate smo obdelali s programoma SDS 2.2.2 in Microsoft Excel. 4 REZULTATI IN RAZPRAVA 4.1 Rezultati poskusa: Preverjanje vpliva zaporedja inokulacije glivnega

ekstrakta in bakterije R. solanacearum na razvoj bolezenskih znamenj pri rastlinah paradižnika

4.1.1 Rast in število CFU bakterij v suspenziji, ki smo jo uporabili za inokulacijo paradižnikov Rast bakterij in CFU v suspenziji smo preverjali tako, da smo vsako koncentracijo od 100 do 105 celic/ml nanesli 6 krat po 20 µl na SMSA gojišče. Plošče smo pregledali 72 ur po inkubaciji pri 28 ˚C. Za izračun CFU smo uporabili ploščo z redčitvijo 103, torej prvo ploščo, kjer smo lahko kolonije šteli. Zaradi večjega števila števnih kolonij je običajno napaka pri izračunih manjša. V enem mililitru suspenzije s koncentracijo 105 celic/ml je bilo dejansko 5,1*104 živih celic. To je sicer nekoliko manj kot je v običajnem postopku testa patogenosti pri paradižniku na Nacionalnem inštitutu za biologijo, a kljub temu ne bi smelo vplivati na razvoj bolezenskih znamenj. Večina kolonij na plošči je bila, glede na morfologijo, avirulentnih. Tabela 4 Pregled plošč za preverjanje rasti bakterije v suspenziji, ki smo jo uporabili za inokulacijo rastlin v testu preverjanja vpliva zaporedja inokulacije ekstrakta na razvoj bolezenskih znamenj pri rastlinah paradižnika, okuženih z bakterijo R. solanacearum, 72 ur po inkubaciji pri 28˚C. Koncentracija bakterije v suspenziji (celice/ml)

Opis kolonij

105 kolonije se zlivajo 104 kolonije se zlivajo 103 kolonije na ploščah so števne (10, 8, 13, 11, 9, neštevno) 102 kolonije na ploščah so števne (1, 1, 1, 2, 1, 3) 101 ni rasti 1 ni rasti

20

Slika 8 Plošče za preverjanje rasti bakterije v suspenziji, ki smo jo uporabili za inokulacijo rastlin v testu preverjanja vpliva zaporedja inokulacije ekstrakta na razvoj bolezenskih znamenj pri rastlinah paradižnika, okuženih z bakterijo R. solanacearum, 72 ur po inkubaciji pri 28˚C. Zgoraj od leve proti desni sta prikazani plošči, na kateri smo nanesli suspenziji s koncentracijama bakterij 1 in 101 celic/ml, spodaj od leve proti desni pa 102 in 103 celic/ml. 4.1.2 Razvoj bolezenskih znamenj na paradižnikih, okuženih z bakterijo R. solanacearum in inokuliranih z ekstraktoma gliv Suillus sp. in Tricholoma sp. Poskus smo izvedli z namenom, da ugotovimo, kako vpliva časovno zaporedje inokulacije ekstrakta in bakterije na razvoj bolezenskih znamenj. Uporabili smo tri tedne stare paradižnike in ekstrakta Suillus sp. in Tricholoma sp. V obeh prvih skupinah (v nadaljevanju Suillus 1 in Tricholoma 1) smo najprej inokulirali z ekstraktom in čez 24 ur na isto mesto še z bakterijo. Pri obeh drugih skupinah (v nadaljevanju Suillus 2 in Tricholoma 2) smo rastline inokulirali z mešanico ekstrakta in bakterije. Pri obeh tretjih skupinah (v nadaljevanju Suillus 3 in Tricholoma 3) pa smo najprej inokulirali z bakterijo in čez 24 ur na isto mesto še z ekstraktom. Poleg vsake testne skupine smo imeli po eno skupino negativne in eno pozitivno kontrolo. Paradižnike v skupini negativne kontrole smo inokulirali z 0,01 M PBS pufrom, paradižnike v skupini pozitivne kontrole pa samo s suspenzijo bakterij R. solanacearum, ki je imela koncentracijo 105 celic/ml. Kot vidimo na sliki 9, so se prva bolezenska znamenja pojavila 4. dan po inokulaciji z bakterijo. Velika razlika v pojavljanju bolezenskih znamenj se na ta dan pojavi med skupinama pozitivnih kontrol Suillus in Tricholoma. V prvi je odstotek zdravih rastlin visok – 93%, v drugi pa je zdravih le še 53% rastlin. To razliko pripisujemo slabšim pogojem v komori, kjer smo gojili rastline skupin Suillus (kljub enakim nastavitvam smo opazili nekoliko nižjo zračno vlago in temperaturo). To domnevo potrjujejo rezultati naših predhodnih raziskav, kjer smo pokazali, da ekstrakti nimajo vpliva na rast rastlin. Rastline iz skupin Suillus so večinoma razvile samo en pravi list, kljub temu da so bile enako stare kot tiste iz skupine Tricholoma. Starost rastlin je bila ob inokulaciji sicer

21

primerna, manj primerno pa je bilo fiziološko stanje, kar bi lahko vplivalo na razvoj bolezenskih znamenj.

O dsto te k parad ižnikov bre z bole ze nskih znam e nj po inokulaciji z bakte rijo R . solanace arum in gliv n im i e kstrakti

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

1 2 3 4 6 7 8 10 14

dnevi po inoku laciji

%

P o zitivna kontro la S uillus S uillus 1 S uillus 2 S uillus 3

P o zitivna kontro la T richo lom a Tricho lom a 1 T ric ho lo m a 2 T richo lom a 3

Slika 9 Primerjava odstotka rastlin paradižnikov brez bolezenskih znamenj med vsemi skupinami paradižnikov na posamezen dan po inokulaciji. Rahel trend opazimo med skupinami Tricholoma 1, 2 in 3, kjer je v skupini Tricholoma 1 odstotek rastlin brez bolezenskih znamenj malo višji kot v ostalih dveh skupinah, kjer je odstotek rastlin brez bolezenskih znamenj enak. Razlike v trendu so na 4. in 14. dan po inokulaciji z bakterijo. Na 4. dan po inokulaciji je odstotek zdravih rastlin v skupini Tricholoma 2 (64%) nižji kot v skupini Tricholoma 3 (86%). Potem sta odstotka od 6. dneva po inokulaciji enaka. Na 14. dan po inokulaciji je v skupini Tricholoma 2 še ena zdrava rastlina (2%), v skupini Tricholoma 3 pa ni več nobene zdrave rastline. Rezultati po drugi strani lepo pokažejo razliko med rastlinami, ki so bile inokulirane z ekstraktom in bakterijo in pozitivno kontrolo. Pri pozitivni kontroli odstotek zdravih rastlin hitro upada, pri rastlinah, ki imajo dodan še ekstrakt, pa počasneje. Rastline negativnih kontrol niso razvile bolezenskih znamenj. Rezultati testa so v prilogi A. Podobno opazimo tudi pri spremljanju napredovanja bolezenskih znamenj. V primerjavi s pozitivno kontrolo skupin Tricholoma pri vseh treh testnih skupinah Tricholoma opazimo malo počasnejši razvoj bolezenski znamenj v prvih šestih dneh po inokulaciji (glej sliko 10). Ker v zadnjih dneh opazovanja nismo opazili bistvenih razlik med zaporedji inokulacije z glivnimi ekstrakti in bakterijo, smo se odločili, da bomo vpliv ekstraktov na krompir preizkušali le s sočasno inokulacijo z bakterijo.

22

Slika 10 Grafični prikaz razvoja bolezenskih znamenj v odvisnosti od časa v skupinah paradižnikov, kjer smo paradižnike inokulirali z ekstraktom Tricholoma sp. in bakterijo R. solanacearum Pri skupinah Suillus je odčitavanje bolezenskih znamenj močno motil slab razvoj rastlin. Zato ne prikazujemo rezultatov napredovanja bolezenskih znamenj v skupinah Suillus. Če bi želeli natančno primerjati rezultate, bi morali v prihodnosti poskus ponoviti po možnosti v istem rastlinjaku. 4.1.3 Širjenje bakterije po rastlini paradižnika Iz literature je znano, da je R. solanacearum gibljiva bakterija, ki kolonizira ksilem. Zanimalo nas je, v katero smer se širi po inokulaciji v rastlinah paradižnika ter koliko se je razširila vzdolž stebla v različnih dneh po inokulaciji oziroma koliko je razvoj bolezenskih znamenj odvisen od širjenja bakterije po ksilemu. V ta namen smo 1., 2., 3. in 6. dan po inokulaciji vzorčili 6 rastlin iz pozitivne kontrole Suillus in 6 rastlin iz pozitivne kontrole Tricholoma. Po tri rastline iz vsake skupine, ki smo jih vzorčili v prvih dneh, so bile brez bolezenskih znamenj, po tri, ki smo jih vzorčili na 6. dan po inokulaciji, pa so imele bolezenska znamenja 2, 3 in 4. Rastline smo odrezali na mestih, ki so prikazana na sliki 5, in tisti del stebla odtisnili na SMSA gojišče. Primer gojišč je na sliki 11.

23

Slika 11 Plošče vzorčenja na 2. dan po inokulaciji pregledane po treh dneh inkubacije. Zgoraj levo pozitivna kontrola, zgoraj desno odtis rastline iz skupine pozitivne kontrole skupin Tricholoma in spodaj odtis rastline iz skupine pozitivne kontrole skupin Suillus. Bakterije na gojiščih so črno-vijolične barve. Tabela 5 Razširjenost bakterije po paradižniku v skupinah pozitivne kontrole Suillus in Tricholoma na 1., 2., 3. in 6. dan po inokulaciji.

Mesta razširjenosti bakterije R. solanacearum po rastlini paradižnika

Dnevi po inokulaciji

Bolezensko znamenje

Pozitivna kontrola skupin Suillus sp.

Pozitivna kontrola skupin Tricholoma sp.

1 0 0 0 2 0 0 2 in 3 3 0 2, 3, 4, 5 2, 3, 4, 5 6 2 1 - 6 1 – 6 6 3 1 - 6 1 – 6 6 4 1 - 6 1 – 6

V tabeli 5 so prikazani vsi rezultati vzorčenja. Ti rezultati so bili pričakovani, saj bakterija vdre v ksilem in se širi po njem, zato je prej zrasla na pozicijah vzorčenja, ki so bile nad mestom inokulacije 2, 3, 4 in 5 kot na 1, ki je bil pod njemu. Bakterija je že 3. dan po inokulaciji močno razširjena po rastlini, ta pa še ne kaže bolezenskih znamenj. Pri bolezenskih znamenjih 2, 3 in 4 je bakterija razširjena po celi rastlini. 4.1.4 Razprava o poskusu: Preverjanje vpliva časovnega zaporedja inokulacije ekstrakta na razvoj bolezenskih znamenj pri rastlinah paradižnika, okuženih z bakterijo R. solanacearum, in širjenje bakterij po rastlini Za najboljšega se je izkazalo zaporedje, pri katerem najprej inokuliramo z ekstraktom in čez 24 ur še z bakterijo, vendar med zaporedji inokulacije ekstrakt – bakterija ni velikih razlik. Zanimivo je, da se je to zaporedje izkazalo za nekolikoo boljše pri obeh testiranih ekstraktih, kljub temu da so bili slabši pogoji v rastlinjaku, v katerem smo

24

gojili paradižnike, inokulirane z ekstraktom gliv Suillus sp. To nakazuje, da bi ekstrakta lahko povzročala sprožitev rastlinskih obrambnih mehanizmov. Kljub temu se pri naslednjem poskusu nismo odločili za ta način inokulacije, ker razlike med zaporedji inokulacije niso tako velike, da bi vplivale na interpretacijo rezultatov. Za naslednji poskus smo izbrali način, ko pred inokulacijo skupaj zmešamo ekstrakt in suspenzijo bakterij ter s to mešanico inokuliramo rastlino. Pri tem načinu poznamo razmerje med volumnoma, inokulirati pa je treba samo enkrat. S tem dosežemo manjše razlike pri sami inokulaciji, rastline pa niso podvržene večkratnemu stresu zaradi le-te. Ta način inokulacije je precej bolj invaziven v primerjavi z načini, ki so jih v poskusih uporabili nekateri drugi raziskovalci. Pradhanang in sod. (2003) so posnemali naravni način okužbe in s suspenzijo koncentracije 9*108 CFU/ml zalili zemljo, jo kasneje tretirali z eteričnimi olji, nekaj dni mešali in zračili. Šele po tednu dni so vanjo posadili paradižnike. Podoben način inokulacij so uporabili Pacumbaba in sod. (1999) pri testiranju protibakterijskih učinkov ekstraktov podgobja gliv šitake. Huang in sod. (2007) so v enem poskusu uporabili enak postopek, v drugem pa so namočili korenine paradižnikov v bakterijsko suspenzijo in tako zagotovili takojšen, gotov stik rastline z bakterijo. Za take načine inokulacije se nismo odločili, ker nismo imeli na voljo dovolj velikih količin ekstrakta ter pogojev, ki bi omogočali enakomerno okužbo tako velikega števila rastlin. Naš način inokulacije ima prednost tudi v tem, da s tem, ko bakterijo vnesemo neposredno v njeno optimalno okolje za razmnoževanje, precej skrajšamo čas trajanja poskusa. V primeru, če bi iz ekstrakta dobili posamezno aktivno substanco, bi lahko rastline gensko spremenili, da bi to substanco aktivno proizvajale in se na ta način same branile pred okužbo. V tem primeru bi bila simulacija naravne okužbe z bakterijo prek zemlje najprimernejša. Čas trajanja naših poskusov je bil dva tedna. Poskusi ostalih avtorjev so trajali od 28 – 40 dni. Poskus je bil prostorsko manj obsežen. Rastline smo inokulirali v enaki starosti, kot so jih v ostalih poskusih, vendar smo z našim načinom inkulacije zagotovili okužbo rastlin ob istem času in enaki fiziološki starosti, ki se v tem obdobju rasti pri rastlinah hitro spreminja. Dodatna razlika, ki jo ima naš način inokulacije v primerjavi z načinom inokulacije, ki so ga uporabili Pacumbaba in sod. (1999) ter Pradhanang in sod. (2003), je neposredno tretiranje rastlin z ekstrakti, medtem ko so z zalivanjem z esencialnimi olji oz. ekstrakti gliv šitake razkuževali zemljo, še preden so vanjo posadili rastline. Ker je bila uporabljena zemlja avtoklavirana, so tako bakterijo prenesli za 3 − 7 dni iz hranilno bogatega v oligotrofno okolje, kar je verjetno poleg esencialnih olj in ekstraktov gliv šitake pripomoglo k znižanju koncentracije bakterij. V primerjavi s pozitivno kontrolo so rastline inokulirane z ekstraktom Tricholoma sp kasneje razvile bolezenska znamenja. To pomeni, da je ekstrakt znižal koncentracijo bakterij v rastlini. Ker so bakterije gibljive in se lahko množijo, ekstrakt pa smo v rastlino vnesli le enkrat in samo na eno mesto na katerem je prišlo tudi do redčenja, so se bakterije lahko vseeno dovolj razširile po rastlini in dosegle dovolj visoke koncentracije, da so povzročile venenje. Poskus z ekstraktom Suillus sp. bi za primerjavo podatkov morali ponoviti. V poskusu širjenja bakterije smo ugotovili tudi, da se bakterija prej razširi v smeri toka ksilema kot obratno ter da je bila razširjena po skoraj celi rastlini že 3. dan po inokulaciji, rastline pa kljub temu še niso kazale bolezenskih znamenj. Kot poroča Tans - Kerstenova in sod. (2001), ni dovolj le, da je bakterija v rastlini prisotna, ampak mora biti prisotna v dovolj velikih koncentracijah, da povzroči venenje rastline.

25

4.2 Rezultati poskusa: Vpliv glivnih ekstraktov na razvoj bolezenskih

znamenj, ki jih povzroča bakterija R. solanacearum na rastlinah krompirja

4.2.1 Rast in število CFU bakterij v suspenziji, ki smo jo uporabili za inokulacijo rastlin krompirjev Rast bakterij v suspenziji smo preverjali tako, da smo vsako koncentracijo od 103 do 106 celic/ml nanesli 4 krat po 20 µl na YPGA gojišče. Plošče smo pregledali 72 ur po inkubaciji pri 28 ˚C. Tabela 6 Pregled vseh plošč za preverjanje rasti bakterije v suspenziji, ki smo jo uporabili za inokulacijo rastlin krompirja, 72 ur po inkubaciji pri 28˚C.

Koncentracija bakterije v suspenziji (celice/ml)

Opis kolonij

106 kolonije se zlivajo, plošče so neštevne 105 kolonije se zlivajo, plošče so neštevne 104 plošče so števne (4, 6, 4, neštevno) 103 plošče so števne (0, 1, 2, 1)

Za izračun CFU smo uporabili ploščo z redčitvijo 104 celic/ml, kjer je bilo več vidnih kolonij kot na plošči z 103 celic/ml, zato je bila napaka pri izračunih manjša. Pri koncentraciji 105 in 106 celic/ml so se kolonije zlivale, plošče niso bile števne. V suspenziji s koncentracijo 105 celic/ml je bilo po naših izračunih 2,3*103 CFU/ml. Tako nizko število živih bakterij je bila verjetno posledica tega, da je od časa priprave suspenzije do časa nanosa bakterij na gojišče preteklo nekaj ur. V tem času so bakterijske celice lahko sedimentirale. Možno je, da suspenzija pred nanosom na gojišče ni bila dovolj dobro premešana. 4.2.2 Razvoj bolezenskih znamenj na krompirjih, okuženimi z bakterijo R. solanacearum in inokuliranimi z glivnimi ekstrakti Suillus sp., Tricholoma sp. in Clitocybe sp. Razvoj bolezenskih znamenj na krompirju smo ocenjevali z ocenami od 0 do 5, kot je opisano v poglavju 3.8. Zanimalo nas je, ali glivni ekstrakti upočasnijo napredovanje bolezni na krompirju in kako se njihovi učinki razlikujejo med sabo. Število rastlin se je v času poskusa v vseh skupinah zaradi vzorčenja rastlin za preverjanja prisotnosti in koncentracije bakterije v njih zmanjševalo, kar je vidno tudi ob primerjavi slik 12 in 13. V primerjavi s skupino pozitivne kontrole, kjer smo inokulirali le s suspenzijo bakterij R. solanacearum, je bil odstotek zdravih rastlin v skupinah inokuliranih še z ekstrakti višji (glej sliko 14). Najučinkovitejši je bil ekstrakt Clitocybe sp.. V tej skupini (v nadaljevanju skupina Clitocybe) je 14 dni po inokulaciji ostalo brez bolezenskih znakov še 55% rastlin (16 od 29). V skupini, ki je bila tretirana z ekstraktom Tricholoma sp. (v nadaljevanju skupina Tricholoma), je bilo ob koncu poskusa še 37% rastlin (10 od 27) brez bolezenskih znamenj. V skupini, ki je bila tretirana z ekstraktom Suillus sp. (v

26

nadaljevanju skupina Suillus), pa je ostalo brez bolezenskih znamenj še 30% rastlin (8 od 27). V skupini pozitivne kontrole sta ob koncu poskusa brez bolezenskih znamenj ostali še 2 od preostalih 27 rastlin, kar predstavlja 7% rastlin te skupine (slika 14). Vsi rezultati testa patogenosti so zbrani v prilogi B. Enako kot v poskusu s paradižniki (slika 9) se tudi tu prva bolezenska znamenja pojavijo 4. dan po inokulaciji in prav tako v vseh skupinah največ rastlin razvije bolezenska znamenja do vključno 7. dne po inokulaciji (priloga B). Iz 4. na 5. dan po inokulaciji vidimo v skupini pozitivne kontrole velik upad števila zdravih rastlin – z 91% na 42%. Tako velikega nenadnega upada števila rastlin brez bolezenskih znamenj ne zaznamo pri nobeni drugi skupini rastlin krompirjev. Od 5. do 7. dneva po inokulaciji v vseh skupinah na novo razvije bolezenska znamenja največ rastlin. V skupini Suillus jih v tem obdobju začne na novo veneti enako število kot v pozitivni kontroli, razlika je le v tem, da v skupini pozitivne kontrole s 4. na 5. dan po inokulaciji oveni 18 rastlin, naslednji dan 3 in potem ponovno 3, v skupini Suillus pa jih s 4. na 5. dan po inokulaciji oveni 10, potem 6 in 8. Od 8. dne po inokulaciji naprej v nobeni skupini ne začno veneti več kot 3 rastline na dan. V skupinah Suillus in Clitocybe opazimo, da je od 10. do 14. dneva po inokulaciji število zdravih rastlin enako. Podobno je v skupini Tricholoma, le da tu iz 10. na 11. dan po inokulaciji razvije bolezenska znamenja še ena rastlina. Takega trenda ne opazimo pri skupini pozitivne kontrole, pri kateri iz 10. na 11. dan po inokulaciji nobena nova rastlina ne razvije bolezenskih znakov. Razvijeta pa jih še dve (od preostalih štirih) do zadnjega dneva pregleda (glej sliko 23 in/ali prilogo B). Na sliki 15 je po skupinah prikazano, kako se bolezenska znamenja spreminjajo s časom. Z najmanjšimi odstopanji od mediane se razvijajo v skupini pozitivne kontrole. V tej skupini je na koncu poskusa le še 5 rastlin, ki niso popolnoma propadle, dve od teh sta brez bolezenskih znamenj. V ostalih skupinah pa so ob koncu poskusa bolezenska znamenja večinoma 0 ali 5, vseh vmesnih pa je na 11. in 14. dan po inokulaciji največ 5. Na koncu poskusa je bila v testnih skupinah tretjina do polovica rastlin brez bolezenskih znamenj, ostale so večinoma do konca propadle (glej tudi prilogo B). Ekstrakti so na krompirju bolj zavrli razvoj bolezenskih znamenj kot na paradižniku (slika 16). Ob koncu poskusa je bilo od vseh testnih rastlin paradižnikov skupaj (247) le 6 rastlin brez bolezenskih znamenj (priloga A). V skupini negativne kontrole se bolezenska znamenja niso razvila.

27

Slika 12 Skupina pozitivne kontrole rastlin krompirjev 2. dan po inokulaciji.

Slika 13 Skupina pozitivne kontrole rastlin krompirjev 8. dan po inokulaciji

28

Odsto tek rastlin kromp irja , k i ni razvil bo lezenskih znakov

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

10 0

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 14

dnevi po inokulaciji

%

Poz itivnakontrola

Suillus spp.

Tric holom a spp.

C litocybe spp.

Slika 14 Grafični prikaz spreminjanja odstotka zdravih rastlin krompirjev po skupinah s časom.

Slika 15 Razvoj bolezenskih znamenj v rastlinah inokuliranih, z ekstraktom a) Suillus sp., b) Tricholoma sp. in c) Clitocybe sp.. Na grafu d) je prikaz razvoja bolezenskih znamenj v skupini pozitivne kontrole, inokulirane le s suspenzijo bakterij R. solanacearum.

29

Prime rjav a odstotka rastlin paradižnika in krompirja bre z bole ze nskih zname nj

0

1 0

2 0

3 0

4 0

5 0

6 0

7 0

8 0

9 0

1 00

1 2 3 4 6 7 8 1 0 14

d n e v i p o in o ku lac iji

%

para d ižn ik i + e kstraktT r ich o lomakro mp ir ji + ekstraktT r ich o lomapozitivn a kon tro lapara d ižn ikovpozitivn a kon tro lakro mp ir jev

Slika 16 Odstotki okuženih rastlin paradižnikov in krompirjev, ki smo jih inokulirali z ekstraktom Tricholoma, in niso razvili bolezenskih znamenj. Ob tem so prikazani odstotki rastlin brez bolezenskih znamenj v obeh skupinah pozitivne kontrole. Prikazali smo le odstotke za rastline iz tiste skupine paradižnikov, ki so bile enako kot rastline krompirjev hkrati inokulirane z ekstraktom Tricholoma sp. in suspenzijo bakterij. 4.2.3 Rezultati qPCR Med testom patogenosti na krompirju smo vzorčili rastline za preverjanje prisotnosti in koncentracije bakterije v njih (za mesta vzorčenja glej sliko 7). Vsako rastlino smo vzorčili na dveh mestih, kot je opisano v poglavju 3.9. Na slikah 17 do 21 so prikazani neobdelani rezultati qPCR. Vzorce smo označevali z dvema črkama in tremi številkami, ločenimi s poševnico. Črki predstavljata okrajšavo za pozitivno ali negativno kontrolo oz. ekstrakt, s katerim smo inokulirali rastline, ki smo jih vzorčili (PK = pozitivna kontrola, Sv = Suillus sp., Ts = Tricholoma sp., Cg = Clitocybe sp., in NK = negativna kontrola). Prva številka pove, katero zaporedno vzorčenje je bilo. Druga številka pove zaporedno rastlino iz tiste skupine na tisti dan vzorčenja. Zadnje število pove, katero mesto na rastlini je bilo vzorčeno. Primer: PK 2/1/2 – rastlina iz skupine pozitivne kontrole, 2. vzorčenje, 1. vzorčena rastlina iz te skupine tega dne, 2. mesto vzorčenja te rastline. Vsi rezultati so predstavljeni s Ct (ang. cycle threshold) vrednostmi, ki nam povejo v katerem krogu pomnoževanja qPCR smo zaznali tarčno DNK. Nižja Ct vrednost pomeni več DNK v vzorcu. V nobenem od vzorcev iz skupine rastlin negativne kontrole nismo zaznali DNK bakterije R. solanacearum (slika 18).

30

Po zitivn a kon tro la15

20

25

30

35

40

45

PK

1/1

/1

PK

1/1

/2

PK

1/2

/1

PK

1/2

/2

PK

2/1

/1

PK

2/1

/2

PK

2/2

/1

PK

2/2

/2

PK

2/3

/1

PK

2/3

/2

PK

3/1

/1

PK

3/1

/2

PK

3/2

/1

PK

3/2

/2

PK

4/1

/1

PK

4/1

/2

PK

4/2

/1

PK

4/2

/2

PK

5/1

/1

PK

5/1

/2

PK

5/2

/1

PK

5/2

/2

PK

5/3

/1

PK

5/3

/2

PK

5/4

/1

PK

5/4

/2

PK

6/1

/1

PK

6/1

/2

PK

6/2

/1

PK

6/2

/2

Ct

C O X ne red če n C O X 1 0x red če n R s ne red če n R s 10 x re dč en

Slika 17 Ct vrednosti nerazredčene in 10 krat razredčene bakterijske in rastlinske DNK vzorcev pozitivne kontrole. Obkrožena so imena vzorcev rastlin, ki so imele ob vzorčenju bolezensko znamenje 3.

N eg ativn a ko n tro la

1 5

2 0

2 5

3 0

3 5

4 0

4 5

NK

1/1

/1

NK

1/1

/2

NK

1/2

/1

NK

1/2

/2

NK

2/1

/1

NK

2/1

/2

NK

2/2

/1

NK

2/2

/2

NK

3/1

/1

NK

3/1

/2

NK

3/2

/1

NK

3/2

/2

NK

4/1

/1

NK

4/1

/2

NK

4/2

/1

NK

4/2

/2

NK

5/1

/1

NK

5/1

/2

NK

5/2

/1

NK

5/2

/2

NK

6/1

/1

NK

6/1

/2

NK

6/2

/1

NK

6/2

/2

Ct

R s C O X

Slika 18 Ct vrednosti bakterijske in rastlinske DNK vzorcev negativne kontrole

31

Su illu s sp .1

52

02

53

03

54

04

5

Sv

1/ 1

/1

Sv

1/ 1

/2

Sv

1/ 2

/1

Sv

1/ 2

/ 2

Sv

2/ 1

/1

Sv

2/1

/ 2

Sv

2/ 2

/ 1

Sv

2/2

/ 2

Sv

2/3

/ 1

Sv

2/3

/ 2

Sv

3/1

/ 1

Sv

3/1

/2

Sv

3/2

/ 1

Sv

3/2

/2

Sv

4/1

/1

Sv

4/1

/2

Sv

4/2

/1

Sv

4/2

/2

Sv

5/1

/1

Sv

5/1

/2

Sv

5/2

/1

Sv

5/2

/2

Sv

5/3

/1

Sv

5/3

/2

Sv

5/4

/1

Sv

5/4

/2

Sv

6/1

/1

Sv

6/1

/2

Sv

6/2

/1

Sv

6/ 2

/2

Ct

R s ne re d če n R s 10 x re d če n C O X ne re dče n C O X 1 0 x re dče n

Slika 19 Ct vrednosti nerazredčene in 10 krat razredčene bakterijske in rastlinske DNK vzorcev skupine, inokulirane z ekstraktom Suillus sp.. Obkrožena so imena vzorcev rastlin, ki so imele ob vzorčenju bolezensko znamenje 3.

T rich o lo m a sp .

15

20

25

30

35

40

45

Ts

1/1

/1

Ts

1/1

/2

Ts

1/2

/1

Ts

1/2

/2

Ts

2/1

/1

Ts

2/1

/2

Ts

2/2

/1

Ts

2/2

/2

Ts

2/3

/1

Ts

2/3

/2

Ts

3/1

/1

Ts

3/1

/2

Ts

3/2

/1

Ts

3/2

/2

Ts

4/1

/1

Ts

4/1

/2

Ts

4/2

/1

Ts

4/2

/2

Ts

5/1

/1

Ts

5/1

/2

Ts

5/2

/1

Ts

5/2

/2

Ts

5/3

/1

Ts

5/3

/2

Ts

5/4

/1

Ts

5/4

/2

Ts

6/1

/1

Ts

6/1

/2

Ts

6/2

/1

Ts

6/2

/2

Ct

R s ne re d če n R s 1 0x re d če n C O X ne re d čen C O X 10 x re d čen

Slika 20 Ct vrednosti nerazredčene in 10 krat razredčene bakterijske in rastlinske DNK vzorcev skupine, inokulirane z ekstraktom Tricholoma sp. Obkrožena so imena vzorcev rastlin, ki so imele ob vzorčenju bolezensko znamenje 3.

32

C lito cyb e sp .

15

20

25

30

35

40

45

Cg

1/1

/1

Cg

1/1

/2

Cg

1/2

/1

Cg

1/2

/2

Cg

2/1

/1

Cg

2/1

/2

Cg

2/2

/1

Cg

2/2

/2

Cg

2/3

/1

Cg

2/3

/2

Cg

3/1

/1

Cg

3/1

/2

Cg

3/2

/1

Cg

3/2

/2

Cg

4/1

/1

Cg

4/1

/2

Cg

4/2

/1

Cg

4/2

/2

Cg

5/1

/1

Cg

5/1

/2

Cg

5/2

/1

Cg

5/2

/2

Cg

6/1

/1

Cg

6/1

/2

Cg

6/2

/1

Cg

6/2

/2

Ct

R s nedredčen Rs 10x redčen CO X neredčen C O X 10x redčen

Slika 21 Ct vrednosti nerazredčene in 10 krat razredčene bakterijske in rastlinske DNK vzorcev skupine, inokulirane z ekstraktom Clitocybe sp. Vzorci NTC so bili vsi (32) razen 2 negativni. Ker sta vrednosti Ct pri obeh visoki (41,43 in 39,50), ker smo za vse vzorce uporabili isto mešanico sond in začetnih oligonukleotidov, in ker na 3. plošči v nobenem NTC ni bilo tarčne DNK, lahko sklepamo, da smo pri nanosu vzorcev ponesreči kontaminirali ti dve mesti z NTC ter da so bile naše reakcijske mešanice za qPCR v redu. Na dan prvega vzorčenja (prvi dan po inokulaciji) pri nobenem vzorcu ne zaznamo bakterijske DNK, iz česar lahko sklepamo, da se bakterija iz mesta inokulacije še ni razširila po rastlini. Pri vzorcih z drugega vzorčenja (2. dan po inokulaciji) zaznamo bakterijsko DNK pri vseh treh vzorčenih rastlinah iz skupine pozitivne kontrole in v enem vzorcu iz skupine Tricholoma. Pri teh rastlinah smo bakterijsko DNK zaznali le na enem od obeh vzorčenih mest. Pri dveh rastlinah pozitivne kontrole je to bilo na drugem - višjem mestu vzorčenja (glej sliko 7). Pri tretjem vzorčenju (3. dan po inokulaciji) prav tako zaznamo bakterijsko DNK pri obeh vzorčenih rastlinah iz skupine pozitivne kontrole in v enem od obeh vzorcev iz skupine Tricholoma. Tokrat je bila bakterijska DNK prisotna na obeh mestih vzorčenja. Na četrti dan po inokulaciji (4. vzorčenje) je bakterijska DNK prisotna v vseh skupinah, vendar ne pri vseh vzorčenih rastlinah. V skupini pozitivne kontrole zaznamo bakterijsko DNK na obeh mestih vzorčenja, vendar le pri eni rastlini. V skupini Tricholoma zaznamo bakterijsko DNK pri obeh vzorčenih rastlinah, vendar pri eni le na višjem (2.) mestu vzorčenja. V skupini Suillus zaznamo enako kot v skupini pozitivne kontrole bakterijsko DNK le v eni rastlini na obeh mestih vzorčenja. V skupini Clitocybe je bakterijska DNK prisotna le v eni rastlini na spodnjem (1.) mestu vzorčenja. Peto vzorčenje je bilo na 6. dan po inokulaciji. Na ta dan smo v skupinah pozitivne kontrole, Tricholoma in Suillus, poleg dveh rastlin brez bolezenskih znamenj vzorčili še po dve rastlini z bolezenskim znamenjem 3. Podobno kot v vzorcih s 4. dne po inokulaciji smo v vzorcih s tega dne pri rastlinah brez bolezenskih znamenj le pri nekaterih zaznali bakterijsko DNK in še to ne nujno na obeh mestih vzorčenja. Pri vseh rastlinah, ki so imela bolezensko

33

znamenje 3, smo zaznali visoke koncentracije bakterijske DNK. Pri obeh vzorčenih rastlinah iz skupine Clitocybe bakterijska DNK ni bila prisotna. V vzorcih rastlin z 9. dne po inokulaciji smo zaznali bakterijsko DNK le v enem, ki je pripadal rastlini iz skupine Suillus. Na ta dan smo vzorčili samo rastline brez bolezenskih znamenj. Metoda qPCR je občutljiva. Ker smo vzorčili rastline z različnimi premeri stebel, in ker je pri vzorčenju lahko prišlo do napake pri merjenju dolžine vzorčenega dela stebla, predstavljamo dobljene rezultate z razmerjem med koncentracijo bakterijske DNK in rastlinske DNK (tabela 7). Koncentracije so bile izračunane s pomočjo umeritvenih krivulj, ki so prikazane v prilogi Č. Vzorcev negativne kontrole in vzorcev s prvega dne po inokulaciji nismo vključili v tabelo, ker v nobenem ni bilo zaznane bakterijske DNK. Vzorci so razporejeni po stolpcih glede na dan vzorčenja po inokulaciji, od tistega z najnižjim razmerjem koncentracij bakterijske in rastlinske DNK do tistega z najvišjim. Vzorce rastlin, ki so imeli ob vzorčenju bolezensko znamenje 3, smo označili s potemnjenimi polji. V skupini Clitocybe je bakterijska DNK prisotna le v enem od vseh vzorcev. Vzorčili smo ga na 4. dan po inokulaciji. Na ta dan je bilo razmerje med rastlinsko in bakterijsko DNK v tem vzorcu nižje od ostalih vzorcev, v katerih je bila bakterijska DNK prisotna. Bakterijsko DNK smo zaznali v 23 rastlinah od 50 vzorčenih (to je brez rastlin negativne kontrole). Od teh 23 rastlin jih je bilo 6 tistih, ki smo jih vzorčili z bolezenskim znamenjem 3. Pričakovali smo, da bo koncentracija bakterijske DNK v vzorcih s prvega mesta vzorčenja višja od tiste z drugega mesta. Koncentracija bakterijske DNK je bila pri 10 rastlinah od 23 višja na 2., višjem mestu vzorčenja. Od teh desetih rastlin pri 4 rastlinah na 1. mestu vzorčenja bakterijske DNK sploh nismo zaznali. Pričakovali smo, da bomo zaznali višje koncentracije bakterijske DNK v rastlinah z bolezenskim znamenjem 3 kot v tistih brez. To znotraj posamezne skupine sicer drži, če pa primerjamo skupine med sabo, lahko tudi to trditev ovržemo. Obe rastlini iz skupine Suillus, vzorčeni na 6. dan po inokulaciji z bolezenskim znamenjem 3, imata nižjo koncentracijo bakterijske DNK kot rastlini iz skupine pozitivne kontrole brez bolezenskih znamenj. Ena je vzorčena na 4. dan po inokulaciji, druga pa na 3. dan po inokulaciji. Podobno opazimo v skupini Tricholoma. Tu so koncentracije bakterijske DNK pri treh od štirih vzorcih nižje kot v vzorcih rastline pozitivne kontrole brez bolezenskih znamenj, vzorčene na četrti dan po inokulaciji (tabela 7). V vzorcih rastlin brez bolezenskih znamenj, v katerih je bila bakterija zaznana, je razmerje koncentracij DNK največkrat najvišje v vzorcih pozitivne kontrole. Tako ni le 6. in 9. dan po inokulaciji, ko je bilo razmerje koncentracij pri vzorcih rastlin brez bolezenskih znamenj višje v vzorcih Suillus. Pri vzorcih rastlin, vzorčenih z bolezenskim znamenjem 3, opazimo, da so koncentracije bakterijske DNK v vseh vzorcih višje na drugem mestu vzorčenja. Izjema je ena rastlina iz skupine Suillus, kjer sta razmerji precej podobni. Med vzorci rastlin z bolezenskim znamenjem 3 naraščajo koncentracije po skupinah – najnižje imajo vzorci skupine Suillus, sledijo vzorci skupine Tricholoma, najvišje koncentracije bakterijske DNK pa zaznamo v vzorcih rastlin pozitivne kontrole. Razlika med najvišjim razmerjem koncentracij bakterijske in rastlinske DNK rastlin z bolezenskim znamenjem 3 (2,2x106) iz skupine pozitivne kontrole in najnižjim iz skupine Suillus (2,7x103) je precej velika.

34

Tabela 7 Razpredelnica z razmerjem bakterijske DNK v odvisnosti od rastlinske DNK. Vzorci so razporejeni po stolpcih glede na dan vzorčenja po inokulaciji, od tistega z najnižjim razmerjem koncentracij do tistega z najvišjim. Kratica Cg pomeni skupino Clitocybe, Sv – Suillus, Ts – Tricholoma, PK – pozitivna kontrola. S potemnjenimi polji so označeni vzorci rastlin, ki so ob vzorčenju imela bolezensko znamenje 3.

2. dpi 3. dpi 4. dpi 6. dpi 9. dpi Ime

vzorca konc. Rs/

konc. COX Ime

vzorca konc. Rs/

konc. COX Ime

vzorca konc. Rs/

konc. COX Ime

vzorca konc. Rs/

konc. COX Ime

vzorca konc. Rs/

konc. COX Cg 2/1/1 0

Cg 3/1/1 0

PK 4/1/1 0

PK 5/3/2 0

PK 6/1/1 0

Cg 2/1/2 0

Cg 3/1/2 0

PK 4/1/2 0

PK 5/4/1 0

PK 6/1/2 0

Cg 2/2/1 0

Cg 3/2/1 0

Cg 4/1/2 0

PK 5/4/2 0

PK 6/2/1 0

Cg 2/2/2 0

Cg 3/2/2 0

Cg 4/2/1 0

Cg 5/1/1 0

PK 6/2/2 0

Cg 2/3/1 0

Sv 3/1/1 0

Cg 4/2/2 0

Cg 5/1/2 0

Cg 6/1/1 0

Cg 2/3/2 0

Sv 3/1/2 0

Sv 4/1/1 0

Cg 5/2/1 0

Cg 6/1/2 0

PK 2/1/1 0

Sv 3/2/1 0

Sv 4/1/2 0

Cg 5/2/2 0

Cg 6/2/1 0

PK 2/2/2 0

Sv 3/2/2 0

Ts 4/1/1 0

Sv 5/4/1 0

Cg 6/2/2 0

PK 2/3/1 0

Ts 3/2/1 0

Cg 4/1/1 9.02

Ts 5/1/2 0

Ts 6/1/1 0

Sv 2/1/1 0

Ts 3/2/2 0

Sv 4/2/2 25.68

Ts 5/2/1 0

Ts 6/1/2 0

Sv 2/1/2 0

Ts 3/1/2 0.17

Sv 4/2/1 269.96

Ts 5/2/2 0

Ts 6/2/1 0

Sv 2/2/1 0

Ts 3/1/1 1.13

Ts 4/1/2 814.15

Ts 5/1/1 0.02

Ts 6/2/2 0

Sv 2/2/2 0

PK 3/2/2 1177.01

Ts 4/2/1 1313.31

Sv 5/4/2 0.15

Sv 6/1/1 0

Sv 2/3/1 0

PK 3/1/2 1937.21

Ts 4/2/2 1529.13

PK 5/3/1 7.38

Sv 6/1/2 0

Sv 2/3/2 0

PK 3/2/1 3174.16

PK 4/2/2 6250.92

Sv 5/2/2 195.62

Sv 6/2/1 0

Ts 2/1/1 0

PK 3/1/1 5618.15

PK 4/2/1 28698.63

Sv 5/2/1 303.61

Sv 6/2/2 0.003

Ts 2/1/2 0

Sv 5/3/1 2699.85

Ts 2/2/2 0

Sv 5/1/2 3424.28

Ts 2/3/1 0

Sv 5/1/1 3748.99

Ts 2/3/2 0

Sv 5/3/2 4477.59

PK 2/3/2 0.16

Ts 5/4/1 5468.53

Ts 2/2/1 0.22

Ts 5/3/2 11739.09

PK 2/2/1 9.40

Ts 5/3/1 12813.02

PK 2/1/2 38.37

Ts 5/4/2 29409.79

PK 5/1/1 128116.02

PK 5/1/2 148808.35

PK 5/2/1 152269.20

PK 5/2/2 2273526.06

35

4.2.4 Razprava S testom patogenosti smo dokazali, da glivni ekstrakti zmanjšajo število uvelih rastlin krompirja, okuženih z bakterijo R. solanacearum. Kot najučinkovitejši se je izkazal ekstrakt Clitocybe sp., sledil mu je ekstrakt Tricholoma sp., najmanj rastlin brez bolezenskih znamenj v testnih skupinah pa je bilo v skupini, inokulirani z ekstraktom Suillus sp.. Ekstrakti so zavrli pojav bolezenskih znamenj pri rastlinah krompirjev, saj so rastline, inokulirane z ekstrakti, začele vidneje veneti 1 dan kasneje kot pozitivna kontrola, to je 5. dan po inokulaciji. Za analizo koncentracije bakterijske DNK v rastlinah smo v času testiranja patogenosti vzorčili 50, rastlin okuženih z bakterijo R. solanacearum. Od teh jih je bilo 44 brez bolezenskih znamenj, 6 pa jih je imelo bolezensko znamenje 3. V vzorcih 35 rastlin bakterijske DNK nismo zaznali. Glede na raziskave Tans - Kerstenove in sod. (2001) bi lahko za te rastline trdili, da je bila koncentracija bakterije na mestu inokulacije nižja od 5*108 celic/ml in se zato bakterije še niso razširile po rastlinah od mesta inokulacije do mest vzorčenja. Nizke koncentracije bakterije so lahko posledica tega, da se te še niso uspele dovolj namnožit, da bi pridobile gibljivost, posledica delovanja ekstraktov in/ali obrambe rastline. Glede na naše rezultate bi lahko sklepali, da je možna tudi neenakomerna porazdelitev bakterij po rastlini. Dejstvo, da koncentracija bakterij v vzorcih ne narašča s časom, lahko razložimo z majhno količino vzorčenih rastlin in rezultatom testa patogenosti. Ker smo ob vsakem vzorčenju rastlin brez bolezenskih znamenj v vsaki skupini vzorčili le po dve oz. tri rastline, koncentracije bakterije v le-teh niso nujno bile reprezentativne za celo skupino na tisti dan vzorčenja. Prav tako je pomembno dejstvo, da sta bili v skupini pozitivne kontrole ob koncu poskusa prisotni rastlini brez bolezenskih znamenj. Pri interpretaciji količine in prisotnosti bakterijske DNK v vzorcih je pomembno število rastlin, ki je na novo začelo razvijati bolezenska znamenja dan po vzorčenju (glej sliko 22). Na 2. in 3. dan po inokulaciji je bakterijska DNK prisotna v vseh vzorčenih rastlinah pozitivne kontrole, na četrti dan po inokulaciji pa se v tej skupini pojavijo prva bolezenska znamenja. Na 4. dan po inokulaciji je bakterijska DNK prisotna v največ vzorcih in v vseh skupinah, okuženih z bakterijo. Verjetnost, da smo izbrali ravno tiste rastline brez bolezenskih znamenj, v katerih se je bakterija že dovolj razmnožila po celi rastlini, je bila ravno v teh dneh največja, saj je največ rastlin v naslednjih dneh začelo veneti. Verjetnost, da bi izbrali rastlino z visoko koncentracijo DNK, je bila 6. dan po inokulaciji veliko manjša, saj začne 7. dan po inokulaciji na novo veneti manj rastlin. Največ (8) je takih ravno v skupini Suillus, v kateri smo v obeh rastlinah, vzorčenih na 6. dan, zaznali bakterijsko DNK. Prav tako je bila majhna verjetnost, da bi med vsemi rastlinami brez bolezenskih znamenj na 9. dan po inokulaciji vzorčili ravno eno tistih, ki jih bodo v kratkem razvile. V testu patogenosti je bilo ob koncu poskusa v skupini rastlin inokuliranih z ekstraktom Clitocybe sp največ rastlin brez bolezenskih znamenj. Da je ekstrakt res učinkovit za zatiranje bakterije R. solanacearum in vivo, je potrdila tudi analiza koncentracije bakterijske DNK v rastlinah. Od vseh vzorčenih rastlin iz te skupine (13) je bila bakterijska DNK prisotna le v eni, na enem mestu vzorčenja, v nizki koncentraciji. Ekstrakta Tricholoma sp. in Suillus sp. sta se med testom patogenosti na krompirju izkazala za učinkovitejša kot pri testu patogenosti na paradižniku (slika 16). Tu sta v primerjavi s pozitivno kontrolo pri več rastlinah zavrla pojav bolezenskih znamenj. V

36

testu patogenosti na krompirju se je ekstrakt Tricholoma sp. ponovno izkazal za malo bolj učinkovitega kot ekstrakt Suillus sp. Pri analizi koncentracije bakterijske DNK pa je v vzorcih z 2., 3. in 4. vzorčenja razmerje koncentraciji med bakterijsko in rastlinsko DNK v vzorcih iz skupine Suillus nižje kot v tistih iz skupine Tricholoma.

O dstote k rastlin krompirja, ki so prv ič razv ila bole ze nska zname nja

0

10

20

30

40

50

60

70

80

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 14

dnevi po inokulaciji

%

Pozitivna kon tro la Su illus T richo loma C litocybe

Slika 22 Incidenca bolezni v skupinah rastlin krompirjev na posamezni dan po inokulaciji.

37

O dstotki pa ra diž nikov skupin T icho lom a , ki so na novo ra z vi li bole z e nska z na m e nja

0

10

20

30

40

50

60

70

80

2 3 4 6 7 8 10 14

d n e vi p o in o k u laciji

%

Poz itiv na kontro la Tr ic holoma Tr ic holoma 1 Tr ic holoma 2 Tr ic holoma 3

Slika 23 Incidenca bolezni v skupinah rastlin paradižnikov na posamezni dan po inokulaciji Ker sta tudi v skupini pozitivne kontrole ostali dve rastlini brez bolezenskih znamenj, ne moremo trditi, da so v testnih skupinah izključno ekstrakti zavrli razvoj le−teh. Ker je odstotek rastlin brez bolezenskih znakov v testnih skupinah bistveno višji kot v skupini pozitivne kontrole, pa lahko trdimo, da so ekstrakti k temu vsekakor pripomogli. Možno je, da so naši ekstrakti inducirali prehod bakterije v VBNC stanje in bi vse rastline po daljšem času uvele. Možno je tudi, da so v rastlinah sprožili odzivno kaskado, ki je poleg protibakerijskega učinka ekstraktov še dodatno zavrla razmnoževanje bakterije. Lahko pa so biološko aktivne snovi v naših ekstraktih (lektini, ki so bakterije zlepili) onemogočili gibljivost in začasno znižali virulentnost. V večini objavljenih raziskav je kot testna rastlina uporabljen paradižnik. Paradižnik je zaradi visoke občutljivosti na bakterijo R. solanacearum in preprostega načina gojenja v rastlinjaku primernejša testna rastlina pri poskusih z bakterijo R. solanacearum kot krompir, ki ga, kljub temu da povzroča največ gospodarske škode v Evropi, redkeje zasledimo v raziskavah. Pri krompirju je med drugim za uniformne rastline potrebna vzgoja iz tkivnih kultur, kar je časovno zahtevno in precej dražje. Krompir je sicer prav tako občutljiv na okužbo z bakterijo R. solanacearum, vendar opazimo nekoliko večje odstopanje števila zdravih rastlin proti bolnim pri pozitivni kontroli kot pri paradižniku. Če primerjamo odstotke rastlin pozitivne kontrole krompirja in pozitivne kontrole paradižnika, ki na novo razvijejo bolezenska znamenja (glej sliki 22 in 23), vidimo, da je pri paradižniku odziv na okužbo hitrejši (od 4. do 6. dne po inokulaciji propadejo vse rastline pozitivne kontrole). Tovrstne raziskave so na krompirju kot primarnem gostitelju bakterije R. solanacearum v Evropi pomembne tako z vidika razumevanja interakcij med patogeno bakterijo in gostiteljem kot tudi potencialne zaščite rastline pred to bakterijo.

38

5 ZAKLJUČKI Med zaporedji inokulacije ekstrakt – bakterija ni velikih razlik. Za najboljšega se je izkazalo zaporedje, pri katerem najprej inokuliramo z ekstraktom in čez 24 ur še z bakterijo. V poskusu širjenja bakterije po paradižniku smo ugotovili, da se bakterija prej razširi v smeri toka ksilema kot obratno ter da je bila razširjena po skoraj celi rastlini že 3. dan po inokulaciji. Rastline kljub temu še niso kazale bolezenskih znamenj. V diplomskem delu smo dokazali, da lahko z ekstrakti višjih gliv uspešno zavremo pojav bolezenskih znamenj, ki jih povzroča bakterija R. solanacearum, tako na paradižniku kot na krompirju. Ekstrakti iz plodišč višjih gliv Suillus sp., Tricholoma sp. in Clitocybe sp. so bili različno učinkoviti. Največ rastlin krompirja brez bolezenskih znamenj je bilo ob koncu poskusa v skupini krompirjev, inokuliranih z ekstraktom Clitocybe sp.. Po učinkovitosti mu je sledil ekstrakt Tricholoma sp., najmanj zdravih rastlin je bilo ob koncu poskusa v skupini krompirjev inokuliranih z ekstraktom Suillus sp.. Ekstrakt Tricholoma sp. se je v zadnjih dneh poskusa izkazal za učinkovitejšega od ekstrakta Suillus sp. tudi v testu patogenosti na paradižniku. Ker je bakterija gibljiva in je imela optimalne pogoje za rast, ekstrakte pa smo v rastline vnesli samo enkrat, to še dodatno potrdi učinkovitost le−teh. Poleg tega smo s tem načinom inokulacije skrajšali čas trajanja poskusa in zagotovili okužbo vseh rastlin v isti fiziološki starosti. Z rezultati kvantifikacijske analize qPCR smo potrdili protibakterijski učinek ekstrakta Clitocybe sp., saj je bila bakterijska DNK prisotna samo v enem vzorcu v nizki koncentraciji. Ekstrakta Suillus sp. in Tricholoma sp. sta imela v primerjavi z vzorci pozitivne kontrole tudi nižje koncentracije bakterij. Ker smo na posamezen dan v posamezni skupini vzorčili le po 2 oz 3 rastline, bi bilo za potrditev tega rezultata potrebno opraviti dodatne analize. Zaradi majhnega števila vzorcev tudi ne moremo govoriti o bistveni povezavi med koncentracijo bakterij v rastlini in bolezenskim znamenjem. V nadaljnjih raziskavah bi bilo za analizo koncentracije bakterije R. solanacearum potrebno vzorčiti več rastlin na več mestih. Ob koncu poskusa bi bilo smiselno preveriti prisotnost in koncentracijo bakterij v rastlinah pozitivne kontrole, ki so brez bolezenskih znamenj. Ugotoviti je treba katera snov v ekstraktu ima protibakterijske učinke na bakterijo R. solanacearum oz. katera snov izboljša obrambni sistem rastline. V primeru, da se katera frakcija ekstrakta pokaže za uspešno, bi lahko v rastline vnesli gen za proizvajanje le-te in tako dobili rastline, ki bi bile odporne na bakterijo R. solanacearum. V raziskavah smo ugotovili, da so testi na krompirju lahko prav tako uspešni kot testi na paradižniku. Tovrstne raziskave na krompirju kot primarnemu gostitelju bakterije R. solanacearum v Evropi so pomembne tako z vidika razumevanja interakcij med patogeno bakterijo in gostiteljem kot tudi potencialne zaščite rastline pred to bakterijo.

39

6 VIRI Buddenhagen I.W, Sequeira L. in Kelman A. 1962. Designation of races of Pseudomonas solanacearum. Phytopathology 52, 726. Brzin J., Rogelj B., Popovič T., Štrukelj B. in Anka Ritonja. 2000. Clitocypin, a New Type of Cysteine Proteinase Inhibitor from Fruit Bodies of Mushroom Clitocybe nebularis. The Journal of Biological Chemistry, Vol. 275, No. 26, pp. 20104–20109 Christeller J.T. 2005. Evolutionary mechanisms acting on proteinase inhibitor variability. FEBS Journal, 272: 5710-5722 Council Directive 98/57/EC on the control of Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi in sod. 1998. Official Journal of European Communities, L235: 1-6 http://www.furs.si/law/EU/zvr/zakonodaja_CIRCA/EU_circa/OSTALO/31998L0057.pdf Cowan M.M. 1999. Plant Products as Antimicrobial Agents. Clinical Microbiology Reviews, p. 564-582, Vol. 12, No. 4 http://cmr.asm.org/cgi/content/full/12/4/564#SEC2 Dreo T., Želko M., Skubic J., Brzin J. in Ravnikar M. 2007. Antibacterial activity of Proteinaceous Extracts of Higher Basidiomycetes Mushrooms against Plant Pathogenic Bacteria, International Journal of Medicinal Mushrooms, 227-228. Elphinstone J. G., Hennessey J. K., Wilson J. K. and Stead D. E. 1996. Sensitivity of different methods for the detection of Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith in potato tuber extracts. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 26: 663–678 European and Mediterranean Plant Protection Organization. 2003. Diagnostic protocols for regulated pests, Ralstonia solanacearum. French E. R. 1994. Integrated control of bacterial wilt of potatoes. CIP Circular 20, 8-11 French E.R., Aley P., Torres E. in Nydegger U. 1993 Diversity of Pseudomonas solanacearum in Peru and Brazil. V: Hartman, G.L. & Hayward, A.C. (Red.) Bacterial Wilt. Canberra, ACIAR Proceedings, pp. 70-77. Gray B.E. in Steck T.R. 2001. The Viable But Nonculturable State of Ralstonia solanacearum May Be Involved in Long-Term Survival and Plant Infection. Applied and Environmental Microbiology, p. 3866–3872 Vol. 67, No. 9 http://www.fito-info.bf.uni-lj.si/cirsium/FITOINFO/SifrantOrg.htm Hase S., Takahashi S., Takenaka S., Nakaho K., Arie T., Seo S., Ohashi Y. in Takahashi H. 2008. Involvement of jasmonic acid signaling in bacterial wilt disease resistance induced by biocontrol agent Pythium oligandrum in tomato, Plant Pathology 57, 870–876 Hayward A. C. 1964. Characteristics of Pseudomonas solanacearum. Journal of Applied Bacteriology, 27: 265-277 Helander I. M., Alakomi H.-L., Latva-Kala K., Mattila-Sandholm T., Pol I., Smid E. J., Gorris L. G. M. in von Wright A. 1998. Characterization of the action of selected

40

essential oil components on Gram-negative bacteria. J. Agric. Food Chem. 46:3590-3595 Huang H.-E., Liu C.-A., Lee M.-J., Kuo C.-G., Chen H.-M., Ger M.-J., Tsai Y.-C., Chen Y.-R., Lin M.-K. in Feng T.-Y. 2007. Resistance Enhancement of Transgenic Tomato to Bacterial Pathogens by the Heterologous Expression of Sweet Pepper Ferredoxin-I Protein, Phytopathology 97:900-906 Ji P., Momol M. T., Olson S. M. in Pradhanang P. M. 2005. Evaluation of Thymol as Biofumigant for Control of Bacterial Wilt of Tomato Under Field Conditions, Plant Dis. 89:479-500 Klement Z., Mavridis A., Rudolph K., Vidaver A., Pérombelon M. C. M. in Moore L. W. 1990. Inoculation of plant tissues. Z. Klement, K. Rudolph, D. C. Sands, ured. Methods in Phytobacteriology. Budapest: Akadémiai Kiadó, 95-124. Krausz J. P. in Thurston H. D. 1975. Breakdown of Resistance to Pseudomonas solanacearum in Tomato. Phytopathology 65:1272-1274, Lindequist U., Niedermeyer T. H. J. in Jülich W.-D. 2005. The Pharmacological Potential of Mushrooms, eCAM; 2(3)285–299. Pacumbaba R. P., Beyl C. A. in Pacumbaba R. O. Jr. 1999. Shiitake Mycelial Leachate Suppresses Growth of Some Bacterial Species and Symptoms of Bacterial Wilt of Tomato and Lima Bean in vitro. Plant Dis. 83:20-23. Peumans W. J., Van Damme E. J. 1995. Lectins as plant defense proteins. Plant Physiology, 109: 347-352 Pradhanang P. M., Momol M. T., Olson S. M. 2003. Effects of Plant Essential Oils on Ralstonia solanacearum Population Density and Bacterial Wilt Incidence in Tomato, Plant Dis. 87:423-427 Roberts P. D., Adkins S., Pernezny K. in Jones J. B. 2004. Disease of pepper and their management. Diseases of fruits and vegetables: Vol. 2: Diagnosis and management. Naqvi S.A.M.H. (ed.). Dordrecht, Kluwer Academic Publishers, 333-387 Skubic J. 2007. Vpliv ekstraktov gliv na rastlinske patogene bakterije, diplomsko delo Biotehniška fakulteta Univerze v Ljubljani Smith I. M., Scott P. R., Holderness M., McNamara D. G., Burger B. V. 1997. Quarantine pests for Europe: data sheets on quarantine pests for the European Union and for the European and Mediterranean Plant Protection Organization 2nd ed. Tans-Kersten J., Huang H. in Allen C. 2001. Ralstonia solanacearum Needs Motility for Invasive Virulence on Tomato. Journal of Bacteriology, p. 3597-3605, Vol. 183, No. 12 Weller S. A., Elphinstone J. G., Smith N. C., Boonham N. in Stead D. E. 2000. Detection of Ralstonia solanacearum strains with quantitative, multiplex, real-time, fluorogenic PCR (TaqMan) assay. Applied and Environmental Microbiology, 66, 7: 2853-2858

41

Winstead N. N. in Kelman A. 1952. Inoculation techniques for evaluating resistance to Pseudomonas solanacearum, Phytopathology 42:628-634 Yabuuchi E., Kosako Y., Oyaizu H., Yano I., Hotta H., Hashimoto Y., Ezaki T. in Arakawa M, 1992, Proposal of Burkholderia gen. nov. and transfer of seven species of the genus Pseudomonas homology group II to the new genus, with the type species Burkholderia cepacia (Palleroni and Holmes 1981) comb. nov. Microbiol Immunol. 36(12):1251-75.

PRILOGA A – Rezultati testa patogenosti na rastlinah paradižnika

Začetek poskusa 8.12.2008, konec 23.12.2008

1. skupina Suillus sp = Ekstrakt Suillus sp. + R. solanacearum po 24h Bolezensko znamenje DPI Št. vseh

rastlin 0 1 2 3 4 5 1. 42 42 / / / / / 2. 42 42 / / / / / 3. 42 42 / / / / / 4. 42 40 2 / / / / 6. 42 14 3 9 13 3 / 7. 42 7 4 8 13 10 / 8. 42 3 4 4 13 18 /

10. 42 2 1 4 13 12 10 14. 42 1 1 2 3 4 31

2. skupina Suillus = Ekstrakt Suillus sp. + R. solanacearum

Bolezensko znamenje DPI Št. vseh rastlin 0 1 2 3 4 5

1. 41 41 / / / / / 2. 41 41 / / / / / 3. 41 41 / / / / / 4. 41 31 10 / / / / 6. 41 9 10 7 13 2 / 7. 41 6 2 3 11 17 2 8. 41 2 4 1 13 14 7

10. 41 / / 1 4 14 22 14. 41 / / / / 3 38

3. skupina Suillus = R. solanacearum + Ekstrakt Suillus sp. po 24h

Bolezensko znamenje DPI Št. vseh rastlin 0 1 2 3 4 5

1. 41 41 / / / / / 2. 41 41 / / / / / 3. 41 41 / / / / / 4. 41 31 7 1 / / / 6. 41 9 9 9 8 5 / 7. 41 6 2 2 15 14 / 8. 41 2 / 3 5 21 5

10. 41 / / / 6 9 22 14. 41 / / / / 2 36

Pri tabelirani in grafični predstavitvi razvoja simptomov pozitivne kontrole so zajete pozitivne kontrole vseh treh skupin skupaj.

Pozitivna kontrola Suillus sp. Bolezensko znamenje DPI Št. vseh

rastlin 0 1 2 3 4 5 1. 18 18 / / / / / 2. 16 16 / / / / / 3. 15 15 / / / / / 4. 15 14 1 / / / / 6. 15 2 5 2 5 1 / 7. 12 2 1 3 5 1 / 8. 12 1 1 1 5 4 /

10. 12 / / / 2 6 4 14. 12 / / / / / 12

1. skupina Tricholoma = Ekstrakt Tricholoma sp. + R. solanacearum po 24h

Bolezensko znamenje DPI Št. vseh rastlin 0 1 2 3 4 5

1. 39 39 / / / / / 2. 39 39 / / / / / 3. 39 39 / / / / / 4. 39 37 2 / / / / 6. 39 10 10 14 1 4 / 7. 39 5 5 7 9 13 / 8. 39 4 3 1 5 25 1

10. 39 4 2 / 2 21 10 14. 39 4 1 / 1 1 32

2. skupina Tricholoma = Ekstrakt Tricholoma sp. + R. solanacearum

Bolezensko znamenje DPI Št. vseh rastlin 0 1 2 3 4 5

1. 42 42 / / / / / 2. 42 42 / / / / / 3. 42 42 / / / / / 4. 42 27 14 1 / / / 6. 42 6 8 12 16 / / 7. 42 1 6 5 8 22 / 8. 42 1 2 5 3 28 3

10. 42 1 / / 2 11 28 14. 42 1 / / / / 41

3. skupina Tricholoma = R. solanacearum + Ekstrakt Tricholoma sp. po 24h Bolezensko znamenje DPI Št. vseh

rastlin 0 1 2 3 4 5 1. 42 42 / / / / / 2. 42 42 / / / / / 3. 42 42 / / / / / 4. 42 36 6 / / / / 6. 42 6 8 12 16 / / 7. 42 1 6 5 8 22 / 8. 42 1 2 5 3 28 3

10. 42 1 / / 2 11 28 14. 42 0 / / / / 41

Pozitivna kontrola Tricholoma sp.

Bolezensko znamenje DPI Št. vseh rastlin 0 1 2 3 4 5

1. 18 18 / / / / / 2. 17 17 / / / / / 3. 16 16 / / / / / 4. 15 8 7 / / / / 6. 15 / / 4 8 3 / 7. 12 / / / 2 10 / 8. 12 / / / / 12 /

10. 12 / / / / 2 10 14. 12 / / / / / 12

PRILOGA B - Rezultati testa patogenosti na rastlinah krompirja Začetek poskusa 7.9.2009, konec 21.9.2009. DPI = dan po inokulaciji.

Pozitivna kontrola Bolezensko znamenje DPI Št. vseh

rastlin 0 1 2 3 4 5 1. 42 42 / / / / / 2. 40 40 / / / / / 3. 37 37 / / / / / 4. 35 32 2 1 / / / 5. 33 14 3 5 11 / / 6. 33 11 / 1 21 / / 7. 29 8 / / 21 / / 8. 29 7 1 / 16 4 1 9. 29 6 / 1 2 17 3

10. 27 4 / 1 1 15 6 11. 27 4 / / 2 1 20 14. 27 2 / / 2 1 22

Suillus sp. + R. solanacearum

Bolezensko znamenje DPI Št. vseh rastlin 0 1 2 3 4 5

1. 42 42 / / / / / 2. 40 40 / / / / / 3. 37 37 / / / / / 4. 35 35 / / / / / 5. 33 25 2 4 2 / / 6. 33 19 5 1 8 / / 7. 29 11 1 3 14 / / 8. 29 11 / 1 10 7 / 9. 29 10 1 / 9 8 1

10. 27 8 / / 4 10 5 11. 27 8 / / 1 4 14 14. 27 8 / / / 1 18

Tricholoma sp. + R. solanacearum Bolezensko znamenje DPI Št. vseh

rastlin 0 1 2 3 4 5 1. 42 42 / / / / / 2. 40 40 / / / / / 3. 37 37 / / / / / 4. 35 34 1 / / / / 5. 33 27 2 1 3 / / 6. 33 20 / 1 12 / / 7. 29 17 / 1 11 / / 8. 29 15 1 1 10 2 / 9. 29 14 / 1 2 6 6

10. 27 11 1 / 3 3 9 11. 27 10 1 1 2 1 12 14. 27 10 / / 2 / 15

Clitocybe sp. + R. solanacearum

Bolezensko znamenje DPI Št. vseh rastlin 0 1 2 3 4 5

1. 42 42 / / / / / 2. 40 40 / / / / / 3. 37 37 / / / / / 4. 35 35 / / / / / 5. 33 28 2 2 1 / / 6. 33 24 / 3 6 / / 7. 31 19 / 3 9 / / 8. 31 19 / / 11 1 / 9. 31 18 0 1 5 4 3

10. 29 16 / / 3 5 5 11. 29 16 / / 1 3 9 14. 29 16 / / / 1 12

PRILOGA C – Rezultati qPCR

Ime vzorca Konc(Rs0x)

Konc(Rs0x)/ konc(COX0x)

Ime vzorca Konc(Rs0x)

Konc(Rs0x)/ konc(COX0x)

Ime vzorca Konc(Rs0x)

Konc(Rs0x)/ konc(COX0x)

Ime vzorca Konc(Rs0x)

Konc(Rs0x)/ konc(COX0x)

Ime vzorca Konc(Rs0x)

Konc(Rs0x)/ konc(COX0x)

PK 1/1/1 0.00 0.00 NK 1/1/1 0 0 Cg 1/1/1 0.00 0.00 Sv 1/1/1 0.00 0.00 Ts 1/1/1 0.00 0.00

PK 1/1/2 0.00 0.00 NK 1/1/2 0 0 Cg 1/1/2 0.00 0.00 Sv 1/1/2 0.00 0.00 Ts 1/1/2 0.00 0.00

PK 1/2/1 0.00 0.00 NK 1/2/1 0 0 Cg 1/2/1 0.00 0.00 Sv 1/2/1 0.00 0.00 Ts 1/2/1 0.00 0.00

1. dpi

PK 1/2/2 0.00 0.00 NK 1/2/2 0 0 Cg 1/2/2 0.00 0.00 Sv 1/2/2 0.00 0.00 Ts 1/2/2 0.00 0.00

PK 2/1/1 0.00 0.00 NK 2/1/1 0 0 Cg 2/1/1 0.00 0.00 Sv 2/1/1 0.00 0.00 Ts 2/1/1 0.00 0.00

PK 2/1/2 1.16E+06 38.37 NK 2/1/2 0 0 Cg 2/1/2 0.00 0.00 Sv 2/1/2 0.00 0.00 Ts 2/1/2 0.00 0.00

PK 2/2/1 4.18E+05 9.40 NK 2/2/1 0 0 Cg 2/2/1 0.00 0.00 Sv 2/2/1 0.00 0.00 Ts 2/2/1 1.39E+04 0.22

PK 2/2/2 0.00 0.00 NK 2/2/2 0 0 Cg 2/2/2 0.00 0.00 Sv 2/2/2 0.00 0.00 Ts 2/2/2 0.00 0.00

PK 2/3/1 0.00 0.00 Cg 2/3/1 0.00 0.00 Sv 2/3/1 0.00 0.00 Ts 2/3/1 0.00 0.00

2. dpi

PK 2/3/2 8.80E+03 0.16 Cg 2/3/2 0.00 0.00 Sv 2/3/2 0.00 0.00 Ts 2/3/2 0.00 0.00

PK 3/1/1 5.37E+08 5618.15 NK 3/1/1 0 0 Cg 3/1/1 0.00 0.00 Sv 3/1/1 0.00 0.00 Ts 3/1/1 1.23E+05 1.13

PK 3/1/2 1.96E+08 1937.21 NK 3/1/2 0 0 Cg 3/1/2 0.00 0.00 Sv 3/1/2 0.00 0.00 Ts 3/1/2 1.41E+04 0.17

PK 3/2/1 1.05E+08 3174.16 NK 3/2/1 0 0 Cg 3/2/1 0.00 0.00 Sv 3/2/1 0.00 0.00 Ts 3/2/1 0.00 0.00 3. dpi

PK 3/2/2 2.59E+07 1177.01 NK 3/2/2 0 0 Cg 3/2/2 0.00 0.00 Sv 3/2/2 0.00 0.00 Ts 3/2/2 0.00 0.00

PK 4/1/1 0.00 0.00 NK 4/1/1 0 0 Cg 4/1/1 1.45E+06 9.02 Sv 4/1/1 0.00 0.00 Ts 4/1/1 0.00 0.00

PK 4/1/2 0.00 0.00 NK 4/1/2 0 0 Cg 4/1/2 0.00 0.00 Sv 4/1/2 0.00 0.00 Ts 4/1/2 1.98E+08 814.15

PK 4/2/1 3.44E+09 28698.63 NK 4/2/1 0 0 Cg 4/2/1 0.00 0.00 Sv 4/2/1 6.72E+07 269.96 Ts 4/2/1 1.18E+08 1313.31 4. dpi

PK 4/2/2 1.13E+09 6250.92 NK 4/2/2 0 0 Cg 4/2/2 0.00 0.00 Sv 4/2/2 6.99E+06 25.68 Ts 4/2/2 2.73E+08 1529.13

PK 5/1/1 1.93E+10 128116.02 NK 5/1/1 0 0 Cg 5/1/1 0.00 0.00 Sv 5/1/1 9.66E+08 3748.99 Ts 5/1/1 3.95E+03 0.02

PK 5/1/2 2.24E+10 148808.35 NK 5/1/2 0 0 Cg 5/1/2 0.00 0.00 Sv 5/1/2 1.67E+09 3424.28 Ts 5/1/2 0.00 0.00

PK 5/2/1 1.67E+10 152269.20 NK 5/2/1 0 0 Cg 5/2/1 0.00 0.00 Sv 5/2/1 4.51E+07 303.61 Ts 5/2/1 0.00 0.00

PK 5/2/2 2.70E+11 2273526.06 NK 5/2/2 0 0 Cg 5/2/2 0.00 0.00 Sv 5/2/2 2.18E+07 195.62 Ts 5/2/2 0.00 0.00

PK 5/3/1 9.47E+05 7.38 Sv 5/3/1 9.17E+08 2699.85 Ts 5/3/1 1.85E+09 12813.02

PK 5/3/2 0.00 0.00 Sv 5/3/2 1.38E+09 4477.59 Ts 5/3/2 3.84E+09 11739.09

PK 5/4/1 0.00 0.00 Sv 5/4/1 0.00 0.00 Ts 5/4/1 1.36E+09 5468.53

6. dpi

PK 5/4/2 0.00 0.00 Sv 5/4/2 4.30E+04 0.15 Ts 5/4/2 7.43E+09 29409.79

PK 6/1/1 0.00 0.00 NK 6/1/1 0 0 Cg 6/1/1 0.00 0.00 Sv 6/1/1 0.00 0.00 Ts 6/1/1 0.00 0.00

PK 6/1/2 0.00 0.00 NK 6/1/2 0 0 Cg 6/1/2 0.00 0.00 Sv 6/1/2 0.00 0.00 Ts 6/1/2 0.00 0.00

PK 6/2/1 0.00 0.00 NK 6/2/1 0 0 Cg 6/2/1 0.00 0.00 Sv 6/2/1 0.00 0.00 Ts 6/2/1 0.00 0.00 9. dpi

PK 6/2/2 0.00 0.00 NK 6/2/2 0 0 Cg 6/2/2 0.00 0.00 Sv 6/2/2 6.60E+02 0.00 Ts 6/2/2 0.00 0.00 Opomba: Kratica Cg pomeni skupino Clitocybe, Sv – Suillus, Ts – Tricholoma, PK – pozitivna kontrola. S potemnjenimi polji so označeni vzorci rastlin, ki so ob vzorčenju imela bolezensko znamenje 3. Rs0x – R. solanacearum neredčen vzorec, COX0x – citokrom oksidaza neredčen vzorec.

PRILOGA Č – Umeritvene krivulje koncentracije bakterije R. solanacearum in gena COX na posameznih qPCR ploščicah

Rs = R. solanacearum, PK = pozitivna kontrola, NK = negativna kontrola, COX = gen za citokrom oksidazo. S pomočjo umeritvenih krivulj smo izračunali koncentracije bakterije oz. gena COX v vzorcih.

Um eritvena krivulja Rs (P K , NK )

y = -0 .3059x + 15.62

R2 = 0 .9954

0123456789

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Ct

Lo

g(k

on

c.)

Um eritvena k rivulja CO X (P K ,NK )

y = -0.2317x + 11.406

R2 = 0.9913

0123456789

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Ct

Log(

konc

.)

Um eritvena k rivulja COX (Clitocy be, S uillus )

y = -0.278x + 12.894

R2 = 0.9836

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Ct

Log

(Kon

c.)

Um eritvena Rs (C litocybe , S uillus)

y = -0 .30 11 x + 1 4 .08 2

R 2 = 0 .9 92

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0 5 1 0 1 5 20 25 30 3 5

C t

Lo

g(k

on

c.)

Um eritvena k rivulja CO X (Tric holom a)

y = -0.2534x + 12.087

R2 = 0.9967

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Ct

log(

konc

.)

Um eritvena k rivulja Rs (Tric holom a)

y = -0.3198x + 14.931

R2 = 0.9939

0123456789

0 10 20 30 40

Ct

log(

konc

.)