Viernes 30 Micro sesion 8 A Maldonado Vibrio Pbvs.panalimentos.org/local/File/INCLUSIONES2008/7... · Vibrio parahaemolyticus: Antecedentes II •En Asia, es la principal causa de

Vibrio parahaemolyticus

Aurora Maldonado B.Wally Silva S.C.

Alda Fernández R.Instituto de Salud Pública de Chile.

Mayo 2008

Vibrio parahaemolyticusAntecedentes:

• En las últimas décadas han emergido otros Vibrio productores de enfermedades que, aunque generalmente de menor severidad que el cólera, tienen la capacidad de producir importantes brotes epidémicos, como Vibrio parahaemolyticus

• Año 1953, investigadores japoneses identificaron por primera vez al Vibrio parahaemolyticus como el causante de intoxicación alimentaria. (Isaka , 272 personas afectadas, 20 fallecidos. El brote se asoció al consumo de sardinas crudas)

Vibrio parahaemolyticus:Antecedentes II

• En Asia, es la principal causa de infecciones intestinales transmitidas por alimentos, casi siempre asociada con el consumo de pescado o mariscos crudos.

• En Estados Unidos es la especie de Vibrio más frecuentemente aislada de muestras clínicas y es primariamente asociada a ETA. Causa de brotes desde 1969.

• Asociado al consumo de alimentos de origen marino (bivalvos, crustáceos)

Vibrio: Características generales

•• MMáás de 75 especiess de 75 especies

•• TaxonomTaxonomíía: en constante revisia: en constante revisióón por la n por la incorporaciincorporacióón de tn de téécnicas de biologcnicas de biologíía molecular, a molecular, lo cual puede llevar eventualmente a reclasificar lo cual puede llevar eventualmente a reclasificar en nuevos gen nuevos gééneros.neros.

•• Al menos 12 de ellas son patAl menos 12 de ellas son patóógenas para el genas para el hombre y varias son tambihombre y varias son tambiéén patn patóógenas para genas para animales tanto vertebrados como invertebrados. animales tanto vertebrados como invertebrados.


• Familia: Vibrionaceae

• Género: Vibrio

• Bacilo curvo gramnegativo, no esporulado•• MideMide 0.50.5––0.8 0.8 µµmm didiáámetrometro, 1.4, 1.4––2.6 2.6 µµmm largolargo• Parte de la flora normal de estuarios y costas del

mundo. • Densidad bacteriana ambiental aumenta en

períodos cálidos.• Capacidad de producir enfermedad es variable, cepas

ambientales mayoritariamente no patogénicas.


•• MMóóvilvil porpor un solo un solo flageloflagelo polarpolar

•• FacultativoFacultativo

•• ColoniasColonias en agar TCBS: Verdesen agar TCBS: Verdes

•• DesarrolloDesarrollo óóptimoptimo en en NaClNaCl 11-- 4%, 4%, crececrece al 8%al 8%

•• pH pH óóptimoptimo: 7.5 : 7.5 -- 8.68.6

•• TemperaturaTemperatura >10>10ººC C -- 4242ººCC

Manifestaciones Clínicas.

Gastroenteritis

Infección Entérica: %

--DiarreaDiarrea acuosaacuosa 9898--CCóólico abdominallico abdominal 8282--NNááuseasuseas 7171--VVóómitosmitos 5252--CefaleaCefalea 4242--FiebreFiebre 2727--CalofrCalofrííosos 2424

�Período incubación 12-24 Hrs. (4-96 hrs).

�Proceso autolimitado ( 3 días ).

Infección Heridas Septicemia

AsociaciAsociacióón de n de Vibrio Vibrio patpatóógenos con genos con

ssííndromes clndromes clíínicosnicos

no+noV. cincinatiensis

no++V. metschnikovii

++no++V. mimicus

nono++V. hollisae

nono+V. furnissii

++nonoV. damsela

++++noV. alginolyticus

++++V. fluvialis

++++++++V. vulnificus

++++++V. parahaemolyticus

++++++V. cholerae no 01

+no+++V. cholerae 01

InfecciInfecciInfecciInfeccióóóón de heridasn de heridasn de heridasn de heridasSepsisSepsisSepsisSepsisDiarreaDiarreaDiarreaDiarreaVibrio Vibrio Vibrio Vibrio spspspsp

V. parahaemolyticus: Factores de virulencia:

TDH (Hemolisina Directa Termoestable)

� Factor más importante determinante de virulencia90% cepas clínicas (Nishibushi et al., Miyamoto et al., Okuda et al., Wong et al.).

<1% cepas ambientales.� Proteína con capacidad hemolítica que posee varias cualidades:- Citotoxicidad, aumenta la permeabilidad vascular y acumulación de

líquidos (Honda, Ljungh, Takeda et al).

- No inactivada por calor (100ºC por 10 min)- Alteración el flujo iónico de las células intestinales: desencadena diarrea

secretora- Relacionada con la formación de porinas�Fenómeno Kanagawa: Hemólisis en Agar Wagatsuma (Miyamoto et al., 1969).

� Codificada por genes de expresión tdh:Fortaleza promotorVptoxRS operon: regulador global genes Vp.Expresión preferencial tdh2 (90%).

FenFenóómenomeno de Kanagawade Kanagawa

•• WagatsumaWagatsuma modificmodificóó el el agaragar para evitar para evitar confusiconfusióón con la actividad hemoln con la actividad hemolíítica normal de tica normal de V. V. parahaemolyticusparahaemolyticus sobre sobre agaragar sangre sangre convencional con 5 % de sangre de cordero. convencional con 5 % de sangre de cordero. Este Este agaragar especial fue llamado especial fue llamado agaragar WagatsumaWagatsumay la especial respuesta hemoly la especial respuesta hemolíítica , el fentica , el fenóómeno meno de de KanagawaKanagawa..

•• En la preparaciEn la preparacióón de este n de este agaragar, se utiliza sangre , se utiliza sangre fresca humana, de perro o cordero.fresca humana, de perro o cordero.

TRH (Hemolisina Relacionada a TDH)

Descubierta en brote islas Maldivas, aislamientos con ausencia de

tdh (Honda et al. 1987).

� Similares características biológicas, inmunológicas y fisicoquímicas a TDH

� Actividad citotóxica en una variedad de tejidos

� Codificada por gen trh, 69% similaridad con tdh2

� Puede coexistir con tdh (Okuda et al.)

� Generalmente asociada a producción de Ureasa (Okuda et al.) isla de patogenicidad (Park et al.)

V. parahaemolyticus Factores de virulencia

Otros factores de Otros factores de patogenicidadpatogenicidad

•• Variedad de Variedad de pilipili

•• HemaglutininasHemaglutininas: (MSHA): (MSHA)

•• Factores de colonizaciFactores de colonizacióón n

•• Capacidad de invasiCapacidad de invasióón celularn celular

V. parahaemolyticusV. parahaemolyticus : PCR TDH: PCR TDH--TRHTRH

382 bp

460 bp

TDH

TRH

PCR

AmplificaciAmplificacióónn del del gengen tdhtdh y y toxRtoxR gengenporpor PCRPCR

LLííneasneas 1 y 6, 1 y 6, marcadormarcador molecular; molecular; llííneanea 2, 2, cepacepa control control V. V. parahaemolyticusparahaemolyticusATCC 17802;ATCC 17802;llííneanea 3, control negative ; 3, control negative ; llííneasneas 4 y 5 , 4 y 5 , cepascepas en en estudioestudio. .

LLííneasneas 1, 1, marcadormarcador molecular;molecular;llííneanea 2, 2, cepacepa control control V. V. parahaemolyticusparahaemolyticusWP1;WP1;llííneanea 3, control 3, control negativonegativo; ; llííneasneas 4 a la 9, 4 a la 9, cepascepas en en estudioestudio..

Tipificación serológica Vibrio parahaemolyticus.

Serotipificación:• Estandarizada, técnicamente dificultosa y cara (Centros de Referencia)

• O lipopolisacárido, K cápsula

Total 65Total 12

5212

36,40,50,51,6111

19,24,52,66,7110

9,23,449

8,20,21,22,39,708

7,197

6,18,466

5,15,17,30,47,60,61,685

4,8,9,10,11,12,13,34,42,49,53,55,63,674

4,5,6,7,27,30,31,33,37,43,45,48,54,57,58,59,65

3

3,282

1,25,26,32,38,41,56,58,64,691

Grupo KGrupo OEl esquema antigénico fue propuesto por

Sakazaki et al. 1963, Hugh, R., and J. C. Feeley. 1972, (Elliot. E. L., FDA

U.S.A., 1998.)

Las pruebas serológicas no son usadas para identificar V. parahaemolyticus porque dan reacciones cruzadas con otros microorganismos.Sin embargo durante investigaciones de brotes de ETA,las pruebas serológicas pueden ser una herramientaepidemiológica valiosa.

Esquema antigénico de Vibrio parahaemolylitus

O3:K6O3:K6O3:K6O3:K6


O3:K6O3:K6O3:K6O3:K6 O3:K6O3:K6O3:K6O3:K6


O3:K6O3:K6O3:K6O3:K6O4:K68O1:KUTO1:KUTO1:KUTO1:KUT

O4:K68O4:K12O4:K12O4:K12O4:K12O1:K56O1:K56O1:K56O1:K56

O4:K63O4:K63O4:K63O4:K63


Propiedades del gPropiedades del géénero nero Vibrio Vibrio y diferenciaciy diferenciacióón de n de

otros gotros gééneros neros fenotfenotíípicamentepicamente similaressimilares

--++Crece en TCBS

+-++Fermenta Manitol

---+Requerimiento Na+

-+++Oxidasa

Enterobac-

teriaceae

Plesiomo-

nas

AeromonasVibrioPrueba

Reacción o propiedad de:

SiembraSiembra de de muestrasmuestras clclíínicasnicas en agar:en agar:

Agar TCBS Agar sangre Agar TSA

Tres esquemas analTres esquemas analííticos para ticos para V. V. parahaemolyticusparahaemolyticus en men muestrasuestras de de alimentosalimentos

1.1. Numero mNumero máás probable (MPN) procedimiento s probable (MPN) procedimiento usado por muchos laboratorios.usado por muchos laboratorios.

2.2. FiltraciFiltracióón por membrana, usando un filtro con n por membrana, usando un filtro con rejilla rejilla hidrofhidrofóóbicabica (HGMF).(HGMF).

3.3. MMéétodo de todo de plaqueoplaqueo directo usando sondas de directo usando sondas de DNA para la identificaciDNA para la identificacióón de la poblacin de la poblacióón total n total de de V. V. parahaemolyticusparahaemolyticus y cepas paty cepas patóógenas genas (contienen TDH). (contienen TDH).

MMéétodotodo semicuantitativosemicuantitativo (NMP)(NMP)

MuestraMuestra alimentoalimento ((bibalvosbibalvos crudoscrudos y y congeladoscongelados):):

LicuarLicuar PesarPesar AgregarAgregar idem PBS idem PBS DilucionesDiluciones: 1:10 : 1:10 –– 1:100 1:100 –– 1:1000 1:1000

SiembraSiembra: APA (: APA (trestres series de 3) y APA 2x series de 3) y APA 2x IncubarIncubar 18 h. 3518 h. 35ººCC

SiembraSiembra: agar TCBS : agar TCBS CHROMagarCHROMagar®

ColoniasColonias verdesverdes ColoniasColonias burdeosburdeos con bordecon bordeblanco blanco

CaracterCaracteríísticassticas bioqubioquíímicasmicas

MMéétodotodo cuantitativocuantitativo

•• MuestraMuestra alimentoalimento ((bibalvosbibalvos crudoscrudos y y congeladoscongelados): ):

LicuarLicuar PesarPesar AgregarAgregar idem PBS idem PBS

DilucionesDiluciones: 1:10 : 1:10 IncubarIncubar 18 h. 4218 h. 42ººCC

SiembraSiembra: agar TCBS : agar TCBS CHROMagarCHROMagar®Vibrio

ColoniasColonias verdesverdes ColoniasColonias burdeosburdeos con borde blanco con borde blanco

CaracterCaracteríísticassticas bioqubioquíímicasmicas

FiltraciFiltracióón por membrana (HGMF)n por membrana (HGMF)

•• DiluciDilucióónn 1:101:10•• FiltrarFiltrar•• SiembraSiembra en agar en agar sulfatosulfato magnesiomagnesio NaClNaCl (TSAMS)(TSAMS)•• IncubarIncubar 4 h 35 4 h 35 ººCC•• SembrarSembrar en agar en agar sacarosasacarosa VpVp (VPSA)(VPSA)•• ColoniasColonias verdesverdes con con rellenorelleno azulazul: : diagndiagnóósticosticopresuntivopresuntivo

•• ConfirmarConfirmar al al menosmenos 5 5 coloniascolonias sospechosassospechosas•• Los Los cuadradoscuadrados confirmadosconfirmados se se multiplicanmultiplican porpor el el total de total de coloniascolonias ttíípicaspicas y se y se calculacalcula el MPNel MPN/g de /g de mariscomarisco

Deposición directa o en medio de transporte Cary Blair

Agar TCBS

Repicar coloniasverdes a placa de Agar Sangre o TSA

OXIDASA

Descartar

- +

TSI:K/A-,-LIA:K/A-,-

MIO: +, +, + ó +, -, +

Incubar 4-5 h a 35ºC


DiagnósticoPresuntivo

Laboratorio de Referencia ISP

Confirmación bioquímica

Confirmación

Informe al Laboratorio

No Si

OxidasaTSILIAMIOOrnitinaArgininaVoges ProskauerArabinosaManitolIndol (Caldo Corazón)NaCl 0%NaCl 1%


V. parahaemolyticusFlujograma Diagnóstico bacteriológico

Informe al Laboratorio localInforme al Servicio RegionalNotificación al Ministerio de Salud

TCBS colonias Sacarosa - (Verdes)

V.parahaemolyticus

V.mimicus

V.hollisae

V.damsela

V.vulnificus

V.harveyi (50%)

Identificación presuntiva

Vibrio parahaemolyticus TSI LIA MIO

DiagnDiagnóóstico de confirmacistico de confirmacióónn dede

VibrioVibrio parahaemolyticusparahaemolyticus

CEPACEPA

TCBSTCBS

Colonia verdeColonia verde

Agar sangreAgar sangre

OxidasaOxidasa: +: +TSI: K/A TSI: K/A -- --LIA: K/K LIA: K/K -- --OrnitinaOrnitina: +: +ArgininaArginina: : --VP: VP: --ArabinosaArabinosa:+:+ManitolManitol: +: +IndolIndol (Caldo Cerebro Coraz(Caldo Cerebro Corazóón): n): ++NaCl 0%: NaCl 0%: --NaCl 1%: +NaCl 1%: +

PruebasPruebas claves claves diferencialesdiferenciales entreentre los los gruposgrupos 1, 5 y 61, 5 y 6

55555555959595955050505000009999999999999999OrnitinaOrnitinaOrnitinaOrnitina MoellerMoellerMoellerMoeller

1111%NaCl%NaCl%NaCl%NaCl

0000000000009393939300000000ArgininaArgininaArgininaArginina MoellerMoellerMoellerMoeller

1111%NaCl%NaCl%NaCl%NaCl

----

++++

----

++++

----

++++

----

++++

++++

++++

++++

++++

Crece en caldo Crece en caldo Crece en caldo Crece en caldo

con:con:con:con:

Sin Sin Sin Sin NaClNaClNaClNaCl

1% 1% 1% 1% NaClNaClNaClNaCl

V.vulV.vulV.vulV.vulnificusnificusnificusnificus

V.parahaeV.parahaeV.parahaeV.parahaemolyticusmolyticusmolyticusmolyticus

V.alginoV.alginoV.alginoV.alginolyticuslyticuslyticuslyticus

V.fluV.fluV.fluV.fluvialisvialisvialisvialis

V.mimiV.mimiV.mimiV.mimicuscuscuscus

V.choV.choV.choV.choleraeleraeleraelerae

Grupo 6Grupo 6Grupo 6Grupo 6Grupo 5Grupo 5Grupo 5Grupo 5Grupo 1Grupo 1Grupo 1Grupo 1PruebaPruebaPruebaPrueba

BioquBioquíímica diferencial para separar especies de mica diferencial para separar especies de

V.parahemolyticusV.parahemolyticus grupos 1, 5 y 6grupos 1, 5 y 6

014001Salicina

50533008Celobiosa

50100100979999D-Manitol

501991000100Sacarosa

Ácido de:

999999809899Movilidad

00950975Voges-Proskauer1% NaCl

V.vul

nificus

V.parahae

molyticus

V.algino

lyticus

V.flu

vialis

V.mimi

cus

V.cho

lerae

Grupo 6Grupo 5Grupo 1Prueba

% de positividad paraa

a: El número indica el porcentaje de cepas que son positivas después de 48 h. de incubación a 35ºC

FOTO

TSI LIA MIO Ornitina Arginina Control

Identificación definitiva:

NaCl 0% 1% Indol Arab Manit

R.M:.+ V.P. + Azúcares: + Azúcares: -

V. parahaemolyticus, cepas de origen clínico recibidas por el Lab. de Referencia,

ISP 1992- Mayo 2008.

Sección Bacteriología, ISP-Chile

39

189

57 6446

193

117

175

903

647

576

927

6 90

52

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008

Años

Nº de

Cep

as

20042004

n=49n=49

O3:K6

O10:KUTO6:K46O4:K12

O3:K58

Vibrio parahaemolyticus, Vibrio parahaemolyticus, serotiposserotipos mmááss

frecuentesfrecuentes en en cepascepas de de origenorigen clclííniconico, ,

ISP 1998ISP 1998--20042004

Serogrupos V.parahaemolyticus

• 2004: Centro Internacional Enfermedades Diarreicas (Bangladesch)

• Cepas chilenas de V.parahaemolyticusde aislamiento humano 1998-2004

• N º= 280

• 225 (81%) = O3 K6

Cepas confirmadas Cepas confirmadas V. parahaemolyticusV. parahaemolyticusaislamientos humanosaislamientos humanos

ISP 2003 ISP 2003 -- 20082008

0

100

200

300

400

500

600

N o rt e Grande 116 2 7 2 0 14 1 14

N o rt e C hico 2 52 8 7 17 2 1

C ent ral 2 2 3 4 4 2 13 16 6 53 8

Sur 1 12 4 4 8 7 3 3 3 3 9 2 3 54

2 0 0 3 2 0 0 4 2 0 0 5 2 0 0 6 2 0 0 7 2 0 0 8

0

20

40

60

80

100

120

140

160

N ort e Grand e

N ort e C hico 2 0 2 13 16

C ent ral 2 2 3 4 3 9 2 3 18

Sur 2 4 14 9 9 6 73 73 13 2

2 0 0 3 2 0 0 4 2 0 0 5 2 0 0 6 2 0 0 7 2 0 0 8

Cepas confirmadas Cepas confirmadas V. parahaemolyticusV. parahaemolyticusaislamientos ambientalesaislamientos ambientales

ISP 2003 ISP 2003 -- 20082008

EvitarlosEvitarlos o comer o comer bienbien cocidoscocidos……

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Viernes 30 Micro sesion 8 A Maldonado Vibrio Pbvs.panalimentos.org/local/File/INCLUSIONES2008/7... · Vibrio parahaemolyticus: Antecedentes II •En Asia, es la principal causa de